Nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn (PRRS) ở việt nam và một số đặc tính bệnh biến tế bào MARC145

luận văn

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp hà nội

Hà Nội - 2010

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả và số liệu thể hiện trong luận văn này là trung thực và chưa từng sử dụng ñể bảo vệ bất cứ học vị nào

Tôi cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Hà

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự giúp ựỡ quý báu của các cá nhân và tập thể Nhân dịp này cho phép tôi ựược bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:

Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trong Viện đào Tạo Sau đại Học, Khoa Thú Y - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã ựào tạo và truyền tải kiến thức khoa học cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Ban lãnh ựạo Viện Thú Y, tập thể bộ môn Hóa sinh, Miễn dịch - Bệnh

lý, nơi tôi công tác và cũng là nơi tôi thực hiện ựề tài này

đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo:

(1) PGS.TS Nguyễn Hữu Nam - Trưởng khoa Thú Y - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội; (2) TS Nguyễn Viết Không - Trưởng bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y; (3)TS Ken Inui- chuyên gia FAO - là những người thầy ựã trực tiếp hướng dẫn giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến gia ựình những người ựã luôn tạo mọi ựiều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Hà

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

DNA Deoxyribonucleic Acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông - Lương liên hiệp quốc FBS Fetal Bovine Serum

HSMDBL Bộ môn Hóa sinh-Miễn dịch-Bệnh lý

IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test

IPMA Immuno- Peroxidase Monolayer Assay

MEM Minimum Eagle Medium

OIE Office Internationable des Epizooties (Tổ chức bảo vệ sức khỏe ñộng

vật thế giới)

PBS Phosphate Buffer Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PRRS Porcine Reproductive and Resiratory Syndrome:

PRRSV Porcine Reproductive and Resiratory Syndrome Virus

RNA Ribonucleic Acid

RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction

TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose: liều gây nhiễm 50% tế bào VNT Virus Neutralization Test: Phản ứng trung hòa vi rút

AEC 3- Amino-9-Ethycarbazone (cơ chất)

MỤC LỤC

ðẶT VẤN ðỀ 1

Mục tiêu của đề tài 2

Ý nghĩa của đề tài 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 3

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

1.3 Căn bệnh 7

1.3.1 Cấu trúc Arteriviruses 8

1.3.2 Các chủng vi rút và phân bố 10

1.3.3 ðường truyền lây 11

1.3.4 Sức đề kháng 12

1.3.5 Triệu chứng lâm sàng 13

1.3.6 Bệnh tích 14

1.3.7 Chẩn đốn 15

NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ðối tượng nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Cách tiếp cận 22

2.4 ðịa điểm, thời gian nghiên cứu 22

2.5 Nguyên liệu 22

2.5.1 Bệnh phẩm 22

2.5.2 Kháng nguyên chuẩn, kháng thể chuẩn 22

2.5.2 Vật liệu, hĩa chất, sinh phẩm 23

2.6 Phương pháp nghiên cứu 25

2.6.1 Nuơi cấy tế bào Marc145 25

2.6.2 Phân lập vi rút PRRS 26

2.6.3 Phản ứng RT-PCR 26

2.6.4 Phản ứng IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) 28

2.6.5 Chuẩn ñộ vi rút PRRS 30

2.6.6 Nhuộm tế bào nuôi cấy trên phiến kính mỏng 31

2.6.7 Cách tính tính giá trị TCID50/ml và ñọc kết quả 33

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả nghiên cứu ñặc tính nhân lên của vi rút RRRS trên tế bào Marc 145 34

3.2.1 ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Việt Nam 36

3.2.2 ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ.37 3.2.3 ðặc tính nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Châu Âu 39

3.2.4 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR 40

3.2.5 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA 41

3.2.6 So sánh ñặc tính nhân lên và gây bệnh trên tế bào của 3 chủng vi rút ñại diện 42

3.3 Quy trình phân lập vi rút ở ñiều kiện Việt Nam 44

3.4 Kết quả phân lập vi rút PRRS ở một số ñịa phương 48

3.4.1 Kết quả phân lập vi rút từ mẫu huyết thanh 49

3.4.2 Kết quả phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm 50

3.4.3 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR 51

3.4.4 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA 51

3.4.5 Chuẩn ñộ vi rút PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 52

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 54

KẾT LUẬN 54

ðỀ NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tiếng việt 55

Tiếng anh 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 01-01 Sự tương ñồng giữa các chủng vi rút PRRS 10

Bảng 02-01 Trình tự nucleotide của primer ñặc hiệu cho PRRS 26

Bảng 02-02 Thành phần phản ứng sinh tổng hợp cDNA 27

Bảng 02-03 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 02-04 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28

Bảng 03-01 Kết quả quan sát bệnh tích tế bào sau khi nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin 36

Bảng 03-02 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Việt Nam 37

Bảng 03-03 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Bắc Mỹ 38

Bảng 03-04 Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Châu Âu 39

Bảng 03-05 kết quả so sánh bệnh biến tế bào các chủng ñại diện 43

Bảng 03-06 Kết quả xác ñịnh mật ñộ và tình trạng phát triển của tế bào Marc145 46

Bảng 03-07 Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) phân lập vi rút từ huyết thanh 49

Bảng 03-08 Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) phân lập vi rút từ phủ tạng 50

Bảng 03-09 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR 51

Bảng 03-10 Kết quả xác ñịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA 52 Bảng 03-11 Kết quả chuẩn ñộ vi rút PRRS chủng phân lập 53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 01-01 Tình hình dịch bệnh PRRS từ năm 2007 - 2010 6

Hình 01-02 ðại thực bào sau khi bị vi rút PRRS xâm nhập 8

Hình 01-03 ðại thực bào khi chưa bị vi rút PRRS xâm nhập 8

Hình 01- 04 Mô hình cấu trúc vi rút PRRS 9

Hình 01- 05 Cấu trúc genome của vi rút PRRS 9

Hình 01-06 Sự tương ñồng giữa chủng vi rút PRRS 11

Hình 01-07 Sơ ñồ nguyên lý phản ứng RT-PCR 19

Hình 03-01 Sự biến ñổi của tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h và hình ảnh nhuộm tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h gây nhiễm vi rút PRRS 35

Hình 03-02 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng Việt Nam 37

Hình 03-03 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng vi rút Bắc Mỹ 38

Hình 03-04 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm vi rút Châu Âu 39

Hình 03-05 Hình ảnh ñiện di agarose gel sản phẩm PCR-PRRS, nhuộm Ethidium bromide 40

Hình 03-06 Kết quả thực hiện phản ứng IPMA ñối với 3 chủng ñại diện 42

Hình 03-07 Tế bào Marc145 46

ðẶT VẤN ðỀ

Trong những năm gần ñây, cùng với sự phát triển không ngừng của ngành chăn nuôi lợn ở nước ta, các bệnh trên lợn cũng xuất hiện ngày càng nhiều và luôn là mối ñe dọa ñối với các nhà chăn nuôi Trong vô số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây bệnh cho lợn phải kể ñến Hội chứng Rối loạn hô hấp và sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) ðây là một bệnh mới do vi rút gây ra Bệnh có ñặc ñiểm sốt cao, biếng ăn, rối loạn sinh sản, gây chết ñối với lợn con, ho và có dấu hiệu của viêm phổi ñối với lợn ở mọi lứa tuổi

Hội chứng Rối loạn hô hấp và sinh sản gây thiệt hại lớn ñối với ngành chăn nuôi lợn ở Việt nam và trên thế giới Hàng năm, tại Mỹ ước tính thiệt hại do PRRS gây ra ở mức 720 triệu ñô la Mỹ [2] Ở Việt nam, thiệt hại kinh

tế do PRRS gây ra chưa ñược ước tính, tuy nhiên trong hai năm 2007 và

2008 hàng loạt các trại lợn ñã phải tiêu huỷ do PRRS Bệnh ñược xếp vào nhóm các bệnh nguy hiểm trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe

ñộng vật thế giới Cho ñến nay, lợn là ñộng vật duy nhất mắc hội chứng rối

loạn hô hấp và sinh sản

Vi rút PRRS thường lan truyền qua ñường tiếp xúc trực tiếp, không khí, các loại dịch tiết, phân, nước tiểu [29,31] Tại phổi vi rút xâm nhập và nhân lên trong các ñại thực bào Bình thường ñại thực bào có thể bắt và tiêu diệt vi khuẩn hoặc vi rút khi xâm nhập vào cơ thể, nhưng vi rút PRRS không những không bị tiêu diệt mà còn có thể nhân lên trong ñại thực bào với số lượng lớn, làm cho chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể suy giảm và nguy

cơ bị nhiễm các bệnh kế phát tăng lên ðiều này giải thích vì sao khi lợn bị PRRS người ta thường khó xác ñịnh ñược nguyên nhân chính gây bệnh [39]

Ở Việt nam cho ñến nay chưa có nhiều nghiên cứu về PRRS, ñể làm tiền ñề cho những nghiên cứu sâu hơn về bệnh học và vi rút PRRS, ñồng

thời muốn phòng chống PRRS ở Việt nam cần thiết phải có vi rút phân lập Trong phân lập vi rút việc xác ñịnh ñược các ñặc tính nhân lên của vi rút, ñặc tính gây bệnh biến tế bào nuôi và các tiêu chí ñánh giá về phân lập vi rút cũng như ngăn trở vi rút phá huỷ tế bào trong các phản ứng trung hoà huyết thanh, ñánh giá mức ñộ miễn dịch của lợn ñược tiêm phòng vac-xin là cần

thiết Xuất phát từ yêu cầu thực tế ñó chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn (PRRS) ở Việt Nam và một số ñặc tính bệnh biến tế bào Marc145”

Mục tiêu của ñề tài

Thiết lập ñược quy trình phân lập vi rút PRRS ở phòng thí nghiệm trong ñiều kiện Việt Nam, xác ñịnh ñược cách ñánh giá bệnh biến tế bào gây nhiễm

vi rút PRRS trên kính hiển vi dựa vào giám ñịnh bằng các phương pháp tham chiếu và áp dụng quy trình trong phân lập vi rút PRRS ñang lưu hành

Ý nghĩa của ñề tài

Vi rút PRRS thường không gây phá hủy tế bào ngay từ lần ñầu phân lập, việc theo dõi ñánh giá kết quả phân lập không giống như các trường hợp các

vi rút gây phá hủy hàng loạt tế bào cảm thụ ðộc lực và mức phá hủy/gây bệnh biến tế bào nuôi của vi rút PRRS ở Việt Nam có thể rất khác nhau, việc xác lập ñiều kiện phân lập và ñánh giá biến ñổi vi thể của tế bào nhiễm

vi rút PRRS là bước khởi ñầu quan trọng cho việc thường quy hóa phân lập

vi rút PRRS trong phòng thí nghiệm Bước ñầu phân lập vi rút ñang lưu hành, ngoài ý nghĩa ñánh giá tính ổn ñịnh và lập lại của phương pháp, còn

có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc tạo nguồn chủng, nguồn gen vi rút cho những nghiên cứu kế tiếp

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hội chứng gây rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) gây thiệt hại lớn về

mặt kinh tế trong ngành chăn nuôi lợn Bệnh do một loại RNA vi rút có vỏ bọc gây ra, loại vi rút này có tên là Porcine Reproductive and Respiratory

Syndrome virus (PRRS), ñã ñược phân loại thuộc giống Arterivirus, họ

Arteriaeridae, bộ Nidovarales [17, 28, 39, 53] Trong tự nhiên, vi rút gây

bệnh cho lợn Các triệu chứng lâm sàng của bệnh bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng ở lợn nái, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn giảm năng suất và tỷ lệ tử vong cao [3, 5,17,23]

Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh PRRS: Bệnh ñược phát hiện lần ñầu

tiên ở miền Bắc nước Mỹ vào năm 1987 Cùng năm ñó, bệnh xuất hiện ở Canada và không lâu sau bệnh ñã nhanh chóng trở thành dịch trên diện rộng [15,19,35] Lúc ñầu do căn nguyên bệnh chưa ñược xác ñịnh nên hội chứng này ñược gọi là “Bệnh bí hiểm ở lợn” (Mystery Swine Disease - MDS) Từ những năm 1989, 1991 bệnh xảy ra ở hầu hết các nước của Châu Âu như:

Hà Lan, ðức, Tây Ban Nha, ðan Mạch, Pháp, Ba Lan gây chết hàng triệu con lợn ở mỗi nước, không dừng lại ở ñó ñại dịch cũng hoành hành ở một số nước của Châu Á như: Nhật Bản, Hàn Quốc,… Lúc này, căn cứ theo triệu chứng lâm sàng quan sát ñược, người ta gọi bệnh bằng nhiều tên khác nhau như : “Bệnh tai xanh ở lợn” (Blue Ear Disease); Hội chứng hô hấp và vô sinh của lợn (SIRS), bệnh bí hiểm ở lợn (MDS), Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (Porcine Epidemic Abortion Syndrome -PEARS), Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS),… ðến năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này ñược tổ chức tại St Paul, Minnesota và ñược tổ chức thú y thế giới nhất trí, công nhận “bệnh bí

hiểm” này là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine

Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) [18,19,23,28,29, 35,43]

Theo Kegong Tian và cs, năm 2006, dịch bệnh PRRS xảy ra ở hơn 10 tỉnh thành của Trung Quốc làm chết 2.000.000 con lợn và khoảng 400.000 trường hợp lợn sảy thai, ñẻ non Type vi rút gây bệnh cho lợn ở Trung Quốc gây sốt cao từ 40oC - 42oC, vì vậy người dân ñịa phương gọi là bệnh “sốt cao” (high fever) [27] Qua một số nghiên cứu với qui mô lớn, người ta ñã xác ñịnh rằng vi rút gây bệnh PRRS tại Trung Quốc là do vi rút PRRS thuộc chủng Bắc Mỹ thể cường ñộc gây ra [25,27,52,51].Chấm câu ở nhiều chỗ) Theo Trevor W Drew: “Vi rút PRRS tiến triển rất nhanh và sự tiến triển này thực sự ñáng ngạc nhiên” Thông thường ñể tồn tại, bất cứ vi khuẩn, vi rút ñều phải ñi vào ký chủ và bắt ñầu gây ra bệnh rất nghiêm trọng nhưng sau ñó ñộc lực của chúng sẽ giảm dần theo thời gian ðối với vi rút PRRS có chiều hướng ngược lại, nghĩa là khi vi rút xảy ra, gây bệnh (tăng ñộc lực), ñộc lực này tăng dần chứ không giảm, vi rút tiến hóa dần và gây bệnh [47]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, bệnh PRRS ñược phát hiện từ năm 1997 trên ñàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) [1] Tuy nhiên, cho ñến nay những nghiên cứu về hội chứng gây rối loạn sinh sản và hô hấp còn nhiều hạn chế Theo ñánh giá không chính thức, bệnh PRRS ñã trở nên khá phổ biến ở các trại chăn nuôi lợn tại Việt Nam [4,7,8] Căn bệnh lần ñầu tiên ñược phát hiện tại bộ môn Hoá sinh - Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú Y vào ngày 19/3/2007, khi phân lập ñược xác ñịnh là dương tính với RT-PCR ñặc hiệu, nhưng chỉ chính thức ñược Cục Thú Y công bố vào tháng 4/2007 trong hội thảo chuyên ngành

Theo số liệu của Cục Thú Y, cuối tháng 2 năm 2007, bệnh PRRS bắt ñầu xuất hiện ở tỉnh Hải Dương sau ñó lây lan ra các tỉnh ñồng bằng Bắc

Bộ, Trung Bộ và Nam Bộ với các triệu chứng lâm sàng trầm trọng gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn [6] Từ cuối tháng 3 năm 2010, dịch bệnh PRRS lại tái xuất hiện ở tỉnh Hải Dương sau ñó phát tán ra các tỉnh trong khu vực, tính ñến ngày 19 tháng 5 năm 2010 ñã có 15 tỉnh thành trong

cả nước công bố có dịch bệnh PRRS và tình hình dịch bệnh vẫn chưa có tín hiệu giảm

Theo các nghiên cứu về bệnh ở những trại lợn giống của các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính ñối với bệnh rất khác nhau từ 1,3% ñến 68,29% [1]

Tình hình dịch bệnh PRRS tại Việt Nam theo từng năm (nguồn phòng dịch tễ Cục thú y)

Hình 01-01 Tình hình dịch bệnh PRRS từ năm 2007 - 2010

1.3 Căn bệnh

Lúc ñầu, người ta cho rằng một số vi rút như Parvovirus, vi rút giả dại (Pseudorabies), vi rút cúm lợn, Porcine enterovirus, ñặc biệt vi rút gây viêm não, cơ tim (Encephalomyocarditis) gây nên ðến năm 1991 vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ñược các nhà khoa học Hà Lan phân lập

và ñặt tên là vi rút Lelystad, một năm sau các tác giả người Mỹ cũng ñã phân lập ñược một vi rút và ñặt tên là vi rút VR 2332, hai vi rút này xuất phát từ một tổ tiên, nhưng tiến hoá theo ñường khác nhau, dẫn ñến những khác nhau về di truyền và tính kháng nguyên [28,35]

Vi rút PRRS là một vi rút RNA sợi ñơn dương ñược xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần giống với vi rút gây viêm khớp ở ngựa (Equine arthritis Virus - EAV), Lactic Dehydrogenase virus của chuột (LDV) và vi rút gây sốt xuất huyết trên khỉ (Simian Haemorrhagic Fever Virus- SHFV) [14,16,46] ðây là vi rút có vỏ bọc, hình cầu, ñường kính từ 50-70 nm và chứa nhân nucleocapsid 25-35 nm Trên bề mặt có những gai nhô ra rất rõ Sự sinh sôi của vi rút bị dừng lại khi dùng Chloroform hay ether, chứng tỏ vỏ có chứa lipid Vi rút có tỷ trọng 1,19 nổi trên CsCl và 1,14 trên Sucroza ðỉnh của tính lây truyền ở CsCl thuần lớn hơn trong dung dịch ñường Sucroza.Vi rút có khả năng sinh sản trên tế bào ñơn nhân và tế bào ñại thực bào, ñồng thời nó có khả năng ñi qua nhau thai, gây bệnh cho bào thai Vi rút có bộ gen dễ bị thay ñổi dẫn ñến những thay ñổi về tính kháng nguyên và có khả năng trốn tránh hệ thống miễn dịch do con vật sinh ra nên nó có thể tồn tại rất lâu trong cơ thể vật bị nhiễm [40]

Vi rút PRRS có thể xâm nhập và nhân lên trong các ñại thực bào (các tế bào có tác dụng bắt và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh) Khi hình thành các virion, vi rút phá hủy các ñại thực bào

có kích thước khoảng 15,1 ñến 15,5 kb và chứa ít nhất 8 khung ñọc mở (ORF) ñể mã hóa 20 protein ñã ñịnh sẵn Hệ gen cũng chứa 2 vùng không dịch mã (UTR) tại vị trí 59 và 39 [33]

ORF 1a và 1b là ñịnh vị xuôi dòng của 59-UTR, nó chiếm giữ khoảng 80% hệ gen ORF1a ñược dịch trực tiếp trong khi ORF1b ñược dịch bởi một khung dịch chuyển ribosomal, ñộ lún xuống của chuỗi Protein ORF1ab lớn

là sự thủy phân protein thành các sản phẩm liên quan ñến sự sao chép vi rút

và bộ phận bản sao [2,38,57]

Hình 01- 04 Mô hình cấu trúc vi rút PRRS

ORFs 2-7 là ñịnh vị ngược dòng của 39- UTR, nó mã hóa một loạt các protein cấu trúc thuộc vi rút có liên hệ với virion như: Protein vỏ bọc (E) và Protein nhân capsit (N) [33] Các Protein này ñều ñược dịch từ một 39 UTR ñược ñịnh vị cố ñịnh trên các bộ gen ARN thông tin (sgmRNAs) [20]

Hình 01- 05 Cấu trúc genome của vi rút PRRS

Một ñặc trưng của Arteriviruses là phương pháp và vị trí của sao bản sơ cấp, chúng sinh sản trong bào chất quanh nhân của các tế bào chủ Những virion mới ñược giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào Tế bào ñích

sơ cấp của vi rút là ñại thực bào túi phôi của lợn Vi rút rất thích hợp với ñại thực bào ñặc biệt là ñại thực bào hoạt ñộng ở vùng phổi Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, vi rút xâm nhập vào cơ thể, riêng ñối với vi rút PRRS có thể nhân lên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết ñại thực bào (tới 40%) ðại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của

hệ thống bảo vệ cơ thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát [57]

1.3.2 Các chủng vi rút và phân bố

Hiện nay, bệnh PRRS có mặt ở hầu hết các châu lục (Ngoại trừ Châu

Úc khẳng ñịnh không có bệnh PRRS) Có 2 chủng vi rút PRRS chính ñó là: Chủng vi rút có nguồn gốc từ Châu Âu (EU) và chủng vi rút có nguồn gốc

từ Bắc Mỹ (NA) Người ta ñã phát hiện thấy chủng vi rút Châu Âu tại một

số vùng của Bắc Mỹ Ở Châu Á, PRRS ñã trở nên khá phổ biến, với sự có mặt của cả 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, tuy nhiên, sự phân bố của vi rút theo các vùng ñịa lý chỉ là tương ñối Các vi rút PRRS phân lập ñược ở châu

Âu có cùng loại kháng nguyên nhưng khác biệt với các chủng của Bắc Mỹ [39,40,33]

Bảng 01-01 So sánh sự tương ñồng về kiểu gen giữa các chủng vi rút

Hình 01-06 Sự tương ựồng giữa các chủng vi rút PRRS

Hai kiểu gen Bắc Mỹ (với chủng VR2332 Mỹ, chủng Quebec 807/ 94 Canada và đài Loan) và kiểu gen ở Châu Âu (với chủng I10 ở Hà Lan và chủng Olot Tây Ban Nha) Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự khác nhau trong chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng virút Những nhánh chĩa ra là vùng phân bố của chủng ựó ựã ựược phân lập trong vùng hoặc từ những vùng xa hơn

1.3.3 đường truyền lây

Vi rút PRRS lây truyền theo các con ựường khác nhau Vi rút xâm nhập

vào và sinh sản trong các ựại thực bào Bệnh có thể ở trạng thái cận lâm sàng hoặc lâm sang gây nên hội chứng hô hấp hay rối loạn sinh sản tùy thuộc vào tuổi của những lợn bị bệnh Vi rút có trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch (trong giai ựoạn nhiễm trùng máu), phân, nước tiểu và phát tán ra môi trường Ở lợn mẹ mang trùng, vi rút có thể lây nhiễm cho bào thai từ giai ựoạn giữa thai kỳ trở ựi và vi rút cũng ựược bài thải qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải vi rút trong vòng 14 ngày trong khi ựó lợn con và lợn choai bài thải vi rút tới 1-2 tháng Vi rút có thể phát tán thông

qua các hình thức: vận chuyển lợn mang trùng, theo gió (có thể ñi xa tới 3 km), bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi và dụng cụ bảo hộ lao ñộng nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một số loài chim hoang [15, 55]

Vi rút PRRS

Lây truyền qua ñường: hô hấp, miệng, sinh dục, niêm mạc và nhiễm xạ

Sinh sản trong niêm mạc, phổi hoặc các ñại thực bào

Vùng cầu nối lympho bào và nhiễm vi rút huyết (trong khoảng 12 giờ sau nhiễm)

Trong cơ thể phân bố ñến các tế bào ñơn nhân và mô ñại thực bào

1.3.4 Sức ñề kháng

Vi rút PRRS có thể tồn tại hàng năm trong ñiều kiện ñông lạnh ở -70oC Trong 1 tuần ở 4oC vi rút giảm 90% hiệu giá, tuy nhiên ở nhiệt ñộ này, người ta vẫn phát hiện ñược vi rút sau 1 tháng Vi rút có sức ñề kháng tốt trong môi trường có pH từ 6,5-7,5 Khi xử lý bởi ether hoặc Chloroform vi rút bị bất hoạt Vi rút không lây nhiễm bệnh ở người

Bệnh lâm sàng (Phụ thuộc vào tuổi biểu hiện)

- Lợn nái: Sảy thai hay chết lưu, lợn vẫn ñẻ nhưng con ñẻ ra yếu hoặc tiêu thai

- Lợn sơ sinh Khó thở, có dấu hiệu tiêu chảy

- Lợn con cai sữa, lợn choai tăng tỷ lệ chết và tổn thất ñến cực ñại

Thải trừ vi rút qua dịch hầu,

máu, nước tiểu, phân

1.3.5 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng bệnh thể hiện cũng rất khác nhau và phụ thuộc vào các chủng vi rút, trạng thái miễn dịch của ñàn cũng như ñiều kiện quản lý chăm sóc Theo ước tính, cứ 3 ñàn lần ñầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì 1 ñàn không có biểu hiện, 1 ñàn có biểu hiện mức ñộ vừa và ñàn còn lại có biểu hiện bệnh ở mức ñộ nặng, lý do cho việc này vẫn chưa có lời giải, tuy nhiên, với những ñàn khoẻ mạnh thì mức ñộ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do vi rút tạo nhiều biến chủng với ñộc lực khác nhau Thực tế, nhiều ñàn

có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng [50]

Lợn nái giai ñoạn cạn sữa: Trong tháng ñầu tiên khi bị nhiễm vi rút, lợn biếng ăn từ 7-14 ngày (10-15% ñàn), sốt 39-400C, sảy thai thường vào giai ñoạn cuối (1-6%), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2%),

ñẻ non (10-15%), ñộng ñực giả (3-5 tuần sau khi thụ tinh), không ñộng dục hoặc chậm ñộng dục trở lại sau khi ñẻ, ho và có dấu hiệu của viêm phổi Lợn nái giai ñoạn ñẻ và nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, mất sữa và viêm vú (triệu chứng ñiển hình), ñẻ sớm khoảng 2-3 ngày, da biến màu, lờ

ñờ hoặc hôn mê, thai gỗ (10-15% thai chết trong 3-4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30%), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh (khoảng dưới 5%) và duy trì trong vài giờ, pha cấp tính này kéo dài trong ñàn tới 6 tuần, ñiển hình là ñẻ non, tăng tỷ lệ thai chết hoặc yếu, tăng số thai

gỗ, chết lưu trong giai ñoạn 3 tuần cuối trước khi sinh, ở một vài ñàn con số này có thể tới 30% tổng số lợn con sinh ra Tỷ lệ chết ở ñàn con có thể tới 70% ở tuần thứ 3-4 sau khi xuất hiện triệu chứng Rối loạn sinh sản có thể kéo dài 4-8 tháng trước khi trở lại bình thường Ảnh hưởng dài lâu của PRRS tới việc sinh sản rất khó ñánh giá, ñặc biệt với những ñàn có tình trạng sức khoẻ kém Một vài ñàn có biểu hiện tăng số lần phối giống lại, sảy thai Ảnh hưởng của PRRS tới sản xuất như sau: Tỷ lệ sinh giảm 10-15% (90% ñàn trở lại bình thường), giảm số lượng con sống sót sau sinh, tăng

lượng con chết khi sinh, lợn hậu bị có thể sinh sản kém, ñẻ sớm, tăng tỷ lệ sảy thai (2-3%), bỏ ăn giai ñoạn sinh con

Lợn ñực giống: Bỏ ăn, sốt, ñờ ñẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt ñường huyết do không bú ñược, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh

về hô hấp, chân choãi ra, ñi run rẩy…

Lợn con cai sữa và lợn choai: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ tuy nhiên,

ở một số ñàn có thể không có triệu chứng Ngoài ra, trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan tỏa cấp tính, hình thành nhiều ổ áp-

xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15%

1.3.6 Bệnh tích

Bệnh tích ñặc trưng ở phổi: Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm ñặc trưng

bởi những ñám chắc, ñặc trên các thuỳ phổi Thuỳ bị bệnh có màu xám ñỏ,

có mủ và ñặc chắc (nhục hoá) Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh lồi ra, khô, nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ ở mặt dưới thuỳ ñỉnh

Về tổ chức phôi thai học, thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng

thâm nhiễm, trong phế nang chứa ñầy dịch viêm và ñại thực bào, một số

trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một bệnh tích ñặc trưng

nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (Pneumocyte) làm cho phế nang nhăn lại, thường bắt gặp ñại thực bào bị phân huỷ trong phế nang

Bệnh tích ñại thể: Xuất huyết ở phổi, phổi bị phù thũng, Lách nhồi máu, hóa gỗ và giãn nở, thận có nhiều ñiểm xuất huyết Tim bị rối loạn Gan hoại

tử, chảy máu trắng ngà, mạch máu não mềm và mỏng Hạch não rỉ máu, hạch bạch huyết có những ñốm băng huyết

1.3.7 Chẩn đốn

1.3.7.1 Chẩn đốn lâm sàng:

Dựa vào những triệu chứng sau [11, 55]:

Triệu chứng đường hơ hấp: Viêm phổi ở lợn con và lợn vỗ béo

Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu của dịch PRRS, cĩ thể thấy hiện tượng sẩy thai ở giai đoạn cuối thời kỳ mang thai và đẻ non cĩ các thai yếu, thai chết lưu, đồng thời cĩ thai gỗ, lợn con sinh ra yếu, chết trước khi cai sữa

Tuy nhiên, bệnh cĩ thể khơng điển hình theo lứa tuổi vì vậy trong chẩn đốn lâm sàng cần phân biệt bệnh PRRS với các bệnh giả dại, cúm lợn, bệnh truyền nhiễm đường hơ hấp do coronavirus, bệnh viêm não và cơ tim, bệnh do circovirus…

1.3.7.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh

ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và cĩ vùng xám và hồng Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dày lên, viêm não giữa và giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho ðối với sảy thai hoặc thai chết lưu thì khơng cĩ bệnh tích đại thể hoặc vi thể đặc trưng

1.3.7.3 Phương pháp huyết thanh học

Cĩ thể phát hiện kháng thể kháng vi rút PRRS trong huyết thanh, dịch của cơ thể hoặc từ thai chết lưu bằng một số phương pháp huyết thanh học như: Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Immunofluo rescence assay-IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp (immunoperoxidase monolayer assay -IPMA) và phản ứng trung hịa vi rút trên mơi trường tế bào 1 lớp (Virus neutralization test-VNT) Trong những phương pháp kể trên, mỗi phương pháp đều cĩ những ưu điểm của nĩ Với phương pháp ELISA cĩ thể chẩn đốn một số lượng mẫu huyết thanh lớn và

cĩ kết quả nhanh Khi dùng phương pháp này cĩ thể phát hiện được cả

chủng vi rút có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và chủng có nguồn gốc từ Châu Âu Trong khi ñó phương pháp IFA và IPMA lại phát hiện ñược các chủng vi rút

về mặt kháng nguyên gần với chủng dùng trong phản ứng [11,19,22,39]

Các bước của phản ứng ELISA:

Bước 1: Gắn kháng nguyên: Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết

ñược pha loãng trong dung dịch ñệm coating buffer, pH = 9,6 sau ñó ñược gắn trên một bề mặt của phase rắn bằng các liên kết hydro, liên kết ion, lực Van der waals

Bước 2: Rửa trôi những phần kháng nguyên không bám vào bề mặt của

phase rắn

Bước 3: Ủ kháng thể kết hợp với enzyme ñặc hiệu với kháng nguyên

Kháng thể này sẽ ñược giữ lại thông qua liên kết với kháng nguyên bám trên

bề mặt phase rắn, những phần không bám với kháng nguyên sẽ bị rửa trôi

Bước 4: Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến ñổi cơ chất

này và tạo tín hiệu có thể xác ñịnh ñược có hay không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

Phản ứng trung hòa vi rút (Virus neutralization test)

Nguyên lý của phản ứng: Vi rút sau khi xâm nhập vào cơ thể kích thích

cơ thể sản sinh ra kháng thể dịch thể ñặc hiệu Sự kết hợp giữa vi rút với kháng thể ñặc hiệu làm cho vi rút mất khả năng gây bệnh gọi là phản ứng trung hòa

Phản ứng trung hòa thường ñược thực hiện trên môi trường tế bào một lớp ñược nuôi cấy trong các ñĩa nhựa 96 lỗ Kháng thể là huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh ñược xử lý ở nhiệt ñộ 560C trong 30 phút ñể diệt bổ thể Trước khi tiến hành cần phải xác ñịnh hiệu giá của vi rút ñể biết ñược liều gây nhiễm 50% tế bào - TCID50 (50%Tissue Culture Infection Dose) Tùy theo từng loại vi rút người ta có thể sử dụng hiệu giá pha loãng vi rút từ 100TCID50 - 200 TCID50

ðọc kết quả: Phản ứng dương tính: Không có sự hủy hoại của tế bào chứng tỏ có kháng thể tương ứng với kháng nguyên (vi rút sử dụng) Phản ứng âm tính: tế bào bị hủy hoại chứng tỏ không có kháng thể tương ứng với

vi rút ñó Tuy nhiên, ñối với vi rút PRRS phản ứng trung hòa vi rút có lẽ kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì kháng thể trung hòa xuất hiện chậm hơn Tuy nhiên, phản ứng trung hòa lại là chỉ thị tốt nhất ñể ñánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hòa có thể tồn tại ít nhất một năm [11]

Rõ ràng là trong khi ñánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh, phải cân nhắc ñến trạng thái miễn dịch của ñàn sau khi ñược tiêm phòng vac-xin vì hiện tại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt ñược kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vac-xin [11]

1.3.7.4 Phát hiện vi rút

ðể phát hiện sự có mặt của vi rút người ta thường sử dụng các phương pháp như: Phân lập vi rút, phương pháp nhân gen (PCR), phương pháp huỳnh quang gián tiếp ñể phát hiện kháng nguyên, phương pháp miễn dịch bệnh lý, phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào (IPMA) khi sử dụng kháng thể chuẩn ñể phát hiện vi rút có trong mẫu bệnh phẩm lợn bị bệnh PRRS [9,11,30,39,41]

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ñược Kary Mullis và cộng

sự phát minh ra vào năm 1983 Kỹ thuật này ñược hoàn thiện và phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzym tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu trình nhiệt cho phép thay ñổi nhanh chóng và chính xác nhiệt ñộ cho tứng giai ñoạn phản ứng Kỹ thuật PCR cho phép khuyếch ñại một ñoạn gene ñặc hiệu Trong PCR thông thường sau 20 -30 vòng ñã có tới hàng triệu phân tử ñược sao chép từ một phân tử DNA, có thể quan sát ñược trên gel sau khi ñiện di và nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide Chính vì thế mà kỹ thuật PCR ñược xem như một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện ñại [56]

ðối với vi rút PRRS là RNA vi rút nên trước khi tiến hành phản ứng PCR thông thường thì RNA của vi rút ñược chuyển thành cDNA nhờ enzyme sao chép ngược (Reverse Transcriptase) Sau ñó mới tiến hành quy trình PCR như thông thường

Thực chất của phản ứng RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự RNA gồm 2 giai ñoạn:

(1)Tổng hợp trình tự DNA mạch kép từ sợi RNA mạch ñơn

(2) Trình tự DNA 2 sợi ñược sử dụng làm khuôn ñể thực hiện phản ứng PCR Phản ứng RT-PCR cần có sự tham gia của enzyme phiên mã ngược

(Reverse Trancriptase) ñược gọi là giai ñoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở

nhiệt ñộ 50oC- 55oC trong 30 phút Sau khi sản phẩm DNA ñược tạo thành

sẽ xảy ra các giai ñoạn của phản ứng PCR

Hình 01-07 Sơ ñồ nguyên lý phản ứng RT-PCR

Nguyên lý của phản ứng PCR: dựa vào ñặc ñiểm sao chép của DNA, enzyme DNA polymerase sử dụng các ñoạn DNA mạch ñơn làm khuôn mẫu ñể tổng hợp nên sợi DNA bổ sung, bắt ñầu từ ñầu 3’OH của chuỗi oligo nucleotide (mồi-primer), nó có khả năng bắt cặp bổ sung với một ñầu của DNA

Primer là những ñoạn DNA ngắn thường có ñộ dài từ 6 - 30 nucleotide, nó

có khả năng bắt cặp bổ sung với một ñầu của DNA sợi khuôn Sau ñó enzym DNA polymerase sẽ có nhiệm vụ kéo dài mồi ñể tạo thành sợi DNA mới

Phân lập vi rút: Có thể phân lập vi rút PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch

amidan, tuy nhiên không giống với các loại vi rút gây bệnh khác, vi rút PRRS có ñặc ñiểm rất khó phân lập và khó quan sát bệnh tích của tế bào Vi rút thích hợp nhất trên tế bào ñại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên, ñây là việc khó thực hiện vì mỗi lần phân lập ñều phải sản xuất lại tế bào, mặt khác giữa các lô tế bào ñược sản xuất ra có sự biến ñổi khác nhau, thì ñộ mẫn

cảm với vi rút PRRS cũng khác nhau Trong phòng thí nghiệm PRRS thích ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc145 trong ñó tế bào thận khỉ châu phi Marc145 thường ñược sử dụng nhiều nhất [11,39,49]

Ngoài ra, người ta cũng sử dụng các phản ứng như: Immuno-peroxidase

monolayer assay (IPMA), Immuno fluorescence Assay (IFA) và phương

pháp miễn dịch bệnh lý ñể phát hiện sự có mặt của vi rút PRRS khi sử dụng kháng thể chuẩn [34,39]

Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence Assay: IFA) là một kỹ thuật cần thiết ñể phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên ñó Kháng thể ñặc hiệu ñược gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate: FITC), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy ñược các phản ứng miễn dịch, ñồng thời không làm thay ñổi các phản ứng miễn dịch Phức hợp kháng thể huỳnh quang ñược thêm vào một tổ chức và

sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nên một phức hợp miễn dịch bền vững Không một kháng thể nào bị mất trong quá trình rửa, và kết quả ñược quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Bộ ñiều hoà của kính hiển vi chứa nguồn ánh sáng có cường ñộ lớn, kích thích kính lọc ñể tạo ra bước sóng có khả năng gây hoạt hoá huỳnh quang, tấm chắn của kính lọc có tác dụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh sáng Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối, kháng nguyên gắn ñặc hiệu với kháng thể huỳnh quang có thể ñược phát hiện bởi màu xanh lục sáng [11,39]

Phòng bệnh:

Chủ ñộng phòng bệnh bằng cách áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, chuồng trại phải thoáng mát về mùa hè, ấm vào mùa ñông, tăng cường chế ñộ dinh dưỡng, mua lợn giống từ những cơ sở ñảm bảo, thiết lập hệ thống chuồng nuôi cách ly ít nhất 8 tuần, hạn chế khách tham quan, sử dụng bảo hộ lao ñộng, không mượn dụng cụ chăn nuôi của các trại khác, thực

hiện “cùng nhập, cùng xuất” lợn và ñể trống chuồng, thường xuyên tiêu ñộc, khử trùng chuồng nuôi

Phòng bệnh bằng vac-xin: Trên thế giới hiện có 2 loại vac-xin chính

ñó là: Vaccin nhược ñộc và vac-xin vô hoạt dùng ñể phòng bệnh PRRS, tuy nhiên hiệu quả của việc phòng bệnh bằng vac-xin vẫn còn nhiều tranh cãi [26,36,39]

ðiều trị

Tùy theo tình hình dịch bệnh, mục ñích chăn nuôi và khả năng kinh tế của từng khu vực ñể có những quyết ñịnh ñúng ñắn trong việc nên ñiều trị hay thiêu hủy lợn ñã nhiễm bệnh PRRS Trong trường hợp ñiều trị ñối với lợn ñã nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng bệnh cần ñược cách ly ñể ñiều trị, sử dụng một số thuốc tăng cường sức ñề kháng và ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát ñồng thời thực hiện biện pháp phòng bệnh cho toàn ñàn theo phương

án “phòng bệnh cho ñàn có nguy cơ nhiễm bệnh” Cách ly toàn bộ vật nuôi

ñã mắc bệnh và có triệu chứng bệnh ðảm bảo chuồng trại luôn khô thoáng

và sạch sẽ, ñồng thời giữ ấm cho vật nuôi [2, 3, 5]

2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi rút gây bệnh rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus - PRRSV)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu thiết lập ñiều kiện phân lập vi rút và một số tiêu chí ñánh giá nhận biết trên kính hiển vi so với các phương pháp tham chiếu

Phân lập vi rút PRRS ở một số ñịa phương

2.3 Cách tiếp cận

ðể phân lập ñược vi rút PRRS cần có mẫu bệnh phẩm hoặc huyết thanh của lợn bị bệnh PRRS, tế bào Marc145 và ñối chứng dương của vi rút PRRS

Khi ñã thiết lập ñược ñiều kiện, áp dụng phân lập vi rút từ bệnh phẩm ở một số ñịa phương

2.4 ðịa ñiểm, thời gian nghiên cứu

ðịa ñiểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa sinh, Miễn dịch, Bệnh lý, Viện Thú Y Thời gian thực hiện: Từ tháng 10 năm 2009 ñến tháng 6 năm 2010 2.5 Nguyên liệu

2.5.1 Bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm thu thập từ các ổ dịch bệnh PRRS ñiển hình xẩy ra ở Việt Nam từ năm 2007- 2010 do bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch - Bệnh lý (HSMDBL) cung cấp

2.5.2 Kháng nguyên chuẩn, kháng thể chuẩn

Kháng nguyên chuẩn: Vi rút PRRS chủng Châu Âu và Bắc Mỹ do Bộ

môn HSMDBL và T.S Ken Inui (chuyên gia FAO) cung cấp

Kháng thể chuẩn: Là mẫu huyết thanh thu ñược từ lợn ñược gây nhiễm

vi rút PRRS (Do chuyên gia FAO cung cấp)

Mẫu huyết thanh âm chuẩn (Do bộ môn HSMDBL cung cấp)

2.5.2 Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm

Vật liệu, hóa chất, dùng trong nuôi cấy tế bào

Tế bào Marc145 có nguồn gốc từ Úc

Môi trường MEM của hãng Gibco, cat # 41500-018

Tripsin EDTA của hãng Gibco, cat # 10091-148

Huyết thanh bào thai bê của hãng Gibco, cat# 15050065

PBS (Phosphate Buffer saline), pH=7,2-7,4, cat #21600069

Nước cất tinh sạch

Kháng sinh, kháng nấm

Vật liệu, hóa chất, dùng trong phân lập vi rút

Tế bào Marc 145 ñơn lớp: chai T75 bám ñáy 100 %

Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, phổi, hạch amidan )

Môi trường MEM

Huyết thanh bào thai bê

PBS (Phosphate Buffer saline), pH=7,2-7,4

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR

TRizol, Chloroform, Iso-Propanol, Ethanol 100% và các thành phần trong tổng hợp cDNA và PCR: Nuclease-free water, Random Primer, RNA , First strand buffer, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Reverse Transcriptase, MgCl2, PCR buffer 10x, Taq polymerase, Reverse Primer R2, Forward Primer F2

Hóa chất dùng trong ñiện di: Agarose, dung dịch TAE, loading dye,

DNA marker, Ethidium Bromide

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng IPMA:

ðĩa tế bào Marc 145 gây nhiễm vi rút PRRS sau 2 ngày

Mẫu huyết thanh dương chuẩn, âm chuẩn

Fixing solution: PBS, Formalin, NP40

Washing buffer: PBS, Tween 80, skim milk

Rabbit IgG peroxidase conjugate

ACE solution

Vật liệu, hóa chất dùng trong nhuộm tiêu bản

Tế bào Marc145

Môi trường MEM

Huyết thanh bào thai bê

vontex, máy ựo pH ựiện tử (Prescisa), máy khuấy từ, máy chạy PCR (Thermocycler), máy ựiện di, chai nuôi cấy T25, T75, T150 của hãng Corning, ựĩa nuôi cấy 96 giếng của hãng Corning Tube ly tâm 15ml, 50 ml, Eppendorf 1,5ml, Eppendorf 2,0ml, PCR tube 1,5ml; 0.5ml; 0,2ml (Eppendorf free RNase), Pipette và ựầu tip tương ứng 1000ộl, 200 ộl, 100ộl, 10ộl, 2ộl (đầu tip free RNase), máng nhựa, giá ựựng, găng tay, khẩu trang, cồn sát trùng và máy móc khác trong phòng thắ nghiệm

Thiết bị: Buồng cấy vô trùng (safety cabinate), cân phân tắch, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm 370C 3% CO2 kắnh hiển vi soi ngược, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C,

tủ lạnh -800C, bình nitơ lỏng

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Nuôi cấy tế bào Marc145

Thực hiện nuôi cấy tế bào theo hướng dẫn của nhà cung cấp (Australian Animal Health Laboratory -AAHL)

Bước 1:

Chuẩn bị ựầy ựủ môi trường, chai nuôi, dụng cụ thắ nghiệm dùng cho nuôi cấy tế bào, buồng cấy, và các máy móc cần thiết trong phòng thắ nghiệm

Bước 2:

Lấy tế bào từ nitơ lỏng ra, ngâm ngay ống tế bào vào trong cốc nước nóng 370C hoặc nắm chặt trong tay cho tế bào tan ra Dùng pipet hút hết dung dịch tế bào vào ống corning ựã có sẵn 10 ml môi trường, li tâm 1500 vòng trong 10 phút ựể loại bỏ dung dịch bảo quản đánh tan cặn tế bào trong 1- 2 ml môi trường, và nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa ựủ 8ml môi trường Nuôi trong tủ ấm 370C 5% CO2 Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vi

2.6.2 Phân lập vi rút PRRS

Theo hướng dần của OIE trong chương 2.08.07 về bệnh rối loạn sinh

sản và hô hấp ở lợn trang 1117-1118, Terrestrial Manual 2008 [39]

Tế bào Marc145 nuôi cấy trong chai T75 bám ñáy 100%

Bước 1:

Hút bỏ môi trường nuôi cấy

Cho 15ml MEM 5% FBS

Bước 2: Gây nhiễm vi rút

Cho 200µl huyễn dịch vi rút PRRS vào chai tế bào

Bước 3:

Nuôi trong tủ ấm 370C 5% CO2 theo dõi sự phát triển hàng ngày

Bước 4: Thu virrus

Tùy theo ñộc lực của chủng vi rút gây nhiễm mà việc thu huyễn dịch

vi rút sẽ ñược thực hiện sau 3- 5 ngày

Thu vi rút vào ống li tâm 15

Bảo quản -800C

2.6.3 Phản ứng RT-PCR

Mồi ñặc hiệu: ðể nhân ñoạn gen ORF5 (Glycoprotein 5)

Bảng 02-01 Trình tự nucleotide của primer ñặc hiệu cho PRRS

Vortex ñều, ñể nhiệt ñộ phòng trong 5 phút

Thêm 200µl Chloroform, vortex trong 30 giây, ñể nhiệt ñộ phòng 3 phút

Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C

Thu dịch nổi bên trên

Thêm 500µl Isopropanol, vortex trong 30 giây, ñể nhiệt ñộ phòng trong 10 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C

Thu cặn, thêm 1ml Ethanol 80%