Xác định kiểu gen của virus viêm gan b ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại thái nguyên bằng phương pháp pcr lồng nested pcr

LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG NESTED - PCR Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60

––––––––––––––––––––

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG

(NESTED - PCR)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG

(NESTED - PCR)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đắc Trung và TS Nguyễn Phú Hùng đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả

Lê Thị Thu Hà

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B 3

1.1.2 Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.3 Virus HBV (Hepatitis B virus) 5

1.2 Các kiểu gen của HBV và tình hình nghiên cứu về kiểu gen của HBV trong và ngoài nước 13

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 17

2.2 Địa điểm nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm 20

2.3.2 Phương pháp tách chiết HBV DNA 21

2.3.3 Định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật real-time PCR 21

2.3.4 Xác định kiểu gen HBV bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) 22

2.3.5 Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Kết quả tách chiết HBV-DNA tổng số 28

3.2 Kết quả xác định kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested – PCR) 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ATP Adenosin triphosphat

ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid

HBV Hepatitis B virus

HBcAg Hepatitis B Core Antigen

HBeAg Hepatitis B Early Antigen

HBsAg Hepatitis B Surface Antigen

ORF Open - reading frame

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SGOT Serum Glutamo-oxalo transaminase SGPT Serum Glutamo-pyruvic transaminase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các

nước trong khu vực 13

Bảng 2.1 Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 17

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 18

Bảng 2.3 Cặp mồi khuếch đại vùng gen S của HBV 23

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vòng ngoài 24

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng ngoài 24

Bảng 2.6 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm 1) 25

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR vòng trong nhóm I 25

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm I) 25

Bảng 2.9 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) 26

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) 26

Bảng 2.11 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) 26

Bảng 3.1 Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại tỉnh Thái Nguyên 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới 4

Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh 6

Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử HBV 6

Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các protein (B) 7

Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV 8

Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV 9

Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan 11

Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu 20

Hình 2.2: Sơ đồ xác định kiểu gen của HBV bằng phản ứng nested-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (nt, nucleotide) 22

Hình 3.1: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của một bệnh nhân nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR 29

Hình 3.2: Kết quả thông số của các phản ứng Realtime-PCR đã thực hiện 30

Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dương và chứng âm 31

Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của một mẫu xét nghiệm dương tính 32

Hình 3.5: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Trần Văn H nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR 33

Hình 3.6: Kết quả xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) của bệnh nhân Tô Văn Kh nhiễm HBV bằng kỹ thuật Real-time PCR 33

Hình 3.7: Sản phẩm PCR vòng 2 với nhóm I (kiểu gen A, B, C) trên bản gel điện di 35

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay, tình trạng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV)

là vấn đề đang được quan tâm trên thế giới nói chung và Việt nam nói riêng Virus viêm gan B là nguyên nhân chủ yếu gây xơ gan, ung thư gan [7], [8] Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization - WHO), có khoảng hơn 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B; trong đó có 350 triệu người mang virus viêm gan B mạn tính Những người mang virus viêm gan B mạn tính là nguồn lây nhiễm quan trọng trong cộng đồng và có nguy cơ cao mắc các bệnh về gan nguy hiểm liên quan đến nhiễm vi rút viêm gan B như bệnh viêm gan hoại tử (necroinflammatory) cấp hoặc mạn, xơ gan và đặc biệt là ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC), làm cho khoảng 5 trăm đến 2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm [46], [47] Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4]

Kiểu gen của HBV được phát hiện lần đầu tiên năm 1988 bởi Okamoto

và cs dựa vào sự khác biệt trên 8% trình tự nucleotide trên toàn bộ bộ gen của HBV [37] Ở các vùng địa lý khác nhau có sự phân bố khác nhau về kiểu gen của HBV [12], [13]

Để xác định genotype HBV có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau như phân tích đa hình của các đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) [6], phương pháp PCR đa mồi (multiplex - PCR) [9,28,30], phương pháp realtime - PCR [49], phương pháp oligonucleotide microarray [41] Sự hiểu biết về sự phân bố giữa các kiểu gen của virus HBV có vai trò rất quan trọng trong công việc điều trị và theo dõi diễn tiến của bệnh, phòng ngừa được các biến chứng của bệnh Đặc biệt điều này cũng rất có ý nghĩa trong công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan siêu vi B Xuất phát từ

thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại Thái Nguyên bằng phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định kiểu gen của virus viêm gan B ở một số bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B tại Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tách chiết HBV DNA tổng số từ mẫu huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm HBV (có kết quả xét nghiệm HBsAg dương tính) Xác định hàm lượng HBV DNA trong mẫu bằng kỹ thuật Real-time PCR

3.2 Xác định kiểu gen của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B

Năm 1964 Baruch Blumberg đã mô tả một loại kháng nguyên (KN) đặc trưng ở thổ dân châu Đại Dương gọi là “KN Australia” Đến năm 1968, phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B mãn tính có tiểu thể hình cầu

và hình sợi, đường kính 27nm không chứa DNA Đó chính là KN bề mặt HBsAg (hepatitis B surface antigen) Hai tiểu thể này không phải là HBV (Hepatitis B virus) hoàn chỉnh vì thiếu genome Năm 1970, người ta phát hiện thấy trong máu bệnh nhân viêm gan B có các thể hình cầu, đường kính 42nm, bên trong chứa ADN kép gọi là tiểu thể Dane Nghiên cứu sau này xác định chính tiểu thể Dane mới là HBV thực sự [13]

1.1.2 Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam

1.1.2.1 Trên thế giới

Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề có tính chất toàn cầu bởi HBV xuất hiện ngay cả ở các quần thể dân chúng sống cách biệt và những người sống trên các hòn đảo Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và cách thức lây truyền

có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng khác nhau trên thế giới Trên cơ sở điều tra huyết thanh học các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B đặc biệt là HBsAg, Tổ chức Y tế Thế giới chia mức độ nhiễm virus viêm gan B thành 3 mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp [45], [46], [47]

Vùng lưu hành dịch cao

Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  8% và tỷ lệ người đã nhiễm virus viêm gan  60% Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn Độ), Châu Phi, hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc

cực như Eskimo, Maoris Việt Nam là nước được xếp là vùng lưu hành dịch cao [20]

Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới [50]

Vùng lưu hành dịch trung bình

Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng nhiễm virus viêm gan B từ 20-60%, 43% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu, hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ Phương thức lây truyền rất đa dạng, xảy

ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn Hay gặp những trường hợp nhiễm cấp virus viêm gan B do phần lớn nhiễm trùng xảy ra ở lứa tuổi thanh niên và người lớn [34], [45]

Vùng lưu hành thấp

Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  2% và tỷ lệ người đã từng nhiễm virus viêm gan B  20% 12% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm các nước như Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand, Bắc Mỹ, Nam

Mỹ Phương thức lây truyền chính là lây truyền ngang ở lứa tuổi trưởng thành, chủ yếu xảy ra ở các nhóm người có nguy cơ cao như tiêm chích ma

tuý, đồng tính luyến ái, nhân viên y tế, người được truyền máu hoặc lây nhiễm trong gia đình người nhiễm virus viêm gan B [16], [46]

1.1.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành viêm gan B cao Tỷ lệ mang HBV trong cộng đồng dân cư là 15% - 25% Hàng năm, có khoảng 20.000 người mắc viêm gan và tỷ lệ tử vong từ 0,7% - 0,8% [6]

Giai đoạn từ năm 1988 đến năm 1996, ở Việt Nam đã có hàng chục nghiên cứu về tỉ lệ mang HBsAg ở người bình thường Mặc dù vậy nhưng các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một vài nhóm đối tượng tại địa phương cụ thể, phân bố tại nhiều vùng trên cả nước Theo nghiên cứu của Hoàng Thủy Nguyên, Phạm Song, giai đoạn 1990-1997, tỉ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng người Việt Nam: Cộng đồng người khỏe mạnh là 15% mang HBsAg và người bệnh có HBV là 45% (IgM anti-HBc) [8] Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho kết quả tỉ lệ nhiễm HBsAg của các đối tượng nghiên cứu ở mức 2 con số

Theo nghiên cứu về tình hình viêm gan virus B ở Việt Nam (Chương trình Quốc gia - Mã số KY 01 - 09), tại Hà Nội, tỉ lệ mang HBV trong cộng đồng dân cư là 11,35 % Tỉ lệ nhiễm HBV tại thành phố Hồ Chí Minh là 19,7% [6]

1.1.3 Virus HBV (Hepatitis B virus)

1.1.3.1 Hình thái HBV

HBV thuộc loại siêu vi trùng (virus):

Nhóm VII (dsDNA-RT)

Họ (familia): Hepadnaviridae

Chi (genus): Orthohepadnavirus

Loài (species): viêm gan B

Các nghiên cứu hiển vi điện tử đã xác định hình thái của HBV Về cấu tạo, hạt virus HBV hoàn chỉnh (Virion) có hình cầu nhỏ, đường kính 22-45

nm, gồm 3 lớp: lớp bao ngoài dày khoảng 7 nm, lớp vỏ Capsit hình hộp, có đường kính khoảng 27 - 28 nm và lõi chứa bộ gen của virus

Trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi virus,

dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 tiểu thể khác nhau của virus: Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm; Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20-22 nm, dài 40-400 nm; Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính 42-45 nm còn gọi là tiểu thể Dane, đây chính là virus hoàn chỉnh [17]

Bộ gen của HBV là một phân tử DNA mạch kép, dạng vòng không hoàn chỉnh, kích thước khoảng 3,2Kb, được cấu tạo bởi hai chuỗi đơn ngược dấu và có chiều dài không bằng nhau Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngoài tạo

nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3,2Kb mang toàn bộ thông tin di truyền của HBV Chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong có kích thước thay đổi chỉ chiếm khoảng 50-80% chuỗi dài

Hình 1.4: Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A)

và với các protein (B) [37]

Hệ gen của HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối lên nhau hoàn toàn hoặc không hoàn toàn nhằm giảm thiểu chiều dài của bộ gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P Các gen này

mã hóa cho toàn bộ các protein của virus [44] Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gối của hai sợi (âm và dương) được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gen xảy ra khi protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm (hình 1.4) [37]

Gen S là gen mã hóa cho các cấu trúc vỏ và bề mặtcủa HBV gồm 3 vùng: pre S1 (108 axít amin) và pre S2 (55 axít amin); hai vùng này mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa các kiểu gen bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa các kiểu gen

Hình 1.5: Gen S và P gối nhau trong cấu trúc genome của HBV [37]

Gen C mã hóa cho các cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29 axít amin) mã hóa cho HBeAg và vùng C (183 axít amin) mã hóa cho HBcAg Gen P (832 axít amin) là gen dài nhất mã hóa cho DNA polymerase và cùng với RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus

Gen X gồm 154 axít amin mã hóa cho hai protein của HBV mà chức năng của chúng là tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân đôi của HBV, cũng như đóng một vai trò chủ yếu trong sự phát triển thành ung thư gan trên bệnh nhân

Sự thay đổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn đến sự thay đổi trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến có các sự khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 6 kiểu gen khác nhau của virus này [37]

Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV [15]

HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn tính [15]

Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus HBV trong tế bào gan Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, nếu trong giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trị số ban đầu thì có nguy cơ trở thành người mang virus mạn tính [12]

HBcAg (Hepatitis B core antigen) tìm thấy trong tế bào gan của người nhiễm HBV Trong huyết thanh, HBcAg hiện diện như một thành phần của

virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do [43]

1.1.3.4 Cơ chế nhân lên của HBV

Quá trình sao chép của HBV có thể được chia làm nhiều bước: 1 Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; 2 Xâm nhập của virus vào tế bào (sự nhập bào);

3 Phóng thích bộ gen virus; 4 Biểu hiện các sản phẩm gen virus; 5 Sao chép

bộ gen virus; 6 Lắp ráp các hạt virion (virus hoàn chỉnh); 7 Phóng thích virus [2]

Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ là một trong các bước then chốt, xác định tính hướng cơ quan của virus nhờ vào các điểm gắn virus và các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào Hạt HBV hoàn chỉnh lưu thông trong máu tìm cách gắn kết vào tế bào chủ Nhiều bằng chứng cho thấy, một vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) là nơi gắn kết thụ thể Sự gắn kết cũng có thể qua trung gian albumin huyết thanh người đã biến đổi Vì thế, HBV có thể dùng protein huyết thanh đã biến đổi như một phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [2]

Cơ chế HBV đi vào tế bào chủ chưa được hiểu biết rõ ràng: hoặc vỏ ngoài HBV có protein dung hợp, protein dung hợp này chèn một chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid của tế bào đích và gây dung hợp màng virus với màng

tế bào, qua đó phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; hoặc virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [2]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, đường kính tối đa các lỗ nhân là 25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm Tuy nhiên, hạt lõi có thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa

Vì kích cỡ của hạt lõi lớn nên sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ gen của virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase virus nối đồng hóa trị [3]

Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]

Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên mã không qua xử lí ghép nối Không có protein nào được mã hóa bởi mạch dương Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không bằng nhau được chui vào nhân và chuyển thành dạng cccDNA Dạng này được dùng làm khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích thước khác nhau 3,5; 2,4; 2,1; và 0,7Kb Trong đó, mRNA 3,5Kb gọi là RNA tiền genome, dùng làm khuôn để tổng hợp bộ gen Các mRNA còn lại được gọi là dưới genome, dùng để tổng hợp các protein khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein lõi C và preC, polypeptide X, protein bề mặt S và protienkinase Các mRNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất [13]

Polypeptide tiền lõi được vận chuyển đến mạng lưới nội chất, từ đó chúng được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiền lõi (HBeAg) RNA tiền genom được đóng gói cùng với HBV DNA polymerase và proteinkinase để tạo thành hạt lõi Trong quá trình nhân lên, virus luôn tổng hợp thừa protein

vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài hạt virus hoàn chỉnh (hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình que hoặc hình sợi [23]

Sau khi hạt lõi được lắp ráp xong, RNA tiền genom được dùng làm khuôn để tổng hợp chuỗi DNA theo cơ chế sao chép ngược Vùng primase của polymerase dùng như một đoạn mồi đối với men phiên mã ngược Bởi thế, mạch DNA (-) lớn lên (ở dưới bên trái) được gắn kết vào đầu tận 5’ của primase Sự phiên mã ngược tiến hành cho đến đầu tận 5’ của khuôn mẫu RNA được tiếp cận Bởi thế một phần dư ngắn được sinh ra ở mạch (-) Hoạt tính RNase H kết hợp với men phiên mã ngược làm thoái hóa khuôn mẫu RNA và phân cắt một đoạn RNA có mũ chụp dài 18 base ở đầu tận 5’ của nó Đoạn này có sự đồng dạng 6 base đối với DR1 và DR2 lặp lại trực tiếp Sự tương tác yếu này cho phép chuyển đoạn và men phiên mã ngược /DNA polymerase từ DR1 vào DR2 Ở đây, đoạn RNA có chức năng như một đoạn mồi tổng hợp DNA mạch (+) DNA polymerase có khả năng xuyên qua tính không liên tục trong khuôn mẫu mạch (-) vì đoạn dư ngắn tận cùng của nó Sau đó, cấu trúc của DNA virion được tái sản xuất Các tế bào gan thường chỉ tích lũy khoảng 50 bản sao HBV DNA cho mỗi tế bào [2], [13]

Sự tổng hợp HBV DNA chưa được hoàn tất trước khi virus trưởng thành Tại mạng lưới nội chất, các phân tử lõi trưởng thành được đóng gói vào trong các protein bề mặt [2], [13]

Sau khi có vỏ ngoài, virus hoàn chỉnh được tiết ra thông qua bọng vận chuyển [2], [13]

1.2 Các kiểu gen của HBV và tình hình nghiên cứu về kiểu gen của HBV trong và ngoài nước

Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế

kỷ 20 đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của virus viêm gan

B, và từ đó một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype Có 6 kiểu gen của HBV đã được xác định và đặt tên từ A đến F Tỷ lệ các kiểu gen khác nhau tuỳ từng vùng địa lý Ở Hoa Kỳ, mọi kiểu gen đều có mặt (35% A, 22% B, 31% C, 10% D và 2% E-F) Các dữ liệu gần đây cho thấy kiểu gen của HBV cũng đóng vai trò quan trọng trong tiến triển của bệnh gan do HBV [20], [21], [33], [35]

Sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV chính là sự khác nhau hơn 8% trong trình tự của các nucleotid trên DNA của HBV Sự phân bố của các kiểu gen khác nhau tùy thuộc các vùng địa lý khác nhau Kiểu gen A thường gặp ở các nước ở tây bắc châu Âu, phía nam Sahara, Ấn Độ và Mỹ Kiểu gen

B và C thường gặp ở các nước Đông nam châu Á, Nhật Bản và các nước ở Thái bình dương Kiểu gen D thường gặp ở các nước vùng Địa trung hải Kiểu gen E thường thấy gặp ở một số nước tại châu Phi Kiểu gen F thường gặp tại một số nước ở trung và nam châu Mỹ [38]

Bảng sau mô tả sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các nước trong khu vực [1]

Bảng 1.1 Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước

và các nước trong khu vực [1]

gen A

Kiểu gen B

Kiểu gen C

Kiểu gen D

Kiểu gen F

Mức độ nặng của bệnh cũng như sự tiến triển sang viêm gan B mạn tính trong các nghiên cứu trên cho thấy có sự giống nhau ở kiểu gen B và C Theo tác giả Norio Akuta thì sự tiến triển sang xơ gan và ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV chiếm tỷ lệ 63% đối với kiểu gen C và 16% ở kiểu gen D và cũng theo tác giả này thì tại Tokyo trong 57 trường hợp viêm gan B cấp thì kiểu gen A chiếm 22,8%, B là 14%, C là 43,9%, D và F chỉ chiếm 1,8%, trong đó có 15,8% không xác định được kiểu gen, còn trong 1.077 trường hợp viêm gan B mạn tính kiểu gen C chiếm một tỷ lệ cao là 87,7% Tiếp theo là B với 9,4% còn A là 1,9%, kiểu gen D và F chỉ chiếm 0,2%, có 0,6% không xác định được kiểu gen Cũng theo tác giả này thì biến chứng nặng trên các bệnh nhân viêm gan mạn thường hay gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen B và C, đặc biệt xơ gan và ung thư gan gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen C hơn kiểu gen B [36]

Một nghiên cứu khác của Xin Ding tại Trung quốc thì kiểu gen C chiếm tỷ lệ cao nhất lên đến 80% các kiểu gen còn lại lần lượt là: kiểu gen A (3%) Kiểu gen B (5,5%), kiểu gen D (0,5%) và kiểu gen B + C là 4,4% còn 3,3 % không xác định được kiểu gen [48]

Mối tương quan giữa kiểu gen và mức độ trầm trọng của bệnh cũng đã được nhiều báo cáo đề cập trong những năm gần đây Kiểu gen nhiễm được cho là gắn mật thiết với tình trạng âm ỷ của bệnh (thông qua việc đánh giá hai chỉ tiêu HBcAg, HBeAg); quá trình bệnh sinh của gan, sự trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch, sự đáp ứng thuốc điều trị và kháng thuốc điều trị virus [31]

Một nghiên cứu khác ở Nhật bản thực hiện trên 585 bệnh nhân viêm gan mạn cũng chỉ ra rằng những người nhiễm kiểu gen B có sự tiến triển sang

xơ gan chậm hơn kiểu gen C [42]

Một nghiên cứu khác ở Tây Ban Nha cho thấy (kiểu gen A chiếm 52%,

D 35% và F 7%) mức lưu hành của HBcAg trong huyết thanh là tương tự giữa kiểu gen A và D Tuy nhiên, sự lưu hành của HBeAg, khả năng duy trì

tính sinh hóa của gan và đáp ứng virus học thường kém hơn với bệnh nhân nhiễm kiểu gen A HBeAg cũng sụt giảm ở mức cao ở những bệnh nhân nhiễm kiểu gen A này [39]

Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng những người bệnh nhiễm kiểu gen

F dường như chết vì những bệnh lý liên quan đến gan sớm hơn kiểu gen A và

D [40] Kiểu gen D cũng cho thấy liên quan ñến các hình thức phát bệnh nhanh chóng hơn trong một nghiên cứu ở Mỹ [22]

Nghiên cứu ở Thụy sĩ thì lại chứng minh rằng kiểu gen A có mức độ chuyển từ thể cấp sang mạn nhanh chóng hơn kiểu gen D, cũng như khả năng phục hồi sau giai đoạn cấp của những kiểu gen là khác nhau [32]

Tóm lại, vẫn còn nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu gen HBV đã được đặt ra và các nhà chuyên môn vẫn đang cố gắng để trả lời:

(1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng tái bản của virus, mức HBV DNA trong máu, các thể bệnh của gan, sự lưu hành của HBeAg, sự khỏi bệnh, và đáp ứng với các thuốc điều trị chính như interferon, lamivudine, adevofir.dipivoxil

(2) Kiểu gen nào chủ yếu ở các nước, sự phân bố kiểu gen HBV theo các vùng địa lý có liên quan với dịch tễ nhiễm HBV?

(3) Ảnh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến đến viêm gan B mạn tính?

Cho đến nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số liệu không được nhiều cũng như các kết quả công bố về sự tương quan giữa kiểu gen với các yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng chưa được thống nhất hoàn toàn [10]

Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định kiểu gen HBV như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay),… Phương pháp

được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu đề tài là phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)

PCR lồng được sử dụng phổ biến trong phân loại phân tử, cho phép khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng cho các đơn vị dưới loài, phân biệt sự

khác nhau giữa các giống động thực vật, các chủng vi sinh vật

Trong nghiên cứu phát hiện kiểu gen của HBV, Nested - PCR cũng đã được sử dụng rất hiệu quả và tiêu biểu như: Phân tích nhanh hệ thống sáu kiểu gen chính của virus viêm gan B bằng kỹ thuật PCR sử dụng mồi định type đặc hiệu của Naito và cộng sự năm 2001 [35] Nghiên cứu xác định kiểu gen của virus gây viêm gan B trong các mẫu huyết thanh của bệnh nhân bị nhiễm HBV của nhóm Đỗ Thị Thanh Thủy, Phạm Hùng Vân, Nguyễn Phạm Thanh Nhân năm 2005 [11] Xác định kiểu gen của virus HBV trong mẫu mô gan sinh thiết ttrong nghiên cứu của Geramizadeh B và cộng sự năm 2008 [24] Năm 2004, Abe Kvà cộng sự đã xác định kiểu gen của virus viêm gan

B bằng kỹ thuật PCR sử dụng loại mồi cụ thể và phân bố địa lý của các kiểu gen [14] Kỹ thuật Nested - PCR cũng được nhóm nghiên cứu người Trung Quốc ứng dụng thành công để điều tra về genotype và subgenotype của virus HBV ở những bệnh nhân Trung Quốc bị nhiễm HBV mạn tính [27]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu

106 mẫu bệnh phẩm huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan virus

B (có HBsAg(+)) do Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn

Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên cung cấp

TAE 1X vừa đủ 100%

Bảng 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

14

Bình nón, đĩa petri, cốc đong thủy

tinh, pipet, đầu côn các loại, v…v, Trung Quốc, Đức, Việt Nam

Hóa chất tách chiết HBV DNA (MERCK): Hóa chất sử dụng tách chiết HBV DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) [19] bao gồm:

+ Dung dịch 1: Dung dịch Trizol gồm có: Phenol 38%; Guanidium thyocianate 0,8%; Glycerol 5%; Điều chỉnh pH = 8

+ Dung dịch 2: Cloroform

+ Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có bổ sung chất trợ tủa

+ Dung dịch 4: Ethanol 70%

+ Dung dịch 5: Dung dịch TE 1X (Tris 0,1M + EDTA 0,001M)

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Taq-polymerase,

EDTA, Tris-HCl, Tris-Base, SDS, buffer PCR, Agarose của các hãng BioRad, Invitrogen

Một số hóa chất khác như agar, sucrose, brommophenol blue, nước khử ion, cồn, iso propanol, chloroform/isoamyl, glicerol… và các muối NaCl, MgCl2, CH3COONa,…

Bộ Kit Realtime PCR định lượng DNA Hepatitis B virus (Công ty cổ

phần Công nghệ Việt Á, đạt tiêu chuẩn ISO 9001: 2008 và GMP-WHO) gồm:

- Bộ hóa chất dùng cho phản ứng realtime PCR (Bảo quản nhiệt độ -20 0 C)

- Bộ mẫu đối chứng (Bảo quản nhiệt độ -20 0 C)

Bộ kit xây dựng đường chuẩn cho kit định lượng gồm:

- iVAqPCR 4Standard Kit - VA.A92-004B - 4 nồng độ/bộ

Dùng xây dựng đường chuẩn cho kit định lượng

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm

Sử dụng phương pháp thu nhận và xử lý mẫu huyết thanh do phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên xây dựng

Thu nhận và xử lý máu tĩnh mạch của bệnh nhân viêm gan B

Điện di và kiểm tra sản phẩm

trên gel agarose

PCR vòng ngoài

PCR vòng trong

Nhóm 1 (Genotype A, B, C)

Nhóm 2 (Genotype D, E, F)

- Lấy 3ml máu từ tĩnh mạch của bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng (Bệnh nhân nhịn ăn và được lấy máu vào buổi sáng) Máu chỉ giữ ở 40C -80C trong tối đa 4 giờ

- Ly tâm ống nghiệm chứa máu với vận tốc 3000 vòng/phút trong 15 phút để tách huyết thanh

- Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào tuýp 1,5ml vô trùng

- Giữ tuýp huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm

2.3.2 Phương pháp tách chiết HBV DNA

Để tách chiết HBV DNA, chúng tôi sử dụng phương pháp tủa [19] Cách tiến hành:

- Đánh dấu các tuýp vô trùng bằng ký hiệu mẫu

- Cho 200μl mẫu huyết thanh vào 1 tuýp vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, trộn đều trong 30 giây, để yên 10 phút

- Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA vào 1 tuýp vô trùng khác có sẵn 600μl dung dịch 3 Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong thời gian 10 phút

- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào

Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

- Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn và để khô ở 600C trong 10-15 phút Cho vào 50μl dung dịch 5

- Bảo quản mẫu DNA ở -200C

2.3.3 Định lượng DNA HBV bằng kỹ thuật real - time PCR

Phản ứng real-time PCR được thực hiện theo Bộ Kit Realtime PCR định lượng DNA Hepatitis B virus (Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á, đạt tiêu chuẩn ISO 9001: 2008 và GMP-WHO) cung cấp