Nghiên cứu bệnh thối củ hại trên cây sì to và khảo sát một số biện pháp phòng trừ

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2010

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu và ñiều tra ñược trình bày trong luận văn là do tôi thực hiện, các số liệu công bố hoàn toàn trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Vũ Thị Tuyết Mai

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện ñào tạo Sau ñại học, khoa Nông học, Bộ môn Bệnh cây

Hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc ñến:

PGS.TS Ngô Bích Hảo - Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã dành nhiều thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này;

Các thầy cô giáo, cán bộ công nhân viên thuộc Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội;

Ban lãnh ñạo Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội - Viện Dược liệu, TS Phan Thuý Hiền - trưởng Bộ môn Canh tác - bảo

vệ thực vật ñã tạo giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài này

ðể hoàn thành luận văn này, tôi còn nhận ñược sự ñộng viên khích lệ của những người thân trong gia ñình và bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm cao quý ñó

Tác giả luận văn

Vũ Thị Tuyết Mai

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iii

2.1 ðặc ñiểm nông sinh học và tác dụng dược lý của cây sì to 4 2.2 Nguồn gốc và sự phân bố nấm Phytophthora cinnamomi 5 2.3 Triệu chứng bệnh và sự gây hại của Phytophthora cinnamomi 9

2.5 Phạm vi ký chủ của nấm Phytophthora cinnamomi 14 2.6 ðặc ñiểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora cinnamomi 15

2.7.1 Sử dụng cây chỉ thị ñể phát hiện bệnh do nấm P.cinnamomi sớm 20

2.7.2 Ngăn chặn sự lây lan của nấm Phytophthora cinnamomi 21

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iv

3.3.1 Phương pháp phân lập, xác ñịnh tác nhân gây bệnh thối củ rễ

cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 27 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học, sinh thái

của tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu quy luật phát sinh, phát triển của

bệnh chết nhanh trên ñồng ruộng tại Sa Pa - Lào Cai và Tam

2.3.4 Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh thối củ cây Sì to tại

4.1 Thành phần bệnh hại cây Sì to (Valeriana jatamansi Jones ) tại

4.2 ðặc ñiểm hình thái nấm Phytophthora cinnamomi gây bệnh 38

4.3.1 Ảnh hưởng của phương pháp lây khác nhau ñến khả năng

nhiễm nấm P cinnamomi gây thối củ rễ cây Sì to 40

4.3.2 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của nấm P cinnamomi

gây bệnh thối củ rễ cây sì to tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc và Sapa

4.4 Nghiên cứu ðặc ñiểm phát sinh phát triển của bệnh thối củ cây Sì

to trên ñồng ruộng tại Tam ðảo - Vĩnh phúc và Sa pa - Lào Cai 46 4.4.1 Mức ñộ gây hại của bệnh ở những ñịa ñiểm trồng khác nhau 46

4.4.2 Diễn biến của bệnh thối củ Sì to (P.cinnamomi) trên ñồng

4.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái ñến bệnh thối củ hại

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp v

4.5.1 Ảnh hưởng của việc sử dụng các loại phân bón khác nhau 51 4.5.2 Ảnh hưởng của thời ñiểm thu hoạch ñến năng suất dược liệu và

4.6 Ảnh hưởng của biện pháp canh tác ñến bệnh thối củ Sì to 56 4.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc ñến bệnh thối củ Sì to 56 4.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bón ñến bệnh thối củ cây Sì to 58

4.7.1 Hiệu quả ức chế của một số loại thuốc hoá học ñến sự phát

triển của nấm P.cinnamomi (Thí nghiệm trong phòng) 62 4.7.2 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học ñến bệnh thối củ cây

4.7.3 Hiệu lực của một số loại thuốc hoá học ñến bệnh thối củ cây Sì to 67

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDTR Chiều dài thân rễ

NSDL Năng suất dược liệu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vii

DANH MỤC BẢNG

4.1 Thành phần bệnh hại cây Sì to (Valeriana jatamansi Jones ) tại

4.2 ðặc ñiểm hình thái nấm Phytophthora cinnamomi gây bệnh 38 4.3 Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm P.cinnamomi cho cây Sì to

4.4 Ảnh hưởng của ñiều kiện nhiệt ñộ tới sự phát triển của sợi nấm

4.5 Ảnh hưởng của ñộ pH ñến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 45 4.6 Mức ñộ gây hại của bệnh thối củ hại trên cây Sì to tại Sa Pa -

4.7 Diễn biến lượng mưa, ñộ ẩm và tỷ lệ bệnh qua các tháng trong

4.8 Ảnh hưởng của chế ñộ phân bón ñến sự phát triển bệnh thối củ

và năng suất cây Sì to tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc 52 4.9 Ảnh hưởng của thời ñiểm thu hoạch ñến năng suất dược liệu và

4.10 Ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc ñến bệnh thối củ hại trên cây Sì to 57 4.11 Ảnh hưởng của phân gà và phân chuồng tới sự phát triển của

4.12 Ảnh hưởng của liều lượng phân bón ñến sinh trưởng phát triển

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp viii

4.15 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học ñến bệnh thối củ rễ

4.16 Hiệu lực của một số loại thuốc hoá học ñến bệnh thối củ cây

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ix

DANH MỤC HÌNH

4.3 Triệu chứng cây Sì to bị bệnh thối củ (Nhiễm nhẹ) 37

4.4 Triệu chứng cây Sì to bị bệnh thối củ (Nhiễm nặng) 37

4.5 Cây Sì to bị thối củ, mạch dẫn thâm ñen (nhiễm nhẹ) 37

4.6 Cây Sì to bị thối toàn bộ củ, mạch dẫn thâm ñen( Nhiễm nặng) 38

4.7 Tản nấm Phytophthora cinnamomi sau 3 ngày nuôi cấy trên môi

4.8 Sợi nấm Phytophthora cinnamomi với các u lồi 39

4.12 Triệu chứng sau khi lây bệnh bằng phương pháp tưới trực tiếp

4.13 Ảnh hưởng của ñiều kiện nhiệt ñộ tới sự phát triển của sợi nấm

4.14 Ảnh hưởng của ñộ pH ñến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 45

4.15 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 46

4.16 Ảnh hưởng của ñộ pH ñến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 46

4.17 Mức ñộ gây hại của bệnh thối củ hại trên cây Sì to tại

4.18 Ảnh hưởng của thời ñiểm thu hoạch ñến năng suất dược liệu và

4.19 Ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc ñến bệnh thối củ hại trên cây Sì to 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp x

4.20 Ảnh hưởng của liều lượng phân bón ñến tỷ lệ bệnh thối củ cây

4.21 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học ñến sự phát triển của

4.22 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học ñến bệnh thối củ rễ cây

4.23 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hoá học ñến năng suất cây Sì to

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 1

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Cây Sì to (Nữ lang nhện) – Valeriana jatamansi Jones thuộc họ Nữ

lang (Valerianaceae) là cây thuốc quí ñược người H’Mông ở Sa Pa - Lào Cai;

Quản Bạ - Hà Giang và Kỳ Sơn – Nghệ An sử dụng làm thuốc an thần trong trường hợp trẻ em bị sốt cao, quấy khóc, chống co thắt, chữa bệnh tim, bồi bổ sức khỏe và dùng cho phụ nữ sau khi sinh [2, 3, 4, 5] Do trữ lượng ít, phân

bố hạn hẹp, nên trong nhiều năm nay loài cây này ñược ñưa vào Sách ñỏ Việt Nam và Danh lục ðỏ cây thuốc Việt Nam ñể chú ý bảo vệ [1,7,8]

Trong vài năm gần ñây, Viện Dược liệu ñã tiến hành những nghiên cứu

sơ bộ về mặt sinh học, hóa học cũng như tác dụng sinh học của loài Sì to [3]

Những kết quả ban ñầu ñạt ñược rất khả quan và ñang ñược tiếp tục nghiên cứu sản xuất thuốc an thần từ loài cây thuốc này

Do nhu cầu sử dụng Sì to ngày một tăng cao mà qua quá trình trồng trọt

và theo dõi, chúng tôi nhận thấy vào mùa mưa tháng 6 trở ñi khi nhiệt ñộ và

ñộ ẩm môi trường cao Sì to bị thối củ, rễ chết hàng loạt do dịch bệnh phát sinh và gây hại, thậm chí còn không cho thu hoạch [9]

Kết quả giám ñịnh ban ñầu tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến

cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu, cho thấy nấm Phytophthora cinnamomi là

nguyên nhân gây bệnh thối củ Sì to Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam chưa có kết quả nghiên cứu một cách cụ thể nào về loài nấm này Do vậy ñể chủ ñộng việc phòng trừ nấm bệnh ñạt hiệu quả cao phục vụ sản xuất tạo nguồn nguyên

liệu làm thuốc, chúng tôi ñề nghị ñi sâu nghiên cứu nấm bệnh Phytophthora cinnamomi hại trên cây Sì to và khảo sát một số biện pháp phòng trừ Xuất phát từ những vấn ñề trên, ñược sự ñồng ý của bộ môn bệnh cây- nông dược, khoa nông học, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Ngô Bích Hảo - trường ðại

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp 2

học Nơng Nghiệp Hà Nội và TS Phan Thuý Hiền - Viện Dược Liệu, chúng

tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bệnh thối củ hại trên cây Sì to và

khảo sát một số biện pháp phịng trừ".

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu xác định nấm bệnh gây thối củ cây sì to, đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh và các biện pháp phịng trừ bệnh cĩ hiệu quả cao phục vụ cho nhu cầu sản xuất giống và dược liệu Sì to

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học:

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu chi tiết về sinh học

sinh thái nấm gây bệnh thối củ cây sì to, cĩ ý nghĩa về đa dạng sinh học của các vi sinh vật gây hại trên cây trồng

- Mơ tả triệu chứng bệnh thối củ hại trên cây sì to, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm, quy luật diễn biến và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh và gây hại của bệnh, làm cơ sở khoa học để xây dựng và đề xuất các biện pháp phịng trừ bệnh thối củ cây Sì to cĩ hiệu quả và làm tài liệu phục vụ cho đào tạo và cho các nghiên cứu ứng dụng khác

+ Ý nghĩa thực tiễn:

- Kết quả của đề tài giúp cho chẩn đốn chính xác triệu chứng, tác nhân gây bệnh thối củ, rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào cai và Tam ðảo - Vĩnh phúc Các cán bộ BVTV cĩ thể nhận biết bệnh trong điều tra và phịng trừ bệnh

- ðề xuất các biện pháp phịng trừ hiệu quả gĩp phần hạn chế bệnh, giảm lượng thuốc hố học sử dụng trên đồng ruộng, nâng cao năng suất, chất lượng Sì to, gĩp phần nâng cao thu nhập cho người dân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 3

1.4 ðối tượng phạm vi nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu: Nấm gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Phạm vi nghiên cứu:

Nghiên cứu nấm bệnh gây thối củ rễ cây Sì to, ñặc ñiểm gây hại của bệnh thối củ rễ Sì to và một số biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu quả và an toàn với môi trường tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Thời gian nghiên cứu: năm 2009 - 2010

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 4

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ðặc ñiểm nông sinh học và tác dụng dược lý của cây sì to

Sì to hay còn ñược gọi là cây nữ lang nhện hoặc liên hương thảo có tên

khoa học là Valeriana jatamansi Jones., thuộc họ Nữ lang - Valerianaceae [2]

Cây dạng thân thảo sống nhiều năm, cao 30-50cm, có lá không nhiều, mọc ñối, nguyên, kéo dài, thuôn, các lá ở thân nhỏ, phiến hình tim,

to 3 - 6 x 2,5 - 4 cm, mỏng, có lông, mép có răng không ñều; cuống 6 - 7cm, có lông Trục ñứng cao 20 - 40cm, mang 1-3 nhánh; hoa màu hồng, thành xim ñơn phân; lá bắc hẹp dài Quả bế dẹp, cao 3mm, một bên có một sóng, một bên có 3 sóng, ở ñỉnh có mào lông dài do ñài biến thành Cây ra hoa từ tháng 10 cho ñến tháng 2 năm sau

Ở nước ta, cây mọc khá phổ biến ở những chỗ ẩm ướt dựa vực, suối

ở các khu vực miền núi như Sa Pa, Bắc Hà của tỉnh Lào Cai, ở Hà Giang, Nghệ An

Người H’Mông ñã ñưa cây về trồng làm thuốc với tên Sì to Về mùa xuân và hạ, thu hái cả cây dùng tươi, về mùa ñông ñào thân rễ rửa sạch, phơi khô trong râm ñể dùng Bộ phận ñược dùng là toàn cây và thân rễ (củ) -

Herba et Rhizoma Valerianae. Thân rễ to bằng ngón tay nhỏ, xám sẫm và mang một bó sợi màu nâu ño ñỏ, mỏng, dựng ñứng do cuống của lá ở gốc Thân rễ chứa tinh dầu, một chất acid kết tinh, acid jatamansic Chúng

có vị cay, ñắng, ngọt, mùi thơm; có tác dụng giảm ñau, trừ thấp tán hàn, ñiều kinh hoạt huyết và cầm máu Tinh dầu có tác dụng kháng sinh và kháng ñộng vật nguyên bào [4,9]

Từ xưa, cây ñã ñược xem như là một hương liệu thuộc loại quý Người

ta cũng sử dụng làm thuốc như dược thảo ñể trị: nhức ñầu, ñau dạ dày, ñau các khớp xương, thuỷ thũng, kinh nguyệt không ñều, ñòn ngã tổn thương,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 5

mụn nhọt với liều dùng uống trong từ 9 - 15g toàn cây, dạng thuốc sắc Hoặc thân rễ 6 - 12g, dạng thuốc sắc hoặc thuốc ngâm rượu, hoặc nghiền nhỏ thành bột uống mỗi lần 0,6 - 1,5g Dùng ngoài lấy thân rễ với lượng thích hợp ñập nhỏ, ñắp vào chỗ ñau Người H’Mông ở Sa Pa - Lào Cai; Quản Bạ - Hà Giang

và Kỳ Sơn – Nghệ An sử dụng làm thuốc an thần trong trường hợp trẻ em bị sốt cao, quấy khóc, chống co thắt, chữa bệnh tim, bồi bổ sức khỏe và dùng cho phụ nữ sau khi sinh [2,3,4,5]

Ở Ấn ðộ, người ta dùng ñể trị ñộng kinh, hysteria và co giật, cũng dùng chữa chứng tim ñập nhanh; có khi dùng trị ñau ruột

Do trữ lượng ít, phân bố hạn hẹp, nên trong nhiều năm nay loài cây này ñược ñưa vào Sách ñỏ Việt Nam và Danh lục ðỏ cây thuốc Việt Nam ñể chú

ý bảo vệ [1,7,8] Bên cạnh ñó, nhu cầu sử dụng Sì to ngày một tăng nhưng vào mùa mưa tháng 6 trở ñi khi nhiệt ñộ và ñộ ẩm môi trường cao Sì to bị thối

củ chết hàng loạt do dịch bệnh phát sinh và gây hại, thậm chí còn không cho thu hoạch Kết quả giám ñịnh ban ñầu tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế

biến cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu, cho thấy nấm Phytophthora cinnamomi Rands là nguyên nhân gây bệnh thối củ Sì to Tuy nhiên hiện nay

ở Việt Nam chưa có kết quả nghiên cứu một cách cụ thể nào về loài nấm này

2.2 Nguồn gốc và sự phân bố nấm Phytophthora cinnamomi

Tên: Phytophthora cinnamomi Rands

Phân loại vị trí: –Lớp Oomycetes, Bộ Peronosporales, Họ Pythiaceae

Phytophthora ( phát âm là Fy-TOFF-thora) là loài nấm tồn tại trong ñất

và nước thuộc lớp, Oomycetes, ngành Oomycota Các loài thuộc ngành này

có dạng sợi và hấp thu dinh dưỡng tương tự như các loài nấm thật, nhưng Oomycota không thuộc giới nấm thật và có một vài ñiểm khác biệt Oomycota là dạng nấm lưỡng bội và sản sinh ra bào tử noãn trong khi nấm thật không sản sinh bào tử noãn và là dạng ñơn bội hoặc nhân kép Oomycota

có thành cấu tạo từ β-glucan và cellulose trong khi nấm thật có thành tế bào

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 6

chứa kitin Cả hai nhóm ựều có các loài có thể sản sinh ra bào tử ựộng, nhưng chỉ có Oomycota có hai loại lông roi (ựuôi roi và tiên mao) Oomycota có tiên mao dạng ống trong khi của nấm thật là dạng dẹt Oomycota là nguyên nhân gây bệnh trên rễ, thân và dẫn ựến chết cây ở một số lượng lớn các loài thực vật bao gồm cả cây ăn quả, cây lấy hạt và cây cảnh Có ắt nhất 300 loài thuộc

nhóm Phytophthora trên toàn thế giới và không dưới 13 loài ựược tìm thấy ở Nam Úc, bao gồm cả P.cinnamomi, P.cactorum, P.citricola, P.megasperma, P.crytogea và P.parasitica.

P cinnamomi là loài phổ biến, gây hại nhiều và có nhiều phân loài P cinnamomi lần ựầu tiên ựược mô tả bởi Rands vào năm 1922 sau khi ựược phân lập từ cây quế Sumatra ở Indonesia Mầm bệnh này hiện ựã ựược tìm thấy trên khắp thế giới và ựược biết là lây nhiễm hơn 2.000 loài thực vật

trong ựó có nhiều loài có tầm quan trọng về kinh tế như Abies fraseri (linh sam Fraser), Eucalyptus spp., Persea americana (bơ), Pinus spp (thông), Quercus spp (sồi), và các loài trong họ Ericaceae (Rhododendron spp., Vv) (Zentmyer 1980)[33] Do phạm vi phân phối rộng rãi, P cinnamomi là

nguyên nhân gây thiệt hại trong một loạt các lĩnh vực kinh tế liên quan ựến rừng, cây lâm nghiệp

Nguồn gốc ựịa lý của P cinnamomi không rõ ràng, Zentmyer

(1988)[34] cho thấy rằng loài này có nguồn gốc bản ựịa ở đông Nam Á và miền nam châu Phi Nó lây lan trên khắp Thái Bình Dương ựến Châu Mỹ Latin trong thế kỷ 18 Tuy nhiên, không có bằng chứng rõ ràng nào về sự lây lan xảy ra Sự xuất hiện của các loại nấm trong nhiều khu vực trong thời gian gần ựây không thực sự hữu ắch trong việc ựưa ra một sự phân bố ựịa lý cho các quốc gia

Ngày nay, P cinnamomi ựược phát hiện trên toàn thế giới và ảnh

hưởng ựến một số lượng lớn các loài thực vật (Summerell và cs 2005)[31] Sự

xuất hiện của P cinnamomi ựã ựược ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới như:

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 7

Châu Á: Trung Quốc (Giang Tô), Ấn độ (Andhra Pradesh, Tamil

Nadu, West Bengal), Indonesia (Java, Sumatra), Israel, Nhật Bản (Honshu, quần ựảo Ryukyu), Malaysia (bán ựảo, Sabah), Philippines, đài Loan, Thổ Nhĩ Kỳ, Việt Nam

Châu Phi: Burundi, Cameroon, Congo, Côte d'Ivoire, Gabon, Guinea,

Kenya, Madagascar, Morocco, Réunion, Rwanda, Nam Phi, Uganda, Zaire, Zambia, Zimbabwe

Bắc Mỹ: Canada (British Columbia), Mexico, USA (Alabama,

Arizona, Arkansas, California, Delaware, Florida, Georgia, Hawaii, Indiana, Kentucky, Louisiana, Maryland, Massachusetts, Mississippi, Missouri, New Jersey, New York, Bắc Carolina, Ohio, Oklahoma, Oregon, Pennsylvania, South Carolina, Tennessee, Texas, Virginia, Washington, West Virginia)

Trung Mỹ và Caribbean: Barbados, Belize, Costa Rica, Cuba,

Dominica, Cộng hoà Dominica, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Haiti, Honduras, Jamaica, Martinique, Panama, Puerto Rico, St Lucia, St Vincent và Grenadines, Trinidad và Tobago

Nam Mỹ: Argentina, Bolivia, Brazil (Goias, São Paulo), Chile,

Columbia, Ecuador, Guyana, Peru, Venezuela

Châu đại Dương: Australia (New South Wales, Northern Territory,

Queensland, Nam Úc, Tasmania, Victoria, Western Australia), ựảo Cook, Fiji, Micronesia, New Zealand, Papua New Guinea

Nấm P cinnamomi ựược ựưa vào Úc trên ựất quanh rễ loại cây trồng khi

những người Châu Âu ựến vùng ựất này vào ựầu những năm 1800 Tuy nhiên,

phải ựến những năm 1960 và 1970 mà P cinnamomi lần ựầu tiên ựược ghi lại trong nhiều tiểu bang của Úc Tại Nam Australia, P cinnamomi lần ựầu tiên

ựược xác ựịnh trên vùng Mount Lofty Ranges vào năm 1972 và trên ựảo Kangaroo vào năm 1993, có thể thông qua chuyển giao thực vật hoặc ựất bị nhiễm khuẩn vào các phương tiện ựi lại, máy móc khác

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 8

Tại Úc, hàng trăm nghìn ha thảm thực vật bản ựịa ở Tây Úc, Victoria và Tasmania, và hàng chục ngàn ha tại Nam Úc, ựang bị ảnh hưởng bởi các mầm

bệnh P cinnamomi cũng ựược tìm thấy ở bờ biển phắa ựông Queensland và

New South Wales (NSW), mặc dù bệnh biểu hiện ở các vùng này thường khó hiểu hơn và mức ựộ ựe dọa không rõ Lượng mưa là một trong những yếu tố

quan trọng ảnh hưởng ựến sự phân bố của P cinnamomi Do ựó, căn bệnh do

mầm bệnh này thường bị giới hạn tại các khu vực ựể ẩm ướt hơn (Summerell

và cs 2005) [31] Nó xuất hiện trong rãnh, dọc theo các ựường thoát nước và ở các khu vực của bề mặt Các yếu tố khác ảnh hưởng mà biểu hiện bệnh là nhiệt

ựộ, ựịa chất, ựiều kiện ựất (bao gồm pH, dinh dưỡng, ựộ ẩm và kết cấu) và sự hiện diện của các loài thực vật mẫn cảm (O'Gara và cs 2005b) [28]

đánh dấu phân tử PCR là phương tiện xác ựịnh tắnh ựa dạng về mặt cấu

trúc di truyền của P cinnamomi Isozymes (Linde và cs 1997)[24],

microsatellite (Dobrowolski và cs 2003) [15] đa hình nucleotide ựơn (SNP) (Lee và Taylor 1992), ựa hình chiều dài ựoạn khuếch ựại (AFLP) (Duan và cs 2008)[ 17] và ựa hình chiều dài các ựoạn cắt giới hạn (RFLP) (Linde và cs 1997) [24]ựã ựược sử dụng ựể tìm sự khác biệt trình tự nucleic acid

Isozyme phân tắch xác ựịnh một số kiểu gen multilocus của P cinnamomi ựược tìm thấy ở Papua New Guinea, nhưng chỉ có ba kiểu gen multilocus ựã ựược tìm thấy cho phân lập từ Australia (Old và cs 1988) [27], một cho loại A1 và hai cho A2 Kiểu gen ựược tìm thấy ựã ựược phổ biến ựể phân lập từ khắp nơi trên thế giới, kết quả cho thấy chúng có khả năng lây lan

vô tắnh (Dobrowolski và cs 2003) [15]

Mầm bệnh biến ở Nam Phi ựược cũng tương tự Linde và cs (1997)[24]

ựã xem xét các phân tắch isozyme cho 135 mẫu isolates P cinnamomi phân lập ựược thu thập từ 1977-1986 và 1991-1993 Có rất ắt heterozygosity và

biến thể di truyền trong sự phân bố (Linde và cs 1997) Giữa các nhóm P cinnamomi A1 và A2, có khoảng cách di truyền cao, trong khi ựó khoảng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 9

cách di truyền thấp giữa các isolates thu thập trong các giai ñoạn 1977-1986

và 1991-1993, và giữa các nhóm khác nhau về ñịa ñiểm thu thập, khu vực Cape và Mpumalanga(Linde và cs 1997) [24] Những phát hiện này cho thấy

P cinnamomi là sinh vật lây lan ít biến ñổi

Phân tích ña hình microsatellite các isolates của Úc cho thấy ba nhóm kiểu gen (Dobrowolski và cs 2003) Hơn nữa, vị trí các mẫu cho thấy các nhóm này ñược phân bố rộng về mặt ñịa lý (Dobrowolski và cs 2003)[15] Linde và cộng sự (1997) [24] sử dụng RFLP phân tích khoảng cách các mẫu của Nam Phi và Úc cho thấy có khoảng cách di truyền ngắn (Dm = 0,003) giữa hai khu vực ñịa lý Loại kiểu gen lai ñược chia sẻ giữa hai nước

Một phân tích AFLP của các chủng miền Nam Carolina của P cinnamomi

từ 23 loài cây chủ, bao gồm ñỗ quyên, hoa trà, nhựa ruồi, và bách, cũng báo cáo không giông nhau về gen giữa A1 và A2 ñược phân lập (Duan và cs 2008)[17] Một kiểm tra của 200 loci thông tin trong 49 mẫu phân lập A2 và 2 mẫu phân lập A1 ñã cho giá trị cao hơn của tính ña hình trong mẫu phân lập A1, trong khi mẫu phân lập A2 ñã giảm biến thể di truyền (Duan et al 2008)

2.3 Triệu chứng bệnh và sự gây hại của Phytophthora cinnamomi

Cây bị nhiễm Phytophthora cinnamomi thường có hiện tượng mục nát rễ

hút Tổn thương có thể lan ra rễ lớn hơn và có thể gây ra thối gốc Khi bị thối

rễ, lá cây có thể héo, trở thành màu vàng nhạt, và chết (Zentmyer 1980; Erwin

và Ribeiro 1996) [19, 33] Thực vật bị nhiễm bệnh có thể gãy ñổ bất ngờ và chết, có thể dần dần suy giảm, hoặc có thể vẫn còn triệu chứng vệt trong nhiều năm (Zentmyer 1980; Erwin và Ribeiro 1996) ðộ ẩm và nhiệt ñộ có thể ñóng một vai trò trong khả năng chống chịu ðiều kiện ẩm ướt, mát mẻ thì miễn nhiễm có nhiều khả năng xảy ra (Erwin và Ribeiro 1996) [19]

Rễ và thân cây bị ảnh hưởng bởi P cinnamomi xâm nhập mạch dẫn và

sau ñó phá hủy ñể trích xuất nước và chất dinh dưỡng Khi cây bị nhiễm sau

ñó sẽ thiếu nước do không hút ñược nước và bị “nội hạn hán”

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 10

Các triệu chứng có thể nhìn thấy bằng mắt thường ñầu tiên của bệnh thường ñược hiển thị như vàng của lá (úa lá), tiếp theo chết khô ñen toàn bộ cây Tùy thuộc vào ñiều kiện môi trường, ñiều này có thể xảy ra trong vài tuần cho cây bụi nhỏ hoặc thậm chí vài năm ñối với cây bụi lớn hay cây gỗ Một loạt các triệu chứng có thể ñược hiển thị: Lá có thể chuyển sang màu vàng do hóa chất, hoặc, côn trùng có thể gấp, nhai, hoặc hình thức chết gân trên lá Các triệu chứng gây ra bởi yếu tố môi trường có nhiều khó khăn ñể xác ñịnh kể bằng mắt thường Tuy nhiên, cây có thể phục hồi với cải thiện ñiều kiện môi trường

Các triệu chứng khác nhau ở các loài thực vật khác nhau Xanthorrhoea

là ví dụ, chết nhanh chóng và có thể sụp ñổ Acacia myrtifolia có thể chết một

cách nhanh chóng, nhưng các triệu chứng có thể bị nhầm bởi nguyên nhân

khác như: ñiều kiện khô hạn nói chung Lá của Banksia spp và Eucalyptus

spp có dấu hiệu chậm hơn nhưng trên nhánh có thể tạm thời tái sinh chồi

Các cây họ ñậu, keo, tràm và một số cây họ mã kỳ bị biến thành màu vàng và chết trong thời kỳ ẩm ướt ấm áp trong suốt mùa xuân và mùa thu Chúng có thể phục hồi và sinh trưởng trong thời gian khô vào mùa hè hoặc thời gian giữa mùa ñông lạnh Chu kỳ sống tiếp tục và xảy ra chết ñen thân vào mùa xuân và mùa thu

Chết ñen thân, củ cũng có thể ñược gây ra bởi các yếu tố khác ngoài P cinnamomi Nguyên nhân có thể do hóa chất, tuổi cây, hỏa hoạn, thiệt hại cơ học, côn trùng, môi trường bao gồm các yếu tố bao gồm hạn hán, úng, muối, sương giá và mưa ñá

P cinnamomi cũng ảnh hưởng ñến cây ăn quả, các loại cây lấy hạt và cây rau Cây cảnh cũng bị gây hại như hoa lily, hoa trà, dâm bụt và ñỗ

quyên Có cả cây lớn hơn bao gồm một số loài cây thông như Pinus radiata

Theo luật bảo tồn và bảo vệ môi trường 1999, Chính phủ liên bang Úc

ñã coi P cinnamomi là một loài gây hại chính ở Úc ðiều này có nghĩa P

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 11

cinnamomi ñược coi là mối ñe dọa lớn tới nguồn tài nguyên ñộng thực vật của các quốc gia, ñặc biệt là ñối với nguồn tài nguyên ñộng thực vật ở Úc ðây là

một mối ñe dọa nguồn tài nguyên quốc gia Dịch bệnh nghiêm trọng của P cinnamomi ñã gây ra thiệt hại rộng lớn ñến khu rừng bạch ñàn ở Úc (Weste &

Taylor, 1971)[35] Phytophthora còn ñe dọa thông Wollemi mới ñược phát hiện vào năm 1994 bởi một nhân viên NPWS Thông Wollemi (Wollemi nobilis) là một trong những loài thực vật hiếm nhất trên thế giới và ñang ñứng

trước nguy cơ tuyệt chủng Nhiễm nấm P cinnamomi và lửa là mối ñe dọa lớn nhất ñối với sự sống còn của loài cây này trong tự nhiên Năm 2005, P cinnamomi ñược tìm thấy là nguyên nhân của hiện tượng chết ñen lá ở cây thông Wollemi

Các bệnh trên bơ gần ñây ñã ñược nghiên cứu bởi Coffey (1992)[14]

P cinnamomi ñã ñược nhận thấy gây hại trên bơ do nấm từ ñất và không có

ký chủ chính, có thể tự do di chuyển từ một trong những cây trồng khác P cinnamomi cũng ñã gây hại trên bơ trong một số các nước ðịa Trung Hải Ở

các vùng ôn ñới, P cinnamomi gây thiệt hại nghiêm trọng ñến các cây trồng

có giá trị cao, cây cảnh và cây bụi

2.4 Tác ñộng ñến ña dạng sinh học

Các mức ñộ của tác ñộng ñến ña dạng sinh học là ñiều kiện do tương tác giữa các mầm bệnh và môi trường (dưới ñiều kiện thuận lợi của ñịa phương và thời gian), cùng với sự nhạy cảm của các loài cây mục tiêu, vai trò chức năng của nó trong hệ sinh thái

Trên khắp nước Úc, số lượng các loài thực vật của Úc dễ bị

Phytophthora cinnamomi gây hại là không rõ nhưng có khả năng là hàng ngàn Ở phía Tây Nam Australia, Shearer và cs (2003) [30] ñã ước tính, trên

cơ sở tỷ lệ các loài mà tính nhạy cảm ñược biết, có khoảng 2.300 loài dễ bị lây nhiễm và 800 trong số này có thể sẽ là rất dễ mắc Một số họ thực vật có nguồn gốc ở Úc thì mẫn cảm hơn các họ khác Các họ dễ bị ảnh hưởng bao

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 12

gồm quắn hoa (Proteaceae), mã kỳ (Epacridaceae), họ ðậu và họ Sổ (Dilleniaceae) (Weste 1994) Chỉ có một vài chi của họ Sim (Myrtaceae), bao gồm bạch ñàn là rất dễ mắc bệnh (McDougall & Summerell 2002) [26]

Cỏ, cói và cỏ gà thường có nhiều khả năng chống chịu P cinnamomi

hơn cây lâu năm thân gỗ (DSE 2005) Do ñó, các khu vực bị nhiễm khuẩn ñôi khi ñược ñặc trưng bởi sự ít ña dạng hơn các loài lâu năm thân gỗ và phong phú về các loài cây bụi và bao gồm cả sự gia tăng ña dạng của cây họ hòa thảo (Weste 1981, 1986; Laidlaw & Wilson 2003; McDougall & Summerell

2002, 2003) [21,26] Các nghiên cứu ñã chứng minh tác ñộng ñáng kể ñến sự

ña dạng loài, có nơi có 60% loài dưới tán trước ñã bị loại bỏ

Các khu vực bệnh ñang dần dần bị xâm chiếm bởi các loài chống chịu, sau ñó thay ñổi cấu trúc thảm thực vật, thành phần loài và năng suất của hệ sinh thái, với các hiệu ứng do hậu quả phụ thuộc vào hệ thực vật và ñộng vật (Wilson và cs 2003) Tại Úc, các triệu chứng bệnh tàn phá hầu hết ñã ñược quan sát trong rừng khô mở, rừng cây thông thường

Sự biến ñổi tính nhạy cảm cũng ñã ñược quan sát trong phạm vi chi Trong chi Bạch ñàn, lợi, hộp là tương ñối kháng với nhiễm trùng, trong khi thông và bạc hà thường nhạy cảm hơn (Phytophthora Technical Group 2003) Ngoài ra, các biến thể trong tính nhạy cảm ñã ñược quan sát thấy các nhóm phân bố khác nhau của cùng một ñơn vị phân loại, cũng như trong quần thể (Harris et al 1983) Tại Victoria, các báo cáo nghiên cứu giám sát tái sinh của nhiều loài thực vật trong các loài dễ bị nhiễm khuẩn trong 30 năm trở lại ñây Dịch bệnh vẫn tái ñịnh kỳ tại các khu vực này trong ñiều kiện thuận lợi (Weste năm 1997; Weste et al 1999) ñộng vật bản ñịa có thể là gián tiếp bị ảnh hưởng bởi P cinnamomi qua việc mất chỗ ở (ví dụ bao gồm thực vật) và các nguồn cung cấp thực phẩm (ví dụ như mật hoa, phấn hoa, hạt, và con mồi, ñặc biệt là vật không xương sống)

Tại bang New South Wales - Úc (NSW), mức ñộ ảnh hưởng của P

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 13

cinnamomi nói chung là không rõ P cinnamomi không gây ra sự mất mát

ñáng kể ñối với các loài thực vật phổ biến như ñã ñược quan sát thấy ở các bang miền nam nước Úc Tuy nhiên, mầm bệnh có tác ñộng ñáng kể ñến thực vật bản ñịa ở một số khu vực phía ñông NSW, và những tác ñộng này chủ yếu ñối với các loài dưới tán (McDougall & Summerell 2005) [26]

Các loài thực vật dễ bị ñe dọa ñược liệt kê trong luật TSC bao gồm các

nguy cơ tuyệt chủng Bạch ñàn imlayensis (Imlay Mallee), Wollemia nobilis (thông Wollemi), Leionema ralstonii (leionema của Ralston) và Tasmannia purpurascens (pepperbush lá rộng) Hoa Telopea speciosissima (waratah)

cũng rất dễ bị các mầm bệnh trong trồng trọt (McDougall & Summerell 2005) [26] 78 loài hiếm hơn nữa hoặc bị ñe dọa ñược cho là có nguy cơ từ các mầm bệnh như là kết quả của sự gần gũi của họ gây hại ñã biết hoặc sự xuất hiện của họ mới trong môi trường sống (McDougall & Summerell 2005) [26]

Thay ñổi trong cấu trúc thảm thực vật gây ra do P cinnamomi ñã ñược

quan sát thấy ở NSW Ví dụ, các khu vực bị nhiễm khuẩn của rừng bạch ñàn ở Mount sieberi Imlay Vườn quốc gia ñang thay ñổi từ một khu rừng với các loài cây bụi phong phú và Xanthorrhoea dưới tán một với ưu thế bởi các loại thảo

mộc Lomandra confertifolia và Tetrarrhena juncea (McDougall & Summerell

2005) Tương tự như vậy, ñã có một sự thay ñổi rõ ràng trong cơ cấu thực vật phụ núi cao tại Vườn quốc gia Barrington Tops, nơi mà trước ñây dưới tán một bụi cây rậm rạp chủ yếu ñã ñược thay thế với một chi phối bởi các giống cỏ Poa (McDougall & Summerell 2003) Việc mất liên tục của các loài dưới tán trong các khu rừng bạch ñàn trên bờ biển phía Nam Úc sẽ ảnh hưởng nguy cấp ñến hai loài ñộng vật có vú là chuột khói (Chuột giả vịnh fumê - Pseudomys

fumeus ) và Chuột nâu lớn miền Nam (Isoodon obesulus) (McDougall &

Summerell 2005) Các giống cây nhỏ ñứng dưới tán của các khu rừng cung cấp

cho các loài và môi trường sống (Xanthorrhoea australis, cây cỏ) cho Chuột

nâu lớn miền Nam Các loại trái cây nhiều thịt và hạt của thực vật trong các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 14

khu rừng là những thành phần quan trọng của chế ñộ ăn uống của chuột khói (McDougall & Summerell 2005) [26]

2.5 Phạm vi ký chủ của nấm Phytophthora cinnamomi

Phạm vi ký chủ P cinnamomi là rất rộng; với gần 1.000 loài ký chủ (Zentmyer, 1983) Các loài hại chủ yếu là cây bơ (Persea americana), và dứa (Ananas comosus P cinnamomi cũng gây hại nặng trên cây dẻ (Castanea dentata ), quế (Cinnanomum spp.), ñỗ quyên (Rhododendron spp.), bạch ñàn (Eucalyptus spp.), hạnh nhân, xơ ri, ñào, mận (Prunus spp.), sồi (Quercus

spp.) và nhiều cây cảnh và cây bụi Ký chủ của nó bao gồm hầu hết các loại cây ăn quả ôn ñới, nhưng ñây không phải là cây chủ quan trọng trong thực tế Tại khu vực EPPO, lê là một cây chủ quan trọng

Nghiên cứu về sự gây hại của P cinnamomi ñã cho thấy sự biến ñổi giữa

các chủng trên cây chủ khác nhau Zentmyer và cs (1980) [33] thấy rằng một

mẫu phân lập A2 của P cinnamomi từ bơ (Persea americana) có khả năng gây bệnh trên bơ nhưng không gây hại trên hoa trà (Camellia spp) Trong khi

một mẫu phân lập A1 từ trà ñã gây bệnh trên cả bơ và trà Tuy nhiên, trong nghiên cứu của mình Zentmyer chỉ kiểm tra hai isolates Weste (1975) cũng

tìm thấy một sự khác biệt trong mức ñộ gây hại của chủng A2 và A1 ở P cinnamomi Isolates của hai loại ñã gây bệnh trên Nothofagus cunninghamii, nhưng các cây cấy với chủng A2, thu thập từ Isopogon ceratophyllus, có tỷ lệ chết 60% trong khi những cây cấy với chủng A1, thu thập từ Tristania conferta, có tỷ lệ chết 100% ( Weste 1975)

Thêm các nghiên cứu gần ñây của Dudzinski và cs (1993) [18], Robin

và Desprez-Loustau (1998) [29] và Huberli và cs (2001) [21] tìm thấy sự thay ñổi trong lần gây hại không bị bó buộc ký chủ ñặc trưng Dudzinski và

cs (1993) sử dụng nhiều tiêu chí ñể ño mức ñộ gây hại: khởi phát các triệu chứng bệnh, số ngày ñến khi cây bị chết, tăng trưởng khối lượng khô và khối lượng gốc

Robin và Desprez-Loustau (1998) ño chiều dài tổn thương về hạt dẻ,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 15

bạch ñàn, gỗ sồi và cây thông ñể ñánh giá những gây hại của 48 phân lập ñược thu thập chủ yếu trong phạm vi nước Pháp từ 16 loài (bao gồm cả hạt

dẻ, bạch ñàn, sồi, thông) Huberli et al (2001) ñã kiểm tra 73 mẫu của Úc phân lập từ 2 ký chủ là trên cây Eucalyptus marginata và Corymbia calophylla Chiều dài tổn thương và sự sống cây trồng ñã ñược sử dụng ñể xác ñịnh mức ñộ hại Trong nghiên cứu khác, Podger (1989) cũng không tìm thấy mối quan hệ giữa isotype gây hại và phân lập, khí hậu xuất xứ, hoặc phân loại học của cây chủ

2.6 ðặc ñiểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora cinnamomi

Phytophthora cinnamomi tuy phân bố rộng khắp thế giới nhưng nhìn chung ñặc ñiểm sinh học của chúng tương tự nhau

Chu kỳ toàn bộ cuộc sống của P cinnamomi xảy ra trong các mô ñất và

cây trồng; các nguồn thức ăn của nấm là gốc rễ và thân cây mô thực vật sống Tăng trưởng và sinh sản ñược ưa chuộng bởi ñiều kiện ñất ẩm và nhiệt ñộ ấm

(DSE 2005) Trong trạng thái sinh trưởng sinh dưỡng, P cinnamomi phát

triển thành dạng không màu gọi là sợi nấm (O'Gara et al 2005b) Ba loại bào

tử sinh sản vô tính ñược sản xuất bởi các sợi nấm bao gồm túi bào tử, bào tử ñộng và hậu bào tử Mặc dù tất cả các bào tử có khả năng trực tiếp lây nhiễm lên thực vật, các bào tử ñộng ñược cho là các phôi vô tính chính của sự lây nhiễm (O'Gara et al 2005b)[28]

Bọc bào tử có hình trứng mọc dài ra (Erwin và Ribeiro 1996) Bọc bào

tử kích thước và hình dạng có thể khác nhau (Erwin và Ribeiro 1996) [19] Bọc bào tử không ñược hình thành trong ñất giàu mùn nhưng ñược sản xuất trong ñất bạc màu hoặc trong các dung dịch khoáng yếu (Zentmyer 1980; Erwin và Ribeiro 1996) Bào tử ñộng có thể sẽ ñược tung ra từ bọc bào tử ở nhiệt ñộ tối ưu, pH và môi trường thích hợp

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 16

Hậu bào tử là những cấu trúc sinh sản vô tính sống ñược sản xuất khi nguồn thức ăn cạn kiệt (rễ của cây bị nhiễm bệnh chết), hoặc trong khoảng thời gian của nhiệt ñộ thấp hoặc hạn hán Hậu bào tử của mầm bệnh thường mọc cụm gồm 3-10 bào tử Chúng là những hình cầu, vách mỏng, kích thước ñường kính khoảng 31-50 µm (Erwin và Ribeiro 1996) [19] Hậu bào tử lẫn trong ñất, sỏi hoặc mô cây trong thời kỳ khô, nảy mầm khi ñộ ẩm thuận lợi và phát triển ñể tạo thành sợi nấm và túi bào tử hoặc hậu bào tử nhiều hơn nữa ðiều này có thể tiếp tục chu kỳ ít nhất 5 năm, với ñiều kiện có một nguồn chất dinh dưỡng (chất hữu cơ) và một hệ vi ñất không cạnh tranh

P cinnamomi là dạng dị tản, ñòi hỏi các cá thể có dạng giới tính A1 và A2 giao phối ñể hình thành bào tử trứng (Galindo-A và Zentmyer 1964) Trong số 2 dạng giới tính, A2 xảy ra thường xuyên hơn (Zentmyer 1980) Bào

tử trứng tròn, gần như trong suốt ñến vàng nâu, có ñường kính từ 19 – 54 µm (Erwin và Ribeiro 1996)

Khi ñến thời ñiểm, nấm phát triển với số lượng lớn túi bào tử ñộng và

có thể di ñộng dể dàng vào ñất xung quanh (DEH 2004) Các bào tử ñộng ñược thu hút về mặt hóa học do rễ cây tiết ra, chúng bơi khoảng cách rất ngắn Chúng có thể ñược phân tán qua một khoảng cách tương ñối lớn qua bề mặt nước và dòng chảy dưới bề mặt Sự lây lan lên ñến 400 mét/năm dựa theo lượng nước mưa hàng năm Bào tử ñộng cũng dễ dàng vận chuyển trong ñất

bị ô nhiễm và trên các công cụ, giày dép và các loại xe (Summerell và cs 2005) [31]

Cả hậu bào tử và du ñộng bào tử có thể sống một thời gian dài trong ñất

và tàn dư thực vật, và chúng sẽ nảy mầm và bước vào chu kỳ sống mới khi ñiều kiện thuận lợi Chúng hoạt ñộng như nguồn gây bệnh cho cây con và có thể lây lan khoảng cách xa thông qua sự chuyển ñộng của ñất bị nhiễm mầm bệnh và các nguyên liệu thực vật chết

Sự thâm nhập xảy ra trong vòng 24h sau nảy mầm (Zentmyer, 1961)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 17

Nấm này sau ñó lây lan trên rễ hút gây thối có thể kéo dài tới thân cây Phôi

vô tính còn có thể bị văng lên và lây nhiễm sang các bộ phận trên không của cây Nhiệt ñộ, ñộ ẩm và ñộ pH ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng và sinh sản của nấm Ảnh hưởng của các yếu tố này ñã ñược xem xét bởi Weste (1983)

P cinnamomi sinh trưởng phát triển tốt nhất ở 24-28 ° C Phạm vi nhiệt

ñộ tối ña cho sự tăng trưởng là 32-34 ° C và tối thiểu là 5-6 ° C (Erwin và Ribeiro 1996) [19]

Mặc dù các báo cáo ban ñầu về P cinnamomi chủ yếu là trong các

nước nhiệt ñới và cận nhiệt ñới, loài nấm này có thể tồn tại và phát triển ở các nước lạnh hơn, và có vẻ không bị hạn chế rõ rệt bởi chế ñộ canh tác hoặc nhiệt ñộ mùa ñông

2.6.1 Vòng ñời

Phytophthora cinnamomi không thể nhìn thấy bằng mắt thường Dưới kính hiển vi nó có hình dạng như một sợi tóc trắng Các bọc bào tử ñược hình thành trong ñiều kiện ẩm và hiếu khí ở nhiệt ñộ 22-280C Trong mỗi bọc bào

tử có mang 30-40 bào tử ñộng ñược hình thành và phát tán Bào tử ñộng có

thể cử ñộng dễ dàng bằng hai lông roi, cho phép P cinnamomi lây nhiễm

sang ñầu rễ khỏe mạnh mới Bào tử ñộng có thể tồn tại ñến bốn ngày

Khi ñiều kiện cho sự sinh trưởng trở nên kém thuận lợi (thường khi ñất khô), sợi nấm có thể tạo thành các hậu bào tử (chlamydospore) Bào tử này có một thành tế bào dày và có thể tồn tại trong ñất hay lưu trữ mô trong nhiều năm, chờ cho ñến khi ñiều kiện phát triển thuận lợi hơn Các sợi nấm cũng có thể tồn tại trên tàn dư thực vật, hoặc trong ñất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 18

2.6.2 Nhân tố môi trường và sự phát triển

Môi trường ảnh hưởng mạnh nhất ñến sự phát triển bệnh khi có sự hiện diện ñồng thời của bào tử nấm và vật chủ

Tàn dư thực vật

Cây bị bệnh

Sợi nấm từ rễ cây bị bệnh

Tấn công

vào cây

Gây hại

Bào tử nấm có khả năng di ñộng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 19

Một loạt các yếu tố xác ñịnh mức ñộ nghiêm trọng của bệnh và tỷ lệ lan rộng của bệnh bao gồm nhiệt ñộ, lượng mưa, loại ñất và ñặc ñiểm, mật ñộ của mầm bệnh trong ñất

P cinnamomi thường thấy ở các nơi:

• Lượng mưa trung bình hàng năm lớn hơn 500 mm;

ðốt nương hoặc cháy rừng có thể phá hủy P cinnamomi tới ñộ sâu 15

cm dưới mặt ñất Tuy nhiên, ñám cháy cũng làm giảm chất hữu cơ trên bề mặt ñất và số lượng vi khuẩn, là ñiều kiện thuận lợi hơn cho sự phát triển của P

cinnamomi Còn lại, hoặc tái sinh trên cây chủ hoặc sau ñó có thể chết

2.6.3 Lây lan của Phytophthora cinnamomi

Nguyên nhân quan trọng nhất trong sự lây lan của P cinnamomi là

thông qua việc vận chuyển sỏi, ñất và nguyên liệu thực vật, mà các xe cộ và máy móc nặng máy móc thiết bị như vậy thường ñược sử dụng trong khai thác gỗ, chữa cháy, ñường xây dựng và bảo trì các tuyến ñường Một chiếc xe không ñược làm sạch sau khi làm việc trong một khu vực bị nhiễm nấm có thể

dễ dàng lây bệnh sang nhiều khu vực khác cách xa nhiều km

Trên một quy mô ñịa phương, mầm bệnh có thể ñược di chuyển tự nhiên bằng cách dính vào ñất, nhờ gió thổi bay, hoặc qua di chuyển của nước tưới từ nguồn nước ra mương thủy lợi Mầm bệnh cũng có thể ñược lây lan qua máy móc ñược sử dụng ñể trồng trọt hay thu hoạch Việc sỏi ñường bị nhiễm nấm ñã dẫn ñến khởi ñầu của dịch bệnh mới ở Australia (Weste, 2002) [35] ðất bị ô nhiễm với cây cảnh trồng trong chậu có thể lây lan mầm bệnh ñến các khu vực sạch bệnh, và ñây là con ñường có thể xảy ra nhất ñối với lây

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 20

lan quốc tế P cinnamomi cũng có thể lây lan trong các cách sau:

• Thông qua vận chuyển ñất có thể lây lan P cinnamomi trên một

nguyên liệu thực vật khoảng cách dài bằng xe ñạp, giày dép, công cụ và thiết

bị cắm trại

• Trong nước (như thoát ra, thủy lợi, chuyển ñất nước) P cinnamomi

sẽ lây lan nhanh chóng xuống dốc trong bề mặt và dòng chảy nước dưới bề mặt Nếu tìm thấy dọc theo nguồn nước, sau ñó mặt nước rất có thể sẽ mang

P cinnamomi vào lưu vực này

• Bằng chuyển sỏi, nước, ñất hoặc bất kỳ nguyên vật liệu khác có mầm bệnh

• Từ cây trồng liên hệ thông qua với gốc dưới bề mặt Sự lan truyền lên dốc và trên mặt ñất bằng phẳng là chậm (khoảng 1 mét/năm) như nó có giới hạn liên hệ từ cây trồng cho cây trồng

• Bằng cách chuyển các cây bị nhiễm khuẩn cho các vùng khác

• ðộng vật, ñặc biệt là những người có móng guốc sự chẻ ñôi

2.7 Chiến lược quản lý Phytophthora cinnamomi

2.7.1 Sử dụng cây chỉ thị ñể phát hiện bệnh do nấm P.cinnamomi sớm

P cinnamomi thông thường tìm thấy trong các khu rừng cây tại tầng ñặc trưng của cây bụi khô và bụi cây có hoa Loài chỉ thị tốt nhất là cỏ rất

nhạy cảm (Xanthorrhoea spp.), chúng cho các triệu chứng ñầu tiên của bệnh nấm P cinnamomi Các loài khác bao gồm cả Họ Phi lao, họ mã kỳ, ñậu răng

ngựa, họ trinh nữ, họ tường vi, họ cơm vàng

Có thể sử dụng một số dạng cây chỉ thị ñể phân biệt bệnh do nấm PP cinnamomi gây nên sớm Dấu hiệu về sự có mặt của P cinnamomi trên các

cây chỉ thị này có thể là biểu hiện của:

• Chết một phần hoặc chết toàn cây ñối với các loài cây chỉ thị nhạy cảm

• Cây chết với tán lá ñổi màu (vàng, nâu hoặc ñỏ)

• Cây chết với sự thể hiện bệnh theo thời gian

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 21

• Sự hiện diện sắc nét của bệnh hoặc ranh giới giữa vùng thực khỏe với thực vật bị nhiễm bệnh

Một cây bị bệnh không thể dễ dàng phân biệt với cây ñã chết, như gốc

cây của Xanthorrhoea spp Trong một thời gian dài nó cũng có thể ñược ghi

nhận khi các thảm thực vật dưới tán, trừ các loại cỏ bản ñịa và vật một lá

mầm khác, bị tiêu diệt Cỏ ngoại lai và dạng cói thường kháng với P cinnamomi

2.7.2 Ngăn chặn sự lây lan của nấm Phytophthora cinnamomi

Một nghiên cứu của MacDonald và cs 1994 tìm thấy P cinnamomi trong

các hệ thống thủy lợi, ao thải thu ñược từ vườn ươm tại California Các

nghiên cứu khác cũng tìm thấy Phytophthora spp trong nước thủy lợi ñược

sử dụng cho các vườn ươm loại cây cảnh (Bush và cs 2003; Themann và cs 2002) Vì vậy, ñiều quan trọng cho vườn ươm ñể có ñược giống sạch bệnh là thực hiện các quy tắc vệ sinh vườn ươm như lọc nước thủy lợi Trong một nghiên cứu gần ñây, Ufer và cs (2008) ñã chứng minh hiệu quả của lọc cát

chậm và lọc hạt dung nham cho việc loại bỏ các Phytophthora spp từ nước tưới Cả hai hệ thống lọc loại bỏ Phytophthora từ các nguồn nước thủy lợi

Nước lọc phải ñược lưu trữ trong hồ chứa cách ly ñất ñể ngăn chặn sự quay trở lại nước của nấm bệnh Sử dụng hóa chất cũng ñược ưu tiên trong các

vườn ươm cây cảnh ñể kiểm soát Phytophthora Hai thuốc diệt nấm,

mefenoxam và AI fosetyl hoặc phosphonate kali, ñược khuyến nghị cho việc

kiểm soát hóa học của P cinnamomi (Hướng dẫn sử dụng hóa chất nông

nghiệp Bắc Carolina, 2008) Nghiên cứu này là có liên quan với việc sử dụng mefenoxam như một biện pháp kiểm soát Mefenoxam kháng một số

Phytophthora spp trong cây cảnh ở Bắc Carolina Tuy nhiên, sức ñề kháng

mefenoxam ñã không ñược báo cáo với trường hợp của P cinnamomi Duan

và cs (2008) [27] kiểm tra tính kháng mefenoxam 51 chủng của P cinnamomi

và thấy tất cả ñều nhạy cảm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 22

Hiện nay, phương pháp kiểm soát phù hợp nhất là tiêu diệt nấm và bảo

vệ ñất Tiêu diệt nấm trong ñất, phương tiện vận chuyển có thể thực hiện ñược với phương pháp xông khói như methyl bromide hoặc với hơi nước không khí tại 160 0F trong 1giờ (Haj Hoitink) Phương pháp bảo vệ ñấtcủa Hoitink và Schmitthenner ñược vạch ra chi tiết Tóm lại, những phương pháp này bao gồm sử dụng cây con khỏe mạnh, loại bỏ rễ mầm bệnh trong môi trường tự

do, và sử dụng giá thể trồng với môi trường ñất thoát nước tốt Giá thể trồng cây cung cấp khoảng 20% không gian không khí và thoát nước tốt bao gồm một sự kết hợp của than bùn giống rong thủy Canada hay ðức, ñá trân châu xốp hoặc, và cát thô

Biện pháp kiểm soát bao gồm giảm ñộ ẩm ñất và cải thiện bằng cách tăng thông khí, thoát nước, và chú ý ñến dinh dưỡng khoáng Phơi ải ñất cũng

hạn chế ñược P cinnamomi trên các cây bơ trẻ Xem xét sự kết hợp của các

biện pháp kiểm soát bệnh ở vườn ươm Phương pháp phòng trừ tổng hợp

thường ñược dùng ñể kiểm soát P cinnamomi trên bơ (Coffey, 1984) [14]

Hóa chất có thể kiểm soát với các thuốc diệt nấm có hệ thống, nhất là fosetyl nhôm (và phosphonic acid) và metalaxyl áp dụng ngâm nươ c ñất, phun trên

lá hoặc tiêm thân cây Bổ sung nguyên tố lưu huỳnh tỷ lệ mắc bệnh giảm trong dứa, rõ ràng thông qua các hiệu ứng về ñộ pH của ñất

Không có cách chữa cho bệnh thối gốc do nấm P cinnamomi, và cũng

rất khó ñể ngăn chặn lây lan khi nó ñã bị nhiễm một khu vực Tuy nhiên, có thể làm chậm sự lây lan của nó và giảm thiểu sự thâm nhập vào các khu vực mới bằng một số cách Trong ñó cách tốt nhất ñể kiểm soát lây lan của nó là ngăn chặn sự phát tán của ñất hoặc tàn dư thực vật bị nhiễm khuẩn

a Khu nguy cơ nhiễm

Ba khu nguy cơ cần ñược xác ñịnh trong quản lý sự xuất hiện và gây

hại của P cinnamomi

• Khu nguy cơ cao: một khu vực ñược xác nhận bởi phòng thí nghiệm hoặc bị

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 23

nghi ngờ (sau kiểm tra trực quan) là có P cinnamomi

• Khu trung bình: khu vực P cinnamomi không nghi ngờ hoặc ñã xác nhận,

nhưng là nơi tiềm năng ñể trở thành là cao (loại ñất, khí hậu có tiềm năng cao cho sự phát triển và sự sống còn, và các loài cây trồng dễ nhiễm có mặt)

• Khu nguy cơ thấp: khu vực P cinnamomi xác nhận không có, và tiềm năng

bị nhiễm là thấp (loại ñất, khí hậu, không có loài thực vật ký chủ cho P cinnamomi là ñiều quan trọng nhất)

b Nguyên tắc vệ sinh khu vực

Thực hiện các quy tắc sau ñây sẽ giúp giảm thiểu sự lây lan của P cinnamomi :

1/ Với các khu nguy cơ trong vùng: Nếu không chắc chắn liệu P cinnamomi có mặt tại một khu vực hay không, thì cần có biện pháp phòng ngừa ñể giảm thiểu bất kỳ nguy cơ có thể lây lan của bệnh

2/ Sau khi hoạt ñộng trong khu có nguy cơ lây nhiễm cao cần ñảm bảo rằng các phương tiện, máy móc thiết bị như lốp xe ñạp và giày dép phải làm sạch trước khi rời khỏi

3/ ðảm bảo làm sạch sau khi từ khu vực có nguy cơ lây nhiễm trung bình và thấp trước khi chuyển vào khu có nguy cơ lây nhiễm cao

Không bao giờ di chuyển từ một khu vực có nguy cơ cao vào một khu vực trung bình hoặc khu có nguy cơ lây nhiễm thấp, trừ khi xe cộ, máy móc, thiết bị ñược làm sạch

4/ Tránh xung quanh vùng ñất vẫn ñang trong quá trình lây nhiễm và theo dõi bất cứ nơi nào có thể

5/ Tránh các vùng dễ bị ngập P cinnamomi rất có thể ñược lưu giữ

trong khu vực ẩm ướt quanh năm

6/ Nguồn tàn dư từ thực vật chỉ nằm trong một khu có nguy cơ lây nhiễm thấp hoặc vừa phải

Không ñược mang tàn dư thực vật trong khu nguy cơ lây nhiễm cao ra

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 24

ngoài kể cả vật chất khác bao gồm gạch vụn, sỏi, cát và ñất ðảm bảo thực hiện các thủ tục thể hiện vệ sinh thích hợp

7/ ðảm bảo tất cả nguồn nước ñược sử dụng là không có P cinnamomi

Khử trùng nước lấy từ các ñập nước và dòng suối với clo (6 ml clo hòa với 10l nước) Nước từ nguồn cung cấp như nhà máy, giếng khoan sâu hoặc nước mưa thường không cần khử trùng và ñược lưu trữ trong thùng chứa tránh tiếp xúc với ñất và chất hữu cơ

8 Không dùng lại nước, ñất hoặc tàn thực vật từ khu vực có nguy cơ lây nhiễm cao Hạn chế di chuyển trong vùng ñất này

9 Hạn chế sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật Có thể sử dụng hóa chất bảo

vệ thực vật kiểm soát cây trồng và cỏ dại mà không gây tác hại ñối với ñất

11 Tuân thủ tất cả các dấu hiệu cảnh báo

Nếu có nghi ngờ P cinnamomi gây hại từ một kiểm tra trực quan, quan

sát thực ñịa có thể ñược xác nhận bằng cách thu thập và thử nghiệm các mô ñất và cây trồng trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên ñiều này không luôn luôn

xác nhận sự hiện diện của P cinnamomi Các mẫu ñất chứa nấm có thể dễ

dàng thể bỏ qua tại nơi lấy mẫu bởi vì phân bố của nấm trên toàn ñất thường không thống nhất Do ñó không có kết quả xét nghiệm"âm tính" mà chỉ ñơn giản là 'không xác nhận'!

Trong khi P cinnamomi có thể ñược giám ñịnh quanh năm, thời gian

tốt nhất ñể thu thập mẫu là trong những tháng ấm áp trong suốt mùa xuân và ñầu mùa hè khi ñất vẫn còn ẩm ðiều kiện ñất ẩm trong thời gian này là cơ

hội lớn nhất ñể phát hiện P cinnamomi trong phòng thí nghiệm

Khuyến khích sử dụng phương pháp sau ñây ñể thu thập các mẫu ñất ñược Chỉ thu thập mẫu nếu ñất bị ẩm và ñảm bảo rằng tất cả các dụng cụ lấy mẫu ñất ñều sạch bệnh Khử trùng các dụng cụ bằng cồn (ñã pha loãng) hoặc bằng thuốc tẩy gia dụng (pha loãng 1 phần trong 4 phần nước) sau ñó rửa sạch với nước cất và lau khô bằng khăn giấy sạch Sau ñó:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 25

1 Thu thập ñất và mẫu thực vật cho thấy các triệu chứng sớm của bệnh (ví dụ ñổi màu lá)

5 ðảm bảo rằng các mẫu ñã ñược dán nhãn ñúng với:

• Liên hệ chi tiết (người liên lạc, ñịa chỉ bưu ñiện và số ñiện thoại)

• mẫu chi tiết (bản ñồ vị trí tham chiếu và ngày)

• Một số thông tin cơ bản (bao gồm cả các cây bị nhiễm)

6 Khử trùng các dụng cụ, giày dép và tay với dung dịch cồn methyl hoặc thuốc tẩy sau mỗi lần lấy mẫu

7 Giữ mẫu từ 10-25 º C (không ñể trong tủ lạnh) Vào mùa hè, mẫu phải ñược vận chuyển trong một hộp chứa cách nhiệt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 26

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

* Các vật liệu nghiên cứu trong phòng:

- Môi trường nuôi cấy: Thành phần (trong 1 lít môi trường):

+ Môi trường PDA: Khoai tây (250gr), ðường Dextro (20gr), Agar (20gr) + Môi trường PCA: Khoai tây (20gr), Cà rốt (20gr), Agar (20gr)

+ Môi trường WA: Agar (20gr), Nước cất (1000ml)

+ Môi trường PSM: Cà rốt (không gọt vỏ)(20g), Khoai tây (không gọt vỏ): 20g, Thạch rau câu (12g), Nước cất (1000ml)

- Các hoá chất: Piranicin, Rifampicin, Streptomycin sulfate, Dichloran, Neomycin sulfate, các loại thuốc BVTV: AGRI - FOS, Aliette,

- Các trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy dụng cụ, buồng cấy, nồi hấp, tủ ñịnh ôn, máy ño ñộ pH, dụng cụ nuôi cấy nấm

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Triệu chứng và ñặc ñiểm hình thái tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Nghiên cứu phân lập, xác ñịnh tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại

Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Nghiên cứu quy luật phát sinh, phát triển của bệnh thối củ cây Sì to trên ñồng ruộng tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

- Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập, xác ñịnh tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì

to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

Việc xác ñịnh tác nhân gây bệnh ñược tiến hành theo quy tắc Koch (1876): với 4 bước

1 Mô tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết Ví dụ: Triệu chứng héo, ñốm, thối thân rễ và nhận dạng: màu sắc, kích thước, hình dạng

2 Phân lập tác nhân gây bệnh và thông qua ñó mô tả và giám ñịnh

3 Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khoẻ, quan sát triệu chứng bệnh biểu hiện có giống mô tả ban ñầu

4 Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ cây lây bệnh có xuất hiện triệu chứng bệnh, xác ñịnh xem có giống với tác nhân gây bệnh phân lập từ cây bệnh ban ñầu

Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm bệnh trong phòng thí nghiệm ñược tiến hành theo Burgess và cộng sự (2008)

3.3.1.1 Ph ương pháp phân lập mẫu bệnh chung

a Phương pháp ñể ẩm

- Rửa mẫu bệnh sạch ñất cát dưới vòi nước

- ðặt mẫu bệnh vào hộp Petri có giấy thấm vô trùng

- Sau 1 - 2 ngày quan sát vi sinh vật gây bệnh từ mô bệnh

b Phương pháp phân lập ký sinh gây bệnh trực tiếp từ mẫu cây bệnh

- Rửa mẫu bệnh dưới vòi nước

- Lựa chọn các mô bệnh ñiển hình

- Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1 x 1 cm Miếng cắt phải nằm ở ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, có cả mô bệnh và mô khoẻ Khử trùng bề mặt bằng cồn 700C trong 15 - 20 giây, sau ñó rửa sạch bằng nước cất vô trùng

- Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao ñã khử trùng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 28

- Làm thuần mẫu nấm bằng cách cấy ñỉnh sinh trưởng của một sợi nấm

từ môi trường WA sang môi trường nuôi cấy PDA và PCAc Phương pháp

phân lập nấm Phytophthora từ ñất và rễ cây Sì to

Phương pháp phân lập Phytophthora từ ñất và rễ cây Sì to bằng sử

dụng mồi bẫy: cánh hoa (Drenth và Sendall, 2004)

- Lấy mẫu ñất ở gốc của cây bị bệnh, bao gồm cả rễ cây bệnh

- Cho ñất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi ñạt 3/4 cốc Khuấy nhẹ ñất trong cốc bàng ñũa thuỷ tinh, ñể ñất lắng xuống khoảng 2h ( tốt nhất ñể qua ñêm)

- Cắt cánh hoa hồng, kích thước khoảng 2 x 2 cm ( 1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên

- ðể cốc bẫy bào tử qua ñêm ở nhiệt ñộ phòng (20 - 250C)

- Quan sát cánh hoa sau: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày xem có xuất hiện vết hoại tử

- Làm sạch cánh hoa có vết bệnh, khử trùng bề mặt và tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh như ñối với mẫu sì to bị bệnh

2.3.1.2 Ph ương pháp lây bệnh nhân tạo (theo Burgess và cộng sự (2008)

Ti ến hành lây bệnh theo 3 phương pháp sau:

- Phương pháp lây bệnh qua ñất với Phytophthora gây thối củ:

+ Ngâm hạt kê và vỏ trấu (tỉ lệ 1:1 về thể tích) trong nước và ñể qua ñêm trong tủ lạnh, ñể hỗn hợp ngấm nước

+ Chắt bỏ phần nước

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 29

+ Cho 150ml giá thể vào một bình tam giác dung tích 250ml

+ Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn ñể nút chặt miệng bình tam giác

+ Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng

+ ðể bình nguội, sau ñó cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào

tử vào giá thể trong bình tam giác

+ Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy ñể ñảm bảo nguồn bệnh ñược phân bố ñều trong giá thể

+ Nấm nhân nuôi trong bình tam giác khoảng 15 ngày, lấy ra trộn vào ñất vào bốn phía của cây

- Lây bệnh trực tiếp lên mô cây ký chủ: Nguồn bệnh ñược phân lập từ mẫu cây bị bệnh, ñược ñặt trực tiếp lên bộ phận của cây

- Tưới trực tiếp dung dịch nấm bệnh vào xung quanh gốc cây: Sợi nấm ñược cấy thuần trên ñĩa petri, cho nước cất vào với liều lượng 1% dung dịch ñặc sợi nấm ñược cạo trên bề mặt sợi nấm trên ñĩa petri, ñể tạo du ñộng bào

tử, liều lượng tưới 300ml/cây/lần, tưới 3 lần trong thời gian 3 tuần (Drenth và Guest, 2004)[16]

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học, sinh thái của tác

nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc

3.3.2.1 Nghiên c ứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự phát triển của tản nấm

Các ngưỡng nhiệt ñộ: 20, 25, 30, 350C

3.3.2.2 Nghiên c ứu ảnh hưởng của các ñộ pH khác nhau

Các ngưỡng pH làm thí nghiệm là: 5; 6; 7; 8

Phương pháp tiến hành chung cho 4 thí nghiệm trên:

- Sử dụng 3 mẫu nấm khác nhau ñã ñược làm thuần

- Môi trường nuôi cấy nấm: PDA

- Mỗi công thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 1 hộp petri cho