Luận văn nghiên cứu một số ký sinh trùng ký sinh trên tôm sú (penaues monodon) bị bệnh phân trắng nuôi tại tỉnh thừa thiên huế

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

HOÀNG LÊ THÙY LAN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ KÝ SINH TRÙNG KÝ SINH

TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BỊ BỆNH PHÂN TRẮNG

NUÔI TẠI TỈNH THỪA THIÊN HUẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Nuôi trồng thuỷ sản

Mã số : 60.62.70

Người hướng dẫn khoa học: TS HÀ KÝ

HÀ NỘI, 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

Hoàng Lê Thùy Lan

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sư phạm

Kỹ thuật - trường đại học Sư phạm Huế - đại học Huế ựã tạo ựiều kiện cho tôi tham gia và hoàn thành chương trình cao học tại trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Thông tin - đào tạo và Hợp tác quốc

tế Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, khoa Sau ựại học trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi ựể giúp tôi ựạt ựược kết quả học tập tốt

Tôi xin chân thành cảm ơn và bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới thầy giáo hướng dẫn Ờ TS Hà Ký, ựã tận tâm, nhiệt tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện ựề tài

Lời cảm ơn chân thành sâu sắc em xin gửi tới thầy giáo TS Bùi Quang

Tề, cô giáo Th.S Nguyễn Thị Hà ựã tận tình hướng dẫn em trong việc thực hiện ựề tài

Xin cám ơn toàn thể cán bộ của Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Miền Bắc ựã tạo mọi ựiều kiện cơ sở vật chất giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến gia ựình và ựồng nghiệp, ựã luôn giúp ựở, ủng hộ và ựộng viên tôi trong suốt thời gian tham gia khoá học cũng như hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

Hoàng Lê Thùy Lan

MỤC LỤC

2.1 Vài nét về nghề nuôi tôm sú trên thế giới và dịch bệnh 32.2 Hiện trạng nghề nuôi tôm sú trong nước và tình hình dịch bệnh 62.3 Một số nghiên cứu về bệnh tôm trên thế giới và trong nước 82.3.1 Một số nghiên cứu về bệnh tôm trên thế giới 82.3.2 Một số nghiên cứu về bệnh tôm ở Việt Nam 122.4 Diễn biến dịch bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi ở nước ta 16

3.2.4 Dụng cụ, hóa chất cần thiết ñể giải phẫu và nghiên cứu ký sinh

3.2.5 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng 233.2.6 Cố ñịnh, bảo quản và làm tiêu bản ký sinh trùng 24

4.1 Dấu hiệu bệnh lý của tôm bị bệnh phân trắng 31

4.3 Thành phần loài ký sinh trùng trên tôm sú bị bệnh phân trắng và

4.3.1 Thành phần giống loài KST trên tôm sú kiểm tra 334.3.2 Vị trí phân loại và ñặc ñiểm hình thái của các loài KST trên tôm

sú bị bệnh phân trắng và tôm sú không bị bệnh phân trắng 344.4 Tỷ lệ nhiễm KST trên tôm sú bị bệnh và không bị bệnh phân trắng 444.5 Mức ñộ nhiễm của từng loài KST bắt gặp trên tôm sú bị bệnh và

4.6.2 Tỷ lệ nhiễm và cường ñộ nhiễm của từng loài KST trên các cơ

quan của tôm sú bị bệnh và không bị bệnh phân trắng 48

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các bệnh do virus và ký sinh trùng thường gặp trên tôm he

Bảng 4.1 Số lượng, chiều dài và khối lượng tôm sú kiểm tra 33

Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm và cường ñộ nhiễm từng loài KST trên các cơ

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Phân trắng nổi trong ao tôm sú nuôi bị bệnh phân trắng tại Huế 31Hình 4.2 A Gan tụy tôm bình thường, B Gan tụy tôm sú bị bệnh phân trắng 32Hình 4.3 A gan tụy tôm khỏe, B gan tụy tôm bị bệnh phân trắng 32

Hình 4.4 Paraophioidina scolecoides trong ruột tôm sú (mẫu tươi,

Hình 4.5 Paraophioidina scolecoides trong ruột tôm sú 35Hình 4.6 Cephalolobus penaeus trong ruột tôm sú bị bệnh phân trắng 37Hình 4.7 A – Vi bào tử trong gan tụy tôm sú bị bệnh phân trắng (nhuộm

Gram - mẫu thu ở Quỳnh Lưu-Nghệ An), B – Vi bào tử trong gan tụy tôm sú bị bệnh phân trắng (theo Nguyễn Thị Hà, 2010) 38Hình 4.8 Tế bào mô hình ống gan tụy nhiễm vi bào tử (nhuộm H&E,

Hình 4.9 Gan tụy tôm sú nhiễm Vi bào tử (nhuộm giemsa, mẫu ở Huế, 2010) 39

Hình 4.10 Epistylis sp ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng 40

Hình 4.11 Epistylis sp ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng 41

Hình 4.12 Z sinense ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng 42

Hình 4.13 Vorticella sp ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng (mẫu

Hình 4.14 Mức ñộ nhiễm của từng loài KST trên tôm sú bị bệnh phân trắng 45Hình 4.15 Tỷ lệ nhiễm của từng loài KST trên tôm sú bị bệnh và không

Hình 4.16 Tỷ lệ nhiễm KST trên các cơ quan của tôm sú 47

Hình 4.18 Cường ñộ nhiễm KST trên phần phụ tôm sú 51

HPV Hepatopancreatic Parvo-like Virus (Virus gây bệnh

gan tụy và bệnh còi trên tôm IHHNV Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis

(Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu

YHV Yellow-head virus (Virus gây bệnh ñầu vàng)

WSSV White spot syndrome virus (Hội chứng virút ñốm

trắng)

PHẦN 1 MỞ đẦU

Nghề nuôi tôm sú (Penaeus monodon) phát triển rất nhanh trên thế giới

cũng như ở Việt Nam, ựóng vai trò rất lớn trong việc cải thiện ựời sống của các cộng ựồng dân cư ven biển và tạo nguồn thu ngoại tệ Mặt hàng tôm mà chủ yếu là tôm sú ựang chiếm trên 18,5% về số lượng và trên 43,5% về kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước, ựã góp phần khẳng ựịnh thế mạnh thứ hai của ngành chế biến thủy sản xuất khẩu

Tuy nhiên, dịch bệnh ựang là trở ngại chắnh của nghề nuôi tôm sú Một

số bệnh là nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm nuôi như bệnh ựốm trắng (WSSV), bệnh ựầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV), bệnh do vi-rút gây hoại tử gan tụy (HPV), bệnh do vi khuẩn và những bệnh về dinh dưỡng v.v Bên cạnh ựó, trong mấy năm gần ựây, ở những ao nuôi tôm sú còn xuất hiện loại bệnh gây tác hại không kém ựược gọi là bệnh phân trắng

Bệnh phân trắng trên tôm sú diễn biến phức tạp, lây lan nhanh, gây thiệt hại ở hầu hết cả nước Việt Nam, trong ựó ựặc biệt là khu vực miền Trung và những vùng nuôi trên cát là nơi bệnh xuất hiện với tần suất lớn và ựang là bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm này (Nguyễn Khắc Lâm và ctv, 2004) Năm 2002, có khoảng 450 ha ao nuôi ở huyện Tuy Hòa-Phú Yên,

300 ha ở tỉnh Khánh Hòa, 60 ha ở tỉnh Bình đình xuất hiện bệnh phân trắng Năm 2003 bệnh tiếp tục phát triển lan rộng ra nhiều tỉnh như Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Bình Thuận, trong khi ựó Ninh Thuận cũng có diện tắch bị bệnh phân trắng trong cả 2 vụ lên ựến 600 ha, và chỉ trong 6 tháng ựầu năm 2004

số diện tắch bị dịch bệnh lên ựến 500 ha Năm 2009, toàn tỉnh Sóc Trăng ựã

có trên 30.000 ha tôm sú thả nuôi bị chết, trong ựó một số diện tắch tôm chết

do ựã xuất hiện bệnh phân trắng Tỉnh Thừa Thiên Huế cũng có hàng trăm ha nuôi tôm bị bệnh, trong ựó có bệnh phân trắng làm cho tôm còi cọc, chậm lớn

Thực tế tác nhân gây bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi vẫn chưa ựược

xác ñịnh, mặc dù bệnh này xảy ra phổ biến ở nhiều khu vực nuôi Có nhiều ý kiến nhận ñịnh về tác nhân gây bệnh phân trắng Theo tiến sĩ Bùi Quang Tề

bệnh gây ra có thể do nhóm nguyên sinh ñộng vật Gregarine gây tổn thương

thành ruột, dạ dày tạo ñiều kiện cho nhóm vi khuẩn Vibrio gây hoại tử thành ruột tạo nên các ñốm trắng hay vàng nhạt trên thành ruột ðặng Thị Hoàng

Oanh (2008) cũng phát hiện thấy nhóm nguyên sinh ñộng vật Gregarine với

tỷ lệ khá cao (32,38%) và nhóm trùng loa kèn cũng ñược tìm thấy trên tôm sú

bị bệnh Do chưa xác ñịnh ñược tác nhân chính gây bệnh phân trắng trên tôm

sú nuôi nên cho ñến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả Việc xác ñịnh một số ký sinh trùng ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần xác ñịnh tác nhân gây bệnh này trên tôm

sú nuôi, từ ñó ñưa ra ñược những biện pháp phòng trị hữu hiệu bệnh phân trắng, ñặc biệt ñối với nhiều vùng nuôi tôm sú ở tỉnh Thừa Thiên Huế ñang bị thiệt hại nặng nề do bệnh phân trắng gây ra Xuất phát từ thực tế ñó tôi thực

hiện ñề tài: “Nghiên cứu một số ký sinh trùng ký sinh trên tôm sú

(Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế”

1 Mục tiêu nghiên cứu:

Xác ñịnh mức ñộ nhiễm một số giống loài ký sinh trùng ký sinh trên tôm sú bị bệnh phân trắng nuôi tại Tỉnh Thừa thiên Huế

2 Nội dung nghiên cứu:

- Thu mẫu, phân loại ñể xác ñịnh thành phần giống, loài ký sinh trùng trên tôm sú bị bệnh phân trắng nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế

- Thu mẫu, phân loại ñể xác ñịnh thành phần giống loài ký sinh trùng

ký sinh trên tôm sú không bị bệnh phân trắng nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế

- Xác ñịnh tỷ lệ nhiễm và cường ñộ nhiễm ký sinh trùng trên tôm sú bị bệnh phân trắng và không bị bệnh phân trắng nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vài nét về nghề nuôi tôm sú trên thế giới và dịch bệnh

Nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) là ngành kinh tế quan trọng ựóng góp một phần ựáng kể trong thị phần xuất khẩu của nhiều quốc gia trên thế giới Sản lượng nuôi trồng thủy sản và khai thác thủy sản trên thế giới trong hơn một thập niên qua tăng ựáng kể ựạt 120,7 triệu tấn năm 1995, nếu tắnh từ năm

1989 sản lượng gia tăng hàng năm vào khoảng 15,6 triệu tấn Hầu hết sản lượng gia tăng ựều ựến từ nuôi trồng thủy sản (FAO, 1997) Trong ựó, sản lượng tôm nuôi ựược ựóng góp chủ yếu từ một số nước châu Á như: Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Bangladesh và Việt Nam Chỉ tắnh riêng năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới ựạt 1,8 triệu tấn trong

ựó Châu Á chiếm 82% (Ling và ctv, 2001)

Tuy nhiên từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh (FAO, 1997) Trong ựiều tra về nuôi tôm trên toàn cầu của Liên minh Nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GAA), năm 2001, dịch bệnh ựã gây thiệt hại khoảng 22% tương ựương với 1 tỷ USD; và theo ựánh giá của nhóm này thì trong 15 năm qua nghề nuôi tôm thế giới bị thiệt hại nặng khoảng 15 tỷ USD do dịch bệnh gây ra Báo cáo ựầu tiên ựược công

bố rộng rãi về tình hình dịch bệnh của tôm là Monodon baculovirus (MBV)

tại đài Loan vào giữa năm 1980 (Timothy và ctv, 2005) MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981)

Tiếp theo ựó là dịch bệnh gây hoại tử do vi rút gây hoại tử hệ thống gan tuỵ của tôm (IHHNV) tại Châu Mỹ, vi rút gây bệnh ựầu vàng (YHV) tại Thái Lan, hội chứng Taura (TSV) tại Châu Mỹ Virus gây bệnh ựầu vàng YHV

cũng ựược xem là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm trước ựây ở Thái Lan (Flegel, 1997; Flegel và ctv, 1995, 1997) Loài virus này ựã gây thiệt hại trên tôm nuôi ở Thái Lan khoảng 40 triệu USD năm 1992 Sau sự bùng nổ dịch bệnh ựầu vàng ở Thái Lan là bệnh ựốm trắng (Flegel và ctv, 1997) Bệnh ựốm trắng nhanh chóng lan rộng ra khu vực Châu Á, lan sang Châu Mỹ và gây thiệt hại lớn từ năm 1999 Năm 2009, bệnh ựốm trắng cũng ựược báo cáo ựã xuất hiện tại một số nước như Myanma, Philippin, Srilanka, Malaisia, Thái Lan (NACA và FAO, 2009) WSSV, YHV, TSV ựã gây thành dịch bệnh toàn cầu trên cả hai ựối tượng nuôi phổ biến là tôm sú và tôm chân trắng

đối với bệnh do tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan ựến bệnh vi khuẩn thường do chắnh nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra (Ruangpan, 1987) Vấn ựề này xảy ra khá phổ biến ở các nước châu Á nơi mà việc nuôi tôm ựược xem là hoạt ựộng chắnh yếu trong nuôi trồng thủy sản Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio ựã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippines (Fernandez và Mayo, 1994), Ấn độ (Raju, 1994) và Indonesia (Sulasmi và ctv, 1994;

Taslihan và Wijayati, 1994) Một số loài vi khuẩn Vibrio như V harveyi, V

và ctv, 1992.) và Philippines (Lavilla-Pitogo và ctv, 1990) Theo Chen (1992), khi nghiên cứu bệnh trên tôm sú nuôi đài Loan cho thấy, có ựến 84,6% vi

khuẩn Vibrio tồn tại trong khối gan tụy của tôm Nghiên cứu về bệnh tôm,

Jayasree và ctv (2006) cho rằng 5 loại bệnh xuất hiện là bệnh mòn cụt ựuôi, bệnh chết ựỏ ở tôm, bệnh vỏ, hội chứng mềm vỏ và WGD ựều do vi khuẩn

Một số bệnh tôm còn do ký sinh trùng gây ra như bệnh trùng hai tế bào

không xương sống, có chu kì sống trực tiếp (John và ctv, 1979) Bệnh

Gregarines xuất hiện ở nhiều loài giáp xác nuôi biển khác nhau tại Châu Á, châu

Mỹ, bệnh thường xảy ra ở hệ thống ương nuôi và ương thịt Gregarines thường

ký sinh ở tôm sú P monodon với mức ñộ nhiễm rất cao, có trường hợp tỷ lệ

nhiễm 100% (Shariff và Subasinghe, 1992) Ở Việt Nam, qua kiểm tra tôm thẻ,

tôm sú nuôi có nhiễm Nematopsis sp ở ruột và dạ dày, mức ñộ nhiễm rất cao, tỷ

lệ từ 70-100%, bệnh ñã xảy ra nhiều trong các ao nuôi tôm sú thâm canh ở cuối chu kỳ nuôi (Bùi Quang Tề, 1998, 2002) ðối với bệnh do vi bào tử ở tôm: Vi bào

tử ký sinh trong các tổ chức của tôm, chúng bám vào cơ vân gây nên những vết tổn

thương lớn làm ñục mờ cơ vì thế nên gọi là bệnh tôm “sợi bông trắng” Bệnh này

còn ñược gọi bằng tên khác như: bệnh tôm bông ở tôm he (Cotton shrimp disease), bệnh vi bào tử ở tôm he (Microsporidia Disease), bệnh tôm sữa (Milk Disease) ðối với tác nhân gây bệnh này người ta ñã phát hiện có 3 giống vi bào tử thường ký sinh

gây bệnh ở tôm he: Giống Thelohania Hennguy, 1892 (Agmasoma), Giống

ctv, 2004)

Năm 2000-2002 ở Thái Lan ñã phát hiện bệnh chậm lớn ở tôm sú nuôi, tác nhân là do 1 chủng vi bào tử ký sinh ở gan tụy Bệnh ñã gây thiệt hại gần 300 triệu USD năm 2002 (Kanokporn Chayaburakul và ctv, 2004) Năm 2009, theo Somjintana Tourtip và ctv, ñã công bố vi bào tử gây bệnh trong gan tụy của tôm sú là

loài vi bào tử nội ký sinh Enterocytozoon hepatopenaei Vi bào tử Enterocytozoon

ñoạn phát triển khác nhau của vi bào tử trùng cũng ñược miêu tả, từ giai ñoạn sớm bào nang dạng amip cho ñến bào tử trưởng thành trong tế bào chất của tế bào vật chủ Các ñĩa cực và dạng sớm của các sợi cực phát triển trong nguyên sinh chất của bào nang dạng amip ñể mọc chồi và giải phóng ra khỏi bề mặt của bào nang Nghiên cứu cũng cho biết bào tử trưởng thành có hình oval, kích thước 0.7*1.1 µm, chứa một nhân ñơn, 5-6 sợi cực, một không bào phía

sau, một ựĩa móc gắn với sợi cực và một lớp thành electron dày (Somjintana Tourtip và ctv, 2009)

Ngoài ra, trong ao nuôi có xuất hiện một số dấu hiệu bất thường như:

tôm bị bệnh phân trắng, gan tôm bị teo hoặc rữa ựược gọi là bệnh Ộphân

tr ắngỢ (White faeces) Thông tin về bệnh ựã ựược ựăng tải trên tạp chắ Nuôi

trồng Thủy sản Châu Á - Thái Bình Dương, 2006 Theo Chalor Limsuwan (2006), bệnh phân trắng trên tôm sú có thể do vi khuẩn hoặc do nguyên sinh ựộng vật ựơn bào (Gregarine) Tuy nhiên theo nhận xét của tác giả thì trong hầu hết các trường hợp là do vi khuẩn Pornlerd Chanratchakool (2004) cũng thông báo bệnh có xuất hiện tại một số khu vực nuôi tôm sú ở Việt Nam Nhìn chung các thông tin ựó dừng lại ở mức ựộ thông báo về hiện tượng chứ chưa nghiên cứu sâu về bệnh này

2.2 Hiện trạng nghề nuôi tôm sú trong nước và tình hình dịch bệnh

Nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam ựang là ngành phát triển mạnh và nhanh chóng trong những năm gần ựây Theo thống kê mới nhất của FAO về xuất khẩu tôm sú trên thế giới (2006), Việt Nam tiếp tục 4 năm liền ựứng thứ 1 về giá trị xuất khẩu, sản lượng với 131.615 tấn, ựạt 1,25 tỷ USD Năm 2008 tôm tiếp tục là nhóm sản phẩm xuất khẩu dẫn ựầu với khoảng 185.000 tấn, trị giá 1,6 tỷ USD so với năm 2007 Thống kê của Tổng cục Hải quan cho biết tắnh ựến hết tháng 11/2009, xuất khẩu tôm của Việt Nam ựạt 190.490 tấn, trị giá trên 1,518 tỉ USD, tăng 7,4% về lượng và 0,73% về giá trị so với cùng kỳ năm 2008

Tuy nhiên, dịch bệnh ựang là trở ngại chắnh và gây nhiều khó khăn cho nghề nuôi tôm sú đã có nhiều nghiên cứu về bệnh liên quan ựến việc xác ựịnh các tác nhân gây bệnh chắnh trên tôm nuôi ở đồng bằng Sông Cửu Long

cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrios còn ghi nhận sự xuất

hiện của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon

Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1997) Tại miền Bắc, theo Mai Văn Tài và ctv (2008), năm 2004 tỷ lệ nhiễm bệnh ñốm trắng do vi rút là khá cao, tại Hải Phòng là 36%, Nam ðịnh 30,3%, Thanh Hóa 40%, Nghệ An (28,5%) và Hà Tĩnh 18,5% Bệnh ñầu vàng cũng xuất hiện với tỷ lệ nhiễm cao tại các tỉnh Hải Phòng, Nam ðịnh, Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh

Năm 2005, 2006, bệnh ñốm trắng vẫn là yếu tố trực tiếp gây chết ở một

số khu vực thuộc các tỉnh Hải Phòng, Nam ðịnh, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Thừa Thiên Huế Năm 2008, tại các vùng nuôi tôm ở ðồng bằng sông Cửu Long, tình trạng tôm sú chết hàng loạt ñã diễn ra trên diện rộng, trên khoảng 100.000 ha, trong ñó hơn 85% là diện tích luân canh lúa - tôm sú kết hợp Năm 2009, bệnh ñốm trắng cũng ñược báo cáo ñã xuất hiện ở nước ta tại một số tỉnhBạc Liêu, Bình Thuận, Long An, Cà Mau, ðồng Nai, Quảng Bình(NACA và FAO, 2009) Cũng trong năm này, diễn biến dịch bệnh trên tôm sú nuôi ở tỉnh Thừa Thiên Huế ñang có chiều hướng gia tăng Theo báo cáo của Chi cục Nuôi trồng Thủy sản Thừa Thiên Huế, bệnh tôm bắt ñầu xuất hiện vào cuối tháng 3 ñầu tháng 4/2010, tính ñến ñầu tháng 4/2010 tổng diện tích tôm sú trên toàn tỉnh bị nhiễm bệnh là 10 ha, xảy ra ở huyện Phú Lộc và Phú Vang ðến cuối tháng 5 tổng diện tích tôm bị bệnh ñã lên tới 889,7 ha Trong

ñó có 20,2 ha/63 hồ ñược xác ñịnh tôm bị bệnh ñốm trắng, 869,5 ha/2.648 hồ tôm ñược xác ñịnh là bị nhiễm bệnh khác có khả năng lây lan Hiện bệnh tôm

ñã và ñang xảy ra trên ñịa bàn bốn huyện nhưng bùng phát mạnh trên hai huyện là Phú Lộc, Phú Vang (Nguyễn Thị Mai, 2010)

Chi cục Nuôi trồng thủy sản Thừa Thiên - Huế còn cho biết, ñến nay, (06/05/2010), toàn tỉnh Thừa Thiên - Huế ñã có trên 180 ha ao tôm nuôi bị chết; trong ñó có 18 ha bị bệnh ñốm trắng và 162 ha bị bệnh môi trường, ñầu vàng… làm chết khoảng 200 triệu con tôm giống từ 30 - 40 ngày tuổi Số tôm

chết chủ yếu tập trung ở các huyện Phú Vang (gần 100 ha), Phú Lộc (trên 75 ha), Quảng ðiền (3,25 ha) và Hương Trà (gần 2 ha) (Bùi Quang Tề và ctv, 2010)

Cho ñến nay thì một số bệnh nguy hiểm như hội chứng vi rút ñốm trắng (WSSV), bệnh ñầu vàng (YHD), bệnh hoại tử của cơ quan tạo máu (IHHNV), MBV thường gặp trên tôm sú nuôi cũng ñã ñược nghiên cứu sâu và có nhiều báo cáo tại Việt Nam Tuy nhiên những báo cáo về bệnh phân trắng mới chỉ dừng lại ở một số báo cáo về sự xuất hiện bệnh mà chưa xác ñịnh ñược nguyên nhân và tác nhân gây bệnh, mặt dù bệnh này xảy ra phổ biến ở nhiều khu vực nuôi

2.3 Một số nghiên cứu về bệnh tôm trên thế giới và trong nước

2.3.1 Một số nghiên cứu về bệnh tôm trên thế giới

Nghiên cứu về bệnh tôm mới chỉ ñược phát hiện và tập trung trong vòng hơn 30 năm nay Các nhà nghiên cứu ñã ñưa ra nhiều phương pháp nhằm tìm ra tác nhân gây bệnh trên tôm, từ ñó ñưa ra các phương pháp phòng

và trị bệnh

Gây bệnh cho tôm nuôi do bởi nhiều tác nhân, trong ñó nhóm tác nhân gây bệnh là vi rút gây thiệt hại khoảng 60%, tiếp theo là vi khuẩn 20%, tác nhân gây bệnh là nấm gây thiệt hại khoảng 7%, 5% do ký sinh trùng và 8% còn lại không rõ tác nhân Chỉ có khoảng 6 loài vi rút ñược phát hiện trên tôm vào những năm 1980, nhưng con số này ñã lên tới hơn 20 loài vào những năm

1990 (Hernandez-Rodriguez và ctv, 2001) và con số mới nhất ñược công bố hiện nay (2007) là khoảng 30 loại (Lightner và Redman, 2007) ðặc biệt, các bệnh truyền nhiễm do nhóm virus WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHD (Yellow Head Disease) là những bệnh ñiển hình về mức ñộ gây thiệt hại nghiêm trọng Phương pháp mô bệnh học và sinh học phân tử ñang ñược ứng

dụng rộng rãi ựể chẩn ựoán, xác ựịnh WSSV, ngoài ra còn sử dụng các phương pháp hữu hiệu khác như huyết học, ELISA, các kỹ thuật ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) như Nested PCR, Realtime PCRẦ

Bệnh MBV cũng khá phổ biến trên tôm sú nuôi, tôm bị nhiễm bệnh thân chuyển màu xám xanh ựến xanh sậm ựen, giảm ăn, kém linh hoạt và chậm tăng trưởng Năm 1991, Kazuo Mômyama tổng kết tại Nhật Bản cho biết có khoảng 900 triệu con thuộc 20 loài giáp xác ựược sản xuất tại các trại

giống và nuôi trong các ao ựầm bị nhiễm bệnh do Baculovirus Trong ựó tôm

sú Penaeus monodon là loài ựược nuôi nhiều thứ 2 sau tôm he Nhật Bản và

chủ yếu nuôi ở vùng Yamaguchi bị bệnh MBV (Fulk Wendy và Main Kevan, 1992)

Lightner (1996), Brock và Lightner (1990), Fulk và Main (1992) ựã ựưa ra một số bệnh thường gặp do virus và ký sinh trùng gây bệnh trên tôm he nuôi tại khu vực châu Á như sau:

Bảng 2.1 Các bệnh do virus và ký sinh trùng thường gặp trên tôm he

(Penaeid shrimp) ở khu vực châu Á

+Hội chứng ựốm trắng (WSBV)

+Bệnh ựầu vàng (YHD)

+Bệnh BMN và MBV

+Bệnh nhiễm trùng dưới vỏ và hoại

tử cơ quan tạo máu (IHHNV)

+Bệnh HPV

+Hội chứng REO virus

+Bệnh Leucothrix mucor +Bệnh trùng hai tế bào +Bệnh sinh vật bám +Bệnh tôm bông

Chen và ctv tổng kết năm 1989-1990 tại đông Nam Á cho biết các ký sinh trùng gây bệnh thường gặp ở tôm là các dạng sinh vật bám như

Zoothamnium, Epistylis , trùng ống hút Acineta và bệnh trùng hai tế bào

về bệnh ký sinh trùng trên tôm nuôi ở khu vực phắa Nam đài Loan Kết quả nghiên cứu cho thấy tôm nuôi thường nhiễm ký sinh trùng giống

và Overstreest (1973) cũng có công trình nghiên cứu về tôm nuôi ở Thái Lan

và đài Loan cho thấy 2 loài ký sinh trùng 2 tế bào Gregarine ký sinh ở ruột

tôm nuôi với tỷ lệ nhiễm ựến 94% (Nguyễn Khắc Lâm, 2009)

đối với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, các vi khuẩn gây bệnh thường

gặp ở tôm là vi khuẩn Vibrio, Pseudomonas Nhóm gây hiện tượng tôm mòn

vỏ, hoại tử phụ bộ, ựốm ựen, nâu ghi nhận là do các nhóm Vibrio, Aeromonas

và Pseudomonas (Alapide-Tendencia và de la Pina, 2001) Bệnh do nhóm

Vibrio phát sáng ựã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở

Philippines, Ấn độ và Indonesia ựược xác ựịnh là Vibrio harveyi, Vibrio

Nghiên cứu về bệnh do vi bào tử ở giáp xác cũng ựược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và tìm hiểu Vi bào tử ký sinh ở nhiều loài giáp xác, hiện

nay ựã mô tả các giống: Agmasoma, Ameson, Nosema, Pleistophora, Tuzetia,

Thelohania, Flabelliforma, Glugoides, Vavraia, Ordospora, Nadelspora,

2002; Moodie et al., 2003; Amogan et al., 2006; Stentiford et al., 2007; Somjintana

et al., 2009), 50 loài vi bào tử ký sinh ở nhóm chân chèo (Copepoda); 30 loài vi bào

tử ký sinh ở Cladocera và hơn 30 loài ở tôm nước mặn, tôm he (P monodon, P

cua (Cancer magister, C maenas) và tôm hùm (Panulirus ornatus và P cygnus)

Năm 1992, Flegel và ctv nghiên cứu về bệnh tôm bông trên tôm sú (Penaeus

chết cao (trên 24%) là do tác nhân gây bệnh vi bào tử thuộc giống Agmasoma (Thelohania) Kiểm tra dưới kính hiển vi ñiện tử cho thấy giai ñoạn phát triển nhân

ñôi và giai ñoạn bào tử ở P monodon và P merguiensis không có sự khác biệt về mặt hình thái học Tôm sú nuôi dễ bị nhiễm bệnh tôm bông trong suốt giai ñoạn sinh

trưởng và dễ nhạy cảm bởi các yếu tố môi trường Tác nhân gây bệnh vi bào tử

bào tử Tác giả còn cho biết kết quả ñề tài về tác nhân gây bệnh là giống vi bào tử

tác giả khác ở Thái Lan như Donyadol et al., 1985; Prascrtphol, 1989

Kanokporn Chayaburakul và ctv (2004) ở Thái Lan ñã tìm ra dạng vi bào tử trên tôm sú Các tiêu bản mô học cho thấy một dạng ký sinh trùng thuộc lớp protozoan có khả năng kết thành bào tử chưa mô tả trước ñây và không phát hiện ñược bằng phương pháp PCR Biến ñổi về mô bệnh học gây ra bởi trùng vi bào tử này là hoại tử các tế bào biểu mô, kết mảng và ngấm qua màng máu của cơ quan gan tụy Ở giai ñoạn sớm thấy sự có mặt của các tế bào Lipid

R, các tế bào biểu mô của ống gan tụy bị hoại tử từ nhẹ ñến vừa phải, xuất hiện

sự gia tăng của các tế bào ưa kiềm, giảm lipid tế bào, nhân tế bào bị tiêu biến

Ở giai ñoạn muộn, ñặc trung là sự giảm các tế bào lipid, các ống gan bị teo lại, các tế bào biểu mô ống gan tụy bị bong tróc; một số tế bào biểu mô bong ra bị phình to do một số lượng lớn bào tử trong nguyên sinh chất

Theo Somjintana Tourtip và ctv, 2009 - Thái Lan: tìm thấy vi bào tử

(Enterocytozoon hepatopenaei) ký sinh trong gan tụy của tôm sú (Penaeus

ñịnh ký sinh trên gan tụy tôm sú Các giai ñoạn từ hợp tử sinh bào tử vô tính (sporogonal plasmodia) ñến bào tử trưởng thành chúng ñều kí sinh trong tế bào chất của tế bào gan tụy hình ống (vật chủ) Có rất nhiều nhân bào tử vô tính kết dính trực tiếp với tế bào chất và chứa rất nhiều hạt nhỏ (Bleb) trên bề mặt tế bào tôm Theo

Toubiana và ctv, 2004 vi bào tử ký sinh trên ba loài tôm he: Fenneropenaeus indicus,

Trong mấy năm gần ñây, trong các ao nuôi tôm sú còn xuất hiện loại bệnh mới ñược gọi là bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi, gây thiệt hại ñáng kể cho người nuôi tôm Tuy nhiên so với các nghiên cứu khác về bệnh tôm sú thì những nghiên cứu về bệnh phân trắng còn rất ít Theo Uma và ctv (2008) ñã ñặt tên bệnh phân trắng là Swollen Hindgut Syndrome (SHG) và cho rằng bệnh do ba loài

vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio gây ra bao gồm: Vibrio harveyi, V alginolyticus

và V Campbellii

Niti Chuchird và ctv (2008) cũng nghiên cứu về nguyên nhân của tôm

sú bị bệnh phân trắng nuôi trong các ao có ñộ mặn thấp (3 - 5‰) Theo nhóm tác giả này, tôm ở giai ñoạn 70 – 80 ngày có xuất hiện hiện tượng phân trắng,

ñó là những ñoạn phân trắng dài trên mặt nước Tôm có màu tối và dạt vào

bờ Khi phân lập vi khuẩn thì thấy xuất hiện 2 loài vi khuẩn là V alginolyticus

và V parahaemolyticus Tác giả cũng so sánh về tôm khi thu hoạch: sản

lượng trung bình, trọng lượng và tỷ lệ sống của tôm ở ao nuôi không bị bệnh cao hơn so với tôm ở những ao bị bệnh phân trắng.

2.3.2 Một số nghiên cứu về bệnh tôm ở Việt Nam

Nghề nuôi tôm ở Việt Nam, ñặc biệt là tôm sú nuôi luôn phải ñối mặt với nhiều rủi ro trong ñó có dịch bệnh, gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm

Năm 1990 Phan Văn Lương và ctv (1990) lần ñầu ñã công bố kết quả xác ñịnh ñược nguyên nhân gây chết tôm ở phía Nam chủ yếu do vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng Bên cạnh ñó các tác giả cũng ñã ñề xuất một số biện pháp phòng trị bệnh do vi khuẩn và ký sinh trùng như dùng một số chất kháng sinh, Formalin; ñồng thời luôn phải giữ môi trường ao nuôi tôm sạch

Năm 1991, khi bệnh tôm ñã phát triển tập trung ở một số khu vực

thuộc ñồng bằng sông Cửu Long, tiếp tục ñề tài của Phan Lương Tâm, Nguyễn Việt Thắng và ctv ñã thực hiện ñề tài nghiên cứu một số bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở ñồng bằng sông Cửu Long ðề tài ñã ñưa ra nguyên nhân

gây chết tôm chủ yếu là do vi khuẩn Vibrio, bệnh MBV và một số bệnh do ký

sinh trùng khác

Năm 1994, Bùi Quang Tề lần ñầu tiên ñã nghiên cứu về mức ñộ nhiễm bệnh MBV trên tôm sú nuôi các tỉnh ven biển phía Nam ðề tài cho biết bệnh MBV là một trong những nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam năm 1993-1994 Tiếp theo ñó ðỗ Thị Hoà cũng ñã nghiên cứu bệnh MBV trên tôm

sú nuôi ở các tỉnh Nam Trung Bộ, kết quả cho thấy: tỷ lệ nhiễm virus MBV ở

ấu trùng tôm sú là 33,8%, tôm giống là 52,5%, tôm thịt là 66,5% Năm 1995

sơ bộ ñiều tra bệnh tôm sú nuôi ở các tỉnh phía Bắc ñã nhiễm mầm bệnh MBV ở các tỉnh: Nghệ An, Thanh Hoá, Hải Phòng (Bùi Quang Tề và ctv, 1997)

Từ năm 1991-1995, Hà Ký và ctv ñã có công trình nghiên cứu thuộc ñề tài KN04-12 ðề tài chủ yếu thực hiện nghiên cứu ở các tỉnh phía Nam và ñã

công bố các bệnh thường gặp ở tôm sú (Penaeus monodon) là các bệnh dạng

sinh vật bám, bệnh do vi khuẩn và bệnh MBV

Năm 1996, ðỗ Thị Hòa ñã nghiên cứu một số bệnh thường gặp trên tôm nuôi tại khu vực Trung bộ Ở ñây tác giả ñã nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn trong môi trường ao nuôi, mức ñộ lây nhiễm của bệnh MBV và một số yếu tố của môi trường liên quan ñến sự phát bệnh, ñồng thời tác giả cũng thử nghiệm sử dụng một số loại thuốc ñể chữa trị một số bệnh do vi khuẩn và ký sinh trùng Nhiều công trình khác cũng ñã nghiên cứu về bệnh tôm ở các tỉnh ven biển phía Nam như chương trình “Khảo sát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường và tôm nuôi thương phẩm ở cáv tỉnh ven biển phía Nam”, công trình “Nghiên cứu sự phát triển các mầm bệnh trên tôm nuôi thương phẩm ở

các mô hình nuôi thực nghiệm khác nhau” (Nguyễn Văn hảo và ctv), công

trình “Nghiên cứu một số vi khuẩn và virus gây bệnh trên tôm sú (Penaeus

Thanh Loan (2002)

Nghề nuôi tôm sú ngày càng phát triển và mang lại hiệu quả cao, vì vậy

ở miền Bắc cũng hình thành một số vùng nuôi tôm tập trung như Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nghệ An, …Tuy nhiên các công trình nghiên cứu về dịch bệnh ở tôm ở các ñịa phương này không nhiều Năm 2000-2001, Bộ môn ñộng vật thủy sản -Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I ñã tổng hợp một số kết quả nghiên cứu bệnh tôm ở các tỉnh phía Bắc Trong báo cáo ñã tổng kết các hình thức nuôi tôm hiện nay ở phía Bắc và cho biết một số bệnh thường gặp ở tôm hiện nay là bệnh ñốm trắng (WSBV), bệnh MBV, bệnh ñầu vàng (YHD), một số nơi thuộc tỉnh Nghệ An bị nhiễm bệnh IHHNV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do sinh vật bám, bệnh tôm bông và bệnh trùng hai tế bào Tháng 4/2002, sau khi dịch bệnh tôm tại một số tỉnh phía Nam sông Hậu bị dịch bệnh ñốm trắng lan ra diện tích vài chục nghìn ha Bộ thủy sản cùng với Viện nghiên cứu thủy sản II và Sở thủy sản các tỉnh phía Nam tổ chức hội thảo nhằm hạn chế không cho dịch bệnh lan rộng thêm Hội nghị ñã tổng kết nguyên nhân gây ra bệnh là do con giống mang mầm bệnh từ trước trong khi công tác kiểm dịch không triệt ñể, cùng với thời tiết thay ñổi thất thường, nắng nóng kéo dài với mưa nhiều, gây thiệt hại cho các tỉnh miền Tây Nam Bộ như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiền Giang

Trong thời gian 3 năm (2003 - 2005), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I ñã tiến hành ñề tài “Nghiên cứu xây dựng giải pháp kỹ thuật nuôi tôm

sú, cá ba sa và cá tra ñảm bảm an toàn vệ sinh thực phẩm” Mục tiêu của ñề tài nhằm tạo ra ñược sản phẩm thuỷ sản ñảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm phục vụ tiêu dùng và xuất khẩu; ñánh giá ñược hiện trạng an toàn vệ

sinh thực phẩm trong nuơi trồng thủy sản cũng như hiệu quả kinh tế các mơ hình nuơi an tồn vệ sinh thực phẩm được xây dựng Ngồi ra cịn một số cơng trình nghiên cứu khác của các tác giả như Bùi Quang Tề (2003, 2008),

Hà Ký (2007), Văn Thị Hạnh (2005)… về các lồi bệnh tơm, các phương pháp chẩn đốn và qua đĩ đề xuất một số giải pháp phịng trị bệnh tơm nuơi

Năm 2004, các tác giả ðỗ Thị Hịa và ctv đã nghiên cứu và xuất bản

giáo trình “Bệnh học thủy sản”, trong đĩ cho biết gây bệnh tơm bơng ở tơm he

phát hiện cĩ 3 giống vi bào tử thường ký sinh gây bệnh ở tơm he, đĩ là giống

(Plistophora), giống Ameson (Nosema) Các giống bào tử ký sinh ở tơm cấu tạo cơ thể tương tự như Glugea Chiều dài bào tử khoảng 1-8 µm ðặc điểm của mỗi giống

khác nhau, giai đoạn tế bào giao tử (Sporont) hay gọi bào nang Số lượng bào tử trong bào nang của từng giống cũng khác nhau:

Các vi bào tử gây bệnh cho tơm là các sinh vật ký sinh bắt buộc, thường cĩ chu kỳ phát triển khá phức tạp Thử nghiệm dùng xác của tơm chết vì bệnh bào tử nhỏ, trộn vào thức ăn cho cá hồi biển, sau đĩ thu lấy phân cá hồi, trộn vào thức ăn cho tơm, bệnh đã phát sinh ở đàn tơm nuơi thí nghiệm sau một khoảng thời gian ngắn Như vậy, trong hệ thống nuơi giáp xác, sự cĩ mặt của các lồi cá, hoặc dùng cá tạp làm thức ăn cho tơm, chính là nguồn lây bệnh vi bào tử cho tơm cua nuơi Dấu hiệu của tơm he bị bệnh vi bào tử thường cĩ màu trắng đục, thể hiện ở các vùng cơ vân, hay mơ của các tổ chức cơ quan bị nhiễm Khi bệnh nặng, màu trắng đục cĩ thể xuất hiện ở nhiều nơi trên cơ thể Bệnh phẩm thu tại các mơ cơ bị nhiễm phát hiện thấy các bào tử cĩ kích thước nhỏ dưới kính hiển vi ở độ phĩng đại cao Trên các lát cắt

mơ học cĩ nhuộm H&E, cho thấy sự chiếm chỗ của các vi bào tử trong mơ cơ hay mơ của các cơ quan như gan tụy, chúng thường bắt màu hồng tím của hematoxylin Vi bào tử đã được phát hiện ký sinh gây bệnh ở nhiều lồi tơm he khác

nhau: P monodon, P merguiensis, P setiferus, P vannamei…và phân bố địa lý

của bệnh này cũng rất rộng, trên phạm vi toàn thế giới (ðỗ Thị Hòa và ctv, 2004)

Năm 2010, Bùi Quang tề và ctv ñã nghiên cứu và báo cáo một số kết quả bước ñầu nghiên cứu bệnh gan tụy trên tôm sú nuôi ở Việt Nam và biện pháp phòng ngừa Bước ñầu ñiều tra cho thấy vi bào tử có thể nhiễm từ giai ñoạn postlarvae của tôm Tôm sú ñưa vào nuôi thương phẩm từ 20 ngày ñến

120 ngày bệnh có thể xuất hiện Bệnh xuất hiện lan rộng khắp từ miền Bắc ñến các tỉnh ñồng bằng sông Cửu Long (Hải Phòng, Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau ñã ñiều tra năm 2010), thường gặp ở khu nuôi tôm công nghiệp Bệnh xuất hiện nhiều khi thời tiết biến ñộng: mưa, nắng thất thường, môi trường nước nhiễm bẩn…(Bùi Quang Tề và ctv, 2010)

2.4 Diễn biến dịch bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi ở nước ta

Bên cạnh những bệnh là nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm nuôi như bệnh ñốm trắng (WSSV), bệnh ñầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV), bệnh do vi khuẩn và những bệnh về dinh dưỡng, trong những năm gần ñây, ở các ao nuôi tôm sú còn xuất hiện bệnh phân trắng, gây thiệt hại ñáng kể cho người nuôi tôm

Bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi ñược phát hiện ở Việt Nam từ năm

1998 với các diễn biến phức tạp, lây lan nhanh, gây thiệt hại lớn cho người sản xuất (Nguyễn Khắc Lâm và ctv, 2004) Bệnh xuất hiện rải rác ở những ao nuôi mật ñộ cao từ 40 con P15/m2 trở lên nhưng không gây thiệt hại lớn, do vậy người nuôi tôm ít ñể ý Từ năm 2000 ñến nay bệnh phát triển ra nhiều vùng, gây thiệt hại ñáng kể cho nhiều vùng nuôi tôm, ñặc biệt là khu vực miền Trung, nơi hầu hết các diện tích ñều nuôi thâm canh theo quy trình ít thay nước Kết quả ñiều tra của nhóm nghiên cứu này trong năm 2002 cũng cho biết có khoảng 450 ha ao nuôi ở huyện Tuy Hoà (Phú Yên), 300 ha ở Khánh Hoà và 60 ha ở Bình Ðịnh có xuất hiện bệnh Trong năm 2003 bệnh tiếp tục phát triển lan rộng ra nhiều tỉnh như: Quảng Trị, Quảng Ngãi, Bình

Thuận, Thừa Thiên Huế Riêng ñối với Ninh Thuận trong năm 2003 diện tích bị dịch bệnh phân trắng trong cả 2 vụ lên ñến 600 ha, và chỉ trong 6 tháng ñầu năm

2004 số diện tích bị dịch bệnh lên ñến 500 ha Bệnh diễn ra ở hầu hết các vùng nuôi, tuy nhiên khu vực nuôi tôm trên cát là nơi xuất hiện bệnh với tỷ lệ cao nhất, chiếm tỷ lệ 80% Tỉnh Thừa Thiên Huế cũng có từ xấp xỉ một trăm ha cho tới vài trăm ha nuôi tôm bị bệnh Trong ñó, nhiều chục ha nuôi tôm bị bệnh phân trắng Bệnh làm cho tôm còi cọc, chậm lớn (Nguyễn Khắc Lâm, 2004)

Có nhiều ý kiến cho rằng bệnh do nhiều tác nhân gây nên bao gồm vi rút, vi khuẩn, nguyên sinh ñộng vật, tảo ñộc và môi trường (theo Bùi Quang

Tề, 2003; ðặng Thị Hoàng Oanh, 2008) Kết quả nghiên cứu bước ñầu của Nguyễn Khắc Lâm (2004) tại Ninh Thuận cho thấy tôm bị bệnh phân trắng có

sự hiện diện của các nhóm mầm bệnh Hepatopancreatic parvovirus (HPV), vi

khuẩn Vibrio gây hoại tử gan tụy và tảo lam Tác giả cho biết thấy sự có mặt của 4 tác nhân: Nhóm vi khuẩn Vibrio gây hoại tử gan tụy (V Proteolyticus,

trên mẫu nghiên cứu); nhóm virus: ñã phát hiện sự có mặt của virus HPV trên các mẫu tôm bệnh (chiếm tỷ lệ 36% trên các mẫu nghiên cứu); nhóm Tảo lam xuất hiện với tỷ lệ 45,4% trên các mẫu nghiên cứu Cuối cùng tác giả ñã

nhận ñịnh bệnh “Phân trắng, teo gan” có thể do nhiều tác nhân gây nên: vi

khuẩn, virus, tảo ñộc, nguyên sinh ñộng vật

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học tôm sú có dấu hiệu bệnh phân trắng nuôi ở một số tỉnh ñồng bằng sông Cửu Long của ðặng Thị Hoàng Oanh (2008) cũng thấy có sự xuất hiện của HPV và vi khuẩn Trong kết quả nghiên cứu này còn cho biết trên mô mang của tôm có nhiều khu vực tổn thương, bị biến ñổi cấu trúc làm bong tróc lớp kitin bao bọc bên ngoài và trên lớp tế bào

biểu mô mang xuất hiện nhiều không bào do nhiễm Zoothamnium sp và

nhuộm H&E thường có dạng hình tròn bắt màu hồng ñậm và dạng hình tròn bên trong có hình móng ngựa bắt màu tím Ngoài ra còn thấy các chất vẫn hữu cơ nằm xen giữa các sợi mang có tác hại làm cản trở quá trình trao ñổi khí Nhóm trùng hai tế bào Gregarine cũng ñược tìm thấy trên tôm sú thu từ các ao có dấu hiệu phân trắng tỷ lệ nhiễm khá cao (32,38%) Tổn thương do nhóm trùng hai tế bào này gây ra là sự hoại tử lớp niêm mạc ruột giữa, gây xuất huyết và ñào thải tế bào biểu mô ruột Trong khi ñó, theo Bùi Quang Tề (2007), bệnh phân trắng ở tôm nguyên nhân ñầu tiên do trùng hai tế bào làm gây tổn thương thành ruột, dạ dày của tôm kết hợp với môi trường ô nhiễm

lượng Vibrio phát triển gia tăng, tôm ăn thức ăn nhiễm Vibrio vào dạ dày ruột,

vi khuẩn nhân cơ hội gây hoại tử thành ruột có màu vàng hoặc trắng (Bùi Quang Tề, 2007)

Nguyễn Thị Hà, 2010 khi nghiên cứu về tác nhân gây bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi cho biết bệnh phân trắng ở tôm sú không phải là bệnh cấp tính gây ra làm tôm chết hàng loạt, nhưng khi tôm bị bệnh rất khó chữa khỏi, nếu tôm khỏi bệnh thì cũng trong tình trạng bị óp và chậm lớn, làm giảm ñáng

kể sản lượng cho người nuôi Tác giả còn cho biết tác nhân gây bệnh là do vi rút, vi khuẩn, ký sinh trùng, yếu tố môi trường, trong ñó tác nhân chủ yếu là

vi bào tử ký sinh trong gan tụy tôm sú và vi khuẩn thuộc giống Vibrio

(Nguyễn Thị Hà, 2010)

Hiện nay, do chưa xác ñịnh ñược tác nhân chính gây bệnh phân trắng trên tôm sú nuôi nên cho ñến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả Hiện tại các ñề tài nghiên cứu mới chỉ ñưa ra ñược các phương pháp phòng bệnh tổng hợp nhằm hạn chế rủi ro do bệnh này gây ra

PHẦN 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng và ñịa ñiểm nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng

Các loài ký sinh trùng trên tôm sú nuôi bị bệnh phân trắng và tôm sú nuôi không bị bệnh phân trắng

3.1.2 ðịa ñiểm

- ðịa ñiểm thu mẫu: Trong quá trình thực hiện ñề tài, chúng tôi không

có ñủ số lượng mẫu tôm sú bị bệnh phân trắng ở tỉnh Thừa Thiên Huế ñể thu mẫu nên ñã thu thêm một số mẫu tôm bị bệnh phân trắng tại tỉnh Nghệ An

Mẫu tôm sú ñược thu trong các ao nuôi ở tỉnh Thừa Thiên Huế và Nghệ

An, bao gồm:

+ Xã Quảng An, huyện Quảng ðiền, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Phú Xuân, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Lộc ðiền, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Quỳnh Xuân, huyện Quỳnh Lưu, tỉnh Nghệ An

- Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm của Khoa Sư phạm Kỹ thuật -

Trường ðại học Sư phạm Huế, ðại học Huế và phòng ký sinh trùng thuộc Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Bắc, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1

3.1.3 Số lượng mẫu thu

- Tôm bị bệnh phân trắng: 100 con

Mẫu thu tại:

+ Xã Quảng An, huyện Quảng ðiền, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Quỳnh Xuân, huyện Quỳnh Lưu, tỉnh Nghệ An

- Tôm không bị bệnh phân trắng: 100 con

Mẫu thu tại:

+ Xã Quảng An, huyện Quảng ðiền, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Phú Xuân, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế

+ Xã Lộc ðiền, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế

3.2 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng

Sử dụng phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của Viện sĩ V.A Dogiel

và bổ sung nghiên cứu của Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007)

Hình 3.1 Khái quát nghiên cứu ký sinh trùng

Mẫu tôm

Kiểm tra phần phụ, mang, ruột, gan tụy

Quan sát bằng kính lúp, kính hiển vi

Tiêu bản tươi

3.2.2 Phương pháp mô bệnh học

Quan sát sự biến ựổi về cấu trúc tế bào bị nhiễm vi bào tử của cơ quan gan tụy trong tôm bị bệnh phân trắng dưới kắnh hiển vi quang học dựa theo phương pháp của Lightner (1996) Quy trình xử lý mô học ựược tiến hành theo các bước như sau: Thu mẫu → Xử lý mẫu → đúc mẫu → Cắt mẫu → Nhuộm mẫu → đọc kết quả

3.2.3 Phương pháp thu mẫu

- Quan sát các các ao nuôi tôm sú có hiện tượng phân trắng và những dấu hiệu bệnh lý bên trong và bên ngoài của tôm sú bị bệnh phân trắng

- Thu mẫu các ao tôm bị bệnh phân trắng trong trường hợp tôm bị bệnh phân trắng Chọn những con có dấu hiệu bệnh lý của bệnh phân trắng ựể nghiên cứu như: trong ao có các sợi phân trắng xốp nổi lên trên mặt nước, trong các sàng thức ăn và có các váng như váng dầu thường tập trung vào góc cuối hướng gió Kiểm tra gan tôm thấy mềm nhũn và có màu trắng sữa, ruột tôm có màu trắng, bên trong có các giải phân ngắt thành từng ựoạn, không liên tục Mẫu ựược phân tắch tại hiện trường và trong phòng thắ nghiệm

- Thu mẫu các ao ựối chứng là những ao trong vùng nghiên cứu nhưng tôm không bị bệnh phân trắng, không có những dấu hiệu phân trắng như trên

- Tôm dùng ựể nghiên cứu là tôm sống

- Tiến hành ựo chiều dài và cân trọng lượng tôm nhanh chóng

3.2.4 Dụng cụ, hóa chất cần thiết ựể giải phẫu và nghiên cứu ký sinh trùng

ký sinh trên tôm

* Dụng cụ

- Kắnh lúp; kắnh giải phẫu có thị kắnh: x7, x10, vật kắnh: x2, x4, x10; kắnh hiển vi có thị kắnh: x10, x15, vật kắnh: x10, x40, x100

- Bộ ựồ giải phẫu gồm các dụng cụ sau: Dao liền cán cỡ vừa ựể lấy

nhớt, dao cán rời ñể rạch cơ, pinxet các loại, dùi nhọn giải phẫu, kéo các loại

- Các loại dụng cụ khác như: khay men, ñĩa petri, cốc thuỷ tinh nhỏ, ống thuỷ tinh nhỏ, chén thuỷ tinh nhỏ, lam kính và lamen

- Máy cắt mô (microtom) và dụng cụ phục vụ cho nhuộm mô tế bào

Sodium Iodate – NaI 0,4 gam

Acid Citric 0,2 gam

Chloral hydrate 100 gam

Nước cất 1000 ml

Postassium Alumnium sulphate 90,0gam

Hoà tan Haematoxylin trong nước cất sau ñó cho NaI và Posstasium Aluminium hoà tan, tiếp tục cho Acid Citric và Chloral hydrate

Dung dịch Eosin Y1 1% 100ml

Dung dịch Phloxine B1 1% 100ml

Acid Acetic ñậm ñặc 5ml

Hoà tan Eosin trong cồn sau ñó thêm Acid Acetic Trước khi hoà Eosin cho 2 – 3 giọt Acid Acetic vào cồn 70%

- Cồn các nồng ñộ: 70%, 75%, 80%, 95%, 100%

- Dung dịch Xylen - Parafin

- Thuốc nhuộm gram

+ Dung dịch 1: tím tinh thể (Crystal violet) 2g Crystal violet + 20 ml cồn etylic 96% + 0,8 g Ammonium oxalate + 80ml nước cất Hòa Crystal violet trong cồn; hòa ammonium oxalte trong nước cất, sau ñó trộn lẫn hai dung dịch, ñể yên sau 24h và lọc dung dịch

+ Dung dịch 2: Lugol 1g Iod tinh thể + 2g KI + 300ml nước cất Hòa tan KI trong khoảng 20ml nước, sau ñó cho Iod vào thêm nước cất vừa ñủ 300ml, ñể yên qua ñêm

+ Dung dịch 3: cồn acetone 95ml cồn etylic 95% + 5ml acetone + Dung dịch 4: Safranin

6g Safranin 0,85% + 20ml cồn etylic 95% + 200ml nước cất Hòa tan Safranin trong 20m cồn sau ñó cho thêm 200ml nước cất

3.2.5 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng

- Quan sát bằng mắt thường những dấu hiệu thay ñổi bên ngoài của tôm

bị bệnh phân trắng

- Thu mẫu bên ngoài: cắt các phần phụ, mang của tôm ðặt lên lam kính, nhỏ vài giọt muối sinh lý, quan sát dưới kính hiển vi có ñộ phóng ñại

100 lần (10×10)

3.2.5.2 Ki ểm tra nội ký sinh trùng

- Giải phẫu tôm: Lấy ruột, gan tụy Các mẫu này làm tiêu bản tươi sau

ñó soi dưới kinh hiển vi ñộ phóng ñại 100 lần (10×10), 400 lần (40x 10), 1000 lần (100x 10)

- Lấy nhớt trong ruột, ñể riêng lên lam kính, thêm vào 1-2 giọt nước và quan sát dưới kính hiển vi Ruột tôm lấy ra ñược cho vào lam kính (với ruột tôm nhỏ) hoặc cho vào một ñĩa lồng (với ruột tôm lớn) ðặt lên kính giải phẫu, dùng hai kim tiêm chia ruột theo các phần trước, giữa, sau và ñể riêng mỗi phần ở các vị trí khác nhau trên ñĩa lồng hoặc trên lam kính, cho vào mỗi

vị trí của ruột vài giọt nước muối có ñộ mặn của ao nuôi hoặc ñộ mặn 30‰ Dùng hai kim tiêm giải phẫu từng phần ruột, soi và ñếm toàn bộ ký sinh trùng có trong ruột

15 Lấy mẫu gan tụy phết mỏng lên lam kính ñể khô tự nhiên rồi nhuộm Gram hoặc cố ñịnh bằng cồn Methanol, sau ñó nhuộm Giemsa Sau ñó tiến hành soi dưới kính hiển vi quang học (X100)

3.2.6 Cố ñịnh, bảo quản và làm tiêu bản ký sinh trùng

* Cố ñịnh và bảo quản mẫu

- ðối với ký sinh trùng ñơn bào cố ñịnh mẫu bằng cách phết kính: Dùng lamen ñặt lên trên lam kính ở vị trí có mẫu, phết nhanh ñể khô tự nhiên

và nhuộm tiêu bản bằng bạc nitrat

- ðối với trùng hai tế bào Gregarine: Tốt nhất ta nên soi ngay khi tôm còn sống, những con chưa kiểm tra ñược ngay nên bảo quản trong dung dịch Davidsion Cũng có thể bảo quản tôm trong tủ lạnh vì qua thử nghiệm cho thấy trùng hai tế bào bảo quản ñược một thời gian trong tủ lạnh Tách trùng hai tế bào riêng rẽ từng con một và tiến hành nhuộm màu bằng Hematoxyline Tuỳ theo từng loại ký sinh trùng khác nhau mà có các phương pháp

nhuộm khác nhau

- ðể kiểm tra sự có mặt của vi bào tử trong gan tụy của tôm, tiến hành

cố ñịnh mẫu tôm bằng dung dịch Davidson Ấu trùng và tôm giống có thể ñể nguyên cả con trong lọ Tôm lớn dùng xilanh tiêm trực tiếp dung dịch cố ñịnh vào vùng mô làm mẫu từ 0,1 - 10 ml tuỳ theo trọng lượng của tôm (thường lượng thuốc cố ñịnh bằng 5 - 15 % trọng lượng của tôm) Tỷ lệ thuốc cố ñịnh

và mẫu là 10 : 1 Ngâm mẫu cố ñịnh từ 24 - 72 giờ tuỳ theo kích cỡ của tôm Sau ñó mẫu tôm ñược giữ trong dung dịch cồn 70%

* Nhuộm màu và làm tiêu bản

- Mẫu là các loài ký sinh trùng ñơn bào dùng Nitrat bạc (AgNO3) 2% ñể nhuộm (phương pháp của Krenh) Lấy lam có trùng xếp một lượt vào chậu thủy tinh (ñể mặt có trùng lên trên), dùng pipet nhỏ 2-3 giọt dung dịch AgNO32% lên lam (nhỏ ñều khắp mặt lam) Sau ñó ñể tất cả chậu thủy tinh trong bóng tối 10 phút Lấy mẫu ra rửa bằng nước sạch nhiều lần Tất cả các mẫu sau khi rửa ñược chuyển sang chậu thủy tinh chứa nước cất mới, ngập sâu 1-1,5 cm, mặt có trùng hướng lên trên, ñem phơi dưới ánh sáng mặt trời trong thời gian từ 30-60 phút tùy theo cường ñộ ánh sáng mặt trời Trong quá trình nhuộm, phải kiểm tra sự bắt màu của tiêu bản nhuộm Rửa lại nước cất nhiều lần và ñựng nghiên cho khô Tiến hành gắn tiêu bản bằng Bom Canada, chú ý tránh ñể có bọt Cuối cùng chọn tiêu bản ñẹp, lưu lại

- Mẫu là trùng hai tế bào Gregarine, nhuộm mẫu bằng Hematoxylin: Dùng ống hút nhỏ hút trùng ra, cho lên lam kính, dùng cồn 70% cố ñịnh trùng

và ñể khô trong không khí Sau khi khô cho vào dung dịch Feric Sulphat Amonium 3% trong 12-24 giờ ñể mẫu gắn chặt vào lam kính Rửa nước 2-3 phút Cho vào thuốc nhuộm Hematoxylin trong 12 giờ ñể bắt mầu Rửa bằng cách cho qua nước chảy nhẹ Sau ñó cho lam kính có trùng ñã nhuộm vào dung dịch Feric Sulphat Amonium 1,5% ñể phân ly mầu, sự phân ly có thể kéo dài trong vài phút ñến vài giờ Kiểm tra sự phân ly dưới kính hiển vi ñến

khi nhân bắt mầu nâu ñậm, tế bào chất mầu sáng trong là ñược Cho vào nước cất 1-2 lần Làm mất nước bằng cách cho lam kính có trùng ñã phân ly mầu lần lượt qua cồn 50%, 70%, 90%, 96% và 100%, mỗi nồng ñộ giữ từ 3-5 phút Tiếp theo cho mẫu ñã mất nước qua xylen trong khoảng 3-5 phút ñể làm trong Cho nhựa canada vào lam kính có trùng ñã qua xử lý, ñậy lamen lên (ñậy sao cho không có bọt khí trong tiêu bản) Ghi etyket ñầy ñủ gắn lên lam kính ðợi khô cho vào hộp ñựng tiêu bản ñể làm mẫu

- Mẫu là vi bào tử, nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm Gram hoặc Giemsa Phết mẫu gan tụy của tôm lên lam kính Nhỏ dung dịch 1: tím tinh thể (Crystal violet) lên tiêu bản, ñể yên 30-60 giây Rửa nước nhanh, vẩy khô Nhỏ dung dịch 2 (Lugol), ñể yên trong 1 phút (tiêu bản có màu ñen) Rửa nước nhanh, vẩy khô Nhỏ dung dịch 3 (cồn-aceton) từ ñầu lam, nghiêng lam

ñể cồn chảy qua chỗ phết mẫu ñể tẩy mầu Rửa nước nhanh, vẩy khô Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) ñể yên 1-2 phút Rửa nước, ñể khô (dùng giấy thấm khô, không ñể xước mẫu) Soi kính hiển vi bằng vật kính dầu (X100)

Ngoài ra có thể nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa Mẫu gan tụy ñược phết mỏng lên lam kính ñể khô tự nhiên, cố ñịnh bằng cồn Methanol, sau ñó nhuộm Giemsa Tiến hành soi dưới kính hiển vi quang học (X 40, X100)

ðể kiểm tra sự có mặt của vi bào tử trong các tế bào của gan tụy, tiến hành làm mô tế bào Các bước ñược thực hiện như sau:

+ Khử nước ở mẫu bằng dung dịch cồn có nồng ñộ tăng dần

+ Làm sạch mẫu trong xylen

+ Cuối cùng thấm parafin cho mẫu sau khi ñã làm sạch

+ Cắt gọt khối parafin có mẫu: Dùng dao cắt gọt bỏ những parafin thừa

và mặt của khối có mẫu cắt sâu vào 3 – 5 mm

* Cắt mẫu

+ Gắn khối Parafin vào máy cắt mô (Microtom)

Cắt mẫu: Những lát cắt dày khoảng 5 – 7µm Chọn mẫu cắt: ñặt các lát cắt vào nước ấm, chờ cho mẫu phẳng rồi lấy lam kính hớt nhẹ cho mẫu nằm ở giữa lam

+ Sau ñó ñể lam vào máy sấy ở nhiệt ñộ 450C cho mẫu khô rồi ñem nhuộm màu

* Nhuộm màu: nhuộm tiêu bản theo hai phương pháp:

- Ph ương pháp nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E)

+ Loại parafin bằng xylen và rửa nước: cho khay ñựng mẫu vào lần lượt qua xylen I, xylen II, mỗi dung dịch 5 phút Sau ñó cho qua lọ cồn 100% (I), cồn 100% (II), cồn 95%, cồn 70% (mỗi nồng ñộ 2 phút) Sau ñó cho vào nước nhúng khoảng 10 lần, thấm giấy rồi cho vào hematoxylin

+ Nhuộm Hematoxylin theo Mayer: 2 - 5 phút

+ Rửa nước cho ñến khi có màu xanh nhạt nhuộm Eosin

+ Nhuộm Eosin 5 - 10 phút

+ Làm mất nước: cho vào cồn 75%, cồn 95%, cồn 100%(I), cồn 100% (II) mỗi nồng ñộ 2 phút

+ Làm trong mẫu: cho vào xylen I, xylen II mỗi xylen 2 phút

+ Gắn lamen lên mẫu ñã nhuộm bằng BomCanada Tuỳ theo kích cỡ thước mẫu dùng các lamen tương ứng Khi ñặt lamen lên lam kính

từ từ không ñể bọt khí

- Ph ương pháp nhuộm bằng giemsa

+ Loại parafin bằng xylen và rửa nước: cho khay ñựng mẫu vào lần lượt xylen I, xylen II, mỗi dung dịch 5 phút Sau ñó cho qua lọ cồn 100% (I), cồn 100% (II), cồn 95%, cồn 70% (mỗi nồng ñộ 2 phút) Sau ñó cho vào nước nhúng 10 lần, thấm giấy rồi cho vào dung dịch giemsa

+ Ngâm mẫu trong dung dịch giemsa ñể qua ñêm

+ Sau khi nhấc mẫu ra khỏi dung dịch giemsa ta cho mẫu vào nồng ñộ cồn 50%, 70%, 95%, 100%(I), 100% (II), mỗi nồng ñộ 2 phút Sau

ñó cho qua xylen I, xylen II (mỗi xylen 5 phút)

+ Gắn lamen lên mẫu ñã nhuộm bằng Bom Canada Tuỳ theo kích cỡ thước mẫu dùng các lamen tương ứng Khi ñặt lamen lên lam kính

từ từ không ñể bọt khí

* ðọc kết quả

- ðối với nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (H&E)

+ ðọc kết quả dưới kính hiển vi

+ Nhân tế bắt màu xanh tím, tế bào chất bắt màu hồng, các thể ẩn trong nhân tế bào nhiễm bệnh bắt màu ñỏ ñồng ñều

- ðối với nhuộm bằng giemsa

+ Ký sinh trùng sẽ bắt màu tím

+ Nhân sẽ bắt màu xanh

+ Collagen và các mô khác sẽ bắt màu hồng

3.2.7 Phân loại ký sinh trùng

Có thể phân loại ký sinh trùng dựa vào dạng sống hoặc ñã cố ñịnh hoặc

ñã làm tiêu bản Nghiên cứu hình thái cấu tạo của ký sinh trùng, ño các chỉ tiêu phân loại cần thiết ñối với từng loài khác nhau

Phương pháp ño kích thước ký sinh trùng: Ký sinh trùng nhỏ dùng thước ño thị kính, ký sinh trùng lớn dùng giấy kẻ ly ñể ño kích thước ðo tất

cả các chỉ tiêu của yêu cầu phân loại ñối với từng loại ký sinh trùng Số lần ño tuỳ thuộc vào từng loài ký sinh trùng, số lượng nhiều ño từ 10 - 15 cá thể Số lượng ít ño toàn bộ cá thể bắt gặp Ký sinh trùng ñơn bào ño ít nhất là 15 cá thể Ký sinh trùng giun sán ño ít nhất là 10 cá thể

Sử dụng một số tài liệu sau ñể phân loại ký sinh trùng:

- Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề,

2007

- Ký sinh trùng ñơn bào của Lom và Dykova, 1992

- Apicomplexa Eugregarinorida the genera của Tiến sĩ sinh học Richard E Clopton, 2000

- Institute of Biology of the Southern seas, Nationnal, Academy of