Luận văn báo cáo tổng quan tài liệu độc tố trong sản xuất thực phẩm

Luận văn báo cáo tổng quan tài liệu độc tố trong sản xuất thực phẩm.

LỜI CÁM ƠN

Em có được kiến thức và sự trưởng thành như ngày hôm nay là nhờ công lao rất lớn của các thầy cô Khoa Công nghệ Hoá học & Dầu khí, nhất là các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM Do vậy, lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô – những người đã hết lòng dìu dắt em trên con đường học vấn

Đặc biệt, em xin tỏ sự ghi ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Lại Mai Hương, cô đã tận tình hướng dẫn, quan tâm chỉ dạy để em hoàn thành luận văn này

Tp HCM, ngày 02 tháng 01 năm 2008

Nguyễn Thụy Nhã Phương

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của loài người Theo quátrình tiến hoá và phát triển của loài người, thực phẩm cũng phát triển theo Cùng với sựtiến triển của khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển Tuynhiên thực phẩm không chỉ cung cấp nguồn dinh dưỡng mà còn chứa những nguy cơ tìmẩn có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng, đó chính là các loại độc tốdù tồn tại trong thực phẩm với hàm lượng rất nhỏ cũng có thể gây ảnh hưởng rất lớn đến

cơ thể

Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh dưỡng mà còn về tính antoàn và không gây hại cho sức khoẻ đối với người tiêu dùng là cần thiết Nếu như các loạiđộc tố có sẵn trong nguyên liệu hoặc bị nhiễm vào sản phẩm trong quá trình chế biến thìcó thể kiểm soát và phòng ngừa, còn các loại độc tố hình thành trong quá trình chế biếnthì đa dạng và khó kiểm soát hơn nhiều Tuy nhiên các tài liệu về độc tố xuất hiện trongquá trình chế biến ở nước ta còn rất hạn chế Vì vậy việc tập hợp tài liệu về đề tài này làmột yêu cầu cấp thiết nhằm tìm ra kỹ thuật chế biến thực phẩm an toàn nhất và giảmthiểu đến mức thấp nhất những nguy cơ tác hại đến sức khỏe người tiêu dùng

Mục đích của luận văn này là tập hợp tất cả tài liệu về độc tố xuất hiện trong quátrình chế biến, thống nhất và sắp xếp thành một hệ thống rõ ràng, đầy đủ Nội dung luậnvăn được chia thành 6 chương như sau:

- Chương 1: Giới thiệu chung về độc tố

- Chương 2: Tổng quan tài liệu về acrylamide

- Chương 3: Tổng quan tài liệu về nhóm hợp chất amine vòng thơm (HAAs)

- Chương 4: Tổng quan tài liệu về nhóm hợp chất hydrocarbon nhiều vòng thơm(PAHs)

- Chương 5: Tổng quan tài liệu về nhóm nitrosamine

- Chương 6: Tổng quan tài liệu về nhóm 3 – MCPD

Trong mỗi chương của luận văn là phần tìm hiểu về công thức cấu tạo, nguồn gốc,tác hại, cơ chế sinh ra độc tố, các yếu tố ảnh hưởng, các phương pháp phân tích và biệnpháp giảm hàm lượng độc tố

Hy vọng nội dung luận văn đáp ứng được các yêu cầu đề ra Do thời gian thực hiệnluận văn quá ngắn, kinh nghiệm và kiến thức của em vẫn còn hạn chế, các sai sót gặpphải là không thể tránh khỏi Mong các thầy cô giúp đỡ chỉnh lý để luận văn của em đượchoàn thiện hơn

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 2.1: Công thức cấu tạo và cấu trúc mạng tinh thể của acrylamide 3Hình 2.2: Phản ứng của acrylamide (1) chuyển hoá thành glycidamide (2) bởi cytochrome P450 6Hình 2.3: Các phản ứng minh họa các cơ chế tạo acrylamide (1) theo phản ứng kiểu Maillard (A) và oxy hoá chất béo (B) 7Hình 2.4: Quá trình tạo thành acrylamide từ Asparagine với đường khử (α – hydroxy – carbonyls) 8Hình 2.5: Kết quả tóm tắt của phương pháp đánh dấu phân tử 9Hình 2.6: Sự tạo thành của acrylamide (1), 3 – aminopropanamide (9), và andehyde 3 – oxopropanamide (8) từ asparagines với sự tham gia của nhóm α – carbonyl 11Hình 2.7: Ảnh hưởng của nồng độ asparagine và glucose lên sự hình thành acrylamidetrong khoai tây chiên ở 1650C trong 4 phút 16Hình 2.8: Aûnh hưởng của thời gian và nhiệt độ dầu chiên đến hàm lượng acrylamide trongkhoai tây chiên dưới điều kiện chiên thông thường 17Hình 2.9: Ảnh hưởng của thời gian chiên và nhiệt độ lên hàm lượng acrylamide có trongkhoai tây chiên ở áp suất chân không (10 Torr) 17Hình 2.10: Hàm lượng acrlamide ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau 18Hình 2.11: Ảnh hưởng của phương pháp chiên và thời gian chiên đến hàm lượng của acrylamide trong khoai tây chiên 19Hình 2.12: Mối tương quan giữa hàm lượng acrylamide và hàm ẩm ban đầu của nguyênliệu 19Hình 2.13: Hàm lượng acrylamide tạo thành trong quá trình chiên bắp - được xử lý vớidung dịch acid citric nồng độ 0, 0.1, 0.2% 20Hình 2.14: Hàm lượng acrylamide trong khoai tây chiên sau khi ngâm trong dung dịch acidcitric nồng độ 0, 1, 2% 21Hình 2.15: Ảnh hưởng của pH lên sự hình thành acrylamide với sự có mặt của asparagine (0.5 mmol) và glucose (0.5 mmol) trong 1 mL phosphate trong suốt quá trình gia nhiệt ở

1500C trong 30 phút 21Hình 2.16: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng acrylamide sau khi gia nhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20 phút 23Hình 2.17: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng hydroxymethylfurfural sau khi gia nhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20 phút 24Hình 2.18: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng furfural sau khi gianhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20 phút 24Hình 2.19: Sự hình thành acrylamide trong quá trình nhiệt phân hỗn hợp glucose và

asparagin 25Hình 2.20: Quá trình trích ly, tinh sạch và tiền xử lý mẫu trước quá trình chạy sắc ký GC –

MS, LC – MS/MS 27Hình 2.21: Quá trình tinh sạch điển hình dùng cột có chất mang rắn SPE dùng trong phân tích hàm lượng acrylamide 28Hình 2.22: Quá trình phát hiện acrylamide bằng phương pháp LC/MS/MS 34Hình 2.23: Hàm lượng acrylamide sinh ra ở sản phẩm khoai tây chiên khi xử lý nguyên liệu trước quá trình chế biến bằng nước và dung dịch acid citric nồng độ 0, 1, 2% 37

Hình 2.24: Aûnh hưởng của Lysine (A) và Glycine (B) đến hàm lượng acrylamide ở sản

phẩm chip khoai tây chiên 38

Hình 2.25: Aûnh hưởng của các loại acid amine khác nhau (nồng độ 0.5%) đến lượng acrylamide sinh ra trong hệ thống thí nghiệm với 50 mM glucose và 50 mM asparagine xử lý nhiệt ở 1500C, 20 phút 39

Hình 2.26: Biểu diễn sự ảnh hưởng của dung dịch lysine (A), glysine (B) và cystein (C) lên hàm lượng acrylamide có trong mẫu chiên ở 1800C 40

Hình 3.1: Cơ chế của quá trình tạo imidazo – quinoline và quinoxaline 47

Hình 3.2: Cơ chế hình thành của PhIP và MeIQx 49

Hình 3.3: Cấu trúc của một số các biến dị DNA của IQ và PhIP 50

Hình 3.4: Cơ chế hình thành biến dị DNA của Norharman 51

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn hàm lượng MeIQx, PhIP và dẫn xuất của chúng trong nước tiểu sau bữa ăn 51

Hình 3.6: Các hợp chất PhIP trong thịt và nước tiểu, cơ chế loại bỏ độc tố và phản ứng thuận nghịch của chúng trong môi trường acid 52

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hàm lượng MeIQx và PhIP ở thịt bò bít tếch được chế biến theo ba phương pháp khác nhau ở bốn mức độ (thời gian) khác nhau 54

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hàm lượng MeIQx và PhIP ở thịt bò hamburger được chế biến theo ba phương pháp khác nhau ở bốn mức độ (thời gian) khác nhau 54

Hình 3.9: Hàm lượng MeIQx và PhIP ở thịt heo được chế biến theo ba phương pháp khác nhau ở ba mức độ (thời gian) khác nhau 55

Hình 3.10: Aûnh hưởng của hàm lượng nước đến lượng độc tố sinh ra trong phản ứng giữa hỗn hợp 0.2 M glucose, 0.4 M glycine và 0.4 M creatinine trong dung môi diethyleneglycol – nước ở 1200C trong 2 giờ 56

Hình 3.11: Hàm lượng HAAs sinh ra với các nồng độ glucose khác nhau 56

Hình 3.12: Aûnh hưởng của các loại đường khử khác nhau, glucose (A), fructose (B), lactose (C) và sucrose (D) đến lượng độc tố hình thành trong quá trình chế biến thịt bo ø 57

Hình 3.13: Hàm lượng HAAs sinh ra với các nồng độ creatinine khác nhau 58

Hình 3.14: Hàm lượng HAAs sinh ra với các nồng độ glycinie khác nhau 58

Hình 3.15: Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa/chất kìm hãm đối với các cation tự do pyrazine 60

Hình 3.16: Hàm lượng HAAs tạo thành trong sản phẩm hamburger (thịt bò nạc) chế biến ở 2000C, 20 phút khi có bổ sung chất chống kìm hãm là ascorbate () và erythorbate (^) 60

Hình 3.17: Quá trình trích ly và tinh sạch HAAs bằng phương pháp sử dụng cột với chất mang rắn SPE 61

Hình 3.18: Cấu trúc phân tử của blue cotton 62

Hình 3.19: Hàm lượng creatine còn lại sau các chế độ xử lý nhiệt bằng bị lò vi sóng khác nhau 66

Hình 3.20: Cấu trúc của một số các chất chống oxy hóa 69

Hình 3.21: Aûnh hưởng của các chất chống oxy hóa khác nhau đến hàm lượng MeIQx và tổng lượng HAAs sinh ra trong phản ứng giữa creatine, glycine và glucose 70

Hình 4.1: Cấu trúc ba chiều của một phân tử PAHs 73

Hình 4.2: Cấu trúc mạng tinh thể của một phân tử PAHs 73

Hình 4.3: Cấu trúc phân tử của một số các hợp chất PAHs 75

Hình 4.4: Phân loại các hợp chất PAHs theo thuyết cấu trúc Clar 76

Hình 4.5: Cấu trúc phân tử của liên kết giữa DNA với BaP ở vị trí C8 và N7 của guanine và N7 của adenine 82

Hình 4.6: Cơ chế tạo thành 3,4 – benzopyrene 83

Hình 4.7: Sự tạo thành các hợp chất PAHs có nhiều vòng thơm từ naphthalene 83

Hình 4.8: Hàm lượng BaP sinh ra ở các loại sản phẩm khác nhau 85

Hình 4.9: Hàm lượng PAHs sinh ra ở phương pháp nướng với nhiều loại nhiên liệu khác nhau 86

Hình 4.10: Hàm lượng BaP ở thịt bò hamburger và thịt bò bít tếch theo 3 phương pháp chế biến ở nhiều thời gian nấu khác nhau 87

Hình 4.11: Cấu tạo của thiết bị trích ly gia tốc ASE 300 88

Hình 5.1: Một số cấu trúc phân tử của các hợp chất N-nitrosamine 99

Hình 5.2: Cơ chế biến dưỡng của các hợp chất N – nitroso 100

Hình 5.3: Các phản ứng tạo nitrosamine (M/M+ là kim loại chuyển tiếp như Fe2+/ Fe3+) 102 Hình 5.4: Khả năng giảm lượng NDMA đối với các nồng độ epicatechin monomer và epicatechin dimmer khác nhau 107

Hình 5.5: Công thức cấu tạo của một số hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh 109

Hình 5.6: Đồ thị ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh đến hàm lượng N -pyrrolidine (NPYR) 109

Hình 5.7: Đồ thị ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh đến hàm lượng N – piperidine (NPIP) 110

Hình 5.8: Đồ thị ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh đến hàm lượng N – morpholine (NMOR) 110

Hình 6.1: Cơ chế tạo chloropropanol dưới điều kiện thủy phân bằng acid 115

Hình 6.2: Sơ đồ hình thành monochloropropanol dưới xúc tác của enzym lipase 116

Hình 6.3: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl (16, 67% nước; 2000C) lên sự hình thành 3-MCPD 118

Hình 6.4: Ảnh hưởng của muối đến hàm lượng 3-MCPD trong các loại thực phẩm 119

Hình 6.5: Ảnh hưởng của nước đến hàm lượng 3-MCPD (3,47%NaCl, 2000C) 120

Hình 6.6: Ảnh hưởng của nước lên hàm lượng 3-MCPD trong các thực phẩm khác nhau

120

Hình 6.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng 3-MCPD (3,47%NaCl, 2000C) 121

Hình 6.8: Ảnh hưởng của béo lên hàm lượng 3-MCPD trong các thực phẩm khác nhau

122

Hình 6.9: Hàm lượng 3-MCPD (mg/kg) trong một số nhóm thực phẩm khác nhau 123

Hình 6.10: Aûnh hưởng của thời gian chế biến đến hàm lượng 3 – MCPD 123

Hình 6.11: (a) Phản ứng của 1,3-DCP và (b) 3-MCPD với HFBA 125

Hình 6.12: Phản ứng phân hủy của 3-MCDP 128

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Tính chất của acrylamide ở điều kiện lý tưởng 250C, 100 kPa 3

Bảng 2.2: Độ hòa tan của acrylamide (g/L) trong một số dung môi ở 300C 4

Bảng 2.3: Hàm lượng acrylamide trước và sau thời gian bảo quản 4

Bảng 2.4: Hàm lượng acrylamide ở một số thực phẩm 5

Bảng 2.5: Tỷ lệ lượng tiêu thụ acrylamide bình quân ở các loại thực phẩm khác nhau từ năm 1994 – 1998 5

Bảng 2.6: Hàm lượng acrylamide hình thành ở các hỗn hợp tác nhân khác nhau 9

Bảng 2.7: Hàm lượng acrylamide hình thành trong phản ứng giữa đường khử và các loại acid amine khác nhau 10

Bảng 2.8: Acrylamide được tổng hợp từ L – aspargine với sự có mặt của nhóm carbonyl dưới xúc tác nhiệt (1800C, 5 phút, 20µL nước) 11

Bảng 2.9: Các hệ số của phương trình động học biểu diễn quá trình hình thành acrylamide trong khoai tây chiên ở áp suất khí quyển 12

Bảng 2.10: Các hệ số của phương trình động học biểu diễn quá trình hình thành acrylamide trong khoai tây chiên áp suất chân không (10 Torr) 13

Bảng 2.11: Sự thay đổi của hàm lượng đường khử ở nhiệt độ bảo quản < 80C 15

Bảng 2.12: Hàm lượng acrylamide (ng/g) khi chiên với các loại dầu khác nhau 22

Bảng 2.13: Thành phần các acid béo có trong các loại dầu mỡ thường dùng để chiên khoai tây và chân gà 22

Bảng 2.14: Khả năng ngăn cản của các cation hoá trị 1, 2, 3 lên sự tạo thành base Schiff của aspargine 23

Bảng 2.15: Tóm tắt một số các phương pháp sắc ký dùng trong phân tích hàm lượng acrylamide ở các loại thực phẩm khác nhau 29

Bảng 2.16: Một số các chương trình chạy sắc ký khí kết hợp với phương pháp khối phổ (GC – MS) khi phân tích hàm lượng acrylamide trong các loại thực phẩm khác nhau 32

Bảng 2.17: Một số các chương trình chạy sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phương pháp khối phổ (LC – MS/MS) khi phân tích hàm lượng acrylamide trong các loại thực phẩm khác nhau 35

Bảng 2.18: Ảnh hưởng của dung dịch lysine, glysine và cystein lên hàm lượng acrylamide trong quá trình chế biến bánh snack 40

Bảng 3.1: Tên viết tắt và tên đầy đủ của một số phân tử HAAs phổ biến 43

Bảng 3.2: Hàm lượng Quinolines và Quinoxalines ở các loại thực phẩm khác nhau 46

Bảng 3.3: Tác nhân và điều kiện thí nghiệm của các phản ứng tạo HAAs trong quá trình xử lý nhiệt giữa createine và acid amine có hoặc không có sự tham gia của đường 47

Bảng 3.4: Kết quả thí nghiệm của một số hợp chất HAAs trên chuột 50

Bảng 3.5: Hàm lượng MeIQx và dẫn xuất trong nước tiểu sau bữa ăn 51

Bảng 3.6: Hàm lượng PhIP và dẫn xuất trong nước tiểu sau bữa ăn 52

Bảng 3.7: Aûnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến hàm lượng cation tự do pyrazine và lượng độc tố HAAs nói chung 59

Bảng 3.8: Một số các phương pháp dùng trong phân tích hàm lượng HAAs ở các loại thực phẩm khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp 63

Bảng 3.9: Một số các phương pháp dùng trong phân tích hàm lượng HAAs ở các loại thực phẩm khác nhau bằng phương pháp sắc ký khí hoặc phương pháp mao dẫn điện tử 64

Bạng 3.10: Haøm löôïng HAAs sinh ra trong quaù trình cheâ bieân thòt boø (chieđn ôû 200 hoaịc

2500C) theơ hieôn qua ñoôc tính ñoâi vôùi Salmonella thuoôc gioâng TA98 khi coù vaø khođng coù quaù

trình xöû lyù nhieôt sô boô baỉng thieât bò loø vi soùng 66

Bạng 3.11: Thaønh phaăn hoùa hóc vaø hoát löïc choẫng oxy hoùa trung bình cụa moôt soâ loái maôt ong 67

Bạng 3.12: Aûnh höôûng cụa caùc loái maôt ong khaùc nhau ñeân haøm löôïng HAAs (ng/g) ôû sạn phaơm thòt boø 67

Bạng 3.13: Aûnh höôûng cụa caùc loái nöôùc soât khaùc nhau ñeân haøm löôïng HAAs (ng/g) ôû sạn phaơm thòt boø chieđn 68

Bạng 3.14: Aûnh höôûng cụa hoên hôïp caùc loái nöôùc soât khaùc nhau ñeân haøm löôïng HAAs (ng/ g) ôû sạn phaơm thòt boø chieđn 68

Bạng 3.15: Aûnh höôûng cụa caùc hôïp chaât höõu cô chöùa löu huyønh ñeân haøm löôïng HAAs (ng/ g) sinh ra trong quaù trình cheâ bieân thòt boø 71

Bạng 4.1: Cođng thöùc caâu táo cụa moôt soâ hôïp chaât PAHs 74

Bạng 4.2: Toùm taĩt tính chaât cụa moôt soâ PAHs 76

Bạng 4.3: Haøm löôïng 3,4 – benzpyrene ôû caùc sạn phaơm xođng khoùi 77

Bạng 4.4: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm thòt boø 78

Bạng 4.5: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm thòt gaø vaø thụy sạn 78

Bạng 4.6: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm thòt heo 78

Bạng 4.7: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm töø söõa, chaât beùo 79

Bạng 4.8: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm baùnh mì, snack, nguõ coâc 79

Bạng 4.9: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc sạn phaơm kéo vaø thöùc aín traùng mieông 79

Bạng 4.10: Haøm löôïng BaP ôû nhoùm caùc loái rau, quạ 80

Bạng 4.11: Caùc hôïp chaât PAH coù khạ naíng ạnh höôûng ñeân caâu truùc gene vaø gađy ung thö 81

Bạng 4.12: Aûnh höôûng cụa Benzo[a]pyrene khi thí nghieôm tređn ñoông vaôt ôû nhieău con ñöôøng haâp thu khaùc nhau 82

Bạng 4.13: Haøm löôïng BaP ôû caùc loái thöïc phaơm ñöôïc cheâ bieân baỉng nhieău phöông phaùp khaùc nhau 84

Bạng 4.14: Haøm löôïng PAHs (ng/g) hình thaønh ôû caùc nhieôt ñoô khaùc nhau vôùi caùc loái daău khaùc nhau 87

Bạng 4.15: Toùm taĩt moôt soâ phöông phaùp phađn tích PAHs trong thöïc phaơm 90

Bạng 5.1: Moôt soâ caùc hôïp chaât N – nitroso trong thöïc phaơm 96

Bạng 5.2: Moôt soâ hôïp chaât N – nitrosamine vaø haøm löôïng cao nhaât cụa chuùng trong moôt soâ thöïc phaơm 98

Bạng 5.3: Löôïng tieđu thú haøng ngaøy cụa N – nitrosodimethylamine (NDMA) vaø nguoăn thöïc phaơm chính ôû caùc quoâc gia khaùc nhau 100

Bạng 5.4: Moôt soâ taùc hái cụa caùc hôïp chaât Nitrosamine tređn ñoông vaôt 101

Bạng 5.5: Moôt soâ caùc chöông trình vaø phöông phaùp saĩc kyù duøng trong phađn tích haøm löôïng nitrosoamine trong thöïc phaơm 105

Bạng 5.6: pH, ñoô maịn, thaønh phaăn hoùa hóc trung bình cụa moôt maêu nöôùc soât 108

Bạng 5.7: Haøm löôïng N – nitrosamine (µg/kg) trong maêu sau khi chieâu xá vôùi lieău chieâu xá khaùc nhau 108

Bạng 5.8: Aûnh höôûng cụa nöôùc eùp haønh ñeân haøm löôïng NPYR, NPIP vaø NMOR 111

Bạng 5.9: Aûnh höôûng cụa nöôùc eùp toûi ñeân haøm löôïng NPYR, NPIP vaø NMOR 111

Bạng 6.1: Haøm löôïng 3 – MCPD ôû moôt soâ loái thöïc phaơm 114

Bảng 6.2: Nồng độ tối đa 3-MCPD cho phép trong một kg nước tương của các nước 118 Bảng 6.3: Thành phần hóa học của các loại thực phẩm khác nhau 122 Bảng 6.4: Các ion chỉ thị trong phương pháp quang phổ EI 126 Bảng 6.5: Tóm tắt một số chương trình chạy sắc ký thường được sử dụng trong phân tích 3-MCPD ở nhóm sản phẩm nước chấm đậu nành 126

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

HAAs (heterocyclic aromatic amines): các hợp chất amine có vòng thơm

PAHs (Polycyclic aromatic hydrocarbons): những hợp chất hydrocarbon chứa nhiềuvòng thơm

HPLC (high pressured liquid chromatography): sắc ký lỏng cao áp

GC (gas chromatography): sắc ký khí

3-MCPD: 3-monochloropropane-1,2 diol

LOD (limit of detection): giới hạn phát hiện

LOQ (limit of quantification): giới hạn phân tích

WR (working range of concentrations): khoảng nồng độ phân tích

IS (internal standard): chất nội chuẩn

SPE (solid-phase extraction): Tinh sạch bằng cột với chất mang rắn

LC (liquid chromatography): phương pháp sắc ký lỏng

MS (mass spectrometry): phương pháp khối phổ

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Giới thiệu chung về độc tố:

1.1.1 Khái niệm độc tố:

 Độc tố hay chất độc hoá học trong thực phẩm là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở một nồng độ nhất định gây ngộ độc cho người hay động vật sử dụng chúng

1.1.2 Phân loại con đường độc tố xâm nhập vào thực phẩm:

 Độc tố tồn tại ở nhiều trạng thái khác nhau, được hình thành và lẫn vào thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau Các độc tố được đưa vào thực phẩm bằng những con đường cơ bản sau:

 Độc tố tạo thành trong thực phẩm do vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm gồm vi khuẩn, vi nấm … Trong quá trình nhiễm và phát triển trong thực phẩm, vi sinh vậtcó khả năng chuyển hoá các chất dinh dưỡng có trong thực phẩm và tạo ra độc tố

 Độc tố có sẵn trong nguồn nguyên liệu thực phẩm như các loại thực vật và động vật có chứa chất độc, chúng không bị biến đổi hoặc bị biến đổi rất ít trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

 Độc tố do thực phẩm bị nhiễm hóa chất:

 Do việc sử dụng bừa bãi, không tuân thủ những qui định về sử dụng các chất phụ gia thực phẩm

 Do sử dụng bao bì có chất lượng kém hoặc không phù hợp với loại thực phẩm

 Do nhiễm kim loại nặng: chì, asen, kẽm, thiếc …

 Do dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: thuốc trừ sâu, phân bón, thuốc diệt cỏ,diệt côn trùng …

 Độc tố do thực phẩm bị biến chất, ôi, hỏng:

 Sự biến chất của các acid amine tạo thành các chất gây độc cho cơ thể như: Tryptophane -> Tryptamine, Histidine -> Histamine và các acid hữu cơ, amoniac, indol, scatol, phenol thường gặp ở các thực phẩm giàu protein như thịt cá và các sản phẩm của thịt cá đã chế biến (thịt kho, thịt xào, thịt luộc, thịt băm, chả, pate, lạp xưởng, xúc xích, hay chả cá, cá kho )

 Sự thủy phân và oxy hóa chất béo hình thành nên các sản phẩm glycerin, acid béo tự do, các peroxyt, hydroperoxyt, aldehyd và cetone gây nên mùi ôi khét và vị đắng cho sản phẩm, thường gặp ở các lọai thực phẩm chế biến với dầu mỡ như các món xào, rán như thịt quay, cá rán

 Thông thường các thực phẩm bị biến chất thường giảm giá trị dinh dưỡng và có sự thay đổi về tính chất cảm quan như mùi vị không ngon, thay đổi màusắc nhưng dễ nhận biết được và có thể kiểm soát được

Độc tố hình thành nên trong quá trình chế biến thực phẩm do sự tương tác giữa các tành phần có sẵn trong nguyên liệu với nhau và với các điều kiện của quá trình chế biến Đây là nhóm độc tố rất đa dạng và khó kiểm soát [2]

Trong khuôn khổ luận văn này em chỉ tìm hiểu tổng quan về các nhóm độc tố xuất hiện trong quá trình chế biến thực phẩm mà có khả năng gây độc lâu dài đốivới cơ thể con người và được hình thành do các phản ứng đặc trưng trong quá

trình cheâ bieân nhö caùc nhoùm: acrylamide, HAAs, PAHs, 3-MCPD vaø N –

nitrosamine

1.2 Giôùi thieôu veă ñoôc toâ xuaât hieôn trong quaù trình cheâ bieân:

 Ñoôc toâ xuaât hieôn trong quaù trình cheâ bieân chính laø caùc hôïp chaât hoùa hóc ñöôïc táo ra trong quaù trình cheâ bieân töø nguyeđn lieôu ra ñeân sạn phaơm Raât khoù ñeơ coù theơ döï ñoaùn heât caùc loái hôïp chaât ñöôïc táo ra trong quaù trình cheâ bieân thöïc phaơm vaø coù theơ gađy hái ñeân söùc khoûe ngöôøi tieđu duøng Nhöng cuõng khođng theơ phụ nhaôn raỉng caùc ñoôc toâ xuaât hieôn trong quaù trình cheâ bieân thöïc phaơm khođng toăn tái Ñaõ coù moôt soâ caùc nhoùm ñoôc toâ xuaât hieôn trong quaù trình cheâ bieân thöïc phaơm ñaõ ñöôïc phaùt hieôn cho ñeân nay goăm:

 Acrylamide ñöôïc phaùt hieôn laăn ñaău tieđn vaøo naím 2002, ñöôïc tìm thaây nhieău ôûcaùc sạn phaơm khoai tađy chieđn, nöôùng vaø caùc sạn phaơm nguõ coâc khaùc Acrylamidecoù khạ naíng gay ung thö, gađy toơn hái heô thaăn kinh vaø caùc nguyeđn lieôu di truyeăn khi thí nghieôm tređn ñoông vaôt Tuy nhieđn vaên chöa coù baỉng chöùng roõ raøng töø caùc thí nghieôm dòch teê hóc raỉng acrylamide coù theơ gađy ra nhöõng taùc ñoông naøy ñoâi vôùi con ngöôøi

 Caùc hôïp chaât amine coù voøng thôm (HAAs):

 Caùc hôïp chaât HAAs thöôøng ñöôïc tìm thaây ôû caùc sạn phaơm nöôùng, chieđn giaøu protein nhö caùc caùc loái sạn phaơm thòt, caù vaø cạ caùc loái nöôùc eùp thòt Haău heât caùc phađn töû HAAs sinh ra trong quaù trình cheâ bieân ñeău cho thaây laø coù khạ naíng gađy ung thö tređn ñođng vaôt

 Caùc hôïp chaât hydrocarbon coù nhieău voøng thôm (PAHs):

 PAHs thöôøng toăn tái nhieău trong mođi tröôøng nhö laø sạn phaơm cụa quaù trình ñoât chaùy khođng hoaøn toaøn nhieđn lieôu vaø cuõng ñöôïc táo thaønh trong quaù trình cheâ bieân thöïc phaơm coù lieđn quan ñeân xöû lyù nhieôt vaø xođng khoùi thöïc phaơm (ñaịc bieôt laøcaùc sạn phaơm thòt) Caùc hôïp chaât naøy coù khạ naíng gađy ung thö cho ngöôøi vaø ñoôngvaôt Trong ñoù chaât coù ñoôc toẫ mánh nhaât vaø phoơ bieân nhaât trong thöïc phaơm laø benzo[a]pyrene [BaP] Ngoaøi ra caùc PAHs coøn toăn tái nhieău trong caùc sạn phaơm daău tinh luyeôn vaø caùc daên xuaât cụa daău môõ nhö bô (haøm löôïng BaP khoạng 0.06 mg/kg) do bò nhieêm baơn trong quaù trình saây khođ hát daău baỉng khoùi loø

 Caùc hôïp chaât N – nitrosamine:

 N – nitrosamine ñöôïc hình thaønh ôû caùc sạn phaơm thöïc phaơm maø thaønh phaăn nguyeđn lieôu coù chöùa nitrite/nitrate (ñaịc bieôt laø sạn phaơm thòt, caù coù söû dúng chaât bạo quạn laø caùc muoâi nitrite/nitrate) Ñađy laø nhöõng hôïp chaât ñöôïc cho laø gađy ung thö trong khoạng roông khi thí nghieôm tređn ñoông vaôt, trong ñoù coù ñoôc tính mánh nhaât chính laø hôïp chaât N-nitrosodimethylamine (NDMA)

 Ñađy laø hôïp chaât ñöôïc tìm thaây phoơ bieân ôû caùc sạn phaơm thụy phađn baỉng acid cụa protein thöïc vaôt ñaịc bieôt laø caùc sạn phaơm nöôùc chaâm ñaôu naønh 3-MCPD thuoôc nhoùm chloropropanol laø moôt chaât ñoôc khođng gađy hái ñeân nguyeđn lieôu di truyeăn nhöng lái coù khạ naíng gađy ung thö tređn ñoông vaôt Ngoaøi ra 3-MCPD coøn ñöôïc tìm thaây trong moôt soâ loái nöôùc giại khaùt bò nhieêm trong quaù trình xöû lyù nöôùc

CHƯƠNG 2: ACRYLAMIDE

2.1 Công thức cấu tạo, tính chất:

2.1.1 Công thức cấu tạo:

 Acrylamide thuộc nhóm amide có công thức phân tử là C3H5NO, C=CC(=O)N và có tên theo IUPAC là 2-propenamide [125]

 Công thức cấu tạo [108] và cấu trúc mạng tinh thể của acrylamide thể hiện theo trục a với các liên kết hydro được thể hiện bằng nét đậm [86]:

Hình 2.1: Công thức cấu tạo và cấu trúc mạng tinh thể của acrylamide

 Ngoài ra acrylamide còn có một số tên gọi khác đồng nghĩa như [122]:

 Acrylic acid amide;

Bảng 2.1: Tính chất của acrylamide ở điều kiện lý tưởng 250C, 100 kPa [125]

Khối lượng phân tử 71.08 g/mol

Năng lượng cần cho quátrình polymer hóa

19.8 kcal/mol

Độ hòa tan trong nước 204 g/100 ml (250C)

Bảng 2.2: Độ hòa tan (g/L) trong một số dung môi ở 300C [102] Tên dung môi Độ hòa tan (g/L)

 Phân tử acrylamide tồn tại trong thực phẩm với độ bền rất cao hầu như không đổisau thời gian dài bảo quản

Bảng 2.3: Hàm lượng acrylamide trước và sau thời gian bảo quản [49]

Tên thực phẩm Thời gian bảo

quản (tháng) Hàm lượng acrylamide(µg/kg)

2.2 Nguồn gốc:

 Acrylamide lần đầu tiên được cả thế giới biết đến thông qua báo cáo của một nhà khoa học Thụy Điển vào tháng 4 năm 2002, đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt do nó được phát hiện có một lượng lớn ở các thực phẩm chiên, rán hoặc nướng lò [8]

 Acrylamide thường được tìm thấy với hàm lượng lớn ở các thực phẩm giàu tinh bột như: khoai tây chiên, bánh mì chiên giòn và cũng được tìm thấy ở các loại thực phẩm khác như: các loại thịt rán heo, gà, bò các loại nước sốt, hamburger nhưng với một lượng nhỏ Do đó người ta cho rằng các loại thực phẩm giàu tinh bột chính là nguồn tạo

ra acrylamide chứ không phải là nhóm thực phẩm giàu protein

 Ngoài ra acrylamide cũng được tìm thấy nhiều ở một số loại ngũ cốc và cà phê rang

do đó người ta cũng cho rằng sự tồn tại của acrylamide có mối liên hệ với phản ứng Maillard xảy ra ở các loại thực phẩm này [36]

 Acrylamide cũng được tìm thấy ở hơn 86 sản phẩm của hạt hạnh nhân như hạnh nhânrang, nướng, trong bánh mì Acrylamide ở những thực phẩm chiên hay nướng được tạo

ra do phản ứng giữa asparagine và các đường khử (fructose, glucose …) Một số nghiên cứu khác cho thấy các phản ứng tự nhiên trong môi trường như phản ứng phân hủy của các loại thuốc diệt cỏ cũng là nguồn tạo ra acrylamide [108]

 Acrylamide còn được tạo ra trong suốt quá trình chế biến thực phẩm bằng lò vi sóng nhưng không được tìm thấy ở những thực phẩm nấu bằng hơi nước hay chưa qua nấu nướng Sự rán vàng trong suốt quá trình chiên, nướng hoặc chiên sâu đều tạo ra

acrylamide và thời gian nấu thực phẩm dài sẽ tạo ra lượng lớn acrylamide [125]

Bảng 2.4: Hàm lượng acrylamide ở một số thực phẩm [24]

Loại thực phẩm Hàm lượng acrylamide

(ppb)

Các loại lương thực khác < 30

Các loại snack mặn khác 122 – 416

Kẹo và thực phẩm tráng miệng 20 – 110

Thức uống không cồn khác < 30

Các loại gia vị và nước sốt 38 – 54

Bảng 2.5: Tỷ lệ lượng tiêu thụ acrylamide bình quân ở các loại thực phẩm khác nhau từ

năm 1994 – 1998 [27]Thực phẩm Lượng

dân sốsửdụng(%)

Lượng thựcphẩm tiêuthụ(g/kg/ngày)

Nồng độacrylamide(µg/kg thựcphẩm )

Lượngacrylamidengười sử dụngtiêu thụ(µg/kg/ngày)

Lượngacrylamidetiêu thụtrung bình(µg/kg/ngày)

Thực phẩm rang,

rô ti

2.3 Tác hại:

 Khi tiến hành thí nghiệm cho động vật tiêu thụ acrylamide liều lượng lớn, trong thời gian dài thì acrylamide có thể gây hại đến hệ thần kinh, làm giảm khả năng sinh sản, tổn hại các nguyên liệu di truyền và tăng nguy cơ gây ung thư các bộ phận như: tuyến giáp, miệng, ung thư vú ở phụ nữ và tinh hoàn ở nam giới [125] Bởi vì acrylamide gây ung thư ở động vật với liều lượng lớn nên nó được tổ chức IARC (International Agency for Research on Cancer) xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư tiềm ẩn ở người [64] Theo ước tính của tổ chức WHO nguy cơ ung thư đối với người tiêu thụ 1.0µgacrylamide/kg thể trọng/ngày là 1/1000, theo Đại học Stockholm là 10/1000 Và trong nửa gram chip khoai tây hoặc trong hai gram khoai tây chiên có thể chứa 1.0 µg

acrylamide, do đó những người thường xuyên ăn những thực phẩm này có thể tiêu thụ đến 35 – 40 µg acrylamide/ngày [54]

 Cơ chế loại bỏ acrylamide của hệ thần kinh của con người và đôïng vật diễn ra theo

sơ đồ sau [49]:

Hình 2.2: Phản ứng chuyển hoá của acrylamide (1) thành glycidamide (2) bởi cytochromeP450 và thioether (3), (4a), (4b)

 Đầu tiên khi vào cơ thể người acrylamide sẽ bị chuyển hóa thành epoxide

glycidamine (2) nhờ enzyme P450 cytochrome monooxygenase CYP 2E1, sau đó

epoxide glycidamine (2) sẽ kết hợp với glutathione (R – SH) tạo thành các thioether tan

trong nước (4a), (4b) thông qua phản ứng Michael Từ acrylamide cũng trực tiếp tạo

thành thioether (3) khi kết hợp với glutathione qua phản ứng Michael [49]

 Acrylamide và các sản phẩm trao đổi chất của nó đặc biệt là glycidamine có thể gâyđộc và gây ung thư khi thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên cơ thể sống ở liều lượng lớn Khi nghiên cứu trên tế bào acrylamide và glycidamine có ảnh hưởng lớn đến quá trình phân chia các nhiễm sắc thể và tỉ lệ đột biến cụ thể là làm biến đổi các base Nitơ A thành G, G thành C và G thành T Ngoài ra acrylamide và glycidamine còn có thể liên kết với các protein và chuỗi ADN làm thay đổi thông tin di truyền và liên kết với phân tử hemoglobin, làm giảm khả năng vận chuyển oxy đến tế bào Và giữa

acrylamide và glycidamine thì glycidamine có hoạt tính cao gấp 100 – 1000 lần so với acrylamide [49] Theo khuyến cáo của tổ chức FAO và WHO lượng acrylamide trung bình mỗi ngày (ADI – average daily food intake) cho dân tộc trên toàn thế giới là từ 0.3 – 0.8 µg/kg thể trọng/ngày Theo nhiều nghiên cứu ở chuột thì mức tiêu thụ acrylamide mà không gây nên bất kỳ tổn thương nào (NOEAL – no observed adverse effect) là 0.2µg/kg thể trọng/ngày [27]

 Tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có một bằng chứng nào rõ ràng về tác động của acrylamide có thể gây ung thư ở người hoặc có thể tác động xấu đến hệ thần kinh khi tiêu thụ acrylamide ở liều lượng thấp hơn liều lượng nghiên cứu [64] Và chỉ có

acrylamide tồn tại ở dạng monomer mới gây độc đến con người còn các các polymer củaacrylamide được xem là không gây độc [122]

2.4 Cơ chế hình thành acrylamide:

Maillard Gồm các phản ứng sau:

 Sự đóng vòng nội phân tử của các base Schiff tạo thành oxazolidin-5-one và

CO2, sự giải phóng các hợp chất beta-elimination các hợp chất Amadori đã bị decarboxyl hóa tạo hoặc sự tạo sản phẩm deamine của 3- aminopropionamide tạo thành acrylamide

 Methionine (hoặc các acid amine khác) trở nên linh động sau quá trình decarboxyl hóa và deamine hóa tạo thành methional, có khả năng phản ứng như aldehyde với asparagine tạo thành acrylamide

3 Sự oxy hóa chất béo khi có mặt các sản phẩm phân hủy nhiệt của các acidamine tự do (NH3) Gồm các phản ứng sau:

 Acrolein (từ triolein) + NH3/Asparagine  Acrylamide hay Acrylic acid +

NH3  Acrylamide (NH3 từ phản ứng phân hủy nhiệt của các acid amine) phản ứng này chỉ có hiệu suất bằng 5% so với hiệu suấtcủa Asparagine [80]

 Các phản ứng minh họa các cơ chế phản ứng trên được cho ở hình sau [49]:

Hình 2.3: Các phản ứng minh họa các cơ chế tạo acrylamide (1) theo phản ứng Maillard

(A) và oxy hoá chất béo (B) với asparagine (5), base Schiff (7), oxopropanamide (8), aminopropionamide (9), chất béo (12), acrolein (11) và acid acrylic (10) Sự chuyển hoá(5) -> (8), (7) -> (1) và (12) -> (11) là kết quả của nhiều phản ứng trung gian

3-(B) Phản ứng oxy hóa chất béo

(A) Phản ứng Maillard

Đường

khử

P.ư Maillard P.ư Strecker

 Theo nhiều nghiên cứu thì trong các cơ chế trên, cơ chế tạo acrylamide giữa Asparagine với đường khử thông qua phản ứng Maillard (A) là con đường chính tạo acrylamide [49]:

 Cơ chế này gồm một chuỗi các phản ứng khác nhau được minh họa ở hình bên dưới [8]:

Hình 2.4: Quá trình tạo thành acrylamide từ Asparagine với đường khử (α – hydroxy –

carbonyls, R – là gốc hydrocarbon) I - Sự tạo thành hợp chất Amadori, II – Quá trìnhdecarboxyl hóa, III – Quá trình tautomerize hóa, IV – Quá trình deamine hóa

 Bước quan trọng nhất trong chuỗi phản ứng tạo acrylamide là sự tạo thành các base Schiff và các hợp chất N- glycosyl Khi có mặt nước thì base Schiff sẽ bị thủy phân tạo thành các tác nhân của phản ứng tạo acrylamide (con đường II) hoặc tham gia phản ứng đồng phân hóa để tạo thành hợp chất Amadori (con đường I), đây là hợp chất trung gian của chuỗi các phản ứng Maillard dẫn đến sự tạo thành 1- và 3 – deoxyosones, cuối cùng là phản ứng phân hủy các hợp chất này tạo ra màu sắc và

hương vị đặc trưng cho sản phẩm Do đó mà hiệu suất của phản ứng tạo acrylamide từ Asparagine với đường khử là rất thấp, thông thường là dưới 1% mol.

 Thông qua con đường II từ base Schiff qua một trong ba phản ứng sẽ tạo thành hợp chất azomethine ylide, đây là hợp chất rất quan trọng tạo ra acrylamide thông qua nhiều cách: trực tiếp từ hợp chất azomethine ylide, gián tiếp từ hợp chất β – emulation (hợp chất trung gian của phản ứng Maillard) hoặc sản phẩm deamine của 3- aminopropionamide (được tạo thành từ hợp chất azomethine ylide) [8]

 Theo nghiên cứu thì cả asparagine và đường khử đều có vai trò đặc biệt quan trọng trong phản ứng tạo acrylamide, được chứng minh qua thí nghiệm sau:

Trong cùng một điều kiện chế biến, hỗn hợp chỉ gồm tinh bột khoai tây và nước, hay tinh bột khoai tây, nước và đường khử tạo ra lượng acrylamide không đáng kể (<50 ppb), khi thêm asparagine vào hỗn hợp tinh bột khoai tây và nước thì một lượngnhỏ acrylamide được xác định (117 ppb) Khi thêm cả asparagine và đường khử vào hỗn hợp tinh bột khoai tây và nước thì đã tạo ra một lượng lớn acrylamide (9270 ppb) Từ đó cho thấy cả asparagine và đường khử đều là tác nhân không thể thiếu trong phản ứng tạo acrylamide trong thực phẩm [24]

Bảng 2.6: Hàm lượng acrylamide hình thành ở các hỗn hợp tác nhân khác nhau [24]

Hỗn hợp tác nhân Hàm lượng acrylamide (ppb)

Tinh bột khoai tây + nước + asparagine+ dextrose 9270

2.4.2 Vai trò của Asparagine trong phản ứng tạo Acrylamide:

 Bằng phương pháp đánh dấu phân tử, ta xác định được rằng chính Asparagine là phân tử cung cấp nên bộ khung của phân tử acrylamide (cung cấp cả nguồn carbon và nitơ) thông qua phản ứng Maillard được tóm tắt ở hình vẽ sau [49]:

Hình 2.5: Kết quả tóm tắt của phương pháp đánh dấu phân tử

2.4.3 Vai trò của tinh bột:

 Mặc dù acrylamide được tạo thành trong quá trình chế biến những sản phẩm giàutinh bột, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có một bằng chứng rõ ràng về mối liên hệ

giữa hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu và hàm lượng acrylamide tạo thành Người ta chỉ nhận thấy rằng các sản phẩm có hàm lượng acrylamide cao (do chứa nhiều asparagine và đường khử) thì có hàm lượng tinh bột cao, do đó rút ra kết luận là acrylamide thường được tạo thành ở các sản phẩm giàu tinh bột [35].

2.4.4 Một số nguồn acid amine khác:

 Khi ta bổ sung vào hệ thống gồm tinh bột khoai tây, nước và thêm vào nhiều tác nhân là các acid amine tự do khác nhau với cùng một loại đường khử, cùng một điều kiện chế biến và sau đó phân tích hàm lượng acrylamide tạo ra đối với các loại acid amine khác nhau ta thu được kết quả như sau:

Bảng 2.7: Hàm lượng acrylamide hình thành trong phản ứng giữa đường khử và các loại

acid amine khác nhauTên acid amine Hàm lượng acrylamide (ppb)

 Ởû các sản phẩm khoai tây chiên, rán tạo ra nhiều acrylamide là do trong khoai tây có chứa hơn 50% lượng acid amine tự do và hơn một nửa lượng acid amine tự do đó là asparagine [24]

2.4.5 Một số nguồn carbon khác:

 Ngoài một số đường khử quen thuộc như glucose và fructose thì cũng có nhiều nguồn carbon khác cũng tham gia vào phản ứng tạo acrylamide Các nguồn carbon này được cho ở bảng sau:

Bảng 2.8: Acrylamide được tổng hợp từ L – aspargine với sự có mặt của nhóm carbonyl

dưới xúc tác nhiệt (1800C, 5 phút, 20µL nước) Nguồn carbon Acrylamide (mmol/mol aspargine)

Hình 2.6: Sự tạo thành của acrylamide (1), 3 – aminopropanamide (9) và aldehyde 3 –

oxopropanamide (8) từ asparagine với sự tham gia của nhóm α – carbonyl từ azomethineylide (22) và các hợp chất imines (23), (24)

 Trong nhóm các phân tử α – hydroxycarbonyls thì fructose có khả năng tạo ramột lượng lớn acrylamide gấp hai lần so với glucose và gấp mười lăm lần lactose

trong cùng một điều kiện phản ứng Điều này là do hợp chất azomethine ylide củafructose có độ bền cao hơn do có nhóm hydroxymethyl ở vị trí α so với phân tử Nitơ(thông qua sáu liên kết vòng Hydro) do đó ngăn cản phản ứng tự chuyển đồøng phânhóa để tạo ra hợp chất Amadori decarboxyl (con đường III) Ngoài ra có một nguyênnhân khác là do fructose có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn do đó có thể ảnh hưởng đếnnhiệt độ và khả năng truyền nhiệt của hỗn hợp [112].

2.4.6 Động học của phản ứng tạo acrylamide trong quá trình chiên, rán các sản phẩm ở điều kiện áp suất khí quyển:

 Động học của phản ứng tạo acrylamide ở các sản phẩm chiên, rán dưới điều kiệnáp suất khí quyển được thiết lập dựa vào mô hình lũy thừa, có thể biểu diễn kháchính xác rằng lượng acrylamide theo thời gian gần như tăng theo hàm số mũ vàcũng có lúc đạt giá trị hằng số cao nhất (hằng số cân bằng):

Trong đó:

C: hàm lượng acrylamide theo thời gian (ppb)

t: thời gian phản ứng, chế biến (s)

A0: hàm lượng acrylamide trước quá trình chế biến (A0=0 ppb)k: hằng số tốc độ (1/s)

A: hằng số chỉ hàm lượng acrylamide ở trạng thái cân bằng (ppb)

t0: hằng số thời gian mà tại đó hàm lượng acrylamide bằng một nửa sovới giá trị cân bằng A (s)

Bảng 2.9: Các hệ số phương trình động học biểu diễn quá trình hình thành acrylamide

trong khoai tây chiên ở áp suất khí quyển [12]

k của phản ứng cũng tăng do nhiệt độ cao làm tăng tốc quá trình tạo acrylamide Từđó có thể rút ra kết luận là nhiệt độ càng tăng thì hàm lượng acrylamide cũng càngtăng

 Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của giá trị hằng số tốc độ k của phản ứng được biểudiễn qua phương trình Arrhenius:

A: hệ số nhân (A = 14.9)

Ea: năng lượng hoạt hóa của phản ứng (Ea = 21,830.9J/mol)

T: nhiệt độ tuyệt đối (K)

R: hằng số khí lý tưởng (R = 8.314 J/mol.K)

 Thay các giá trị đã biết vào phương trình ta có sự thuộc của k theo nhiệt độ đượcbiểu diễn như sau:

 Cuối cùng hàm lượng acrylamide trong suốt quá trình chiên rán ở điều kiện ápsuất khí quyển được biểu diễn bằng phương trình sau:

2.4.7 Động học của phản ứng tạo acrylamide trong quá trình chiên rán các sản phẩm ở điều kiện áp suất chân không:

 Ở điều kiện áp suất chân không sự ảnh hưởng của thời gian đến sự tạo thànhacrylamide được biểu diễn theo phương trình động học bậc 1 sau:

Trong đó:

C: hàm lượng acrylamide theo thời gian (ppb)

t: thời gian phản ứng, chế biến (s)

C0: hàm lượng acrylamide ban đầu (ppb)

k: hằng số tốc độ (1/s)

 Thông qua phương pháp hồi quy không tuyến tính ta biết sự phụ thuộc vào nhiệtđộ của các hệ số trong phương trình động học trên [12]:

Bảng 2.10: Các hệ số phương trình động học biểu diễn quá trình hình thành acrylamide

trong khoai tây chiên ở áp suất chân không (10 Torr)

Với:

A: hệ số lũy thừa (A = 505498)

Ea: năng lượng hoạt hóa của phản ứng (Ea = 61,059.2J/mol)

T: nhiệt độ tuyệt đối (K)

R: hằng số khí lý tưởng (R = 8.314 J/mol.K)

 Thay các giá trị đã biết vào phương trình ta có sự thuộc của k theo nhiệt độ đượcbiểu diễn như sau:

 Cuối cùng hàm lượng acrylamide trong suốt quá trình chiên rán ở điều kiện ápsuất chân không (10 Torr) được biểu diễn bằng phương trình sau:

 Như vậy động học của phản ứng tạo acrylamide ở điều kiện áp suất khí quyển vàchân không là rất khác nhau Suốt quá trình chiên rán ở áp suất khí quyển hàm lượngacrylamide tăng dần theo thời gian và có thể đạt cực đại ở giá trị hằng số cân bằng.Nhưng ở điều kiện áp suất chân không thì hàm lượng acrylamide tăng dần theo quytắc lũy thừa ở mọi thời gian chế biến Sự khác nhau có thể giải thích là do ở điềukiện áp suất chân không thì nhiệt độ sôi của dầu giảm, do đó tốc độ phân hủy củaacrylamide là rất chậm nên hàm lượng acrylamide tăng theo quy tắc lũy thừa ởkhoảng thời gian rất dài hơn so với ở điều kiện áp suất khí quyển

 Ngoài ra năng lượng hoạt hóa của phản ứng (Ea) ở điều kiện áp suất khí quyểnvà chân không là rất khác nhau (21,830.9 và 61,059.2 J/mol), mà năng lượng hoạthóa càng cao thì chứng tỏ nhiệt độ có ảnh hưởng càng lớn đến sự tạo thànhacrylamide Do đó có thể thấy khi nhiệt độ tăng từ 165 đến 1800C (áp suất khíquyển) thì hằng số tốc độ k chỉ tăng 6%, còn khi tăng nhiệt độ từ 125 đến 1400C (ápsuất chân không) thì hằng số tốc độ k tăng khoảng 86% Điều này được giải thích là

do ở nhiệt độ càng cao thì tốc độ phân hủy của acrylamide cao, do đó làm giảm dầnảnh hưởng của thời gian đến sự tạo thành acrylamide [12]

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng:

 Những yếu tố không thuộc bản chất bên trong nguyên liệu: quá trình xử lý nông nghiệp, loại đất trồng, điều kiện chăm sóc, bảo quản

 Những yếu tố thuộc bản chất bên trong nguyên liệu: thành phần hóa học của nguyênliệu đặc biệt là hàm lượng acid amine (asparagine) và đường khử

 Các thông số công nghệ của quá trình chế biến: nhiệt độ, thời gian, độ ẩm, áp suất,

pH [35]

2.5.1 Những yếu tố không thuộc bản chất bên trong nguyên liệu :

 Aûnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản nguyên liệu đến hàm lượngacrylamide trong sản phẩm khoai tây chiên: Hàm lượng acrylamide ở nguyên liệukhoai tây được bảo quản ở 40C thì cao hơn nguyên liệu khoai tây được bảo quản ở

80C do ở nhiệt độ 40C thì hàm lượng đường khử (đặc biệt là fructose) cao hơn ở 80C

Và hàm lượng acrylamide càng tăng tỷ lệ với thời gian bảo quản, thời gian bảo quảncàng dài thì hàm lượng đường khử (glucose và fructose) trong nguyên liệu càng tăng

do đó lượng acrylamide sinh ra cũng càng tăng

Bảng 2.11: Sự thay đổi của hàm lượng đường khử ở nhiệt độ bảo quản < 80C [28]

Thời gian bảoquản (ngày) (so với nguyên liệu sau thu hoạch)Hệ số tăng hàm lượng đường khử

 Thời gian thu hoạch ngũ cốc và khoai tây cũng có ảnh hưởng đáng kể đến hàmlượng các tác nhân tham gia vào phản ứng tạo acrylamide Khoai tây cùng mộtgiống, cùng một điều kiện gieo trồng nếu được thu hoạch ở thời kỳ trưởng thành cóthể giảm đáng kể hàm lượng đường khử do đó giảm hàm lượng acrylamide trong quátrình chế biến [58]

2.5.2 Những yếu tố thuộc bản chất bên trong nguyên liệu [13]:

 Hàm lượng acrylamide sinh ra phụ thuộc rất nhiều vào thành phần hóa học củanguyên liệu đặc biệt là hàm lượng acid amine (Asparagine) và đường khử Hình vẽsau biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ asparagine và glucose (%) đến hàm lượngacrylamide (ppm):

Hình 2.7: Ảnh hưởng của nồng độ asparagine và glucose lên sự hình thành acrylamide ở

sản phẩm khoai tây chiên ở 1650C trong 4 phút

 Ta thấy rằng khi nồng độ asparagine và glucose (%) càng tăng thì hàm lượngacrylamide (ppm) cũng càng tăng Ở cùng nồng độ cố định asparagine trung bình(0.167%) và cao (0.271%) thì lượng acrylamide tăng tương ứng gấp 39 lần và 70 lầnkhi tăng lượng glucose, nhưng ở cùng nồng độ glucose trung bình (0.233%) và cao(0.425%) thì lượng acrylamide tăng tương ứng gấp 60 lần và 100 lần khi tăng nồngđộ asparagine Do đó ta có thể rút ra kết luận là asparagine có ảnh hưởng lớn hơnglucose đến sự tạo thành acrylamide

2.5.3 Các thông số công nghệ của quá trình chế biến:

a) Kích thước của nguyên liệu hay tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích nguyên liệu (S/V):

 Theo nhiều nghiên cứu thì khi tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích nguyên liệu (S/V) nhỏ thì hàm lượng acrylamide tạo ra trong quá trình chế biến tăng dần khi tăng nhiệt độ, ví dụ như hàm lượng acrylamide ở miếng khoai tây chiên hình tròn có đường kính 30 mm, chiều cao 15 mm ở nhiệt độ 1800C là 2,000 ppb và ở

2000C là 2,500 ppb sau thời gian 10 giây

 Khi tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích nguyên liệu (S/V) lớn thì hàm lượngacrylamide tạo ra trong quá trình chế biến thường đạt giá trị cực đại ở nhiệt độ chế biến là 160 – 1800C, ví dụ như hàm lượng acrylamide ở miếng khoai tây chiên hình tròn có đường kính 30 mm, chiều cao 3 mm ở nhiệt độ 1800C là 12,000ppb và ở 2000C là 8,000 ppb sau 7 phút [12]

b) Nhiệt độ và thời gian:

 Khi nhiệt độ và thời gian càng tăng thì hàm lượng acrylamide tạo ra càng nhiều, có thể thấy rõ qua hình vẽ sau :

Hình 2.8: Aûnh hưởng của thời gian và nhiệt độ dầu chiên đến hàm lượng acrylamide trong

khoai tây chiên dưới điều kiện áp suất thường (330 giây ở 1500C, 300 giây ở 1650C và 230giây ở 1800C)

 Ở thời gian đầu của quá trình chiên hàm lượng acrylamide tăng nhanh và sau đó đạt đến cực đại và hầu như không đổi Điều này có thể giải thích là do ở thời gian đầu acrylamide chỉ được tạo thành mà không bị phân hủy nhưng sau một khoảng thời gian acrylamide được sinh ra cũng bị đồng thời bị phân hủy, và khi tốc độ phân hủy acrylamide bằng với tốc độ sinh ra thì hàm lượng acrylamide đạtcân bằng và không thay đổi Ở nhiệt độ phản ứng càng cao thì sự phân hủy acrylamide diễn ra càng nhanh và hàm lượng acrylamide đạt cực đại cũng càng nhanh (140 giây ở nhiệt độ 1800C, 240 giây ở nhiệt độ 1650C, 300 giây ở nhiệt độ

1500C)

 Khi chiên khoai tây ở cùng một điều kiện hàm ẩm (1.5% ± 0.3%), hàm lượng acrylamide giảm 19% khi nhiệt độ quá trình giảm từ 180 xuống 1650C, giảm 54%khi nhiệt độ quá trình giảm từ 165 xuống 1500C, giảm 62% khi nhiệt độ quá trình giảm từ 180 xuống 1500C

 Ở điều kiện áp suất chân không sự phụ thuộc của hàm lượng acrylamide ở sản phẩm khoai tây chiên vào nhiệt độ và thời gian phản ứng được minh họa qua hình vẽ sau:

Hình 2.9: Ảnh hưởng của thời gian chiên và nhiệt độ lên hàm lượng acrylamide có trong

khoai tây chiên ở áp suất chân không (10 Torr)

 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hàm lượng acrylamide hình thành ở sản phẩm chiên ở điều kiện áp suất chân không còn rõ rệt hơn rất nhiều so với chiên

ở điều kiện áp suất khí quyển Ở nhiệt độ 1180C, hàm lượng acrylamide tăng từ không phát hiện đến nồng độ 48 ± 1 ppb trong suốt 600 giây của quá trình chế biến, ở nhiệt độ 1250C, hàm lượng acrylamide tăng từ 6 ± 1 ppb đến nồng độ 111

± 18 ppb, khi nhiệt độ tăng lên 1400C, hàm lượng acrylamide tăng từ 8 ± 1 ppb đến nồng độ 524 ± 26 ppb trong vòng 480 giây

 Như vậy khi nhiệt độ của phản ứng giảm từ 1400C xuống 1250C hay 1180C thìhàm lượng acrylamide tạo thành giảm đi hơn 95%, còn khi giảm nhiệt độ từ

1250C xuống 1180C thì hàm lượng acrylamide tạo thành chỉ giảm đi 17% Từ đó

ta có thể rút ra kết luận là nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng

acrylamide tạo thành ở áp suất chân không, lượng acrylamide tạo thành tăng theoquy tắc lũy thừa khi tăng dần nhiệt độ và sự tăng này diễn ra ở mọi thời gian của quá trình chế biến Điều này có thể giải thích do ở điều kiện áp suất chân không thì nhiệt độ sôi của dầu giảm, do đó tốc độ phân hủy của acrylamide là rất chậm nên hàm lượng acrylamide tăng theo quy tắc lũy thừa ở khoảng thời gian rất dài hơn so với ở điều kiện áp suất khí quyển [12]

 Và giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian thì nhiệt độ có ảnh hưởng lớn hơn đến hàm lượng acrylamide do tỉ lệ acrylamide tăng khi tăng nhiệt độ thì cao hơn rất nhiều so với khi tăng thời gian có thể thấy rõ qua hình vẽ sau [44]:

Hình 2.10: Hàm lượng acrlamide ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau

c) Áp suất và phương pháp chế biến:

 Áp suất có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của sản phẩm và đến hàm lượng acrylamide tạo thành do ảnh hưởng đến nhiệt độ sôi của dầu cũng là nhiệt độ củaquá trình phản ứng Nghiên cứu cho thấy sản phẩm được chiên ở áp suất chân không (1180C, 10 Torr) có chất lượng cao hơn so với sản phẩm được chiên ở áp suất khí quyển (1650C) về màu sắc, hàm lượng dầu sót… và cũng chứa hàm lượngacrylamide bé hơn đến 94% (48 ± 1 ppb so với 847 ± 80 ppb) ở cùng một điều kiện hàm ẩm (1.5% ± 0.3%) [12]

Hình 2.11: Ảnh hưởng của phương pháp chiên và thời gian chiên đến hàm lượng của

acrylamide trong khoai tây chiên

d) Độ ẩm:

 Đến nay vẫn chưa có nghiên cứu rõ ràng về vai trò của nước đối với quá trìnhtạo acrylamide nhưng có nhiều giả thiết cho rằng hàm lượng nước có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng cũng như khả năng di động của các phần tử trong hỗn hợp Nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng nước ban đầu trong nguyên liệu quả hạnh đào đến hàm lượng acrylamide tạo thành trong quá trình rang hạnh đào (ở

1650C, 12.5 phút) được biểu diễn qua đồ thị sau:

Hình 2.12: Mối tương quan giữa hàm lượng acrylamide và hàm ẩm ban đầu của nguyên

liệu (ở hai sản phẩm khác nhau) (165 0C)

 Từ đồ thị trên ta rút ra kết luận là nguyên liệu có hàm ẩm ban đầu càng lớn thì hàm lượng acrylamide tạo ra trong quá trình chế biến càng nhỏ Nhiều nghiêncứu khác cũng cho thấy khi tăng hàm ẩm lên từ 1 – 2% có khả năng giảm đáng kể hàm lượng acrylamide tạo ra trong sản phẩm khoai tây chiên và các sản phẩm

rang, nướng từ khoai tây và lúa mì Điều này có thể được giải thích là do khi nguyên liệu ban đầu có hàm ẩm cao thì có thể duy trì nhiệt độ của sản phẩm ở nhiệt độ thấp thời gian lâu hơn do nhiệt được cung cấp cho quá trình bay hơi nước

ở đầu giai đoạn chế biến, do đó hàm lượng acrylamide tạo ra thấp hơn [44]

e) pH:

 Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acrylamide sinh ra ta thêm acid citric, một acid hữu cơ được xem là an toàn đối với thực phẩm, vào nguyên liệu trước quá trình chế biến đối với các sản phẩm chiên và rán từ bắp ngô và khoai tây

 Phương pháp tiến hành: ngâm nguyên liệu vào trong dung dịch chứa acid citric với các nồng độ xác định trong 1 giờ trước quá trình chiên, rán Để tiến hành đo pH của nguyên liệu sau khi ngâm acid citric ta đem nguyên liệu đi nghiền mịn, đem ép lấy nước cốt rồi đo giá trị pH của dung dịch

 Ở sản phẩm chip từ bắp ngô chiên (1210C, 30 phút): pH của nguyên liệu không được xử lý bằng acid và được xử lý với acid citric nồng độ 0.1% và 0.2% lần lượt là: 5.7, 4.5 và 4.2 Như vậy thêm 0.1% và 0.2% acid citric có thể giảm 1.2 và 1.5 đơn vị pH của nguyên liệu Hàm lượng acrylamide trong các mẫu sản phẩm sau quá trình chiên là: 124.8 ± 17.0 µg acrylamide/kg ở nguyên liệu không được xử lý bằng acid citric, 62.8 ±7.4 và 22.2 ±6.0 µg acrylamide/kg ở nguyên liệu được xử lý với dung dịch acid citric nồng độ 0.1% và 0.2% Vậy giảm pH củanguyên liệu 1.2 và 1.5 đơn vị có thể giảm 49.7 và 82.2% hàm lượng acrylamide tạo thành sau quá trình chế biến mà vẫn không làm thay đổi hương vị của sản phẩm ngoại trừ sản phẩm được xử lý với acid citric nồng độ 0.2% có màu hơi nhạt hơn so với các sản phẩm khác Kết quả thí nghiệm được minh họa bằng hìnhvẽ sau:

Hình 2.13: Hàm lượng acrylamide tạo thành trong quá trình chiên với nguyên liệu được xử

lý bằng dung dịch acid citric nồng độ 0.1, 0.2% và không xử lý (0)

 Ở sản phẩm chip từ bắp ngô nướng (2550C, 100 giây): nguyên liệu được xử lývới acid citric nồng độ 0.1% và 0.2% trước quá trình nướng có thể giảm 58.2 và 72.8% hàm lượng acrylamide tạo thành sau quá trình chế biến

Hình 2.14: Hàm lượng acrylamide trong khoai tây chiên sau khi ngâm trong nước và dung

dịch acid citric nồng độ 1, 2% hoặc không xử lý (0)

 Tiến hành thí nghiệm với phản ứng tạo acrylamide từ glucose và asparagine được chỉnh pH bằng hệ đệm phosphate, ở 1500C và 30 phút ta thu được kết quả như sau:

Hình 2.15: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành acrylamide với sự có mặt của asparagine

(0.5 mmol) và glucose (0.5 mmol) trong 1 mL phosphate trong suốt quá trình gia nhiệt ở

1500C trong 30 phút

 Từ đồ thị trên cho thấy ở pH 7.0 và 8.0 không có sự khác biệt náo đáng kể vềhàm lượng acrylamide sinh ra sau quá trình phản ứng Nhưng khi pH giảm từ 7.0xuống 6.0 thì lượng acrylamide giảm đến 73.3% và khi pH giảm từ 7.0 xuống còn4.0 thì lượng acrylamide giảm đến 99.1% Như vậy khi pH của nguyên liệu cànggiảm thì lượng acrylamide tạo ra càng giảm và sự giảm này chỉ diễn ra rõ ràngkhi pH≤ 6.0 Aûnh hưởng của pH đến lượng acrylamide tạo ra là do ở pH thấp thìtrung tâm hạt nhân khuyết điện tử tự do của nhóm amine trong phân tửAsparagine (_NH2) bị chuyển đổi thành amine mang điện tích dương (_NH3+)thay vì tạo thành base Schiff thông qua việc chuyển hạt nhân của nhóm α- amine

sang vị trí nối đôi carbonyl (C=C) của phân tử đường khử để tạo thành phân tửacrylamide do đó làm ngừng phản ứng tạo acrylamide trong thực phẩm [76].

f) Phẩm chất dầu và loại dầu sử dụng:

 Aûnh hưởng của loại dầu sử dụng đối với hàm lượng acrylamide tạo thành sauquá trình chiên (trong cùng một điều kiện chế biến) ở sản phẩm đùi gà chiên vàkhoai tây chiên được cho ở bảng sau:

Bảng 2.12: Hàm lượng acrylamide (ng/g) khi chiên với các loại dầu khác nhau

 Nguyên nhân là do ở dầu nành hàm lượng acid béo không no cao hơn so vớidầu cọ và mỡ lợn, đặc biệt là acid oleic và linoleic (22.5 và 54.3%) Trong quátrình xử lý nhiệt các triglyceride có thể bị thủy phân tạo thành các acid béo tự do,trong đó có lượng lớn các acid oleic và linoleic, các acid này bị oxy hóa tạo thànhcác hydroperoxides và sau đó tạo thành octanal và hexanal, cuối cùng các hợpchất này tác dụng với asparagine tạo thành acrylamide (cơ chế tạo acrylamidethông qua quá trình oxy hóa các hợp chất béo) Thành phần acid béo của dầu cọ,dầu nành và mỡ lợn được cho ở bảng sau [117]:

Bảng 2.13: Thành phần các acid béo có trong các loại dầu mỡ thường dùng để chiên khoai

tây và chân gàCác

acid

(12:0)

Myristicacid(14: 0)

Palmiticacid(16: 0)

Stearicacid(18:0)

Palmitoleicacid(16: 1)

Oleicacid(18:1)

Linoleicacid(18: 2)

Linolenicacid(18: 3)

g) Các cation kim loại:

 Theo nhiều nghiên cứu thì sự có mặt của các cation kim loại có ảnh hưởnglớn đến hàm lượng acrylamide được tạo thành Khi tiến hành thí nghiệm với phảnứng tạo acrylamide từ glucose và asparagine ở 1500C trong 20 phút thì ảnh hưởngcủa các cation kim loại khác nhau đến hàm lượng acrylamide thu được như sau:

Hình 2.16: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng acrylamide sau khi gia

nhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20 phút

 Từ đồ thị trên ta thấy rằng các cation kim loại (ngoại trừ Na+) có tác dụnglàm giảm hàm lượng acrylamide khi nồng độ kim loại càng tăng Tác dụng nàycàng rõ rệt đối với kim loại có hóa trị càng cao: Fe3+có thể giảm đến 97% lượngacrylamide Riêng đối vời Na+ chỉ có tác dụng giảm 59% khi nồng độ cation Na+

tăng từ 0 đến 5 µmoles, khi tăng nồng độ Na+ hơn nữa thì lại làm tăng hàm lượngacrylamide

 Aûnh hưởng của các cation kim loại đến sự tạo thành acrylamide là do cáccation này có khả năng ngăn cản sự tạo thành các base Schiff, một phân tử đóngvai trò quan trọng trong sự hình thành acrylamide Khả năng ngăn cản sự tạothành các base Schiff của các cation kim loại khác nhau được cho ở bảng sau:

Bảng 2.14: Khả năng ngăn cản của các cation hoá trị 1, 2, 3 lên sự tạo thành base Schiff

của aspargine Hàm lượng

 Mặc dù các cation kim loại có thể giảm đáng kể hàm lượng acrylamide sinh

ra nhưng nó lại xúc tác cho phản ứng tạo ra các hợp chất khác nhưhydroxymethylfurfural và furfural, những chất cũng được cho là có thể gây độcđối với con người, sự tăng của các hợp chất này diễn ra đồng thời với sự giảmhàm lượng acrylamide:

Hình 2.17: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng hydroxymethylfurfural

sau khi gia nhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20phút

Hình 2.18: Ảnh hưởng của các cation hoá trị 1, 2, 3 đến hàm lượng furfural sau khi gia

nhiệt với hỗn hợp glucose và asparagine (mỗi loại 10µL) ở 1500C trong 20 phút

 Cơ chế phản ứng tạo hydromethylfurfural và furfural khi có mặt các cationkim loại được minh họa bằng hình vẽ sau [113]:

Hình 2.19: Cơ chế phản ứng tạo hydromethylfurfural và furfural khi có mặt các cation kim

loại (II)

2.6 Phương pháp phân tích acrylamide:

 Quy trình phân tích hàm lượng acrylamide ở các loại thực phẩm thường tuân theo những bước sau: Trích ly acrylamide khỏi thực phẩm bằng các dung môi phân cực, sau đó tiến hành brôm hóa mẫu, tinh sạch, định tính và định lượng bằng nhiều phương pháp (sắc ký khí, sắc ký lỏng ) Trong các bước trên thì quá trình brôm hóa mẫu và quá trìnhtạo dẫn xuất là mất rất nhiều thời gian [117]

 Cho đến nay người ta đã phát triển nhiều phương pháp sắc ký để phân tích hàm lượng acrylamide trong quá trình xử lý nhiệt thực phẩm trong đó thì phương pháp sắc ký lỏng cao áp và phương pháp sắc kí khí kết hợp với phương pháp khối phổ là được sử dụng nhiều nhất [129] Dưới đây là một số kiến thức tổng quan hai phương pháp sắc ký lỏng cao áp và phương pháp sắc kí khí kết hợp với phương pháp khối phổ LC/MS/MS và

GC – MS thường được dùng nhiều nhất để phân tích hàm lượng acrylamide trong thực phẩm:

2.6.1 Quá trình trích ly:

 Dung môi trích ly: Nước ở nhiệt độ phòng được sử dụng để trích ly acrylamidetừ nhiều loại thực phẩm khác nhau vì tính chất rất háo nước của acrylamide Ngoài nước ta có thể sử dụng methanol như là một chất trích ly vì thuận lợi trong quá trình bốc hơi dung môi và cô đặc hoặc cũng có thể sử dụng dung dịch nước muối NaCl nồng độ cao để ngăn cản quá trình nhũ hóa có thể xảy ra trong quá trình xử lý mẫu nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi mẫu Ngoài ra trong các phòng thí nghiệm để tăng hiệu quả trích ly người ta cũng sử dụng hỗn hợp nước và acetone làm dung môi trích ly [129] vì hỗn hợp dung môi (nước và dung môi hữu xơ) thường cho kết quả trích ly cao hơn khi chỉ đơn lẻ sử dụng nước hoặc dung môi hữu cơ Và tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và nước là 4:1 thì sẽ cho kết quả trích

ly cao nhất [117]

 Trong quá trình xử lý mẫu cần hạn chế gia nhiệt hoặc sử dụng sóng siêu âm bởi vì có thể tạo ra một lượng lớn các phân tử nhỏ có thể làm bão hòa cột trích lysử dụng chất mang rắn (SPE), làm giảm hiệu quả tinh sạch và giảm tuổi thọ của cột Tuy nhiên dung môi trích ly có thể được gia nhiệt trước đến nhiệt độ 800C nhằm tăng tốc quá trình trích ly vì acrylamide khá bền ở nhiệt độ này

 Ngoài ra để trích ly acrylamide người ta cũng có thể sử dụng phương pháptrích ly lỏng cao áp (PLE – pressurized liquid extraction), đây là phương pháptrích ly các chất rắn và bán rắn sử dụng các dung môi lỏng ở nhiệt độ và áp suấtcao để tăng hiệu suất trích ly vì tăng nhiệt độ sẽ tăng động học của quá trìnhtrích ly, đồng thời áp suất cao sẽ giảm nhiệt độ sôi của dung môi khiến quá trìnhtrích ly diễn ra nhanh và an toàn Do đó đây cũng là một phương pháp trích lynhanh và hiệu quả acrylamide từ nhiều loại thực phẩm khác nhau

 Để kiểm soát hiệu suất thu hồi mẫu và lượng mẫu thất thoát trong suốt quátrình xử lý mẫu người ta bổ sung chất nội chuẩn sau quá trình đồng hóa mẫu Mộtsố chất nội chuẩn thường được sử dụng như: [13C3] acrylamide, [13C1] acrylamide,[2H3] acrylamide, N,N – dimethylacrylamide, methacrylamide Yêu cầu đối vớichất nội chuẩn là có tính chất hóa, lý học giống như của hợp chất acrylamidechuẩn [129]

 Đối với các thực phẩm giàu béo trước hoặc trong quá trình chiết tách cần thựchiện quá trình tách béo bằng các dung môi như hexane, cyclohexane hoặcpetroleum ether Còn đối với các loại thực phẩm giàu protein trước quá trình trích

ly cần đông tụ protein bằng các dung dịch methanol, acetonitrile hoặc nước muốinồng độ cao Ngoài ra cũng có thể loại protein bằng phương pháp Carrez I (thêm1mL dung dịch 0.68M potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate) sau đó kết hợpvới Carrez II (1mL dung dịch 2M zinc sulfate heptahydrate) trong điều kiện

khuấy mạnh liên tục Đây là một phương pháp loại protein rất nhanh, trong vòng

<1 phút

 Sau quá trình trích ly dịch trích được ly tâm trước khi bắt đầu quá trình tinh

sạch, một số các chế độ ly tâm như: kết hợp giữa ly tâm và lọc bằng máy li tâm

Centricon plus – 20 và lưới lọc PVDF (polyvinylidene fluoride) 0.45 µm hoặc

thực hiện quá trình ly tâm hai giai đoạn, giai đoạn một ly tâm ở 4000 rpm trong

10 phút ở 100C, giai đoạn hai ở 10.000 rpm trong 10 phút ở 100C

 Toàn bộ quá trình trích ly và tinh sạch acrylamide trước quá trình chạy sắc ký

trong LC/MS/MS và GC – MS điển hình được biểu diễn bằng hình vẽ sau [129]:

Trích ly SPE

Thu phần dung dịch mẫu sau rửa giải

Bỏ nước rửa đầu

Brôm hóa bằng 100-300 µl hỗn hợp : KBr : 16,2g Hbr : 0,8 ml Bromine: 5ml Nước : 60ml Làm

Rửa bằng MeOH (1ml)

Bão hòa với nước (2 ml)

Bơm dung dịch mẫu (0.5 – 2 ml)

Rửa giải với nước

Bỏ nước

rửa đầu

Thu phần dung dịch mẫu sau rửa giải

Làm khô

Bốc hơi đến khô bằng máy ly tâm chân không

Hòa tan vào 2µ lượng EtAc

Ly tâm ở 15.000 rpm (10 phút)

Lọc bằng lưới lọc membrance (0,22 µm)

Lọc ly tâm để loại những phân tử có

phân tử khối > 3.000 (50 phút)

Rửa bằng MeOH (1ml) Bão hòa với nước (2 ml) Bơm dung dịch mẫu (0.5 – 2 ml) Rửa giải với nước

Hình 2 20: Quá trình trích ly,

tinh sạch và xử lý mẫu trước quá trình chạy sắc ký GC –

MS, LC – MS/MS, EtAc: ethyl acetate, MeOH : methanol

2.6.2 Quá trình tinh sạch:

 Quá trình tinh sạch là sự kết hợp của nhiều quá trình tinh sạch sử dụng cột cóchất mang rắn (SPE) Ta có thể tinh sạch bằng cách kết hợp giữa cột Oasis HLB(Water, Milford, MA, USA) và cột Bond Elut-Accucat (mixedmode: C8, SAX andSCX) (Varian, Palo Alto, CA, USA) hoặc kết hợp giữa hai cột gồm: Oasis MAX(mixed-mode anion exchange: kiểu hỗn hợp trao đổi anion ) ( Water), cột OasisMCX (mixed-mode cation exchange: kiểu hỗn hợp trao đổi anion ) và cột ENVI-Carb (nhồi bằng carbon hoạt tính) (Supelco, Bellefonte, PA, USA) hoặc cũng cóthể kết hợp giữa cột Bond Elut C18, cột Bond Elut Jr-PSA (trao đổi anion) và cộtBond Elut Accucat (Varian)

 Cấu tạo của cột Oasis HLB: chất mang chính là hệ cân bằng hệ ưa nước – kịnước và chất nhồi pha đảo thấm nước, còn cột Oasis MCX có chất mang chính làchất nhồi pha đảo trao đổi cation hỗn hợp Đây là hai cột được ứng dụng tronghầu hết các quá trình tinh sạch SPE trong phân tích acrylamide

 Một quá trình tinh sạch sử dụng cột có chất mang rắn SPE điển hình gồm haibước: Bước A sử dụng một ống xả chân không để cài đặt mức chân không, vớitốc độ dòng 2 – 4 ml/phút đối với cột Oasis HLB Còn đối với cột Oasis MCXkhông cần ống xả chân không vì các phân tử kích thước lớn (60 µm) được bơmxuyên qua cột tinh sạch Toàn bột quá trình tinh sạch được biểu diễn bằng hìnhvẽ sau:

Hình 2.21: Quá trình tinh sạch điển hình dùng cột có chất mang rắn SPE dùng trong phân

tích hàm lượng acrylamide

 Với điều kiện tinh sạch như trên thì có thể đạt được hiệu suất thu hồi mẫu lênđến 98% và độ lệch chuẩn (RSD) là 9.5% (n = 15 mẫu)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly là: quá trình nghiền mẫu (khôhoặc ướt), dung môi trích ly (nước hoặc hỗn hợp với các dung dịch hữu cơ khác),nhiệt độ và thời gian trích ly, thành phần nguyên liệu, các bước khác (tách béo,loại protein) Trong quá trình xử lý mẫu thì quá trình tinh sạch sử dụng cột cóchất mang rắn (SPE) đóng một vai trò rất quan trọng thường được sử dụng rộngrãi trong quá trình phân tích

Rửa cột bằng 2ml methanol và

2ml NaCl

Giải hấp bằng 3 ml methanol có

chưa 1% acid formic

Bơm dung dịch đã giải hấp từ bước A

Rửa bằng 0.5 ml methanol

Bốc hơi dung môi, tái hòa tan vào 0.4 ml nước

Bước A: Tinh sạch bằng

Bảng 2.15: Tóm tắt một số các phương pháp sắc ký dùng trong phân tích hàm lượng

acrylamide ở các loại thực phẩm khác nhauTên thực

phẩm

Phương pháp trích ly Phương pháp tinh sạch Phương pháp sắc

ký và chất nộichuẩnNgũ cốc ăn

Tinh sạch bằng nước và methanol, tinh sạch bằng cột SPE, lọc bằng dụng cụ lọc syringe

LC–ESI-MS/MS;[13C3]acrylamide [110]

Cà phê Pha loãng với chất nội

chuẩn, trích ly bằng HPLCvới pha động là nước , ly tâm, lắc (30 giây), ly tâm lại và lọc bằng lưới lọc 0.45µm

Sử dụng cột Oasis HLB 6cc,dung môi là nước –

methanol (1:1), sau đó tinh sạch bằng cột Bond Elut-Accucat, dung môi là nước – methanol (1:1)

LC–MS/MS; [13C3]acrylamide [22]

Cô đặc trong thiết bị bốc hơi đến khi mẫu còn < 2ml, pha loãng bằng nước đến thể tích cố định 2 ml, lọc nhanh

GC–MS[39]

Thực phẩm

từ ngũ cốc

Nghiền, pha loãng với chất nội chuẩn, thêm nước, đồng hóa (30 giây), chỉnh đến pH 4-5 bằng acid acetic, loại protein bằng phương pháp Carrez

I và Carrez II, ly tâm

(16,000×g, 15phút), brôm

hóa mẫu

Chuyển mẫu vào cột sắc kýchứa muối sulfate và Florisil đã hoạt hóa (5g mỗiloại), tạo dẫn xuất

acrylamide bằng acetone, bốc hơi mẫu đến 2 ml và sau đó cô đến khô, hòa tan vào EtAcd (400µL) thêm 40

µL triethylamine sau đó lọcbằng lưới lọc 0.2 µm

GC–MS;

[13C3]acrylamide [130]

I và Carrez II, thêm 5 mldichloromethane, ly tâm,chuyển vào ống nghiệmchứa 1.8 g NaCl, trích lybằng EtAc (13 mL), sauđó cô mẫu đến khô

Sử dụng cột IsoluteMultimode, dung môi lànước – methanol (2:1), rửalại bằng nước, cô mẫu còn

90 µL, thêm 90 µLmethanol vào mẫu

LC–MS/MS;[2H3]acrylamide[52]

Các thực

phẩm chiên

Trích ly bằng nước, lytâm, pha loãng với chấtnội chuẩn,

Tinh sạch bằng cột

strata-X-C, dung môi là nước –methanol (1:1), cô cạn dướiđiều kiện chân không, táihòa tan vào 1ml nước

HPLC–UV; LC–MS;

[2H3]acrylamide[31]

Khoai tây

chiên

Pha loãng với chất nộichuẩn, ủ ở nhiệt độ phòng(30 phút), trích ly bằngnước, lắc 10 phút trongbồn siêu âm, ly tâm

Lọc bằng lưới lọc nylonkích thước 0.45 µm

LC–ESI-MS;[13C3]acrylamide[42]

ly bằng nước, lắc (30phút, 600C) trong bồn siêuâm, ly tâm

Tinh sạch bằng acetonitrile,loại protein bằng phươngpháp Carrez I và Carrez II,

ly tâm và lọc bằng mànglọc membrane

LC–MS/MS;[2H3]acrylamide[66]

Nhiều loại

thực phẩm:

cá, bánh

mì, pizza

Đồng hóa mẫu, bảo quản

ở nhiệt độ 200C trước quátrình phân tích, pha loãngvới chất nội chuẩn, trích

ly bằng nước, ly tâm

Tinh sạch bằng cột SPE, lọc

ly tâm đến khi đạt được thểtích mẫu cần

LC–MS/MS;[13C3]acrylamide[129]

Loại protein bằng phươngpháp Carrez I và Carrez II,tách béo bằng n - hexane,bão hòa bằng dung dịchNaCl, trích ly hai lần bằng50mL EtAc, cô cạn đến1ml

GC–MS/MS;[13C3]acrylamide[118]

Snack, bánh

mì đen, vịt

quay và rôti

Đồng hóa mẫu, pha loãngvới chất nội chuẩn, trích

ly bằng dung dịchmethanol 5%, đặt ở nhiệtđộ phòng trong 1giờ, ly

tâm (136,000×g, 5phút).

Không cần thêm một bướctinh sạch nào, bơm trực tiếpvào bộ phận trích mẫu

LC–MS/MS;[13C3]acrylamide[30]

Nhiều loại

thực phẩm Nghiền, tách béo bằng iso– hexane, pha loãng với

chất nội chuẩn, ủ ở nhiệtđộ phòng trong vòng 30phút

Tinh sạch bằng acetonitrile,loại protein bằng phươngpháp Carrez I và Carrez II,

ly tâm (4500×g, 10 phút)

và lọc bằng màng lọcmembrane

HPLC–MS/MS;GC–MS/MS;[2H3]acrylamide[114]

Cà phê Pha loãng với chất nội

chuẩn, trích ly bằng nước,

ly tâm (3500×g, 10 phút)

Tinh sạch bằng cột IsoluteMultimode, dung môi lànước – acetonitrile (4:1),loại dung môi với tốc độ6ml/phút đến khi còn 2mlmẫu

LC–MS/MS;[2H3]acrylamide[96]

SPE (solid-phase extraction): Tinh sạch bằng cột với chất mang rắn.PTFE: polytetrafluoroethylene.

ESI: electrospray ionization

2.6.3 Quá trình phân tích :

 Quá trình phân tích bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp với phương phápkhối phổ (GC – MS): gồm hai phương pháp nhỏ là sắc ký khí kết hợp với phươngpháp khối phổ (GC – MS) có tạo dẫn xuất và không tạo dẫn xuất [129]

Phương pháp sắc ký khí kết hợp với phương pháp khối phổ (GC – MS) có tạo dẫn xuất:

 Trong quá trình phân tích acrylamide bằng phương pháp sắc ký khí kết hợpvới phương pháp khối phổ (GC – MS) có tạo dẫn xuất và không tạo dẫn xuất đềuthực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của acrylamide với brôm (brôm hóa) trước quátrình tinh sạch mẫu Mục đích của quá trình brôm hóa là nhằm tạo ra hợp chất dễbay hơi hơn làm tăng hiệu quả của phương pháp sắc ký (ít phân cực hơn dễ hòatan vào các dung môi hữu cơ không phân cực như ethyl acetate và hexane, tăngthời gian lưu và sự rõ ràng của các peak) và phương pháp khối phổ (tăng khốilượng các ion) dẫn đến tăng hiệu quả phân tích nhưng đồng thời mất nhiều thờigian cho quá trình tạo dẫn xuất [129]

 Nguyên tắc: sử dụng máy sắc ký khí HP 6890, đầu dò HP 5973, cột mao dẫnMDN- 5 (30 x 0.32 mm, chiều dày 0.32 µm, được nhồi bằng dung dịch PH MEsiloxane 5%) để trích ly acrylamide rồi dùng phổ kế với phương pháp ion bằngđiện tử để định tính và định lượng acrylamide

 Tóm tắt phương pháp: Các quá trình trích ly được thực hiện như trên, riêngquá trình brôm hóa mẫu được thực hiện bằng các tác nhân brôm hóa (được chuẩn

bị bằng hỗn hợp 50.8 g KBr, 2.8 ml HBr, 16.8 ml nước đã bão hòa brôm và 200

ml nước vô khuẩn), ở nhiệt độ 40C ở nơi tối trong vòng 12 giờ Sau đó dung dịchsodium thiosulfate (1M) cho đến khi mất màu vàng trong dung dịch để phân hủyhết brôm dư [117] Hoặc ta cũng có thể dùng muối KBr và KBrO3 để thực hiệnbrôm hóa mẫu Mặc dù phương pháp này an toàn và ít độc hại hơn các phươngpháp khác nhưng lại có hiệu suất thấp [129]

 Sau quá trình trích ly ta thực hiện quá trình tinh sạch: bằng các tác nhân nhưethyl acetate 100%, hoặc hỗn hợp acetate – hexane tỉ lệ 1:4 hay 4:1 về thể tích,trong đó ethyl acetate 100% cho hiệu quả tinh sạch tốt nhất, sau đó đổ dung dịchvào một lọ nhỏ chứa 2g anhydrous sodium sulfate lắc đều trong vòng 10 phút đểloại hết nước dư Dịch chiết sau đó được bốc hơi đến khô và được tái hòa tan vàovào dung dịch chứa 150 µl trimethylamine và 150 µl ethyl acetate, nhằm mụcđích chuyển hóa 2,3 – dibromopropionamide thành 2–dibromopropionamidethông qua quá trình dehyrobromine hoá trong suốt quá trình chạy sắc ký

 Bơm mẫu vào bộ phân trích mẫu tiến hành chạy sắc ký

 Chế độ vận hành cột sắc ký thích hợp nhất là: nhiệt độ ban đầu của cột là

700C, tăng từ từ lên đến 1500C với tốc độ 100C/phút, giữ ở 1500C trong 1phút, rồinâng lên 2400C với tốc độ 300C/phút và giữ ở 2400C trong vòng 5 phút Nhiệt độcủa injector bơm mẫu là 1500C, sử dụng khí mang là He với lưu lượng dòng khí là8.0 ml/phút