Nghiên cứu phân loại cá tiểu bạc ở hồ thác bà yên bái

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan những số liệu viết trong bản luận văn này là trung thực và chưa từng ñược công bố ở bất kỳ công trình nào Kết quả có ñược ở luận văn do sự cố gắng làm việc, nghiên cứu và học hỏi một cách nghiêm túc của bản thân

Tác giả

ðỗ Văn Sơn

LỜI CẢM ƠN

Lời ựầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS.Thái Thanh Bình, người ựã ựịnh hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ và tạo ựiều kiện ựể tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Mark Schultz, cán bộ Trung tâm công nghệ sinh học - Trường đại học Charles Darwin Australia người ựã giúp tôi trong quá giải trình tự ADN cá Tiểu bạc

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới KS.Nguyễn Văn Hảo, CN.Nguyễn Phương Hồng người ựã trực tiếp giúp ựỡ, hộ trợ tôi hoàn thành các thắ nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ công nhân viên phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, phòng thắ nghiêm công nghệ sinh học Thuỷ Sản - trường Cao đẳng Thuỷ Sản - Bắc Ninh, cán bộ công nhân viên Công ty Cá tầm phương bắc và ban chủ nhiệm ựề tài Ộđánh giá tác ựộng của việc di giống, thuần hoá cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà và ựề xuất hướng phát triểnỢ ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường ựại học Nông nghiệp Hà Nội; Phòng ựào tạo và hợp tác quốc tế - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 ựã tạo ựiều kiện ựể tôi có ựược khoá học này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm tới các anh chị ựồng nghiệp, bạn bè, gia ựình ựã cổ vũ và giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tác giả

đỗ Văn Sơn

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

PHẦN I MỞ ðẦU 1

PHẦNII TỔNG QUAN 3

2.1 Một số ñặc ñiểm sinh học của cá Tiểu bạc 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Phân bố và di giống cá Tiểu bạc ở Trung Quốc 3

2.1.3 ðặc ñiểm dinh dưỡng 5

2.1.4 ðặc ñiểm sinh trưởng 5

2.1.5 ðặc ñiểm sinh sản 6

2.2 Quá trình di giống thuần hóa cá Tiểu bạc vào Việt Nam 6

2.3 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước và trong nước 8

2.3.1 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước 8

2.3.2 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở trong nước 9

2.4 Một số ứng dụng di truyền phân tử ADN ở ty thể trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam 10

2.5 Tổng quan phương pháp sử dụng ñể phân loại 11

2.5.1 Tách chiết ADN 11

2.5.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 12

2.5.3 ðoạn mồi (Primer) 14

2.5.4 ðiện di 16

2.5.5 Xây dựng quan hệ phả hệ 16

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian, ñịa ñiểm thực hiện ñề tài 18

3.2 ðối tượng nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp thu mẫu 18

3.4 Phương pháp phân loại hình thái 22

3.5 Phương pháp phân loại bằng giải trình tự ADN 26

3.5.1 Tách chiết ADN 26

3.5.2 Phản ứng PCR 28

3.5.3 ðiện di 29

3.5.4 Làm sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit QIAGEN 30

3.5.5 Giải trình tự ADN 31

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 32

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả nghiên cứu hình thái cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà 33

4.2 Kết quả nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc bằng giải trình tự ADN ở ty thể vùng gen Cytochrome b 40

4.2.1 Phân loại cá Tiểu bạc dựa trên cây phả hệ 41

4.2.2 Kết quả phân tích sự sai khác giữa các loài cá Tiểu bạc 46

4.2.3 Kết quả phân tích khoảng cách di truyền giữa các nhóm loài cá Tiểu bạc 47

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

V : ðơn vị ño hiệu ñiên thế

dNTP : Deoxy nucleoside triphosphate

Taq : Thermus aquaticus

Min : Nhỏ nhất

TB : Trung bình

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Các loài cá trong giống Neosalanx ở Trung Quốc 4

Bảng 3 1 ðịa ñiểm, code mẫu, số lượng mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác

Bà ñược phân loại bằng hình thái và giải trình tự ADN 21 Bảng 3 2 Các chỉ tiêu phân loại hình thái 22 Bảng 4 1 Các chỉ tiêu hình thái của cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà năm

2009, các ký hiệu ñược trình bày ở bảng 3.2 37 Bảng 4 2 Chỉ tiêu ñếm của cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà năm 2009 38 Bảng 4 3 ðối chiếu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà với khóa phân loại 39 Bảng 4 4 Các loài cá Tiểu bạc trên ngân hàng gen ñược sử dụng ñể so

sánh với cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà 41 Bảng 4 5 Số base sai khác giữa các loài cá Tiểu bạc 47 Bảng 4 6 Khoảng cách di truyền giữa loài cá Tiểu bạc so với cá Tiểu

bạc ở hồ Thác Bà 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2 1 Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái 3

Hình 2.2 Sơ ñồ nguyên lý của phản ứng PCR 14

Hình 3.1 ðịa ñiểm thu mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái 20

Hình 3 2 Sơ ñồ giải mã trình tự ADN của cá Tiểu bạc 26

Hình 3 3 Máy PCR 29

Hình 3 4 Máy ñiện di kiểm tra sản phẩn PCR 30

Hình 4 1 Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái 34

Hình 4 2 Mẫu a là cá ñực và b là cá cái; a1 là vây hậu môn của cá ñực, b1 là vây hậu môn của cá cái 36

Hình 4 3 Cây Neigbor Joining ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 42

Hình 4 4 Cây Minimun Evolution ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 43

Hình 4 5 Cây Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 44

Hình 4 6 Cây Neigbor Joining – dạng vòng ñược xây dựng từ các trình tự ADN của cá Tiểu bạc vùng gen Cytochrome b với giá trị bootstrap ñược tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu ñược trình bày ở Bảng 3.1 45

đến thế kỷ XVIII, Linnaeus vẫn giữ hệ thống của Artedi nhưng ựã có

sự thay ựổi và bổ sung quan trọng đặc biệt tên mỗi loài ựược sử dụng tên gọi kép: tên giống và tên loài, công trình này ựược xem là cơ sở của phân loại học Trên cơ sở hệ thống này Linnaeus ựã mô tả 2.600 loài cá [16] Từ ựó cho ựến nay ựã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại cá ựược công bố và bổ sung vào thành phần, số lượng các loài cá hiện nay

Ở Việt Nam việc phân loại cá ựược biết ựến qua sử sách ghi lại từ rất sớm, bắt ựầu từ thời Lê Quý đôn, song những nghiên cứu thực sự về phân loại từ cuối thế kỷ XIX, ựặc biệt là nghiên cứu phân loại các loài cá nước ngọt đầu tiên là tác giả E Sauvage năm 1881; sau ựó ựến G Tirant năm

1883, L Vaillant từ năm 1881 Ờ 1904, P Chevey từ năm 1930 - 1937 Công trình nghiên cứu khu hệ cá của P Chevey và J Lemasson với tác phẩm ỘGóp phần nghiên cứu các loài cá Bắc Bộ Việt NamỢ ựược coi là nghiên cứu lớn nhất ở thời kỳ này Công trình ựã xác ựịnh ở Miền Bắc Việt Nam có 98 loài trong 71 giống, 17 họ và 10 bộ [5], [6] Những năm kế tiếp ựã có nhiều tác giả Việt Nam tiến hành phân loại cá như: Mai đình Yên năm 1987 ựã phân loại ựược 210 loài, 27 họ và 11 bộ Công trình nghiên cứu này ựã bổ sung và thay thế P Chevey và J Lemasson Ngoài ra còn nhiều tác giả khác như Nguyễn Thái Tự (1983), Nguyễn Hữu Dực (1995), Võ Văn Phú (1998), Ngô

Sỹ Vân (1999), Nguyễn Thị Thu Hè (2000), Vũ Trung Tạng, Nguyễn Văn Hảo (2001, 2005) đã phân loại ựược khu hệ cá nước ngọt Việt Nam có 540 loài, 228 giống, 57 họ thuộc 18 bộ

Có thể nói, phân loại cá ở Việt Nam ựã có ựạt ựược thành tắch lớn Xong chưa thể phân loại ựược hết các loài cá, ựặc biệt là các loài cá di nhập

từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới ngày càng ựược phát triển Tuy nhiên việc phân loại bằng hình thái gặp nhiều khó khăn ở một số loài có kắch thước nhỏ, ở các giai ựoạn trứng, ấu trùng, hình thái thay ựổi theo môi trường

để khắc phục những hạn chế của phương pháp phân loại cá dựa vào hình thái, việc kết hợp ứng dụng marker phân tử, ựặc biệt ADN ở ty thể trong phân loại cá là rất cần thiết Vì ADN ở ty thể di truyền theo dòng mẹ, không

có sự trộn lẫn Giải mã trình tự ADN các vùng gen ở ty thể cho kết quả nhanh chắnh xác, thu mẫu không gây hại ựến ựộng vật

Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà là ựối tượng ựược di nhập vào Việt Nam ở dạng trứng từ Trung Quốc, khi trưởng thành cá có kắch thước nhỏ, mình trong suốt và hầu như không có vẩy do ựó khó phân loại Từ khi ựược di nhập ựến nay chưa có một công trình nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà nào ựược công bố

Xuất phát từ vấn ựề trên chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài: ỘNghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên BáiỢ

Mục tiêu

Phân loại ựược cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái

Nội dung nghiên cứu

Phân loại cá Tiểu bạc dựa vào hình thái

Phân loại cá Tiểu bạc bằng giải trình tự ADN ở ty thể vùng gen

Cytochrome b

Cá không có ñường bên, vây lưng nằm ở phần sau cơ thể

Tiểu bạc Neosalanx ở Trung Quốc hiện nay ñược xác ñịnh có 8 loài khác nhau

ở (Bảng 2.1) Trong ñó có loài Neosalanx pseudotaihuesis Zhang,1987 gọi là

loài tựa Neosalanx taihuesis về mặt hình thái [38], [39], [43]

Bảng 2 1 Các loài cá trong giống Neosalanx ở Trung Quốc

Cá Bạc Thái hồ tự nói lên xuất xứ ựầu tiên của ựịa bàn phân bố Cá ựược thuần hóa, di giống vào các hồ khác nhau của Trung Quốc từ năm 1979 Hiện nay, cá Tiểu bạc ựã có mặt hầu hết ở khắp các hồ chứa ở các tỉnh của Trung Quốc Trước tiên cá ựược di giống vào hồ điền Trì ở cao nguyên Vân Nam, tiếp theo là các hồ ở phắa tây nam Vân Nam [18] Theo tài liệu của Tạ Tuấn và ctv (1997) thì sản lượng khai thác các năm ở toàn tỉnh Vân Nam [22]:

Năm 1981 khai thác ựược 6,5 tấn

Năm 1982 khai thác 1200 tấn

Năm 1984 khai thác 3503 tấn

đến cuối năm 1994 có 90% số hồ của tỉnh Vân Nam ựã ựược nhận cá Tiểu bạc di giống và sản lượng ựạt 3.000 Ờ 5.000 tấn Nếu cộng từ năm 1985 Ờ 1994 sản lượng cá thu ựược 25.000 tấn, giá trị 750.000.000 NDT, giá mỗi

kg là 30 NDT hay 3,614 USD Tiếp theo là tỉnh Quảng đông từ năm 1996

Cho ựến cuối thế kỷ trước cá Tiểu bạc từ Thái hồ ựã di giống về ựến 10 tỉnh ở Trung Quốc từ Bắc chắ Nam như Cát Lâm, Hồ Nam, Phúc Kiến, Nội Mông, Hắc Long Giang, Triết Giang [21]

Tóm lại, qua các tài liệu ta thấy ựược ựịa bàn phân bố tự nhiên trước ựây

và bây giờ của cá Tiểu bạc khác nhau rất xa, nhờ di giống mà mở rộng vùng

phân bố

Cá Tiểu bạc không phải là loài xâm hại trên thế giới [29] Tuy nhiên, chưa có công trình nào ở Trung Quốc cũng như trên thế giới nghiên cứu ựánh giá tác ựộng của việc di giống thuần hoá loài cá này ựến ựa dạng sinh học, ựến nuôi trồng và phát triển nguồn lợi thuỷ sản

2.1.3 đặc ựiểm dinh dưỡng

Thức ăn chủ yếu của cá Tiểu bạc là ựộng vật phù du trong ựó các loài

Bosmina coregoni, Daphnia longispina, Mesocyclops leuckarti là thức ăn chắnh chiếm từ 20 -100% tổng số thức ăn trong ruột cá ở vùng Thái hồ Cá có tập tắnh bắt mồi vào ban ựêm thời gian bắt mồi từ 21giờ ựến 9 giờ sang ngày hôm sau [23]

2.1.4 đặc ựiểm sinh trưởng

Cá Tiểu bạc ở Thái hồ 10 tháng tuổi có chiều dài thân trung bình 7,5cm, nặng 1,57g, ở hồ Khánh Lan, Quảng Tây cá có chiều dài thân 74 - 88

cm, nặng 1,35 - 1,5 g Cá nuôi ở điền Trì, Vân Nam 12 tháng tuổi dài trung bình 8,42 cm, nặng 3,74g Ở một số hồ tự nhiên người ta ựã phát hiện những con lớn nhất có chiều dài 10 -12 cm, nặng 19 - 20 g, cá 10 tháng tuổi ở Quảng đông dài trung bình 7,35 cm Tốc ựộ sinh trưởng nhanh trung bình 10 ngày tăng 12,95% khối lượng cơ thể [36]

đây là loài cá có ựặc ựiểm sinh trưởng nhanh, sức sinh trưởng lớn, năng lực cạnh tranh sinh tồn mạnh, tuy nhiên chu kỳ sống ngắn cho nên khả năng tái tạo quần ựàn dao ựộng rất lớn trong các năm thường chênh lệch từ 3-

10 lần Trong công tác quản lý phát triển nguồn lợi phải chú ý cao ñộ, ñặc biệt chú ý con giống ñể tái tạo phục hồi nguồn lợi [41]

2.1.5 ðặc ñiểm sinh sản

Cá Tiểu bạc là loài có chu kỳ sống ngắn Hầu hết các tài liệu ñều nói cá

có tuổi thọ một năm, nhưng gần ñây ñã phát hiện một số ít có tuổi thọ hai năm

Sức sinh sản của cá Tiểu bạc tương ñối cao ñạt từ 1.024 – 2.100 trứng/1g khối lượng cơ thể, sức sinh sản tuyệt ñối dao ñộng theo cỡ cá thường

cỡ 74mm sức sinh sản 2.354 trứng Lần ñẻ ñầu tiên cá có kích thước từ 70mm [12]

53-ðặc ñiểm phân biệt chính giữa cá ñực và cá cái khi ñạt kích cỡ thành thục vào mùa sinh sản Cá ñực có vây hậu môn hình quạt, viền sau lồi tạo thành vòng cung hơi tròn ñều và có hàng vẩy phía trên gốc vây hậu môn; phía trước gốc vây hậu môn phần cơ thịt to hơi lồi và thô ráp Cá cái vây hậu môn hình dài, viền sau lõm vào, không có vẩy ở phía trên vây hậu môn; phía trước vây hậu môn bằng phẳng không thô [49]

Mùa vụ sinh sản vào hai mùa chính: mùa xuân và mùa thu, tỷ lệ cái/ñực trong quần ñàn thường từ 1,3/1 - 3,5/1

Thời gian phát triển phôi của cá dài: Ở nhiệt ñộ 13oC là 163 giờ, ở nhiệt

ñộ 18,9oC là 85 giờ Nhiệt ñộ càng cao tốc ñộ phát triển phôi càng ngắn

2.2 Quá trình di giống thuần hóa cá Tiểu bạc vào Việt Nam

Cá Tiểu bạc cách ñây nửa thế kỷ chỉ là một loài cá hoang dại như nhiều loài cá khác, nhưng trong thời gian chừng 20 – 30 năm nay nó ñã trở thành ñối tượng ñược người dân các vùng ñông tây nam bắc Trung Quốc chú ý phát triển nuôi và rất coi trọng [8]

Cá Tiểu bạc có giá trị dinh dưỡng cao, phù hợp với yêu cầu chất lượng thực phẩm hiện nay (mỡ ít, ñạm nhiều) do vậy việc nhân giống cá Tiểu bạc

ñang trở thành yêu cầu ñối với nhiều nơi ở Trung Quốc Giá trứng thụ tinh là 8.200 – 8.500 USD / 1 triệu trứng Giá cá thương phẩm tại bến cá từ 3.000 – 3.500 USD/ tấn ñắt gấp 10 lần giá các loại cá bình thường Người Trung Quốc gọi cá Tiểu bạc là “sâm nước”, hay “vàng mềm”, giá chào xuất khẩu bằng 9.000 - 10.000 USD/1 tấn Người Nhật rất ưa thích cá này, tiếp ñó là các nước châu Âu với các kiểu chế biến khác nhau Nhu cầu thế giới mỗi năm tiêu thụ khoảng 150.000 tấn Hiện nay Trung Quốc chỉ mới ñáp ứng ñược 20.000 tấn/1 năm [22]

Cá Tiểu bạc ñược di nhập vào nước ta năm 1995 từ Côn Minh – Vân Nam – Trung Quốc và ñược thả nuôi ở hồ Thác Bà – Yên Bái [13] Sau khi thả cá chỉ ñược khai thác ở năm ñầu, các năm tiếp theo không khai thác ñược Những nghiên cứu ban ñầu về loài cá này cũng ñã ñược ghi nhận Ngô Sỹ Vân, 1999 [27] ðến năm 2001, cá Tiểu bạc lại tiếp tục nhập nội thả vào hồ Thác Bà do Trung Tâm thuỷ sản Yên Bái thực hiện Từ năm 2000 - 2001 Trung tâm thuỷ sản Yên Bái hợp tác với công ty trách nhiệm hữu hạn Triết Giang - Vân Nam tiến hành di giống cá Tiểu bạc vào hồ Thác Bà - Yên Bái Trung tâm chuyển trứng thụ tinh (trên một triệu trứng) về thả xuống hồ, lần thứ 2 vào năm 2001 thả mười triệu trứng thụ tinh, tất cả ñều lấy ở hồ chứa ở Vân Nam Sau khi thả ñược một năm, Trung tâm thuỷ sản Thác Bà ñã dùng

ñủ các loại ngư cụ ñánh bắt thử ở hồ nhưng không thu ñược cá Tiểu bạc Riêng số cá thả ở các ao ương cỡ lớn (10.000m2/ao) thì trứng cá nở và lớn, phát triển bình thường tuy có nhiễm bệnh [25] Năm 2005 cá Tiểu bạc ñã xuất hiện ở Mông Sơn và Cầu Biệc, năm 2006 ở Mông Sơn, Phú An, ñến năm

2007 xuất hiện ở Mông Sơn, Bãi Sỏi - Yên Bình, Cầu Biệc, Phúc An, Mỹ Gia, dọc hệ thống sông chảy lên Phan Thanh Thống kê cá Tiểu bạc do ngư dân khai thác ñược ñem bán ở các chợ cận kề hồ chứa và ở thị trường xa hơn như

ở Hải Phòng, Hà Nội cho thấy sản lượng cá Tiểu bạc khai thác ñược năm

2007 khoảng 10 tấn Theo cán bộ kỹ thuật Trung tâm thuỷ sản Yên Bái thì cá này phân bố rộng, từ hạ lưu ñến thượng lưu hồ chứa, tập trung vào các vùng ven sông chảy của hồ Thác Bà

Theo các ñánh giá sơ bộ của Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 1 và Trung tâm thuỷ sản Yên Bái từ năm 2007 tới nay, cá Tiểu bạc phát triển với

số lượng khá lớn ñã ñem lại hiệu quả kinh tế cao cho các ngư dân khai thác cá trên hồ giá từ 40.000ñ ñến 120.000ñ/kg, nhiều ñêm khai thác ñược 4 - 10kg/vó 400m2

Mặc dù cá Tiểu bạc ñã hình thành quần ñàn lớn ở hồ Thác Bà, tuy nhiên cho ñến nay chưa một nghiên cứu khoa học chính thức nào ñược công bố Nhiều ý kiến nghi ngờ cho rằng có phải là cá Tiểu bạc hay không ðây là một trong những vấn ñề cần nghiên cứu phân loại rõ ràng ñể khẳng ñịnh Nhưng nhìn chung sự phát triển của quần ñàn cá Tiểu bạc trước mắt

ñã cải thiện năng suất cá trên hồ ñồng thời có ñem lại thu nhập cho người dân khai thác

2.3 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước và trong nước

2.3.1 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở ngoài nước

Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc cũng như mối quan hệ giữa loài cá

này với các loài trong giống Neosalanx ñã ñược nhiều nhà nghiên cứu cá ở

Trung Quốc quan tâm

Chu & ctv (1900) ñã tiến hành phân loại về phương diện hình thái tại

tỉnh Vân Nam – Trung Quốc Tác giả ñã phân loại ñược trong họ Salangidae có một giống Neosalanx và một loài trong giống này là Neosalanx taihuensis [33]

Pan (1991) tác giả ñã xác ñịnh loài Neosalanx tangkahkeii [46]

Zhoujie Zhang Chun – Guang (2005) ñã tiến hành phân loại ở các thủy vực của Quảng Tây – Trung Quốc và phân loại ñược ba loài trong ba giống

Loài Neosalanx taihuensis, Leucosoma chinensis, Salanx cuvieri [49]

Zhang & ctv (2007) nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc và mối quan hệ

của nó với các loài trong họ Salangidae Zhang & ctv (2007) cho rằng loài Neosalanx taihuensis gần giống loài Neosalanx pseudotaihuensis [51]

Fu & ctv (2005) cũng nghiên cứu mối quan hệ các loài trong họ

Salangidae sử dụng giải mã trình tự ADN vùng gen 16S và Cytochrome b [50]

2.3.2 Nghiên cứu phân loại cá Tiểu bạc ở trong nước

Ở Việt Nam cá Tiểu bạc ñược biết ñến từ năm 1995 do di nhập từ Côn Minh – Vân Nam – Trung Quốc và ñược thả nuôi ở hồ Thác Bà Sau khi thả, cá chỉ ñược khai thác ở năm ñầu, các năm tiếp theo không khai thác ñược [13]

Những nghiên cứu ban ñầu về loài cá này cũng ñã ñược ghi nhận thông qua luận văn thạc sỹ “Hiện trạng khu hệ cá hồ chứa Thác Bà - Luận văn thạc

sỹ Trường ñại học Nha Trang” - Ngô Sỹ Vân, 1999 [27]

Năm 2001, dự án của Trung tâm thuỷ sản Yên Bái hợp tác với công ty trách nhiệm hữu hạn Triết Giang – Vân Nam tiến hành di giống cá Tiểu bạc vào hồ Thác Bà - Yên Bái dưới dạng trứng ñược thụ tinh

Nghiên cứu về cá Tiểu bạc ñược ñề cập ñến trên cuốn sách “ Cá nước ngọt Việt Nam – tập III” do tác giả Nguyễn Văn Hảo năm 2005 [6]

Trong cuốn tài liệu Kỹ thuật nuôi thủy ñặc sản nước ngọt tập II (Tái bản lần thứ 3 có sửa chữa bổ sung), NXB Nông nghiệp Hà Nội tác giả Ngô Trọng Lư, Thái Bá Hồ, 2005 cũng xác ñịnh có cá Tiểu bạc trên hồ Thác Bà và cho rằng ñây là loài có giá trị kinh tế cao [9]

Tuy nhiên, tất cả các công trình nghiên cứu trên chỉ mang tính chất cập nhật ghi nhận có sự tồn tại cá Tiểu bạc ở Thác Bà – Yên Bái

2.4 Một số ứng dụng di truyền phân tử ADN ở ty thể trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam

Những năm gần ñây việc ứng dụng di truyền phân tử trong nuôi trồng thủy sản là khá phổ biến trên nhiều lĩnh vực Như làm dấu theo dõi quần ñàn ñem lại ñộ chính xác cao trong di truyền và chọn giống cá, nghiên cứu ña dạng di truyền, lập bản ñồ gen, phân loại cá … ðặc biệt việc sử dụng ADN ở

ty thể, vì ADN ở ty thể có hầu hết ở các sinh vật có nhân chuẩn ADN ty thể

là chuỗi xoắn kép trần, dạng vòng, kích thước từ 15 – 20Kb, trong ñó có 13 gen mã hóa protein, 22 gen tARN, 2 gen rARN và vùng không mã hóa dài khoảng 1000bp gọi là vùng ñiều khiển ADN ở ty thể là vật chất di truyền ngoài nhân, di truyền theo dòng mẹ ða dạng ADN ty thể ñược sử dụng rộng rãi trong phân loại [26]

Nhiều tác giả ñã ứng dụng di truyền phân tử rất thành công trong nuôi trồng thủy sản: chọn giống cá Rophi dòng GIFT, phân tích cấu trúc di truyền và quan hệ chủng loại của các quần thể cá tra nuôi [2] Nghiên cứu nâng cao chất lượng di truyền cá trắm cỏ, cá mrigan [18], khảo sát ña dạng di truyền một số quần ñàn tôm sú bằng hai kỹ thuật RAPD và mtADN PCR – RFLP [9]

Ngoài ra việc ứng dụng di tryền phân tử vào phân loại một số loài thủy sản, ñặc biệt là ADN ở ty thể trong phân loại cá rất phổ biến vì ADN ở ty thể

di truyền theo dòng mẹ, không có sự trộn lẫn Giải mã trình tự ADN các vùng gen ở ty thể cho kết quả nhanh chính xác, thu mẫu không gây hại ñến ñộng vật và rất hữu hiệu trong phân loại sinh vật hiện nay

Những năm gần ñây phương pháp giải mã trình tự ADN các vùng gen ở

ty thể ñã bắt ñầu ñược áp dụng ñể phân loại các loài cá nuôi ở Việt Nam Nguyễn Kiều Dợi và ctv (2007) ñã kết hợp giữa giải mã trình tự vùng gen 16S rRNA trên ADN ty thể và khóa phân loại ñã phân biệt ñược 3 loài cá thuộc họ

cá da trơn Pangasiidae [3] Ngô Sĩ Vân & Thái Thanh Bình (2006) ñã hoàn

thiện ñịnh loại cá Rô tổng trường và cá Tràu tiến vua bằng cách giải mã 16S rRNA trên ADN ty thể và RAG1 trên ADN của nhân [28] Thái Thanh Bình

& ctv (2004; 2006) phân biệt ñược sự khác nhau giữa cá chép trắng Việt Nam

và các dòng cá chép trên thế giới bằng phương pháp giải trình ADN ở ty thể Thái Thanh Bình & ctv ñã phân loại các loài cá trong họ cá chép dựa trên giải

mã trình tự ADN của ty thể vùng gen 16S rRNA, D-Loop và Cytochrome b

[47], [48]

Thái Thanh Bình & ctv (2009) phân loại các loài cua xanh trong giống

Scylla tại Việt Nam bằng giải trình tự ADN ở ty thể vùng gen COI Các tác

giả ñã phát hiện có ít nhất 4 loài cua xanh phân bố ở Việt Nam Loài Scylla paramamosia là loài phân bố phổ biến nhất hiện nay [1]

2.5 Tổng quan phương pháp sử dụng ñể phân loại

2.5.1 Tách chiết ADN

Mọi nghiên cứu và ứng dụng di truyền phân tử ñều bắt ñầu từ việc chiết xuất và tinh sạch một lượng ñủ lớn ADN

Yêu cầu của chiết xuất và tinh sạch là:

Có ñược ñủ một lượng axit nucleic mong muốn, còn nguyên vẹn Không bị phân huỷ, bị gãy bởi tác ñộng cơ giới, hoặc bị phân giải bởi một số enzyme nội, ngoại bào và hoá chất

Theo Phan Hữu Tôn (2009), sinh vật nhân thật ADN phần lớn nằm trong nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào, một lượng nhỏ nằm ở trong ty thể và lạp thể ðể ñảm bảo tách chiết ñược ADN ñáp ứng các yêu cầu trên thì cần gồm các bước cơ bản sau ñây [17]:

Lấy mẫu ñể chiết tách ADN ñó là phá vỡ màng tế bào và nhân bằng

nghiền tế bào (ñối với sinh vật ña bào) trong nitơ lỏng hoặc ñá lạnh với dung dịch chiết xuất

Hoà tan ADN và loại bỏ các tạp chất, thành phần trong mẫu ADN khi chiết xuất thường chứa cả protein, ARN, carbohydrate và lipid, do vậy cần phải loại bỏ các tạp chất này ra khỏi dung dịch ADN Hiện nay người ta thường dùng một số hợp chất ñể loại bỏ các tạp chất trên như sau: dùng phenol/chloroform/isoamyl với tỷ lệ tương ứng là: 25:24:1 ñể chiết tách ADN

và kết tủa các protein, ARN, carbohydrate và lipid Sau ly tâm sẽ thu ñược phần dung dịch nước phía trên ống nghiệm chứa ADN hòa tan Phần kết tủa nằm phía dưới ñáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn

Kết tủa ADN: nhằm thu ñược ADN ở dạng cô ñặc và bảo vệ chúng không bị phân hủy bởi các enzyme DNase và khi cần thì lại hòa tan chúng theo nồng ñộ tùy ý

2.5.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật nhân ADN ñặc hiệu) là một kỹ thuật nhằm nhân bản phân tử ADN hoặc ñoạn ADN nhất ñịnh, lặp ñi lặp lại qua nhiều chu kì trong ống nghiệm cho ñến khi thu ñược một khối lượng mong muốn Phương pháp này do nhà hoá sinh kiêm nhà thơ tên là Kary Mullis phát hiện vào năm 1985 và sau ñó ñã ñược tặng giải thưởng Nobel Thành công chính của phương pháp là việc phát hiện ra enzyme ADN polymerase hoạt ñộng tốt ở nhiệt ñộ cao tới 100oC nhưng không có khả năng ñọc sửa [4], [30]

Nguyên tắc của PCR: Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi

ñể tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN ñặc hiệu dựa trên hoạt ñộng của enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt ñộng của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase ñều cần những mồi là những ñoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một ñầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau ñó sẽ

ñược nối dài ra nhờ hoạt ñộng của ADN polymerase ñể hình thành một mạch mới hoàn chỉnh [42]

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước chính:

B ước 1: Biến tính: Xử lý nhiệt ñộ ñể tách ADN mạch kép thành mạch

ñơn dùng làm khuôn ñể tổng hợp mạch mới Nhiệt ñộ thường là 94 – 95oC, trong thời gian 2 – 5 phút

B ước 2: Gắn mồi: Hạ nhiệt ñộ xuống khoảng 30 – 65oC trong khoảng

20 giây ñến 2 phút Các ñoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc

bổ sung, ñây là giai ñoạn quan trọng Nhiệt ñộ gắn mồi phải ñảm bảo ñúng ñể

khả năng gắn mồi tốt nhất, tránh hiện tượng gắn không ñặc hiệu

B ước 3: Kéo dài: Các dNTP ñược lắp ráp tạo thành mạch ñơn ADN

mới bổ sung với mạch khuôn bắt ñầu từ mồi Nhiệt ñộ bước này là 68 –

72oC Thời gian kéo dài tùy thuộc vào chiều dài của ñoạn cần nhân lên, thời gian khoảng 20 giây ñối với ñoạn cần nhân lên nhỏ hơn 500 nucleotit, 40 giây ñối với ñoạn ADN nhỏ hơn 1.200 nucleotit, thường thì thời gian kéo dài

2 – 5 phút

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như trên, lặp lại từ 25 ñến 50 lần tùy thuộc mục ñích yêu cầu nghiên cứu Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nếu kéo dài quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng theo Số phân tử ADN nhân ñược lên tính theo công thức sau: N=2(A-2), trong ñó N là số ñoạn ADN sẽ ñược nhân lên, A

là số chu kì phản ứng trừ ñi 2 vì ở 2 chu kì ñầu không nhân ñược một phân tử ADN nào

Có thể tóm tắt các bước của chu kỳ phản ứng theo sơ ñồ sau [45]:

Hình 2.2 Sơ ñồ nguyên lý của phản ứng PCR

2.5.3 ðoạn mồi (Primer)

ðoạn mồi: là một sợi nucleic acid (hoặc ribonucleic acid) dùng ñể làm ñoạn khởi ñầu cho quá trình nhân ñôi của ADN Hầu hết các ADN (enzyme

PHẢN ỨNG PCR

Lặp lại 30 - 40 lần

Bước 1: Biến tính

xúc tác quá trình nhân ñôi ADN) không thể bắt ñầu tổng hợp một ñoạn ADN mới mà thiếu primer Vì nó chỉ gắn các nucleotide vào sợi primer có sẵn theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn [14]

Trong hầu hết các quá trình sao chép ADN tự nhiên, mồi cơ bản cho việc tổng hợp ADN là sợi RNA ngắn RNA này ñược tạo ra bởi RNA polymerase, nó ñược loại bỏ ñi và ñược thay thế bằng ADN bởi ADN polymerase

Nguyên tắc hoạt ñộng của ñoạn mồi: là những ñoạn ADN ñơn có kích thước chỉ vài chục base (18-30), cứ thế bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào ñoạn khởi ñầu và ñoạn kết thúc của chuỗi ADN ñích khi chuỗi ñích này ñược biến tính thành sợi ñơn Trong thử nghiệm PCR, ñoạn mồi có hai vai trò chính: (1) Quyết ñịnh nên tính ñặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu ñoạn mồi ñược chọn càng ñặc hiệu cho chuỗi ñích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi ñích mà không thể bắt cặp ñược trên các chuỗi ADN khác ngoài chuỗi ñích thì sản phẩm PCR càng ñặc hiệu và thử nghiệm PCR càng ñặc hiệu (2) Khởi ñộng men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt ñầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi ADN ñích một khi nó nhận dạng ñược ñầu 3', (là ñầu mà nó xúc tác cho một dNTP - deoxy nucleoside triphosphate, tức là ñơn vị ñể có thể tổng hợp ñược các bản sao của ADN ñích ñược gắn vào) ñang ở tình trạng sợi ñôi Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dựng một cặp mồi gọi là primer set, trong ñó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi là down-stream prime Cặp mồi này quyết ñịnh nên kích thước của sản phẩm PCR Chúng càng bắt cặp trên chuỗi ñích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu [44]

2.5.4 ðiện di

Phương pháp này ñược sử dụng trong cả phân tích ñịnh tính và ñịnh lượng và cả thu nhận và tách các axit nucleic và cả protein ra từ một hỗn hợp mẫu

Cơ sở khoa học của phương pháp dựa trên khả năng di chuyển của những phân tử tích ñiện trong dung dịch ở trường ñiện di, ñối với axit nucleic thường mang ñiện tích âm phân bố ñều khắp phân tử Dung dịch thường ñược giữ trong giá thể, các lỗ như giấy lọc hoặc cellulose acetate hay trong các gel tạo bởi tinh bột, agar hay polyacrylamide Các phân tử (axit nhân và protein) khác nhau sẽ có ñộ tích ñiện, kích thước, hình thể và khối lượng phân tử khác nhau Khi chịu tác ñộng của ñiện trường chúng sẽ di chuyển về ñiện cực, trường hợp axit nhân sẽ di chuyển về cực dương [17]

Phương pháp ñiện di trong gel thường ñược sử dụng ñể phân li (phân ñoạn) ADN, oligonucleotide, protein sau ñó có thể dùng ñể giám biệt và tinh chế các chất ñó Có 2 phương pháp ñiện di axit nhân là ñiện di trên gel agarose và polyacrylamide, khả năng phân tách của 2 phương pháp có khác nhau Nếu muốn phân tách các ñoạn ADN dài từ 0,5 ñến 25kb thì dùng ñiện

di trên nền gel agarose Trong khi muốn phân tách ñoạn ADN nhỏ từ 2 ñến 300bp thì nên dùng phương pháp ñiện di trong gel polyacrylamide [10]

2.5.5 Xây dựng quan hệ phả hệ

Mục ñích của phân tích phả hệ nhằm xây dựng lại mối quan hệ tiến hóa của các giống loài sinh vật Phương pháp phổ biến hiện nay là xây dựng cây phả hệ (cây phân loại) dựa trên số liệu di truyền phân tử và các chương trình phần mền Hầu hết các phương pháp có thể phân biệt ñược các loài dựa trên các thuật toán khác nhau [34]

Phương pháp so sánh theo cặp dựa vào các khoảng cách di truyền của từng loài nhờ thông tin số liệu ma trận Những ma trận này thường ñược xây dựng dựa trên số liệu ñầu vào của 3 loại cây phả hệ phổ biến:

- Neigbor Joining (NJ)

- Minimun Evolution (ME)

- Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean (UPGMA) Các phương pháp này dựa trên các hàm logaric tạo nên các giả thiết về quá trình tiến hóa khác nhau Ví dụ UPGMA dựa theo tỷ lệ tiến hóa cân bằng trong suốt quá trình phát triển của cây phân loài Ưu ñiểm của phương pháp này là có thể phân tích với lượng số liệu lớn, cho kết quả nhanh ME ñược tiến hành bằng cách cân bằng các nhóm của cây tiến hóa Các cây ñược so sánh trong ñiều kiện chuẩn hóa [32], [40]

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, ñịa ñiểm thực hiện ñề tài

Thời gian thực hiện: ðề tài ñược thực hiện từ tháng 10 năm 2008 ñến tháng 11 năm 2009

ðịa ñiểm thực tập: ñề tài tiến hành thu mẫu tại hồ Thác Bà - Yên Bái và phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thuỷ sản Trường Cao ñẳng Thuỷ sản - Bắc Ninh kết hợp với Trung tâm công nghệ sinh học - Trường ðại học Charles Darwin - Australia

3.2 ðối tượng nghiên cứu

Cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà - Yên Bái

3.3 Phương pháp thu mẫu

Dựa vào ñặc ñiểm hình thái ñể thu mẫu, ñịa ñiểm thu mẫu, số mẫu ñược phân tích hình thái và ADN ñược trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1

Hồ Thác Bà là hồ chứa lớn nên mẫu cá Tiểu bạc ñược thu từ 10 ñiểm ñại diện vùng nước nông, sâu, bãi ñẻ mỗi ñiểm thu 30 mẫu cá Mẫu ñược thu vào ban ñêm bằng phương pháp cất vó kết hợp với ánh sáng ñèn hoặc kéo lưới vét vào ban ngày

Mẫu ñược thu với 2 mục ñích ñó là dùng ñể phân loại hình thái và phân loại bằng giải mã trình tự ADN

- Thu mẫu cá Tiểu bạc ñể phân loại hình thái

+ Cách thu mẫu: Mẫu ñược thu ở 10 ñiểm trên hồ bằng cách cất vó kết hợp với ánh sáng ñèn vào ban ñêm, diện tích của vó là 400m2 Ngoài ra một

số ñiểm ở hồ Thác Bà có ñộ sâu của nước thấp (vùng nước nông) có thể dùng lưới vét ñể thu cá Tiểu bạc vào ban ngày Mỗi ñiểm ñược thu 30 mẫu cá, tổng

10 ñiểm thu 300 mẫu

+ Cách bảo quản mẫu: Mẫu cá dùng ñể phân loại hình thái ñược bảo quản trong bình thủy tinh dung tích 500ml, mỗi ñiểm một bình Dung dịch

bảo quản mẫu là formol nồng ñộ 4% Các ñiểm ñược ñánh dấu riêng ñể tránh nhầm lẫn

- Thu mẫu cá Tiểu bạc ñể giải mã trình tự ADN

+ Cách thu mẫu: Mẫu dùng ñể giải trình tự ADN ñược tiến hành lấy một lượng thịt cá khoảng 0,2g trên cơ thể cá bằng kéo cắt, yêu cầu cá vẫn còn tươi, sống và ñược lấy trực ở hồ Thác Bà Mẫu dùng ñể giải trình tự ADN ñược lấy ngẫu nhiên 5 mẫu trong 30 mẫu ở mỗi ñiểm thu mẫu Tổng số mẫu dùng ñể giải trình tự ADN là 50 mẫu

+ Cách bảo quản mẫu: Mẫu thịt cá dùng ñể giải trình tự ADN ñược bảo quản trong ống Eppendoft dung tích 1.500µl, dung dịch bảo quản là cồn tuyệt ñối nồng ñộ 99% Phần còn lại dùng ñể phân loại hình thái ñược bảo quản trong bình thủy tinh dung tích 250ml có chứa dung dịch formol nồng ñộ 4%

ñể bảo quản Các ñiểm, các mẫu dùng giải trình tự ADN ñược ñánh dấu riêng

ñể tránh nhầm lẫn

Tổng 300 mẫu dùng ñể phân loại hình thái và giải trình tự ADN ñược bảo quản, vận chuyển về Phòng thí nghiệm - Trường cao ñẳng thủy sản ñể tiến hành phân tích

Hình 3 1 ðịa ñiểm thu mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái

Bảng 3 1 ðịa ñiểm, code mẫu, số lượng mẫu cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà ñược phân loại bằng hình thái và giải trình tự ADN

mẫu

Số mẫu phân tích hình thái (mẫu)

Số mẫu giải trình tự ADN (mẫu)

Yên Bình, tỉnh Yên Bái

Yên Bình, tỉnh Yên Bái

Yên Bình, tỉnh Yên Bái

3.4 Phương pháp phân loại hình thái

Phân loại cá Tiểu bạc dựa vào hình thái theo phương pháp của Prauvdin (1973), Pan (1991), Zhoujie Zhang Chun – Gay (2005)

Tiến hành quan sát mẫu tươi sống và miêu tả hình thái bên ngoài của cá thông qua màu sắc, số lượng vây, vị trí vây, vẩy cá

Tiến hành ño, ñếm và tính toán một số chỉ tiêu hình thái của cá Tiểu bạc ở hồ Thác Bà – Yên Bái ðối chiếu với khóa phân loại gốc của cá Tiểu bạc ở Trung Quốc

Phương pháp phân loại cá tiểu bạc bằng hình thái bên ngoài thông qua các chỉ tiêu ơ Bảng 3.2

Bảng 3 2 Các chỉ tiêu phân loại hình thái

STT Các chỉ tiêu

Chiều dài toàn bộ thân: là chiều dài từ ñầu mút mõn

cá cho ñến hết vây ñuôi của cá

Chiều dài cá ñến thùy giữa vây ñuôi: là chiều dài từ ñầu mút mõn cá cho ñến ñiểm giữa bắt ñầu phân nhánh của vây ñuôi cá

3 Lo Chiều dài thân bỏ ñuôi: là chiều dài từ ñầu mút mõn cá cho ñến gốc vây ñuôi

4 Ot Chiều dài mõn cá : là chiều dài từ ñầu mút mõn cá cho ñến viền trước mắt

5 O ðường kính mắt: là chiều dài từ viền mắt trước ñến miền mắt sau của cá

6 Op Phần ñầu sau mắt: là chiều dài từ viền mắt sau ñến hết xương nắp mang

7 T Chiều dài ñầu: là chiều dài từ ñầu mút mõn cá cho ñến hết xương nắp mang

Chiều rộng miệng: là chiều rộng tối ña của miệng cá

từ trái qua phải

Chiều cao lớn nhất của thân: là chiều cao từ phía trên trên của thân ñến phía dưới của thân cá ở vị trí trước vây lưng

Khoảng cách giữa vây ngực và vây bụng: là chiều dài

từ khởi ñiểm vây ngực cho ñến khởi ñiểm vây bụng của cá

23 VA

Khoảng cách giữa vây bụng và vây hậu môn: là chiều dài từ khởi ñiểm vây bụng cho ñến khởi ñiểm vây hậu môn

Chiều cao vây mỡ: là chiều cao từ khởi ñiểm gốc vây

mỡ cho ñến hết tia vây cao nhất

Chiều dài gốc vây hậu môn: là chiều dài từ khởi ñiểm gốc vây hậu môn cho ñến hết gốc vây hậu môn phía sau

30 hA Chiều cao vây hậu môn: là chiều cao từ khởi ñiểm gốc vây hậu môn cho ñến hết tia vây cao nhất

Chiều dài thùy dưới của vây ñuôi: là chiều dài từ khởi ñiểm gốc vây ñuôi cho ñến hết tia vây cao nhất phía dưới

35 Tia giữa C

Chiều dài tia giữa của vây ñuôi: là chiều dài từ khởi ñiểm gốc vây ñuôi cho ñến hết tia vây giữa vị trí phân nhánh giữa 2 thùy trên và dưới

Răng của hàm trên

45 Rằng hàm dưới Răng của hàm dưới

3.5 Phương pháp phân loại bằng giải trình tự ADN

Hình 3 2 Sơ ñồ giải mã trình tự ADN của cá Tiểu bạc

Gải mã trình tự ADN ñược tiến hành theo các bước: Tách chiết ADN,

nhân bản ADN, làm sạch sản phẩm PCR, ñọc trình tự (Hình 3.2)

3.5.1 Tách chiết ADN

Crandall (1999) [34]

* Hóa chất tách chiết ADN

- Cell Lysis Solution: 10 mM Tris, 100mM EDTA, 2% SDS pH: 8

MẪU CÁ

TÁCH CHIẾT

CẶP MỒI

LÀM SẠCH SẢN PHẨM PCR

- Cho 5 µl dung dịch Proteinase K vào ống

- Lắc nhẹ ñều mẫu 20 lần bằng vỉ lắc hoặc bằng tay

- ðem ủ mẫu trong hệ thống ủ nhiệt ở nhiệt ñộ 550C trong khoảng 8 giờ hoặc lâu hơn tùy theo khả năng tan của mẫu cho tới khi mẫu tan hoàn toàn (dung dịch mẫu trong suốt)

- Thêm 240 µl dung dịch Ammonium acetate vào ống

ðảo ñều mẫu trên máy votex trong khoảng 20 giây, sau ñó ñem ñể lạnh sâu

-200C từ 2- 3 giờ (ít nhất là 1giờ ) ñể protein và tạp tủa xuống ñáy

- Ly tâm với tốc ñộ 13.000 vòng/phút trong 5 phút

- Bỏ tủa thu dịch bằng cách hút lấy 700 µl dịch nổi cho vào ống mới (nếu thành phần dịch lấy ra vẫn chứa hàm lượng protein cao thì có thể lập lại lần 2

ñể ñảm bảo mẫu không chứa tạp và protein)

- Cho vào ống mẫu 700 µl dung dịch Iso protanol

- Lắc ñều mẫu từ 25 - 50 lần ñể dung dịch Iso protanol hòa tan vào mẫu

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

- ðem mẫu ủ lạnh (- 200C ) trong 3giờ ít nhất trong 1giờ, ñể tủa ADN

- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

- Bỏ dich, thu phần kết tủa ADN bằng cách ñổ dịch nhẹ ra ngoài kết hợp với

úp miệng ống lên giấy thấm ñể loại bỏ hoàn toàn dung dịch

- Cho vào 700 µl dung dịch Ethanol (cồn) 70% vào, ñảo vài lần ñể rửa lại ADN cho sạch

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút

- Bỏ cồn thu tủa ADN bằng cách ñổ cồn nhẹ ra ngoài

- Làm khô mẫu ADN bằng cách mở nắp eppendofd chứa ADN ñể trong hộp thanh trùng 2 - 3 giờ hoặc úp xuống giấy thấm ñể ở nhiệt ñộ phòng thí nghiệm ñến khi mẫu khô hoàn toàn

- Cho vào 100 µl dung dịch nước khử Iôn, lưu giữ trong tủ lạnh ( - 200C)

3.5.2 Phản ứng PCR

Cytochrome b ở ty thể Vùng gen Cytochrome b của cá Tiểu bạc ñược khuếch

- Chuẩn bị agarose gel:

Cân 2 mg agarose cho vào ống

Cho 100 ml TAE 1X vào ống và khấy ñều ñể hòa tan agarose

ðun trên lò vi sóng trong khoảng 2 phút ñến khi dung dịch agarose trong suốt

ðể dung dịch agarose nguội ở nhiệt ñộ 60 – 640C

ðổ dung dịch agarose ñã ñun sẵn vào khuôn gel ñã kẹp máng chắc chắn

và cài lược sẵn (lược 10 giếng hoặc 15 giếng tùy thuộc vào số lượng mẫu ñiện di), khi ñổ phải từ từ và luôn tạo dòng ñể gel không lẫn bọt khí

ðộ dày của gel khoảng từ 3 – 5 mm

Rút lược ra sau khi gel ñã ñặc (thường sau khi ñổ gel khoảng 20 thì rút lược ra) Khi rút phải rứt khoát và theo phương thẳng ñứng ñể tránh giếng bị vỡ

ðặt gel vào buồng ñiện di có chứa dung dịch TAE 1X, dung dịch này

phải phủ ñầy mặt gel nhưng không ñược quá mức max trong buồng ñiện di

- Cho mẫu vào giếng:

Dùng micropipet lấy 1 µl loading dye ñể trên giấy nến chống thấm

Lấy 3 µl ADN trong mẫu PCR cho vào 1 µl loading dye

ðảo ñều dung dịch mẫu bằng pipet

Dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng, không làm tràn ra ngoài và sang các giếng bên cạnh

Giếng cuối cùng nạp marker

- Chạy máy ñiện di

Chỉnh hiệu ñiện thế 110 V, mức mA là 500

Chạy máy trong khoảng 25 - 30 phút, khi nào thấy vạch chạy 3/4 bản gel thì dừng lại

Mang bản gel sau khi chạy ñiện di ñi nhuộm bằng ethidium bromide

trong 10 phút rồi mang soi

Quan sát dưới ñèn UV

Hình 3 4 Máy ñiện di kiểm tra sản phẩn PCR 3.5.4 Làm sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit QIAGEN

* Các bước tiến hành làm sạch sản phẩm PCR bằng QIA quick PCR

- Cho 100 µl Buffer PB vào ống chứa sản phẩm PCR