Xác định trình tự gen e6 và l1 của hpv và gen ebna 1 của ebv để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của HPV Human papilloma virus trong hơn 95% các trường hợp ung thư cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-

HOÀNG VĂN MẠNH

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG

THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Lê Thanh Hoà

Thái Nguyên - 2011

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ala Alanine

bp Base pair

BL Burkitt’s Lymphoma CTC Cổ tử cung

E Early region EBV Epstein-Barr Virus Gly Glycine

gs-PCR Group-specific PCR HPV Human papilloma virus HP6 Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu)

L Late region LCL Lymphoblastoid LCR Long control region LMP Latent membrane protein MHC Major Histocompatibility Complex MT7 Miền trung 7 (ký hiệu mẫu)

NPC Nasopharyngeal carcinoma p53 Protein 53

PV Papilloma virus

RB Retinoblast

TR Terminal repeat ts-PCR Type- specific PCR UICC Universal Integrated Circuit Card UTBM Carcinoma

VCA Viral capsid antigen VMH Vòm mũi họng WHO World Health Organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính Châu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục 4 Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư cổ tử cung 9

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1 61

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 4

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 4

1.1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6

1.1.1.3 Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC 6

1.1.1.4 Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung 6

1.1.2 Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus 9

1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus 9

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus 12

1.1.2.3 Quá trình nhân lên của HPV 14

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV 16

1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC 17

1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học 17

1.1.3.2 Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA 19

1.1.3.3 Định týp HPV bằng sinh học phân tử 19

1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng

phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 21

1.2 UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22

1.2.1 Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23

1.2.2 Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV) 24

1.2.2.1 Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH 24

1.2.2.2 Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV 25

1.2.2.3 Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV… 26

1.2.2.4 Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV 28

1.2.2.5 Gene và sản phẩm của gene EBNA-1 29

1.2.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.2 Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 33

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 33

2.2.2 Hoá chất 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4 Quy trình nghiên cứu 35

2.4.1 Lấy mẫu và bảo quản 35

2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35

2.4.3 Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 37

2.4.3.1 Thiết kế mồi……… 37

2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR 38

2.4.3.3 Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR 40

2.4.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 41

2.4.4 Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42

2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp 42

2.4.4.2 Chuyển nạp……… ……… 43

2.4.4.3 Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44

2.4.4.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45

2.4.4.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47

2.4.5 Giải trình trình tự và xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 51

3.1.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và HPV-18 52

3.1.3 Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và HPV-18 từ các mẫu kiểm tra 53

3.1.4 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và

chuỗi gen L1 của HPV-18 54

3.1.5 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của HPV16 và L1 của HPV18 56

3.1.6 Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59

3.2 Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của

EBV 60

3.2.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60

3.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 61

3.2.3 Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV 62

3.2.4 Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 của EBV 63

3.2.5 Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt Nam và thế giới 64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng 12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ

lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng

Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bệnh

có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ quan trong cơ thể Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam

và các quốc gia đang phát triển trong khu vực Trong đó, ung thư CTC đứng thứ

2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở Việt Nam [1], [9] Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56]

Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen và môi trường sống Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến triển ung thư Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên nhân gây ra hai loại ung thư này ở người Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện

diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư

cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]

Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư

VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24]

Papilloma virus (PV) thuộc họ Papillomaviridae, lưu hành phổ biến

trong tự nhiên, gây bệnh chủ yếu cho các loài động vật có xương sống bậc cao như: người, ngựa, bò, chó, thỏ và một số loài chim Đặc biệt, PV có đặc tính gây bệnh đặc hiệu loài, HPV chỉ gây bệnh ở người mà không gây bệnh ở loài khác [36] Đối với người, HPV thích ứng gây khối u ở da, miệng, thực quản, hầu, họng và đường hậu môn - sinh dục Cấu trúc hệ gen HPV là phân tử DNA sợi

đôi (double strand DNA - dsDNA) hình vòng tròn khép kín, có độ dài khoảng

7900 cặp nucleotid, được bao bọc bởi phân tử protein histon, các vùng gen HPV được định vị trên một sợi DNA Trong đó, L1 là gen mã hoá cho protein vỏ ngoài và cũng chính là thành phần kháng nguyên bề mặt của virus Gen E6 thuộc phân vùng gen thứ 2 (vùng sao chép sớm) của hệ gen HPV, tổng hợp protein E6 và các protein tương ứng, có vai trò quan trọng giúp cho sự nhân lên DNA của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư CTC Protein E6 của HPV xâm nhập hệ gen của tế bào, phong toả và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53, kích thích phân giải p53 nhờ enzym ubiquitin ligase [57] Hậu quả, tế bào vẫn tiếp tục phân chia, không có sự kiểm soát và phát triển thành khối u

EBV là loại virus nhiễm phổ biến trong cộng đồng còn gọi là Herpes

virus type 4, thuộc họ Herpesviridae [26] EBV gây bệnh trên người và lây

truyền qua đường tiêu hoá, có đặc tính thích ứng tế bào Lympho B và là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM), liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như: tăng sinh lympho B, ung thư biểu

mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày Tuy nhiên, EBV có khả năng gây

sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh Cấu trúc hệ gen của EBV là DNA sợi đôi xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184 kb, mã hoá cho 9 protein virus Trong

đó, gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA protein kháng nguyên, có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus, bên cạnh đó protein EBNA-1 còn ngăn cản quá

trình phân giải và trình diện kháng nguyên của virus ở tế bào nhiễm Gen EBNA-1

và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả các khối u có liên quan đến EBV Như vậy, với sự hiểu biết về các đặc tính sinh học phân tử của HPV và EBV, cùng với sự phát triển của các kĩ thuật ứng dụng sinh học phân tử, hoàn toàn có thể giúp cho việc phát hiện sớm và chính xác HPV và EBV trên bệnh nhân, phục vụ chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị sớm nhằm ngăn chặn

sự tiến triển của bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do các ung thư mà chúng gây ra Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính, định loại và xác định týp một cách chính xác, có hệ thống về HPV và EBV Việc nghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán phát hiện HPV và EBV cũng đã được thực hiện gần đây, nhưng còn nhiều hạn chế như: quy trình thực hiện phức tạp, thời gian trả lời kết quả kéo dài và giá thành xét nghiệm

Xuất phát trên cơ sở phân tích những công trình nghiên cứu có liên quan,

những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về Human papilloma virus (HPV) và Epstein-Barr Virus (EBV), chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“ Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng” với mục tiêu

nghiên cứu:

1 Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18, ở một

số chủng Human papilloma virus (HPV) bằng cặp mồi thử nghiệm để

nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới

2 Thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của một số chủng Epstein-Barr Virus

(EBV) bằng cặp mồi thử nghiệm để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử

và so sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV)

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung là bệnh ác tính thường gặp thứ hai ở phụ nữ trên toàn thế giới và là một trong số các nguyên nhân tử vong hàng đầu liên quan đến bệnh ung thư cho phụ nữ ở các nước đang phát triển với khoảng 500.000 ca mới

và 250.000 ca chết mỗi năm Khoảng 80% số ca ung thư cổ tử cung xảy ra ở các

nước có mức sống thấp [27]

1.1.1.1 Trên thế giới

Trên toàn thế giới tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung trên 100.000 phụ nữ (tất

cả các lứa tuổi) Theo Hiệp hội chống ung thư thế giới (UICC), tỷ lệ ung thư CTC chiếm 12% trong số các bệnh ung thư ở phụ nữ (Hình 1.1)

Ở Pháp, cứ 100.000 phụ nữ ở tuổi 45 có 13 trường hợp mắc ung thư CTC

và con số này tăng lên khi ở tuổi 60 cứ 100.000 người có 46 người mắc Tần suất mới mắc hàng năm từ 20 đến 85 trường hợp trong tổng số 100.000 phụ nữ

Tỷ lệ tử vong do ung thư CTC ở các nước cũng rất khác nhau, ở Mexico là cao nhất

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả

năng nhiễm ung thư của các châu lục [64].

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả

năng nhiễm ung thư của các châu lục [64].

Các nghiên cứu điều tra gần đây cho thấy, tỷ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong

do ung thư CTC ở các nước phát triển đang có xu hướng giảm dần, do áp dụng

rộng rãi phương pháp chẩn đoán sàng lọc Pap smear, nên đã phát hiện sớm ung

thư CTC Ở Anh tỷ lệ chết giảm từ 88/100.000 dân năm 1972 xuống còn 63/100.000 dân trong năm 1992 Ở Mỹ tỷ lệ mới mắc là 44/100.000 dân năm 1947, đến năm 1996 tỷ lệ mới mắc hàng năm đã giảm xuống 7,5/100.000 dân [49]

Các nước có tỷ lệ ước tính mắc ung thư cổ tử cung cao nhất xảy ra ở châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ và Châu Á

Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính châu Phi) [11]

điều kiện sử dụng thử nghiệm Pap smear không phải là có sẵn [9]

Ở châu Á bao gồm Malaysia khoảng 266.000 trường hợp mới phát hiện và 143.000 ca tử vong mỗi năm [63]

Ở khu vực Đông Nam châu Á, tỷ lệ ung thư CTC ở Thái lan, Myanma, Lào, Campuchia chiếm cao nhất [8]

Tóm lại, tỷ lệ mắc bệnh ung thư CTC khác nhau tùy thuộc các quốc gia, dân tộc, chủng tộc trong cùng một nước, phụ nữ da đen mắc bệnh gấp 2 lần phụ

nữ da trắng, phụ nữ ở thành thị mắc bệnh cao hơn phụ nữ ở nông thôn [8], [50]

1.1.1.2 Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có thống kê cụ thể hàng năm về tỷ lệ mới mắc và tử vong do bệnh ung thư CTC Tuy nhiên, năm 1994, theo điều tra của bệnh viện K - Hà Nội, tỷ lệ ung thư CTC là 7,7/100.000 phụ nữ, chiếm 6% trong các loại ung thư Ở thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ này là 35/100.000 phụ nữ và chiếm hơn 20% trong các loại ung thư nói chung Ung thư CTC đứng thứ 2 trong

số các ung thư ở phụ nữ Việt Nam, nhưng gây tử vong cao nhất cho phụ nữ [9]

1.1.1.3 Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thƣ CTC

Nhiều nghiên cứu và giả thuyết cho thấy ung thư CTC hay gặp ở những phụ nữ có hoạt động tình dục sớm (dưới 20 tuổi), có nhiều bạn tình, những người có thai sớm, đẻ nhiều, mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục, có thói quen hút thuốc lá, tình trạng kinh tế thấp, có tiền sử viêm nhiễm CTC, nhất là loạn sản CTC không được điều trị triệt để, nhiễm nhiều loại virus cơ hội như

Herpes simplex virus týp 2 [3], [6] và [11]

Hiện nay, nguyên nhân gây ung thư CTC đã được biết một cách cụ thể,

đó là do loại virus sinh u nhú ở người Human papillomavirus (HPV), thuộc họ

Papillomaviridae gây ra HPV được phát hiện có mặt trong, trên 95% các

trường hợp ung thư CTC, do vậy được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [62], [71]

1.1.1.4 Human papilloma virus và bệnh ung thƣ cổ tử cung

Các nghiên cứu dịch tễ học tại Hoa Kỳ cho thấy rằng 75% dân số tuổi 15

- 50 bị nhiễm HPV sinh dục và kéo dài trong suốt cuộc đời của họ Trong số đó,

60% bị nhiễm trùng thoáng qua, 10% bị nhiễm trùng dai dẳng (có sự hiện diện của HPV DNA trong các mẫu mô bộ phận sinh dục), 4% có dấu hiệu nhẹ tế bào học và 1% với tổn thương lâm sàng

Ở Việt Nam, tần suất lưu hành của HPV là rất cao ở nhóm tuổi có sinh hoạt tình dục ở cả nam và nữ Nhóm tuổi 20 - 29 bị nhiễm HPV cao nhất Một

nghiên cứu theo dõi bằng Pap smear ở phụ nữ trẻ tuổi trong 2 năm, đã nhận thấy

tỷ lệ nhiễm HPV trong năm đầu là 3%, trong năm sau là 7% [11] Tỷ lệ mới mắc HPV hàng năm là 7%

Có rất nhiều týp HPV là nguyên nhân gây ung thư CTC, nhưng tần suất xuất hiện có khác nhau [25] HPV týp 16 (HPV-16) là týp nổi trội chiếm 46 - 63% các trường hợp ung thư CTC, tiếp theo là HPV-18 (10-14%), HPV-31 (2-7%), HPV-33 (3-5%) và HPV-45 (2-8%) ở nhiều nơi trên thế giới trừ châu Á Bên cạnh các týp trên, ở châu Á còn phát hiện các týp khác là HPV-58 (6%) và HPV-52 (4%) Ngoài HPV-16 và HPV-18, các týp HPV có khả năng gây ung thư CTC bao gồm: HPV-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68, -73

và -82, và có thể cả các týp HPV-26, -53 và -66 [47], [54]

Ở người, nhiễm virus papilloma thường biểu hiện những trạng thái tăng

sinh nội mô biểu bì thuộc nhiều dạng khác nhau như: sùi niêm mạc, viêm, xơ cứng biểu mô, khối u papilloma vùng sinh dục, vùng hầu họng, dạng tăng sinh

tế bào keratin [71] Hầu như, mọi týp HPV đều có biểu hiện đặc trưng liên quan đến khối u papilloma vùng sinh dục, như condyloma, u xơ và u mềm CTC, chúng có tính chất lây truyền qua đường tình dục [42] Biểu hiện khối u điển hình do HPV gây ra chủ yếu là u biểu mô vùng hậu môn - sinh dục như: âm hộ, âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật và khối u ở vòm họng, hầu- họng [17]

Những nghiên cứu về Human papillomavirus (HPV) cho thấy HPV tác

động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung, tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 loại mô khác nhau: biểu

mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa) Biểu mô lát tầng

không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quy định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ được bong ra ngoài HPV tấn công vào lớp tế bào đáy của biểu mô vốn có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của 1 rồi nhiều lớp tế bào sau đó Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô lát (dị sản nặng tại chỗ), sẽ có khả năng phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn Tuy nhiên, những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn không có tiếp xúc mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây

ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên HPV (Hình 1.2)

Những nghiên cứu ở giai đoạn xâm lấn và giai đoạn trước xâm lấn là cần thiết để dự đoán tác động tương lai của loại vắc-xin HPV-16/HPV-18 và xét nghiệm HPV Phân tích xác định các chủng HPV trong ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn (ICC) cho thấy HPV-16 là phổ biến nhất và HPV-18 loại thứ hai phổ biến, trong tất cả các châu lục Kết hợp giữa các trường hợp nhiễm HPV-16/HPV-18, ICC ở Châu Âu, Bắc Mỹ và Australia (74 - 77%) cao hơn so với ở Châu Phi, Châu Á và Nam/Trung Mỹ (65 - 70%) Các loại HPV phổ biến nhất là HPV 31, 33, 35, 45, 52 và 58, mặc dù sự phân bố tương đối của chúng khác nhau tùy theo vùng địa lý Tổn thương mô biểu bì mức độ cao (tổn thương có

vảy cao cấp intraepithelial HSIL (high-grade squamous intra-epithelial lesion),

trong nhiễm HPV thường biểu hiện rõ ràng trong vòng vài tháng, khoảng 90% biểu hiện rõ ràng trong vòng hai tháng Trong số các trường hợp HSIL, HPV16/18 có tỷ lệ nhiễm là 52% [52]

Ngày nay, nhiều bằng chứng cho thấy dường như cũng có các đáp ứng miễn dịch trong bệnh nhân nhiễm HPV mặc dù yếu ớt: những người có suy giảm miễn dịch dễ bị nhiễm HPV và khi đã nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh và nặng nề Bên cạnh đó, có sự gia tăng nồng độ kháng thể kháng HPV sau khi bị nhiễm tự nhiên, tuy nhiên nồng độ kháng thể này không đủ để gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ cơ thể nhiễm Tổn thương dị sản hay ung thư cổ tử cung có một thời gian dài phát triển tại biểu mô và tại cổ tử cung Trung bình, khoảng 10- 20 năm cho sự tiến triển từ dị sản đến ung thư cổ tử cung Đây chính là điều kiện thuận lợi cho việc kiểm soát ung thư cổ tử cung, giúp phát hiện sớm và điều trị những tổn thương dị sản cũng như ung thư giai đoạn sớm

1.1.2 Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus

1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus

Những nghiên cứu về sinh học chức năng và sinh học phân tử đã cho

phép phân loại Papilloma virus (PV) một cách hoàn chỉnh và tách hẳn nhóm

papilloma virus ra khỏi nhóm Polyoma virus Như vậy, tất cả PV chỉ là một

nhóm duy nhất, thuộc họ Papillomaviridae PV phân bố tương đối rộng rãi trong

thiên nhiên, gây bệnh cho các loài động vật có xương sống bậc cao chủ yếu là

người, ngựa, bò, chó, thỏ và một số loài chim Virus Papilloma gây bệnh cho

người (HPV) chỉ là một loại duy nhất [36] Tính đặc hiệu loài gây bệnh của PV rất cao, khó có thể tìm thấy loại PV của loài này lại gây bệnh loài khác, PV chỉ thích ứng biểu mô sừng và niêm mạc, gây tăng sinh tế bào biểu mô ở đường sinh dục và hậu môn, vùng vòm họng, hầu - họng [32] Đối với người, HPV gây khối u ở da, miệng, thực quản, hầu, họng và đường hậu môn - sinh dục

Về phân loại, PV được chia làm 5 siêu nhóm chính (super- groups) đánh

dấu từ A - E (Hình 1.3) Trong mỗi siêu nhóm, PV được chia thành các nhóm khác nhau, mỗi một nhóm lại bao gồm các virus thuộc các týp khác nhau [22]

Ví dụ: siêu nhóm A, chủ yếu là HPV bao gồm 12 nhóm phụ là A1 - 12, trong đó các týp HPV thuộc nhóm A9 là các loại virus có khả năng gây ung thư CTC rất cao

Hầu hết, PV gây bệnh và biểu hiện lâm sàng đều thuộc siêu nhóm A (PV thích ứng đường sinh dục và niêm mạc), hoặc siêu nhóm B (PV gây u xơ cứng biểu mô sùi) Siêu nhóm C và D gồm các PV gây khối u xơ papilloma và khối u

đích thực do Papillomavirus gây ra Siêu nhóm E chưa được phân loại chính xác

đó là hỗn hợp của PV thích ứng và gây khối u ở da

PV được phân chia tiếp tục thành các týp Đối với HPV được coi là cùng týp, nếu chuỗi gen L1 trong hệ gen không khác nhau trên 10% Tuy nhiên cũng

có nhiều trường hợp, phân týp HPV không hoàn toàn dựa vào chênh lệch % nucleotid trong chuỗi gen L1, mà còn phải xem xét đặc tính gây bệnh của các týp đó [21], [22]

Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus dựa trên so

sánh chuỗi nucleotid của gen capsid L1 Các chuỗi gen được thu nhận từ Ngân hàng Gen, xử lý bằng chương trình BioEdit, ClustalX 1.8.1 và phân tích phả hệ bằng chương trình MEGA2.1 Nhóm A5, A7 và A9 gồm các týp HPV có nguy

cơ gây ung thư cao ở người [35]

1.1.2.2 Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus

Năm 1974 - 1976, bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV và chứng minh HPV

là nguyên nhân gây ung thư CTC Nhưng đến những năm 1980, sự phát triển ứng dụng các kỹ thuật đã xác định DNA - HPV trong mô bệnh phẩm ung thư CTC [18], [19], [72] Những týp đầu tiên được phân lập là HPV-16 và HPV-18,

và hệ gen của chúng chính là nguồn gen quan trọng trong nghiên cứu về HPV

Virus Papilloma của người có kích thước nhỏ, khoảng 55nanomet (nm), không

có vỏ bọc ngoài cùng Dưới kính hiển vi điện tử, HPV trông giống như quả bóng gôn, nằm cạnh nhau theo một tập hợp (Hình 1.4) [51], [70]

Hạt virus có cấu trúc hình khối, gồm 72 capsomer, tạo nên protein cấu trúc capsid có 2 lớp: Lớp 1 (L1) và lớp 2 (L2) L1 (layer 1) là lớp protein bề

mặt, còn gọi là lớp vỏ lớn, có cấu trúc khối từ các đơn vị 5 góc cạnh Kề cận L1

là protein cấu trúc của L2 (layer 2), còn gọi là lớp vỏ bé, gồm nhiều đơn vị xếp

lớp theo nhau (12 đơn vị /virus)

tử histon Các gen thành phần hệ gen của HPV được định vị trong một sợi DNA

Về chức năng, hệ gen HPV chia làm 3 phân vùng quan trọng:

- Phân vùng thứ nhất: Là vùng không mã hóa L, có độ dài 400 - 1000 bp,

có chức năng điều hoà sao chép, gọi là vùng điều hoà lớn (LCR = long control region), gồm chuỗi p97 (TATA Singnal 1,2) là tiểu phần khởi động (p97 core promoter), các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen câm [16] Vùng này có hệ

số biến đổi nucleotid cao hơn rất nhiều so với các vùng khác của hệ gen HPV

- Phân vùng thứ hai: Là vùng sao chép sớm, ký hiệu là E (early region),

gồm các gen: E1, E2, E4, E5, E6 và E7, giúp cho sự nhân lên DNA của virus, tham gia cơ chế hình thành khối u CTC

- Phân vùng thứ ba: gồm các gen tổng hợp protein L1 và L2, là những

protein cấu trúc capsid của virus, được sản xuất muộn hơn Do vậy, được gọi là vùng sao chép muộn, ký hiệu là L (late region) (Hình 1.5)

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của hệ gen HPV -16

Ghi chú: E1,2,4,5,6,7: các gen sớm; L1,2: các gen muộn; TATA Singnal 1,2: promotor khởi động sao chép của hệ gen; Long Control Region: vùng điều khiển của hệ gen [16]

Hiện nay, HPV có khoảng 100 týp khác nhau đã được xác định, mỗi týp

có hàng chục phân týp (subtype); mỗi một phân týp lại có hàng chục biến thể (variant) khác nhau, còn gọi là chủng virus, các chủng virus được đặt tên theo

địa danh, hoặc nhân danh, do đó nếu phân tích về mặt di truyền, nhiều chủng tuy tên khác nhau nhưng rất có thể cùng thuộc về một biến thể Do sự biến động và

đa dạng này, việc định týp và định chủng của HPV là rất phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và chính xác Việc định týp và chủng (biến thể) của HPV dựa vào kết quả phân tích và xác định mức độ đồng nhất về thành phần nucleotid, cũng như mức độ tương đồng về thành phần acid amin của các chuỗi gen E6, E7 và L1

Một mẫu virus HPV mới phân lập, được gọi là cùng týp với một týp HPV

đã xác định trước đó, nếu thành phần nucleotid của các chuỗi E6, E7 và L1 có mức độ đồng nhất trên 90% [59] Những mẫu virus khác nhau trong cùng một týp lại được phân chia thành các phân týp (hay biến thể hoặc chủng) trên cơ sở

phân tích sự biến đổi nucleotid và acid amin của các gen sớm (E) và gen muộn

(L) Về nguyên tắc, một virus HPV mới phân lập được coi là đồng phân týp (đồng chủng) nằm trong một týp HPV nào đó, nếu như hệ gen của chúng có mức độ đồng nhất về nucleotid và về acid amin tương đồng 90 - 98% Một biến thể độc lập của virus HPV phải có sai khác ít nhất là 2% so với biến thể khác khi

so sánh; nếu dưới 2%, chúng được coi là cùng biến thể Tuy sai khác ít về hệ gen, nhưng có một số biến thể HPV trong tự nhiên lại có các đặc tính sinh học

và hóa sinh học khác nhau, đặc biệt là khả năng gây ung thư và cơ chế hình thành khối u CTC

1.1.2.3 Quá trình nhân lên của HPV

HPV thường bắt đầu nhân lên ngay sau khi xâm nhập vào tế bào biểu mô, qua những chấn thương rất nhỏ của biểu mô như sinh hoạt tình dục Do chỉ những tế bào màng đáy của biểu mô vẩy mới mẫn cảm với virus [11]

Một số hoạt chất (Integrin- 6) rất cần thiết cho thụ thể của tế bào hoạt động đối với HPV-6, nhưng không bắt buộc đối với HPV-11, -33 Giống như nhiều loại virus khác, HPV-16, -33 khi tiếp xúc với tế bào chủ, thông qua thụ

- Virus xâm nhập vào tế bào biểu mô hạ tầng thì sự nhân lên của virus thuộc loại hình không tăng về số lượng và tồn tại với một số lượng thấp, DNA của tế bào thực hiện quá trình tổng hợp nên DNA của chính virus, với tỷ lệ: 1 phân tử hệ gen /1 tế bào

- Đối với tế bào keratin đã được biệt hoá thích ứng với virus thì virus thực hiện quá trình nhân lên và tự nó điều khiển quá trình nhân lên DNA của mình với một số lượng rất lớn, đồng thời tổng hợp nên protein cấu trúc capsid, để thực hiện quá trình lắp ghép, tạo virus hoàn chỉnh

Hình 1.6 Quá trình nhân lên của HPV [11]

1.1.2.4 Cơ chế gây ung thƣ cổ tử cung của HPV

Khái niệm về cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV

Cơ chế HPV gây ung thư CTC đã được Massimi và Banks (1997) giải thích như sau: ở người và động vật, có hai protein điều chỉnh sự phân chia và

mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hoà khối u)

Khi hai gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, làm cho tự nó tiếp xúc với RB

và p53 sẽ gây cản trở quá trình điều chỉnh sự phân chia tế bào, kết quả tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không có sự kiểm soát, thay đổi cấu trúc và gen không thể sửa chữa được và phát triển thành ung thư Trong giai đoạn sớm, những tế bào CTC bị nhiễm có thể chỉ thay đổi nhỏ về hình dáng và kích thước, dần dần bị biến dạng, rối loạn trật tự cấu trúc, phá huỷ biểu mô bề mặt CTC Những thay đổi này sẽ gây nghịch sản hoặc tạo thành khối tân tạo hoặc là ung thư trong biểu mô ở CTC [2], [11]

Do hệ gen của HPV chỉ mã hoá được 8 đến 10 loại protein, cho nên trong quá trình nhân lên, HPV sử dụng các yếu tố trợ giúp của tế bào chủ trong việc tương tác vùng điều hoà lớn (LCR) của hệ gen, để sao chép gen E6, E7 Protein E6, E7 kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào nhiễm bằng cách bám vào và vô hoạt

protein điều hoà khối u của tế bào, hoạt chất cyclin (chất kích thích chu kỳ nhân

lên của tế bào) và các enzym kinase [55]

Trong quá trình gây nhiễm của HPV, gen E6 và E7 đã tạo nên môi trường không thích hợp, làm biến đổi hoạt động sống của tế bào, buộc tế bào phục vụ riêng cho virus Dẫn đến tế bào bị biến đổi nghiêm trọng về hình thái, cấu trúc cũng như chức năng, nhưng tế bào không chết mà chỉ biệt hoá và sinh trưởng theo hướng khác

Cơ chế gây ung thư cổ tử cung do tương tác của protein E6 và p53

Không giống như các loại ung thư khác, p53 trong ung thư CTC vẫn tồn tại dưới dạng nguyên thuỷ và không bị đột biến Protein E6 của HPV phong toả

và kìm hãm p53 bằng cách bám vào p53, hướng p53 phân giải nhờ enzym ubiquitin ligase [57] Do ảnh hưởng của sự phân giải này, gen p53 không thực hiện sự đột biến điểm ở trong gen Hậu quả dẫn đến kìm hãm quá trình phân

chia tế bào, sự “chết theo chương trình (apoptosis) ” và điều hoà sự sửa sai

DNA Như vậy, tế bào vẫn tiếp tục phân chia, không có sự kiểm soát và trở thành khối u Gen E6 của HPV-16 là loại protein bao gồm 158 axit amin có cấu trúc gấp khúc phức tạp chứa 2 cấu trúc Zinc -finger motif kế tiếp nhau Zinc-finger motif là cấu trúc bao gồm 4 axit amin Cystein (C) hay Histidin (H) làm khung tương tác kết hợp với nguyên tố Kẽm (Z++) Có 4 loại Zinc-finger motif, trong đó ở HPV-16 là cấu trúc bao gồm 4 axit amin Cystein (C) hay Histidin (H) làm khung tương tác kết hợp với nguyên tố Kẽm (Z++) Có 4 loại Zinc-finger motif, trong đó ở HPV-16, gen E6 có Zinc-finger motif thuộc loại thứ nhất Protein E6 của các týp HPV thuộc nhóm "nguy cơ thấp" không có khả năng bám

vào p53 với số lượng ít và chúng không tác động lên p53 trong điều kiện in vitro

[9] Tuy nhiên, protein E6 của HPV có thể hình thành phức hợp đa thành phần với ít nhất 6 loại protein nội bào khác và vô hiệu hóa hoạt động chức năng của

chúng Nhưng cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được các protein này

1.1.3 Chẩn đoán ung thƣ CTC

1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học

Ung thư CTC thường gặp ở phụ nữ độ tuổi sinh đẻ, từ 30 - 50 tuổi [3], [8], [11] Vùng phát hiện ung thư CTC chủ yếu ở ranh giới giữa biểu mô lát và

biểu mô trụ (Squamous Columnar Junction - SCJ) tiến triển lâu dài từ các tổn

thương nghi ngờ Triệu chứng hay gặp là ra máu bất thường, ra máu tự nhiên hoặc sau giao hợp hoặc sau mãn kinh Khí hư thường lẫn máu, mủ, có mùi hôi

và đau thường xuất hiện ở giai đoạn muộn [12], [49], [50] Cả về tế bào C, mô bệnh học và sinh học phân tử đều phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa HPV với ung thư CTC Năm 1949, George Papanicolaou đã đưa ra một phương pháp

tế bào học phát hiện những bất thường của tế bào biểu mô ở CTC để phát hiện

sớm ung thư CTC, được gọi là Pap smear Nguyên lý của phương pháp này là

dựa vào tính chất các tế bào của niêm mạc âm đạo CTC bong ra một cách liên tục, đặc biệt là các tế bào ác tính bong càng sớm và dễ bong Đây là phương pháp có độ đặc hiệu cao (trên 90%), độ nhạy khoảng 60 - 85% lại đơn giản, tiết kiệm, cho nên được sử dụng trong chẩn đoán sàng lọc trong nhiều năm qua để phát hiện sớm ung thư CTC Dựa trên cơ sở phân tích hình thái học chi tiết Papanicolaou và Traut đưa ra bảng phân loại gồm 5 nhóm phiến đồ: [3], [11], [65]

+ P I: Phiến đồ bình thường

+ P II: Phiến đồ viêm: như P I nhưng có tăng sinh tế bào Đôi khi thấy tế bào đáy nhưng vẫn bình thường hoặc tế bào dự trữ hoặc tế bào viêm + P III: Nghi ngờ có tế bào ung thư, cần theo dõi

+ P IV: Có ít tế bào ung thư

+ P V: Hầu như toàn bộ tiêu bản là những tế bào bong có đầy đủ tính chất của ung thư

Hiện nay, thường áp dụng hệ thống phân loại Bethesda - 2001 để chẩn

đoán và phân loại các tổn thương biểu mô ở CTC (Squamous Intraepithelial

những ưu điểm trên phương pháp Pap smear đã đóng góp rất nhiều trong chẩn

đoán sớm ung thư CTC, tuy nhiên phương pháp này cũng có tỷ lệ âm tính giả, theo nghiên cứu của các tác giả tỷ lệ dao động từ 1,1 đến 29,7% [3], [4], [15], [65] Ngày nay, nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật PCR

cho phép phát hiện chính xác nhiễm HPV

1.1.3.2 Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA

Phát hiện các serotype bằng phương pháp phát hiện sự có mặt của mRNA của gen E6, E7 sau khi đã hoà nhập vào hệ gen của tế bào chủ Thực chất của phương pháp này dựa trên cơ sở gen E6, E7 có khả năng đột nhập vào hệ gen tế bào chủ và trở thành một thành phần của hệ gen tế bào chủ Gen E6, E7 của HPV cũng được sao chép thành các RNA tương ứng Khi phát hiện sự có mặt của các gen này, nghĩa là tế bào chủ đã bị nhiễm và tiếp nhận DNA của HPV Khi tế bào cơ thể đã có sự xâm nhập của DNA E6 và E7 vào hệ gen, tế bào đã biến đổi thành tế bào ung thư ác tính và tần suất xuất hiện của mRNA của E6 và E7 là rất cao, chúng có hoạt tính cao để tổng hợp các protein E6, E7 gây ung thư Phương pháp này sử dụng chất huỳnh quang và thực hiện trên máy đo hàm lượng tế bào, gọi là phương pháp tế bào động Ngoài ra, có thể thực hiện trực

tiếp trên các phiến kính đã được sử dụng trong chẩn đoán “Pap smear” và xem

kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang (có thể nhận biết được các tế bào nổi và

tế bào đã nhập gen) Theo các báo cáo nghiên cứu thì độ nhạy của phương pháp

là 100%, độ đặc hiệu là 70%, sở dĩ phương pháp này có dương tính giả là do tính đặc hiệu có bị giảm, tuy nhiên dương tính giả không có nghĩa là âm tính, do hàm lượng gen E6 và E7 thấp (virus chưa sao chép hoàn toàn) [9]

1.1.3.3 Định týp HPV bằng sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử quan trọng nhất trong chẩn đoán và định týp HPV là PCR, sử dụng các cặp mồi chung cho mọi týp HPV và đặc hiệu riêng cho từng týp riêng biệt Do vậy, có 2 loại PCR được sử dụng: PCR chung cho

mọi týp HPV và PCR riêng cho từng týp HPV

PCR chung cho mọi týp HPV

PCR chung cho mọi týp phát hiện HPV, còn được gọi là PCR đặc hiệu theo

nhóm, gs-PCR (group-specific PCR), phát hiện virus thuộc cùng một nhóm Một

trong những cố gắng của các nhà khoa học thực nghiệm là làm sao chỉ cần một

phản ứng PCR mà phát hiện được tất cả các týp HPV và phân biệt HPV với các loại virus gây ung thư khác Do vậy, PCR trong trường hợp này phải sử dụng

các cặp mồi (primer) chung cho nhiều týp HPV, nhưng chỉ riêng cho HPV, mà

không chung với các virus khác Cặp mồi cổ điển nhất được thiết kế là MY09 - MY11, có khả năng nhân lên được đoạn DNA có độ dài 450 cặp nucleotid, nằm trong gen L1 là gen cấu trúc vỏ capsid của HPV [17] Cặp mồi thứ hai là GP5 - GP6 cũng được sử dụng để thu nhận một đoạn DNA nằm bên trong giới hạn của vùng DNA do MY09 -MY11 nhân lên Sử dụng cả hai cặp mồi MY09 - MY11

và GP5 - GP6 và phương pháp PCR lồng (Nested PCR) phản ứng được thực hiện

có độ nhạy cao với lượng khuôn ban đầu chỉ cần là 0,005 - 0,010 nanogram (ng), tương đương với DNA hệ gen của 10 - 200 virus HPV

Có khoảng 7% số lượng phản ứng PCR với cặp mồi MY09 - MY11 không cho kết quả phát hiện DNA - HPV, có thể do không có DNA của virus HPV trong tế bào ung thư của mẫu nghiên cứu hoặc DNA - HPV đã nhập gen vào tế bào CTC và do vậy virus không còn tồn tại trong bệnh phẩm [61]

Nhiều phương pháp nghiên cứu được sử dụng để định týp HPV sau khi nhân một đoạn gen bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chung Cặp mồi chung của PCR hoạt động trên hệ gen HPV của nhiều týp, nhưng không cho biết sản phẩm PCR là của týp nào Do vậy, việc xác định týp chỉ có thể thành công sau khi phân tích sản phẩm Trong nhiều cách phân tích, người ta thường sử dụng phương pháp giải trình tự (Sequencing) và so sánh đối chiếu các chuỗi nucleotid

và acid amin của sản phẩm; hoặc sử dụng phương pháp phân tích đa hình RFLP

(Restriction fragment length polymorphism) và hợp lai phóng xạ với các mẫu dò

DNA đã biết

Gần đây, cặp mồi ký hiệu SPF10 được thiết kế chỉ nhân được đoạn gen 65

bp (Base pair) của gen L1, nhưng rất nhạy và hầu như thực hiện được với tất cả

các mẫu bệnh phẩm, kể cả bệnh phẩm cố định bằng formalin PCR khó cho sản

phẩm dài với khuôn DNA kém chất lượng, đặc biệt là DNA tách từ mẫu cố định trong formalin Do đó, SPF10 tỏ ra có lợi thế khi rà soát nhiều loại bệnh phẩm

có chất lượng khác nhau

PCR riêng định týp HPV

Định týp riêng biệt HPV dựa vào tìm kiếm sự khác nhau về thành phần gen trong gen E6 và E7, đây là các gen "độc", tổng hợp protein gây ung thư, do vậy chúng quyết định độc lực (tính gây bệnh) của HPV và chúng có mức độ biến đổi khác nhau Hiện nay, đã có 14 cặp mồi đặc hiệu cho PCR, sử dụng một cách đặc hiệu và nhạy nhân đoạn gen có độ dài 100bp trong gen E7, phát hiện HPV thuộc các týp HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66 và -68 [62] Phản ứng có độ nhạy rất cao, chỉ cần 10 - 200 virus HPV là đủ cung cấp DNA hệ gen làm khuôn để thực hiện PCR thành công Do có khả năng phát hiện

riêng từng týp, nên phản ứng PCR kiểu này được gọi là phản ứng PCR đặc hiệu

theo týp, ký hiệu là ts-PCR (type- specific PCR) PCR đặc hiệu theo týp hiện nay

được sử dụng nhiều trong nghiên cứu, nhưng rất giới hạn trong sàng lọc bệnh phẩm đại trà, do chi phí còn rất cao

1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam

Bệnh ung thư CTC là một bệnh phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao trong các bệnh ung thư nói chung và ung thư đường sinh dục nữ nói riêng, có thể coi đây

là một bệnh nguy hiểm đối với phụ nữ trên thế giới và đặc biệt ở Việt Nam hiện nay Mặc dù, với sự hiểu biết ngày càng sâu sắc về nguyên nhân gây bệnh và ứng dụng các biện pháp nhằm phát hiện sớm, ngăn ngừa tiến triển của bệnh như:

vệ sinh, phát hiện sớm và điều trị những tổn thương nghi ngờ, chẩn đoán sàng lọc…, nhưng cho đến nay bệnh vẫn ngày càng có xu hướng gia tăng

Bệnh được gây ra bởi nhiều nguyên nhân đa dạng và phức tạp dẫn đến việc phát hiện, chẩn đoán và áp dụng các biện pháp điều trị, ngăn ngừa cho bệnh

nhân ở giai đoạn tiềm ẩn của bệnh gặp nhiều khó khăn HPV đã được xác định

là nguyên nhân chính gây ung thư CTC ở người và lây nhiễm chủ yếu qua đường tình dục cũng là một trong những nguyên nhân góp phần gia tăng tỷ lệ mắc mới hàng năm trong cộng đồng Tuy nhiên, những hiểu biết về HPV và ung thư CTC đã cho thấy bệnh hoàn toàn có thể được ngăn chặn và điều trị khỏi, nếu được phát hiện và điều trị sớm Các phương pháp chẩn đoán bệnh sử dụng phổ biến hiện nay dựa trên triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán tế bào học, soi CTC, chẩn đoán mô bệnh học, thường chỉ phát hiện được ở giai đoạn muộn khi bệnh

đã chuyển sang giai đoạn ung thư, không hoặc khó chẩn đoán được người bệnh

có bị nhiễm HPV ở giai đoạn sớm, tiềm ẩn và nếu nhiễm thì thuộc týp HPV nào Các dữ liệu về gen và hệ gen của HPV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen [GenBank (http://www ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việc phân tích, so sánh đối chiếu các týp HPV ở Việt Nam, qua đó lựa chọn ra các chỉ thị di truyền của HPV nhằm phục vụ cho xây dựng phương pháp phát hiện HPV lưu hành gây bệnh tại Việt Nam, giúp cho việc chẩn đoán phát hiện sớm HPV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc chẩn đoán ung thư CTC và xác định týp HPV hay gặp ở nước ta

1.2 UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV)

1.2.1 Dịch tễ học ung thƣ vòm mũi họng

Ung thư vòm mũi họng NPC (Nasopharyngeal carcinoma) là một khối u

ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng [53] Loại ung thư này được xếp vào các khối u biểu mô của đường tiêu hoá và hô hấp trên Đây là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người Việt Nam và là loại hay gặp nhất trong các ung thư vùng tai mũi họng [23], [56]

1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, vùng có nguy cơ ung thư vòm mũi họng cao nhất là miền Nam Trung Quốc và phần lớn các nước Đông Nam Á với tỷ lệ 20 – 30/100.000

dân, do đó ung thư vòm mũi họng còn gọi là U Quảng Đông [33] Trong những vùng này, NPC là ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu của nam giới và chiếm tới 3/4 các loại ung thư vùng đầu cổ Vùng có nguy cơ trung bình ở quanh bờ biển Địa Trung Hải và phía Đông Châu Phi với tỷ lệ 5 - 9/100.000 dân Vùng có nguy cơ rất thấp 0,1- 0,5/100.000 dân như Châu Âu, Châu Mỹ và ở các nước công nghiệp phát triển (Bắc Mỹ, Nhật, Úc) là những nơi mà NPC chỉ chiếm 1-3% vùng đầu mặt cổ

Ngoài tính phức tạp chủng/type và đặc tính gây bệnh của EBV, còn phải

kể đến sự đa nhiễm các loại virus ung thư khác như: HSV, HPV, CMV, HIV và

có thể EBV tồn tại trợ giúp tương tác lẫn nhau để ung thư biểu mô phát triển mạnh hơn [48] EBV có thể là phức hợp chính gây ra ung thư VMH và các ung thư biểu mô khác rải rác trong cơ thể, mà nguyên nhân gây bệnh cũng hết sức đa dạng, phức tạp dẫn đến việc chẩn đoán và điều trị bệnh gặp nhiều khó khăn Có rất nhiều giả thiết, về nguyên nhân gây bệnh ung thư vòm họng nhưng tập trung

thành ba nhóm chủ yếu đó là do virus Epstein-Barr, do di truyền và do các yếu

tố môi trường, tập quán ăn uống, hoá chất [45], [69] Trong thời gian gần đây, nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả đã chứng minh được mối liên quan

mật thiết giữa virus Epstein-Barr và ung thư vòm mũi họng Các nghiên cứu này

đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh

và vai trò quan trọng của virus Epstein-Barr trong bệnh học cũng như trong quá

trình sàng lọc chẩn đoán, điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24], [30], [37], [40]

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, ung thư vòm mũi họng đứng hàng đầu trong các ung thư Tai Mũi Họng và Đầu Mặt Cổ, đứng hàng thứ 7 trong các ung thư toàn thân (7,1%) Theo UICC, ung thư vòm mũi họng chiếm 1% dân số thế giới EBV là mối quan tâm sâu sắc của các nhà lâm sàng và sinh học phân tử, do quần thể EBV ở nước

ta cũng có nhiều biến động lớn và có nét riêng biệt về đặc tính phân tử và gây bệnh [13] Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định được chủng EBV giống chủng

của châu Âu B95-8 [14] Một số chủng/type mới phát hiện được coi là nguyên nhân gây ung thư cao, thuộc nhóm lưu hành vùng Nam Trung Quốc, có những đột biến đặc biệt so với EBV của thế giới [7], [13], [67]

Một trong những phương pháp tiên tiến trong định type virus gây bệnh, là thu nhận đoạn gen (gen kháng nguyên hoặc/và độc lực) hoặc toàn bộ đoạn gen, hệ gen cần nghiên cứu bằng phản ứng PCR, sau đó so sánh trình tự của chuỗi nucleotide/amino acid của chúng, đối chiếu với các chủng/type khác trên thế giới Hiện nay, trong Ngân hàng gen [GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] đã có hàng trăm chuỗi nucleotid và một số hệ gen hoàn chỉnh của EBV thuộc các type khác nhau trên thế giới, đặc biệt toàn bộ hệ gen của chủng GD1 (số đăng ký: AY961628) thuộc loại độc lực cao phân lập ở Quảng Đông trong vùng dịch tễ ung thư VMH Nam Trung Quốc [67], là một nguồn dữ liệu quý giá cho việc so sánh đối chiếu các chủng/type EBV của Việt Nam Qua nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, đã phát hiện được hàng trăm chuỗi nucleotid và một số

hệ gen hoàn chỉnh của EBV trong các mô sinh thiết ung thư vòm mũi họng thuộc các type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN) Các chủng virus này có phân bố khác nhau theo các vùng trên thế giới Chúng có độc tính và đặc tính gây bệnh khác nhau [24]

1.2.2 Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus

1.2.2.1 Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thƣ vòm mũi họng (VMH)

Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xương hàm trên ở trẻ em Châu Phi, từ đó bệnh này được mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL) Năm

1964, Epstein-Bar phân lập được loại virus ở dòng Lymphoblast trong khối u

BL bằng kính hiển vi điện tử [28] Từ đó virus này được mang tên: Virus

Epstein - Barr (EBV) Năm 1966, Kelein báo cáo về phản ứng miễn dịch của

kháng thể dịch chống lại tế bào Lympho B nuôi cấy [34] Cũng vào năm ấy Old báo cáo phản ứng ngưng kết của kháng thể chống kháng nguyên EBV trong ung thư VMH Năm 1968, Henle khuấy động nền y học thế giới bởi phát hiện thấy

sự chuyển đổi từ (-) sang (+) của phản ứng miễn dịch của kháng thể chống lại EBV ở một kỹ thuật viên trong khoa của ông mà trước đó đã mắc bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng Sau đó, Henle nghiên cứu thấy phản ứng miễn dịch huỳnh quang (+) tới 92 % ở bệnh nhân ung thư VMH Năm 1969, phát hiện được EBV trong tế bào line của tổ chức ung thư vòm bằng kính hiển vi điện tử Năm 1975, Nadol phân lập được các tiểu thể EBV trong tế bào biểu mô ung thư

vòm bằng kính hiển vi điện tử Đây là lần đầu thấy các tiểu thể virus Herpes

trong tế bào ung thư của người và gợi ý rằng EBV có thể là tác nhân gây ung thư [20], [60] Đặc biệt, EBV làm chuyển dạng tế bào lympho thành nguyên bào lympho và thay đổi cả thể nhiễm sắc, đồng thời lại trung hòa kháng thể Năm

1980, một số nghiên cứu đã tìm ra được các nhóm gen cơ bản và năm 1984 đã biết được toàn bộ chuỗi gen của EBV và ngày nay hệ gen EBV của hàng chục chủng trên thế giới đã được giải mã và nghiên cứu [31], [41], [67])

1.2.2.2 Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV

EBV là một thành viên thuộc nhóm Herpes type 4 gây nhiễm bệnh trên

người [46], được phân loại theo sơ đồ phân loại như sau: Viruses; dsDNA

viruses, no RNA stage; Herpesviridae; Gamma herpesvirinae; Lympho cryptovirus; Human herpesvirus 4 (liệt kê danh pháp phân loại tại Ngân hàng

Gen:(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy/taxonomyhome.html/)

EBV tồn tại dưới dạng hình khối cầu, bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài

(envelope) và trong cùng là hệ gen virus Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi

DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184kb Hệ gen được chứa đựng trong vỏ capsid, có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ nhân DNA của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV Capsid là vỏ được xác định bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3-

2 Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là những đơn vị cấu trúc trên 5 đỉnh hay

6 đỉnh Các đơn vị protein đó được mã hoá bởi các gen virus Capsid lại được

bao quanh bởi một vỏ bao ngoài khác, gọi là vỏ ngoài (envelope), cấu trúc

chủ yếu từ thành phần glycoprotein Vỏ bao này cũng được mã hoá và cũng mang dấu ấn miễn dịch Giữa capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với tác động của acid, ether, các dung dịch hoà tan, sát khuẩn và đông khô [26] Hiện nay, có hai loại EBV được biết gây nhiễm ở người đó là: EBV-1 và EBV-2, mặc dù biểu hiện lâm sàng và gây bệnh như nhau, nhưng trong hệ gen có sự sai khác về cấu trúc gen EBNA-1

1.2.2.3 Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thƣ của EBV

EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên người và lan truyền qua đường tiêu hoá, thường được phát hiện trong chất thải tế bào, chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hoá và hô hấp như nước bọt, niêm dịch vùng họng EBV có đặc tính hướng bạch huyết hấp phụ lên tế bào Lympho B thông qua tương tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CD21 của bổ thể C3d Sự xâm nhập của EBV vào Lympho B còn có sự trợ giúp của phức hợp gp25 (gL), gp42/38 và gp85 (gH) Phức hợp này làm trung gian tương tác giữa EBV với MHC lớp 2 và chúng có vai trò như một tổ hợp thụ thể đồng trợ giúp cho EBV xâm nhập sâu vào tế bào Lympho B [48] EBV gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh EBV là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và có liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thư như tăng sinh lymphoB hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô như ung thư VMH và ung thư dạ dày Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gen của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các gen protein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các sản phẩm protein mà

nó có thể đóng vai trò chuyển hoá khối u lành thành ác tính [46]

Trong cơ thể, EBV có 3 hướng tiếp tục tiến triển được minh hoạ ở Hình 1.7:

- Xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên (Hình 1.7-(2 ))

- Gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên (Hình 1.7-(1)/(3)/(6)/(7)/(8)/(9))

- Tàng nhiễm và tiến triển ung thư khi có đủ điều kiện (Hình 1.7-(3)/(4)) Ngoài ra, quá trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của lympho T (Hình 1.7-(5))

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV

trong cơ thể bị nhiễm [48]

Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy điều kiện thích ứng trong tế bào biểu mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm có sinh sản

(productive infection) (Hình 1.7-(2)) EBV giải phóng ra tiếp tục các hướng tiến

triển như đã nêu ở trên EBV có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển

từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho

B giải phóng virus vào nước bọt hoặc có thể chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến triển ung thư vòm họng [48]

Đối với trường hợp thứ hai, EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến lympho B có trong vùng họng, thực hiện sự xâm nhập và nhân lên trong các tế bào này Virus giải

phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, xâm nhiễm vào quần thể lympho

B, gây nhiễm thứ cấp mà kết quả là có một lượng lớn EBV được tung ra, chúng

có rất nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV lại có thể gây nhiễm các tế bào biểu

mô (Hình 1.7-(7-9))

Đối với trường hợp thứ ba, EBV thực hiện sự gây nhiễm bán sinh sản

(semi-productive infection) và tàng nhiễm trong tế bào lympho B (Hình 1.7 –

(4)) Nhờ trợ giúp của một số sản phẩm protein sớm (EBNA-1) và muộn 1), EBV thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B, non hoá và biệt hoá chúng tăng sinh và tiến triển ung thư Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV khởi phát còn chịu nhiều tác động hỗ trợ của rất nhiều yếu tố mà về thực chất ngày nay còn chưa biết rõ

(LMP-1.2.2.4 Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gen của EBV

Hệ gen của EBV là cấu trúc DNA vòng, sợi đôi (dsDNA), chứa các gen

mã hóa cho các protein của virus được định vị trên một sợi DNA của hệ gen Trong Hình 1.8 là sơ đồ cấu trúc vòng DNA của hệ gen EBV, trong đó có vùng mầm và điểm khởi phát oriP; các exon mã hoá cho 6 protein kháng nguyên nhân (EBNA-1, -2, -3A, -3B -3C và EBNA-LP) và 3 protein màng (LMP-1, -2A, -2B) Các promoter cho từng vùng sao chép được ký hiệu Cp/Wp, Qp (b) Sơ đồ mạch thẳng của hệ gen EBV, trong đó có 6 gen EBNA và gen LMP-1 giới hạn

hai đầu bởi các chuỗi kết thúc TR (terminal repeat)

Hệ gen của EBV có 6 tổ hợp gen mã hoá cho các loại protein kháng nguyên: Kháng nguyên nhân, ký hiệu là EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 gen mã hoá cho protein màng (LMP-1, LMP-2A và LMP-2B) [26], [48] Sáu protein EBNA có liên quan đến vai trò xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào Lympho B giai đoạn đầu, còn 3 loại protein LMP liên quan đến chu kỳ EBV trong dòng tế bào Lympho B đã chuyển đổi từ dạng nghỉ sang dạng thường trực - những dòng tế bào mầm gây nhiễm trùng muộn (LCL) Trong dòng tế bào LCL, EBNA được sao chép trong một RNA thông tin đơn nhất và tổng hợp thành một protein chung, sau đó được phân cắt thành các EBNA thành phần độc lập [46], [66]

1.2.2.5 Gen và sản phẩm của gen EBNA-1

Gen EBNA-1 là một đoạn DNA nằm trong tổ hợp gen EBNA mã hoá cho protein EBNA-1 EBNA-1 là chuỗi polypeptide bao gồm 641 acid amin, trong đó thành phần 3 acid amin glycine-glycine-alanine (Gly-Gly-Ala) được lặp lại nhiều

Hình 1.8 Cấu trúc hệ gen EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) và dạng mạch

thẳng (b) (Murray PG và cs, 2001 [48])

lần, mà số lượng lặp thay đổi khác nhau trong các mẫu/chủng EBV khác nhau [60] Vùng lặp 3 acid amin Gly-Gly-Ala này có tác dụng điều hoà nghịch MHC-I và ngăn cản quá trình phân giải kháng nguyên Nếu không có trình diện kháng nguyên phân giải thì Lympho T loại CD8 không có chức năng hoạt động để kìm hãm hoạt hoá EBNA-1 Protein EBNA-1 có vai trò thiết yếu trong quá trình xâm nhập và nhân lên cũng như duy trì sự tái tạo hệ gen của virus Gen EBNA-1 và sản phẩm protein EBNA-1 có mặt trong tất cả mọi dạng khối u có liên quan đến EBV và gen EBNA-1 có khả năng biểu hiện protein bằng cách sử dụng một trong 4 loại promoter khởi động EBNA-1 thực hiện chức năng bằng cách bám vào vùng

mầm oriP là điểm khởi phát sự nhân lên của DNA hệ gen EBV EBNA-1 còn

tương tác điều hoà tiếp tục sự sao chép của tổ hợp EBNA bằng cách bám vào vị

trí Qp và promoter này được sử dụng trong tế bào nhiễm EBV theo chương trình

tàng nhiễm type 1 và tàng nhiễm type 2 [26] Ngoài ra, có vai trò kích hoạt sao

chép và điều hoà chức năng của promoter Cp và LMP-1 Vai trò trong sự hình

thành khối u lymphoma tế bào B của EBNA-1 cũng được chứng minh khi gây bệnh thực nghiệm trên chuột Trong tất cả các EBNA thì gen EBNA-1 có vai trò quan trọng trong chu kỳ tái tạo, nhân lên và gây bệnh của EBV

1.2.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam

Khi người bị nhiễm EBV có những điều kiện cần thiết cho sự tiến triển ung thư VMH và nhiễm tiềm tàng EBV vào tế bào lympho-B đủ điều kiện phát triển thành dạng ung thư Burkitt (BL), người ta luôn thấy gen EBNA-1 ở trạng thái sao chép sớm và protein luôn luôn được tổng hợp, do vậy kháng nguyên EBNA-1 xuất hiện kèm theo cho phép xác nhận tế bào đã chuẩn bị cho sự chuyển dạng sớm trở thành ung thư Việc phát hiện gen EBNA-1 trong những tháng đầu tiên, đặc biệt là phát hiện từ tế bào lympho-B chuyển dạng có tầm quan trọng đặc biệt cho sự xác

nhận chính xác bệnh nhân đã có dấu hiệu ung thư sớm [58] VCA (Viral capsid

antigen) là kháng nguyên vỏ virus, luôn luôn xuất hiện trong người nhiễm EBV, vì

EBV nhân lên trong tế bào biểu mô cần protein này Đối với EBV gây nhiễm tiềm tàng lympho-B và có dấu hiệu chuyển dạng gây ung thư hay biểu mô vùng họng chuyển thành NPC, sự biểu hiện gen EBNA nói chung và EBNA-1 nói riêng cũng như thành phẩm của gen này là protein EBNA-1 trong cơ thể là chỉ thị chẩn đoán hết sức quan trọng và cần thiết xác định người bệnh xuất hiện ung thư ở giai đoạn sớm EBNA-1 cần thiết cho virus nhân lên và khép vòng tạo episome chuẩn bị cho sự gây nhiễm tiềm tàng và chuyển dạng ung thư, do vậy, gen EBNA-1 có giá trị chẩn đoạn sớm rất cao trong ứng dụng sinh học phân tử

Chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật PCR thông thường và PCR định lượng (real-time PCR) đã được áp dụng rộng rãi đối với phát hiện EBV ở mọi dạng gây nhiễm và gây bệnh, ở ung thư NPC hay Burkitt hoặc trong các ung thư khác có liên quan đến vai trò của EBV [29] Một số nghiên cứu sử dụng PCR và real-time PCR

đã thành công trong phát hiện EBV ở ung thư vú, trong liên kết tiến triển NPC [39], trong tế bào di căn lan toả trong cơ thể hoặc sử dụng phát hiện gen trước khi kiểm nghiệm bằng huyết thanh học và PCR còn phát hiện được EBV trong bệnh phẩm

cố định paraffin hoặc mẫu máu lâm sang [38] Như vậy, có thể phân làm 2 giai đoạn chẩn đoán: chẩn đoán sớm (trong vòng 6 tháng) sử dụng kỹ thuật phân tử phát hiện gen EBNA-1 hoặc kỹ thuật miễn dịch phát hiện sản phẩm của gen và chẩn đoán muộn kỹ thuật miễn dịch phát hiện kháng thể kháng EBNA-1

Tuy nhiên, cho đến nay những nghiên cứu sinh học phân tử EBV và NPC

ở nước ta mới chỉ dừng ở góc độ khám phá chỉ thị di truyền phân tử giúp giám sát lâm sàng chứ chưa có những nghiên cứu gen/hệ gen một cách có hệ thống để có

những giám sát dịch tễ học phân tử loại virus nguy hiểm này Vì thế, việc chẩn

đoán sớm và phòng bệnh còn rất hạn chế Hiện nay, phương pháp PCR sử dụng chỉ thị phân tử của EBV, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hơn nữa có thể xác định được các týp EBV đã và đang được ứng dụng vào trong chẩn đoán Các dữ liệu về gen và hệ gen của EBV được lưu trữ trong Ngân hàng Gen [GenBank - (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)] là một nguồn dữ liệu giá trị cho việc phân tích,