Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đôngtụ từ nước thải chăn nuôi heo ở các tỉnh Đồng bằngsông Cửu Long

Vi khuẩn đông tụ trong hệ thống bùn hoạt tính Quá trình bùn hoạt tính sử dụng quần thể vi sinh vật để xử lý nước thải, là phương phápsinh học phổ biến nhất để loại bỏ chất hữu cơ và vô c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

DO NGHIÊN CỨU SINH THỰC HIỆN

1 Tên Đề tài: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đông

tụ từ nước thải chăn nuôi heo ở các tỉnh Đồng bằng

sông Cửu Long

2 Mã số

2 Lĩnh vực nghiên cứu: Vi sinh vật môi trường (Chuyên ngành: Vi sinh vật học)

3 Thời gian thực hiện: 07 tháng

Từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013

4 Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên nghiên cứu sinh: HỒ THANH TÂM Học vị, chức danh KH: Thạc sĩ - NCS

MSHV: P000028 Lớp: Vi sinh vật học

Khoa/Viện: Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ nơi ở: 148/274/16, đường 3/2, phường Hưng Lợi, quận Ninh Kiều, thành phố Cần ThơĐiện thoại nơi ở:……… Điện thoại di động: 0909161759

Phân lập và tuyểnchọn vi khuẩn đông tụ

từ nước thải chăn nuôiheo ở các tỉnh Đồngbằng sông Cửu LongTRẦN HOÀI PHONG Học viên cao học

MSHV: M000042, Khóa:

19Chuyên ngành: Côngnghệ Sinh học

Phối hợp, thực hiệnmột số thí nghiệm

TRẦN NGỌC HÂN Sinh viên Đại học

MSSV: 3112462, Khóa: 37Chuyên ngành: Công nghệSinh học

Phối hợp, thực hiệnmột số thí nghiệm

6 Cán bộ hướng dẫn nghiên cứu sinh thực hiện đề tài

PGS.TS CAO NGỌC Viện Nghiên Cứu và Phát Hỗ trợ thực hiện và

ĐIỆP Triển Công Nghệ Sinh

Hỗ trợ thực hiện và lập dự toán kinh phí

đề tài

7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

7.1 Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống sinh học xử lý nước thải

7.1.1 Vi khuẩn đông tụ trong hệ thống bùn hoạt tính

Quá trình bùn hoạt tính sử dụng quần thể vi sinh vật để xử lý nước thải, là phương phápsinh học phổ biến nhất để loại bỏ chất hữu cơ và vô cơ trong các công nghệ xử lý nước Sự đông

tụ (Aggregation), kết dính (Adherence) và lắng (Settlement) là các quá trình quan trọng trong vậnhành bùn hoạt tính Sự đông tụ và kết dính được biết là quá trình kết tụ sinh học (Biofloculation),lắng xuống tạo thành bùn Các quá trình được vận hành một cách tuần hoàn Vì vậy, quá trìnhbùn hoạt tính hoạt động hiệu quả phải đảm bảo các hạt bùn được lắng tốt Sự đông tụ và lắng tốtquyết định độ sạch và trong của nước sau xử lý Tuy nhiên, quá trình bùn hoạt tính thường gặpnhiều sự cố như sự phát triển quá nhiều của vi khuẩn dạng sợi hoặc bùn kém chất lượng như bùnlắng kém hay bùn tạo khối (Phuong et al., 2009)

Quá trình kết tụ sinh học được biết là cơ chế của sự đông tụ và kết dính trong bùn hoạt tính

Kết quả là do các vi khuẩn kết tụ sinh học như Flavobacterium spp và Pseudomonas spp đã

được phân lập từ các nguồn bùn hoạt tính khác nhau (Endo et al., 1976; Kato et al, 1971; Tago vàAida, 1977; Sakka et al., 1981) Tuy nhiên vi khuẩn không kết tụ được biết hiện diện rất nhiềutrong các mẫu bùn Theo Kakii (2000), trong 50 dòng vi khuẩn được phân lập trong bùn hoạt tínhchỉ có 35% dòng vi khuẩn kết tụ tốt, 65% còn lại là các dòng vi khuẩn không có khả năng kết tụ.Các dòng vi khuẩn này ít được đề cập đến, có thể vì chúng được xem là mối nguy hại do chúngkhông lắng và gây đục nước (Phuong et al., 2009) Nhưng càng về sau, nhiều nghiên cứu đã chothấy vai trò của chúng trong quá trình đông tụ và lắng của bùn hoạt tính

Theo Malik (2003), sự đông tụ vi sinh vật trong bùn hoạt tính gồm nhiều dạng vi khuẩnkhác nhau trong đó có cả vi khuẩn không có khả năng kết tụ Các dòng vi khuẩn này có khả nănggôm tụ thành các hạt nhờ quá trình đông tụ (Aggregation) Đông tụ là sự kết dính giữa các tế bàokhác nhau (cell to cell) và đã được nghiên cứu đối với nhóm vi khuẩn trong bùn hoạt tính và

màng sinh học Theo Malik và Kakii (2003) cho thấy dòng vi khuẩn không kết tụ Acinetobacter

johnsonii S35 và A junii S33 có khả năng đông tụ với 3 dòng vi khuẩn khác là Oligotropha carboxidovorans S23, Microbacterium esteraromaticum S51 và Xanthomonas axonopodis S53

(Hình 1)

Hình 1: Sự đông tụ giữa các dòng vi khuẩn (Malik và Kakii, 2003)

Cơ chế của quá trình đông tụ trong hệ thống bùn hoạt tính là sự kết đôi phụ thuộc (pairdependent) và tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn là yếu tố kiểm soát quá trình này Sự kếtdính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại Lectin trên tế bào này với mộtoligosaccharide trên tế bào kia Sự đông tụ ngừng lại nếu protein Lectin bị biến tính do nhiệt độhoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose, hoặc các đường đơnkhác), chúng liên kết với protein Lectin khóa hoạt động của protein này (Kolenbrander andAnderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al., 1997) (Hình 2)

Mặt khác, để làm rõ vai trò liên kết protein lectin – oligosaccharide, Malik et al., (2003) đã

xử lý tế bào vi khuẩn với Actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với Periodate để cắt cầunối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ

Hình 2: Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ

(Malik et al 2003)

Sự kết dính của tế bào vi khuẩn đông tụ tạo thành chất dính trong khối nhầy của bùn hoạttính hấp thụ các chất lơ lửng, vi khuẩn, chất màu, mùi… trong nước thải Do vậy hạt bông bùn sẽlớn dần rồi từ từ lắng xuống đáy Kết quả nước sáng màu, giảm lượng ô nhiễm, các huyền phùlắng xuống cùng với bùn và nước được làm sạch.

7.1.2 Vi khuẩn đông tụ trong hệ thống màng sinh học

Nhiều nghiên cứu về sự đông tụ của vi sinh vật trong các hệ thống sinh học đã cho thấy vaitrò sự đông tụ là yếu tố cần thiết cho sự hình thành màng sinh học (Saginur et al., 2006) Sự đông

tụ là một trong hai dạng tương tác góp phần phát triển màng sinh học Bước 1 là sự kết dính(Coadhesion) của tế bào đơn trong môi trường đến bề mặt vật liệu Bước thứ 2 chủ yếu là sựđông tụ, từ các tế bào đơn lẻ hoặc từ một nhóm các tế bào khác nhau (đông tụ) hoặc một nhóm các

tế bào giống nhau (tự đông tụ) sẽ kết dính với những tế bào kết dính với bề mặt vật liệu đầu tiên.Quá trình này được tiếp diễn và tạo thành màng sinh học đa chủng vi sinh vật (Hình 3)

Hình 3: Sự hình thành màng sinh học (Ngo, 2010)

8 Tính cấp thiết của đề tài

Chăn nuôi heo là ngành nghề gắn liền với cuộc sống của người dân Việt Nam từ ngàn nămnay, đặc biệt là ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Trong những năm gần đây đời sống củangười dân không ngừng được cải thiện, nâng cao, nhu cầu tiêu thụ thịt heo ngày một tăng cả về

số lượng và chất lượng, điều này đã thúc đẩy ngành chăn nuôi heo ngày càng phát triển Tuynhiên, cùng với sự phát triển nghề chăn nuôi heo, đã thải ra một lượng chất thải khá lớn làm ônhiễm môi trường, đặc biệt là môi trường nước Nguồn nước thải chăn nuôi heo hiện nay ít được

xử lý hoặc chỉ xử lý đơn giản rồi thải ra sông ngòi, ao, hồ gây ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởngđến môi trường sinh thái và sức khỏe con người Nước thải chăn nuôi heo chứa nhiều chất hữu

cơ, vô cơ dưới dạng các hạt có kích thước nhỏ, khó lắng, khó có thể tách ra được bằng cácphương pháp cơ học vì tốn nhiều thời gian mà hiệu quả không cao Một trong những vấn đề chưađược giải quyết là việc tìm ra những giải pháp thích hợp nhằm hạn chế tác động tiêu cực củangành chăn nuôi heo đến môi trường, vì thế cũng có nhiều nghiên cứu, cố tìm những biện pháphay kỹ thuật hữu hiệu để loại bỏ chất ô nhiễm trong nước thải chăn nuôi heo, có biện pháp cơhọc, lý hóa, sinh học Trong đó, phương pháp sinh học đang được xem là phương pháp hữu hiệunhất trong lĩnh vực xử lý nước thải, vì những ưu điểm của phương pháp này: đơn giản, rẻ tiền,hiệu quả cao hơn các biện pháp khác Quá trình công nghệ sinh học xử lý nước thải hoạt độngdựa trên sự hoạt động của hệ vi sinh vật Vì vậy, để áp dụng hiệu quả phương pháp này, điều tiênquyết là phải có một quần thể vi sinh vật tốt để loại bỏ các chất ô nhiễm

Từ lâu, vi khuẩn kết tụ sinh học (Flocculation bacteria) được biết là cơ chế của quá trìnhkết dính trong bùn hoạt tính và màng sinh học ứng dụng xử lý nước thải Tuy nhiên, các nghiêncứu gần đây cho thấy vi khuẩn không có khả năng kết tụ (Non-flocculation bacteria) lại là quầnthể chiếm ưu thế trong các hệ thống sinh học xử lý nước thải Các chủng vi khuẩn không có khảnăng kết tụ có một cơ chế riêng ít được nói đến, trong đó nhóm vi khuẩn có khả năng đông tụ(Aggregation) lại chiếm ưu thế Sự đông tụ làm kết dính các tế bào vi khuẩn với nhau và dính vớicác hạt chất hữu cơ vô cơ lơ lửng trong nước thải, góp phần tạo thành bùn hoạt tính hay giữ vai tròquan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học trong xử lý nước thải Mặc dù vậy, hiện tại córất ít công trình nghiên cứu về đặc điểm cũng như vai trò ứng dụng của các dòng vi khuẩn này.Chính vì thế, nghiên cứu các dòng vi khuẩn đông tụ giúp làm rõ hơn các đặc điểm và vai trò củachúng, đồng thời là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nâng cao hiệu quả các quá trình sinh họctrong xử lý nước thải

Vì vậy, để có được một nền sản xuất nông nghiệp bền vững; đặc biệt là ngành chăn nuôi heo thân

thiện với môi trường thì mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, tuyển chọn và tìm hiểu sự phân

bố của những dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao, để làm cơ sở ứng dụng công nghệ sinh họcvào thực tế cuộc sống, nhằm góp phần xử lý nước thải trong ngành chăn nuôi heo hiệu quả, trướckhi thải ra môi trường

9 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao từ nước thải chăn nuôi heo (sau biogas); Xây dựng giản đồ phả hệ các dòng vi khuẩn đông tụ ở Đồng bằng sông Cửu Long

10 Phương pháp nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu

10.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 07/2013 - 12/2013 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệSinh học, Trường đại học Cần Thơ

10.2 Phương tiện nghiên cứu

Thu mẫu nước thải chăn nuôi heo (nước thải lẫn chất thải rắn) sau biogas trong các hệthống lọc, hầm chứa hoặc các hồ sinh học (ao thủy sinh) ở trại chăn nuôi heo của 52 Huyện/Thịthuộc 13 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

Tổng số 150 mẫu nước thải chăn nuôi heo (Số mẫu và địa điểm thu mẫu tại nơi không có vikhuẩn kết tụ cao) Dùng ly nhựa 250 ml lấy phần nước thải đã được khuấy lên cho vào keo nhựa 100

ml bịt kín lại mang về phòng thí nghiệm trữ ở nhiệt độ 3-50C

10.3 Thiết bị

- Thiết bị phân lập vi khuẩn: Bình tam giác loại 1000ml, 250ml, đĩa Petri, tủ cấy vi sinh vật(Pháp); tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức); kính hiển vi Olympus CHT (Nhật); kính hiển viOlympus BH - 2 (Nhật); máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức); nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi -international (Đức),…

Thiết bị cho các thí nghiệm khác: Cốc 1000ml; ống nghiệm; máy khuấy từ (Hoa kỳ); pH kếOrion 420A (Hoa Kỳ); máy vortex IKA (Mỹ); cân điện tử Sartorius (Đức); tủ sấy EHRET (Đức);

lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

10.4 Hóa chất

- Hóa chất dùng phân lập và tuyển chọn vi khuẩn: Polypepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl,MgSO4, CaCl2, FeCl3, K2HPO4, KCl, CaCl2, MnSO4, Al2(SO)4, Glucose, sucrose, maltose, NaOH,HCl, (NH4)2SO4, p-xylen

10.5 Phương pháp nghiên cứu

10.5.1 Phân lập vi khuẩn đông tụ (Bacterial Coaggregation) từ nước thải chăn nuôi heo

Môi trường Polypepton phân lập vi khuẩn đông tụ (Phuong et al., 2009)

- Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc

Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường thạch đồng thời tiến hành đo kích thước (sau

24 giờ nuôi, đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet) và quan sát hình thái các dạng khuẩnlạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2000)

- Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển độngcủa vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2000)

Chuẩn bị mẫu vi khuẩn:

+ Nhỏ 20 μl nước cất vô trùng lên lame

+ Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.

+ Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame

+ Đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lammen tiếp xúcvới lame một góc 45° rồi hạ lammen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không cóbọt khí

Tiến hành quan sát mẫu về hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn dưới kínhhiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần

10.5.2 Tuyển chọn vi khuẩn đông tụ

10.5.2.1 Xác định khả năng kỵ nước của tế bào vi khuẩn

Thí nghiệm 1: Xác định khả năng kỵ nước của tế bào dựa trên khả năng hấp thụ đến

p-xylen theo phương pháp của Rosenberg et al (1980) Vi khuẩn được nuôi trên môi trườngPolypepton lỏng trong 3 ngày, sau đó được ly tâm ở tốc độ cao (11.000 vòng/phút trong 10 phút)

để lấy sinh khối tế bào Tiếp theo vi khuẩn được rửa 2 lần với dung dịch muối (3mM NaCl +0.5mM CaCl2) và cuối cùng chứa trong dung dich này bằng với thể tích ban đầu Lấy 5ml dịch tếbào vi khuẩn này cho vào ống nghiệm cùng với 5ml p-xylen, vortex 1 phút, sau đó để yên 5 phút.Khả năng kỵ nước của tế bào vi khuẩn được tính thông qua đo OD ở bước sóng 660 nm của dịch

vi khuẩn trước và sau khi thêm p-xylen bằng công thức:

Khả năng hấp thụ của tế bào vi khuẩn đến p-xylen = 100

*OD0: OD dịch vi khuẩn trước khi thêm p-xylen

*ODm: OD dịch vi khuẩn sau thêm p-xylen

10.5.2.2 Xác định khả năng tự đông tụ (autoaggregation) của tế bào vi khuẩn

Thí nghiệm 2: được tiến hành theo phương pháp của Phuong et al (2009) Chọn các dòng

vi khuẩn có bề mặt tế bào kỵ nước cao vừa thực hiện ở thí nghiệm 1 nuôi trong 50 ml môi trườngPolypepton lỏng ở nhiệt độ phòng, lắc 120 vòng/phút Ở tại các thời điểm 10, 20, 40, 50, 60, 70,

80 giờ, hút 1.5 ml dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 660 nm; 1.5 ml khác đem ly tâm nhẹ (650vòng/phút trong 2 phút) và đo OD Dịch vi khuẩn đồng thời được chụp hình dưới kính hiển vi ởtất cả các thời điểm

(%)

*OD0: OD dịch vi khuẩn trước khi ly tâm

*ODs: OD dịch vi khuẩn sau ly tâm

10.5.2.3 Xác định khả năng đông tụ giữa các dòng vi khuẩn (coaggregation)

Thí nghiệm 3: Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Phuong et al (2009) Từ

các dòng vi khuẩn có khả năng tự đông tụ cao, tiến hành xác định khả năng đông tụ với nhautheo từng cặp dòng vi khuẩn Số cặp dòng vi khuẩn được bố trí thí nghiệm tính theo công thức:

Xác định khả năng đông tụ theo từng cặp vi khuẩn, mỗi dòng lấy 20 ml cho vào bình tamgiác 100 ml, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Ở tại các thời điểm 5, 10, 30, 60 phút, hút 1.5

ml dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 660 nm; 1.5 ml khác đem ly tâm nhẹ (650 vòng/phút trong

2 phút) và đo OD Khả năng đông tụ = 100

(%)

*OD0: OD dịch vi khuẩn trước khi ly tâm

*ODs: OD dịch vi khuẩn sau ly tâm

10.5.2.4 Xác định yếu tố pH ảnh hưởng đến khả năng đông tụ

Thí nghiệm 4: chọn cặp dòng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm 3 thực hiện thí nghiệm 4 để

xác định giá trị pH tối ưu

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn như sau: vi khuẩn được nuôi trong 250 ml môi trường Polypeptonlỏng ở nhiệt độ phòng, lắc 120 vòng/phút, và nuôi đến thời điểm sự đông tụ đạt tối ưu được xácđịnh ở thí nghiệm 2 Vi khuẩn được ly tâm ở tốc độ cao (11.000 vòng/phút trong 10 phút) để lấysinh khối tế bào Tiếp theo vi khuẩn được rửa 2 lần với dung dịch muối (3mM NaCl + 0.5mMCaCl2) và chứa trong dung dịch này sao cho OD660 bằng 0.3, pH được điều chỉnh lần lượt ở cácgiá trị 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Kế đến dịch vi khuẩn được ly tâm nhẹ (650 vòng/phút trong 2 phút) đểlấy dịch vi khuẩn lơ lửng phía trên, loại bỏ các tế bào tự đông tụ

- Tổ hợp vi khuẩn đo khả năng đông tụ: mỗi dòng lấy 20 ml cho vào bình tam giác 100 ml,lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Ở tại các thời điểm tối ưu được xác định ở thí nghiệm 3, hút1.5 ml dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 660 nm; 1.5 ml khác đem ly tâm nhẹ (650 vòng/phúttrong 2 phút) và đo OD Dịch vi khuẩn đồng thời được chụp hình dưới kính hiển vi ở tất cả cácthời điểm.

(%)

*OD0: OD dịch vi khuẩn trước khi ly tâm

*ODs: OD dịch vi khuẩn sau ly tâm

10.5.2.5 Nhận diện và phân tích mối tương quan giữa các dòng vi khuẩn đông tụ được tuyển chọn với các dòng vi khuẩn có ở ngân hàng dữ liệu của NCBI.

Được thực hiện theo 04 bước như sau:

(i) Ly trích DNA của vi khuẩn

Phương pháp ly trích DNA của vi khuẩn (Neumann et al.,1992)

Ly trích DNA vi khuẩn để phục vụ cho phản ứng PCR Thực hiện theo quy trình:

- Lấy 2 ml dung dịch vi khuẩn cho vào tuýp 2,2 ml (vi khuẩn được nuôi trong môi trường LBlỏng (Bactotryptone 10 g/l, Yeast extract 5 g/l và NaCl 10 g/l) qua đêm

- Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút Loại bỏ phần nước

- Hòa tan sinh khối với 250 μl dung dịch TE pH=8

- Thêm 50 μl dung dịch 10% SDS cộng 10 μl Proteinase K (20 mg/l) Ủ 20 phút trong 650C,mỗi 5 phút đảo ngược túyp một lần để trộn đều dung dịch

- Thêm 400 μl 10% CTAB/0,7 M NaCl, trộn đều Ủ ở 650 trong 20 phút

- Thêm 600 μl chloroform:isoamyl alcohol (24:1)

- Trộn đều và ly tâm ở 12.000 vòng trong 10 phút

- Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào tuýp mới và thêm 1 ml isopropanol, lắc đều,giữ ở -200C ít nhất 30 phút

- Rửa với 1ml ethanol 70%, ly tâm ở 12.000 rpm trong 5 phút, làm 2 lần (mỗi lần đổ bỏethanol)

Phơi khô DNA ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ

- Hòa tan trong 30 μl nước cất 2 lần (Bi-H2O)

- Trữ lạnh ở -200C để bảo quản DNA

- Mẫu DNA sau khi ly trích, được xác định nồng độ DNA bằng máy hấp thu quang phổ, sau

đó pha sẵn lượng DNA dùng cho phản ứng PCR

(ii) Phản ứng polymerase chain reaction (PCR)

- Phản ứng PCR với cặp mồi theo Zhao et al (2010) có trình tự sau:

8F 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’

1492R 5’ - TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’

- Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với nồng độ 25µl:

- Quy trình phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đọan như sau:

+ Giai đoạn tháo xoắn, tách mạch: ở nhiệt độ 950C trong 1 phút

+ Giai đoạn gắn đoạn mồi: khi nhiệt độ hạ xuống 560C, giai đọan này kéo dài khoảng 45giây đến 1 phút

+ Giai đoạn kéo dài chuỗi: ở nhiệt độ 720C, giai đọan này kéo dài 2 phút Mẫu chạy PCRđược giữ ở 100C

(iii) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên agarose gel

- Chuẩn bị agarose gel:

+ Cân 0,48 g agarose cho vào bình tam giác đựng 45ml dung dịch TAE 1X

+ Đun nóng hỗn hợp trong 3 phút cho agarose tan hoàn toàn

+ Để nguội tự nhiên khoảng 10 phút

+ Bổ sung 0,8 μl ethidium bromide và lắc nhẹ cho đều

+ Đổ nhẹ dung dịch agarose vào khuôn để định hình gel (khi đổ gel phải đổ dứt khoát đểtránh bọt khí làm ảnh hưởng đến sự điện di sản phẩm PCR).

- Chạy điện di:

+ Đặt agarose gel đã được định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TBE 1X

+ Nhỏ 10μl mẫu sản phẩm PCR của DNA đã được trộn đều với 2 μl loading buffer vàogiếng trên agarose gel

+ Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút

Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000(Hoa Kỳ)

+ So sánh kích thước DNA của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn 1500 bp

(iv) Giải trình tự đoạn DNA

+ Cho vào tuýp sản phẩm PCR 2.5 μl EDTA + 30 μl cồn 96% để tủa DNA

+ Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút

+ Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 45 phút, loại bỏ phần dung dịch

+ Rửa với 30 μl cồn 70%, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ phần dungdịch (lặp lại 2 lần)

+ Sấy chân không 10 phút ở 300C

+ Cho vào tuýp 20 μl Hidye formamide, sau đó đặt tuýp vào máy PCR ở nhiệt độ 950Ctrong 5 phút

+ Cho vào máy giải trình tự ABI 3130

+ Đọc kết quả

+ Dùng chương trình BLAST so sánh trình tự đoạn DNA của dòng vi khuẩn với trình tựDNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI

+ Xây dựng giản đồ phả hệ từ các dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao được tuyển chọn

ở thí nghiệm 2 bằng chương trình MEGA 5.1 để tìm hiểu mối quan hệ di truyền của chúng

11 Nội dung nghiên cứu và tiến độ thực hiện

Thời gian (bắt đầu-kết thúc)

Người thực hiện

1 Phân lập và tuyển chọn các dòng Ít nhất 120 dòng vi khuẩn 07/2013 Hồ Thanh Tâm

vi khuẩn có khả năng đông tụ đông tụ trong nước thải

chăn nuôi heo ở ĐBSCL

đến09/2013

Trần Hoài Phong Trần Ngọc Hân

2

Kiểm tra sinh hóa các dòng vi

khuẩn đã phân lập được với dung

môi P-xylen và tuyển chọn được

các cặp dòng vi khuẩn có khả

năng đông tụ cao

Tuyển chọn được ít nhất 2cặp dòng vi khuẩn có khảnăng đông tụ cao

09/2013đến11/2013

Hồ Thanh TâmTrần Hoài Phong Trần Ngọc Hân

3

Giải trình tự 16S rRNA các dòng

vi khuẩn có khả năng đông tụ

cao đã được tuyển chọn và lập

giản đồ phả hệ các dòng vi khuẩn

đông tụ

Giải trình tự 16S rRNA ítnhất 13 dòng vi khuẩnđông tụ cao đại diện cho

13 tỉnh ĐBSCL và lậpgiản đồ phả hệ các dòng

vi khuẩn này

11/2013đến12/2013

Hồ Thanh TâmTrần Hoài Phong Trần Ngọc Hân

Tên sản phẩm, số lượng và yêu cầu khoa học đối với sản phẩm:

Số

TT

1 Dòng vi khuẩn đông tụ 2 cặp Cặp dòng vi khuẩn có khả năng

đông tụ cao 2

Kiểm tra sinh hóa với dung môiP-xylen để xác định khả nănggom tụ của tế bào vi khuẩn đông

tụ nhờ vào tính kỵ nước của bềmặt tế bào

Kết quả phân lập và hiệu quảđông tụ của các cặp vi khuẩnđông tụ

4

Phân lập, tuyển chọn và ứngdụng vi khuẩn đông tụ trong xử

lý nước thải chăn nuôi heo saubiogas

Kết hợp đào tạo: 01 học viên Cao học; 01 sinh viên Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học

Số bài báo công bố (bài):

Địa chỉ có thể sử dụng kết quả của đề tài:

- Bổ sung thông tin cho Luận án Nghiên cứu sinh của chủ nhiệm đề tài.

- Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, ĐH Cần Thơ

- Đóng góp tư liệu cho quá trình nghiên cứu và giảng dạy về vi sinh vật trong xử lý nước thải cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh vật

13 Kinh phí thực hiện đề tài và nguồn kinh phí

Tổng kinh phí: 15.000.000 đồng (Mười lăm triệu đồng)

Trong đó:

Kinh phí sự nghiệp khoa học công nghệ: 15.000.000 đồng

Các nguồn kinh phí khác (cơ sở hỗ trợ, tài trợ của cá nhân, tổ chức ): 00 đồng

Nhu cầu kinh phí từng năm:

- Năm 2013: 15.000.000 đồng

Dự trù tổng kinh phí theo các mục chi (thuê khoán chuyên môn ; nguyên vật liệu, năng lượng; chi khác, ):

Thuê khoán chuyên môn: 10.664.000 đồng

Nguyên vật liệu, năng lượng: 4.336.000 đồng

Ngày tháng năm … Cần Thơ, ngày 24 tháng 06 năm 2013

Duyệt của đơn vị Cán bộ hướng dẫn Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP NCS HỒ THANH TÂM Phòng Quản lý Khoa học Khoa Đào tạo Sau đại học

HIỆU TRƯỞNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Độc lập -Tự do - Hạnh phúc

Số: T/HĐ-QLKH 20……NCS Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

HỢP ĐỒNG TRIỂN KHAI ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

(do Nghiên Cứu Sinh thực hiện)

Căn cứ theo danh mục được duyệt đề tài Nghiên cứu Khoa học cấp Trường (do NghiênCứu Sinh thực hiện) năm 2013

Sau khi xem xét mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài:

Bên B: (Bên thực hiện đề tài), đại diện:

Họ và tên Nghiên Cứu Sinh chủ nhiệm đề tài: HỒ THANH TÂM

CMND số: 363806024 Ngày cấp: 25/01/2011 Nơi cấp: Hậu Giang

MSHV: P000028 Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Khoa/Viện: Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Khoá học: đợt 1 năm 2012

Địa chỉ nơi ở: 148/274/16, đường 3/2, phường Hưng Lợi, quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ

Điện thoại: 0909161759 Email: httam75@gmail.com

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Cao Ngọc Điệp MSCB: 000743

Đơn vị: Viện NC & Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ

Điện thọai liên lạc: 0913 833 792 Email: cndiep@ctu.edu.vn

đã thỏa thuận như sau:

Điều 1: Bên B chịu trách nhiệm tổ chức triển khai các nội dung nghiên cứu cụ thể dưới

Xử lý số liệu, viết báo cáo và tổ chức nghiệm thu đề tài

Thời gian tiến hành thực hiện đề tài:

Từ ngày 01 tháng 7 năm 2013 đến ngày 31 tháng 12 năm 2013

Điều 2: Bên B phải nộp cho bên A các sản phẩm khoa học sau đây:

- 4 cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao trong nước thải chăn nuôi heo sau biogas.

- Cây phả hệ di truyền các dòng vi khuẩn đông tụ bản địa đã được tuyển chọn

Thời gian nộp sản phẩm trước ngày 31 tháng 12 năm 2013

Điều 3: Bên A cấp cho bên B số tiền là: 15.000.000 đồng trong năm 2013

Điều 4: Trong tiến trình thực hiện đề tài NCKH, công tác kiểm tra có thể được thực hiện

định kỳ hoặc đột xuất do Phòng QLKH có trách nhiệm tổ chức Thành phần Đoàn kiểm tra doHiệu trưởng nhà trường quyết định thành lập tùy vào yêu cầu và nội dung của vấn đề cần kiểmtra Dựa vào kết quả kiểm tra, đề tài có thể được điều chỉnh, gia hạn thời gian để phù hợp vớiyêu cầu thực tế hoặc buộc chấm dứt hợp đồng, xử lý vi phạm nếu phát hiện bên B không đủnăng lực hoặc phát hiện tranh chấp có liên quan đến việc thực hiện đề tài mà không thể giảiquyết được Hai bên thoả thuận việc kiểm tra thực hiện hợp đồng vào các thời điểm phù hợp

Điều 5: Khi đề tài đã thực hiện chưa quá ½ thời gian thực hiện đề tài, nếu có những thay

đổi, điều chỉnh về nội dung, thời gian, cán bộ tham gia hoặc các vấn đề khác, bên B làm bảnbáo cáo gởi cho Phòng QLKH để được Trường xem xét cho bổ sung

Điều 6: Sử dụng kinh phí tuân thủ theo quy định của Nhà nước, bộ ngành liên quan, theo

quy định quản lý đề tài NCKH và quy chế chi tiêu nội bộ của Trường Đại học Cần Thơ hiệnhành

Điều 7: Sau khi hoàn thành nhiệm vụ ghi ở Điều 1 và Điều 2, hai bên chịu trách nhiệm

cùng tổ chức đánh giá nghiệm thu sản phẩm theo đúng Quy định về quản lý đề tài nghiên cứukhoa học và chuyển giao công nghệ của Trường hiện hành Sản phẩm của bên B được Hội đồngđánh giá nghiệm thu là cơ sở để thanh lý hợp đồng

Điều 8: Bên A thực hiện quyền chủ sở hữu và bên B có quyền tác giả đối với các sản phẩm

hoặc quy trình khoa học công nghệ được tạo ra từ kết quả nghiên cứu khoa học của đề tài Việcđăng ký quyền sở hữu trí tuệ do bên A thực hiện, bên B có trách nhiệm hoàn thành hồ sơ đăng

ký theo quy định

Điều 9: Hai bên cam kết thực hiện đúng các điều khoản đã được ghi trong hợp đồng Nếu

bên nào vi phạm phải chịu trách nhiệm theo các quy định hiện hành

Điều 10: Trong quá trình thực hiện hợp đồng, hai bên phải thông báo cho nhau những vấn

đề nảy sinh và cùng nhau bàn bạc giải quyết Hợp đồng có giá trị kể từ ngày ký Hợp đồng nàylàm thành 03 bản, mỗi bên giữ 1 bản, 1 bản gởi phòng Tài vụ Trường để cấp kinh phí

Đại diện Bên A (BGH Trường ĐHCT) Đại diện Bên B

NCS HỒ THANH TÂM Cán bộ hướng dẫn

PGS.TS.CAO NGỌC ĐIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Khoa/Viện: Viện NC & Phát triền Công nghệ Sinh học,trường Đại học Cần Thơ

Số điện thoại: 0909161759 Email: httam75@gmail.com

4 Tổng kinh phí được duyệt: 15.000.000 đồng

ĐVT: đồng

TT LIỆT KÊ CHI TIẾT CÁC KHOẢN CHI ĐƠN VỊ

TÍNH LƯỢNG ĐƠN GIÁ SỐ THÀNH TIỀN

I Nội dung chi không giao khoán

1 Chi về vật tư, hóa chất, nguyên vật liệu

(không có định mức kinh tế - kỹ thuật do

các Bộ ngành chức năng ban hành) cho thí

nghiệm, thử nghiệm phục vụ yêu cầu

nghiên cứu khoa học…

Chi tiền công, thù lao cho cán bộ, chi thù

lao chuyên gia nhận xét, phản biện, đánh giá;

chi tiền công lao động khác tham gia thực

hiện đề tài; chi hội thảo khoa học: Chủ nhiệm

đề tài, dự án được quyền quyết định các mức

chi cao hơn hoặc thấp hơn mức quy định của

Nhà nước, tùy theo chất lượng và hiệu quả

công việc nghiên cứu)

Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn các dòng

vi khuẩn có khả năng đông tụ

Thuê giải trình tự các dòng vi khuẩn Mẫu 18 200.000 3.600.000

TT LIỆT KÊ CHI TIẾT CÁC KHOẢN CHI ĐƠN VỊ

TÍNH LƯỢNG ĐƠN GIÁ SỐ THÀNH TIỀN

3

Các khoản chi: hỗ trợ đào tạo, chuyển giao

công nghệ, chuyển giao kết quả nghiên cứu;

chi công tác phí trong nước; chi đoàn vào;

chi hội nghị, hội thảo khoa học; chi văn

phòng phẩm, in ấn, thông tin, liên lạc; chi

dịch tài liệu từ tiếng nước ngoài, chi biên

soạn và in ấn sách chuyên khảo để phổ biến

trong khuôn khổ của đề tài; phí đăng ký bảo

hộ quyền sở hữu trí tuệ;chi hoạt động quảng

cáo, xúc tiến thương mại đối với sản phẩm

Chi phí hội nghị, hội thảo, nghiệm thu đánh

6 Phụ cấp trách nhiệm cho chủ nhiệm đề tài Tháng 06 100.000 600.000

7 Quản lý chung nhiệm vụ KH&CN Đề tài 01 450.000 450.000

Bằng chữ: Mười lăm triệu đồng chẵn.

Cần Thơ, ngày 24 tháng 6 năm 2013

KHOA SAU ĐẠI HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP NCS HỒ THANH TÂM

PHÒNG QUẢN LÝ KHOA HỌC BAN GIÁM HIỆU DUYỆT