Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen agps và agpl mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

Các nghiên cứu biểu hiện vượt mức AGPase phân lập từ thực vật hoặc từ vi khuẩn trên cây chuyển gen đều làm tăng hàm lượng tinh bột tích lũy trong các mô chuyển gen.. Nghiên cứu này xuất

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn Văn Đoài

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH

BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ

HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thành bằng quá trình nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Bích Ngọc cùng với cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật, viện Công nghệ Sinh học Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực Phần văn bản trích dẫn đều được ghi rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng khoa học

Hà nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành dựa vào kinh phí của đề tài: ““Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn

có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen”

Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, em Lý Khánh Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành tốt công việc và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tinh bột 3

1.1.1 Tinh bột ở thực vật 3

1.1.2 Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật 4

1.1.3 Dự trữ tinh bột ở lá cây 6

1.2 Enzyme AGPase 7

1.2.1 Enzyme AGPase ở thực vật 7

1.2.2 AGPase ở sắn 10

1.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột 11

1.3.1 Tăng khả năng tích lũy tinh bột 11

1.3.2 Tăng khả năng phân hủy tinh bột 12

1.3.3 Thay đổi thành phần tinh bột 12

1.4 Công nghệ chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 13

1.5 Biểu hiện nhiều gene trên cùng một khung đọc mở với 2a peptide 15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Vật liệu 17

2.1.2 Hóa chất 17

2.2 Phương pháp 18

2.2.1 Một số phương pháp sinh học phân tử 18

2.2.2 Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn 21

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL 23

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A tumefaciens 25

2.2.5 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp PCR 27

2.2.6 Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot 28

2.2.7 Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL 31

3.1.1 Nhân đoạn gen AGPS và AGPL bằng RT-PCR 31

3.1.2 Tách dòng gen AGPS và AGPL 32

3.1.3 Kết quả giải trình tự với mồi M13F và M13R 33

3.2 Kết quả thiết kế vector chuyển gen 36

3.2.1 Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI 37

3.2.2 Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121 39

3.2.3 Biến nạp pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens 42

3.3 Kết quả chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá 42

3.3.1 Tạo cây thuốc lá chuyển gen AGPSL 42

3.3.2 Kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng PCR 44

3.3.3 Phân tích biểu hiện gen AGPSL bằng Western blot 46

3.4 Kết quả định lƣợng tinh bột tích lũy ở lá 48

3.4.1 Kiểm tra tinh bột bằng Iodine 48

3.4.2 Định lƣợng tinh bột bằng Anthrone 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

Kết luận 58

Kiến nghị 58

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Sách và bài báo 59

Website 62

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 63

Bài báo 63

Trình tự gen 63

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Viết đầy đủ

35S Cauliflower mosaic virus 35S promoter

3-PGA 3-Phosphoglyceric acid

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ADPG Adenosine diphophate glucose

AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase

AGPL AGPase large subunit (Tiểu phần lớn AGPase)

AGPS AGPase small subunit (Tiểu phần nhỏ AGPase)

cmyc Myc (human c-Myc oncogene) epitope tag

DBE Debranching enzyme (Enzyme khử nhánh mạng tinh bột)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

isoform đồng phân (enzyme)

kDa Kilodalton (1000 dalton)

LB Lysogeny broth (Môi trường nuôi cấy Lysogeny)

NPTII Neomycin phosphotransferase II gene

Pi Inorganic phosphate (Photphate vô cơ (HPO42-))

SBE Starch branching enzyme (Enzyme phân nhánh mạch tinh bột)

Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách mồi PCR sử dụng 17Bảng 2.2 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X 18

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase 19Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn 20Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân

dòng đoạn AGPS và AGPL 22

Bảng 2.6 Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp

SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI 24

Bảng 2.7 Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen 26

Bảng 3.1 Kết quả so sánh trình tự gen AGPS và AGPL mới phân lập với trình

tự tham chiếu 34

Bảng 3.2 Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 2h chiếu sáng 53Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng tinh bột ở lá sau 14h chiếu sáng 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo

Akula Nookaraju) [1] 5

Hình 1.2 Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48] 6

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20] 8

Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37] 9

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2010) [26] 12

Hình 1.6 Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47] 15

Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR 23

Hình 2.2 Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc 25

Hình 3.1 Kết quả RT-PCR nhân đoạn AGPS và AGPL từ RNA tổng số tách ở lá sắn 32

Hình 3.2 Kết quả tách dòng gen AGPS và AGPL 33

Hình 3.3 Kết quả giải trình tự gen AGPS và AGPL 34

Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS và AGPL mới phân lập 35

Hình 3.5 Một số phương án biểu hiện hai gen trên cùng một vector 37

Hình 3.6 Kết quả tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI 38

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI và SacI (A) và sơ đồ vector pBI121 (B) 39

Hình 3.8 Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL 40

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra vector và A tumefaciens mang vector pBI-35S-AGPSL 41

Hình 3.10 Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào cây thuốc lá 43

Hình 3.11 Kết quả phân tích PCR cây thuốc lá chuyển gen AGPase 45

Hình 3.12 Kết quả lai western blot kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPSL 47

Hình 3.13 Các bước kiểm tra hàm lượng tinh bột lá bằng iodine [49] 48

Hình 3.14 Ảnh nhuộm iodine lá thuốc lá chuyển gen 50

Hình 3.15 Sơ đồ phản ứng Anthrone với Glucose 51

Hình 3.16 Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Anthrone (I) (α = 0.05) 52

Hình 3.17 Đường chuẩn định lượng Anthrone (II) (α = 0.075) 55

Hình 3.18 Hàm lượng tinh bột trong lá cây chuyển gen và cây không chuyển sau 2h và 14h chiếu sáng 56

MỞ ĐẦU

Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương thực và nguyên liệu công nghiệp Phần lớn tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi Tinh bột cũng là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các lĩnh vưc công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dược phẩm, mỹ phẩm, nhiên liệu, giấy và xây dựng… Nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên và tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên,

do đặc tính dễ lên men Năm 2015, lượng tinh bột được sản xuất trên thế giới lên đến

85 triệu tấn, gấp đôi so với năm 1995 (40 triệu tấn) [50] Dự đoán, nhu cầu về tinh bột

sẽ còn tăng mạnh trong tương lai

Để đáp ứng nhu cầu tinh bột, ngoài việc tăng diện tích trồng trọt, tìm ra các cây trồng mới thì việc cải tiến các giống cũ là chiến lược quan trọng trong nông nghiệp Trong đó, cải tiến cây trồng theo hướng tăng năng suất tinh bột, giảm thời gian sản xuất hay cải tiến chất lượng tinh bột là những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu Các phương pháp chọn giống, lai tạo truyền thống đã đạt được nhiều thành quả lớn trong cải thiện năng suất cây trồng Tuy nhiên, năng suất tinh bột của các giống lai tạo đã gần đạt đến năng suất tối đa, trong khi đó, diện tích đất canh tác đang ngày càng thu hẹp Bởi vậy, chọn tạo giống bằng công nghệ sinh học hiện đại (chuyển gen) đang là chiến lược quan trọng trong sản xuất tinh bột trên thế giới

Năm 2000, 81% sản lượng tinh bột trên thế giới sản xuất từ ngô, tiếp đó là lúa

mì (5%), khoai tây (8,3%), sắn và các cây trồng khác (5%) Nhưng đến năm 2010, sản lượng tinh bột từ ngô còn 54%, trong khi đó sản lượng sắn tăng mạnh (33%) ) [50] Thống kê này cho thấy ngô và sắn là hai cây trồng có tiềm năng lớn trong công nghiệp tinh bột

Trong gần một thập kỷ qua, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, rất nhiều công cụ được phát triển sẵn sàng phục vụ cho việc phân tích chức năng gen ở sắn, ví dụ như bản đồ di truyền, thư viện BAC (Bacterial artificial chromosome), thư viện EST (expressed sequence tags) Đặc biệt gần đây toàn bộ hệ

gen của sắn đã được giải trình tự [52] Phân tích sự biểu hiện của toàn bộ hệ gen cũng

là một công cụ hữu hiệu nhằm nâng cao khả năng tiếp cận của các nhà khoa học để nghiên cứu sâu các quá trình sinh học của sắn Trong đó, nhiều gen liên quan đến sinh

tổng hợp tinh bột đã được nghiên cứu Có thể kể đến các gen như: AGPase, nhóm gen

GBSS, SS, SBE, DBE, ISA …

Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADP-glucose và pyrophosphate AGPase là enzyme quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen tăng khả năng tích lũy tinh bột

[45] Các nghiên cứu biểu hiện vượt mức AGPase phân lập từ thực vật hoặc từ vi

khuẩn trên cây chuyển gen đều làm tăng hàm lượng tinh bột tích lũy trong các mô

chuyển gen Gen AGPase ở sắn cũng đã được phân lập và chứng minh khả năng làm

tăng khả năng tích lũy tinh bột ở thực vật [45], [46]

Nghiên cứu này xuất phát từ ý tưởng xây dựng một vector chuyển gen ở thực vật phục vụ việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy tinh

bột Gen AGPS và AGPL mã hóa enzyme AGPase ở sắn được phân lập và thiết kế

vector biểu hiện trên cây mô hình (thuốc lá), để đánh giá khả năng hoạt động của vector chuyển gen và tích lũy tinh bột của gen chuyển Kết quả thu được có ý nghĩa trong việc nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng khả năng tích lũy tinh bột Công trình này được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TINH BỘT

1.1.1 Tinh bột ở thực vật

Tinh bột là một glucan không tan, được cấu tạo bởi hai loại polyme của glucose

là amylose và amylopectin Amylose là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo nên

từ các phân tử α-D-glucose nhờ các liên kết α-1,4-glucoside Amylose được tạo ra từ 500-1000 phân tử α-D-glucose hoặc có khi chỉ khoảng 250-300 phân tử Chuỗi phân

tử glucose xoắn lại với nhau theo hình xoắn lò xo Sự hình thành dạng xoắn lò xo là do

sự hình thành các liên kết hydro giữa các phân tử glucose Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị glucose và được duy trì bởi liên kết hydro với các dòng xoắn kề bên Khoảng không gian giữa các vòng xoắn có kích thước phù hợp cho một số phân tử khác có thể liên kết vào, ví dụ như iodine Khi phân tử iodine liên kết vào vòng xoắn sẽ làm cho các phân tử glucose thay đổi vị trí và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trưng Ái lực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài mạch polymer Amylopectin có cấu tạo phức tạp hơn amylose Tham gia cấu tạo của amylopectin có khoảng 500,000 đến 1 triệu phân tử α-D-gluco liên kết với nhau, được nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Cứ khoảng 24-30 đơn vị glucose trên mạch sẽ có 1 liên kết α-1,6 glucoside để tạo mạch nhánh Trên mạch nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh cấp 2, cứ như vậy phân tử amylopectin phân nhánh nhiều cấp rất phức tạp

Người ta có thể phân biệt được amylose và amylopectin dựa trên sự khác nhau

về khối lượng phân tử; cũng như về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iodine Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 107 đến 108; trong khi phân tử lượng của amylose chỉ khoảng 5x105 đến 106 Ở nhiệt độ 200C, khả năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2 % khối lượng trong khi amylose là 20% khối lượng Ngoài

ra, amylose tương tác với iodine tạo phức có màu xanh dương, trong khi amylopectin tạo phức màu đỏ nâu

Ở thực vật bậc cao, tinh bột được tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp Tinh bột được coi là nguồn carbohydrate dự trữ chủ

yếu và đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của tế bào thực vật Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp được giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không được chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác Dạng tinh bột tạm thời này sẽ được phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây

Trong các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp như thân, rễ, củ và hạt, sucrose có thể được chuyển đổi thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid chuyên biệt gọi là amyloplasts Tinh bột lưu trữ được tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài người phần lớn là

cơ quan lưu trữ tinh bột ở thực vật Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (lúa, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ thân (khoai tây, khoai mỡ New Zealand) và rễ củ (khoai lang, sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu

Tinh bột là nguồn carbonhydrate chủ yếu cho con người và đồng thời cho nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp Hiện nay nguồn nguyên liệu tinh bột cho công nghiệp chủ yếu tách chiết từ ngô, tuy nhiên một lượng đáng kể khác từ lúa, lúa

mì, sắn, khoai tây, arrowroot (Maranta arundinacea), và sago palm (Metroxylon

sagu) Tinh bột từ các nguồn khác nhau có thành phần polymer, cấu trúc và thành phần

hóa lý khác nhau Thành phần hóa lý chính là chức năng của tinh bột quyết định khả năng ứng dụng của tinh bột

1.1.2 Cơ chế dự trữ tinh bột ở thực vật

Tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan là một quá trình phức tạp, có liên quan đến quang hợp và sucrose (Hình 1.1) Quá trình này bao gồm ba bước quan trọng xảy ra trong lục lạp và bột lạp [35] [45]

i) Cung cấp glucose-1-phosphate (Glc-1-P) vào trong các thể lạp Glc-1-P

có thể được cung cấp từ quá trình quang hợp ở lục lạp (đối với tế bào quang hơp) hoặc từ quá trình chuyển hóa sucrose, sucrose nhận được từ mạch dẫn (đối với tế bào không quang hợp)

ii) Tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P và ATP nhờ enzyme

AGPase Đây là phản ứng quan trọng, có ảnh hưởng đến tốc độ tổng hợp tinh bột

iii) Tổng hợp tinh bột (amylose và amylopectin) từ ADPG

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa saccharide và tổng hợp tinh bột ở thực vật (theo Akula Nookaraju) [1]

Ghi chú: Sản phẩm của chu trình Calvin (DHAP và GA3P) được biến đổi thành Glucose-1-P

và Fructose-6-P (hoặc 1-6PP) Glucose-1-P được chuyển đổi thành ADP-Glucose dưới sự xúc tác của AGPase, ADP-Glucose được xúc tác trùng hợp thành mạch tinh bột, quá trình này diễn ra trong lục lạp hoặc bột lạp Glucose và Fructose cũng được chuyển hóa thành

sucrose được dự trữ trong không bào hoặc chuyển tới các tế bào khác của cây AI: acid

invertase; CeSy: cellulose synthase; HK: hexokinase; FRK: fructokinase; FBPase: 1,6-biphosphatase; N/AI: neutral or alkaline invertase; PFP: pyrophosphate d -frucrose-6- phospahte 1-phosphotransferase; PGM: phosphoglucomutase; SoSUT1: spinach sucrose

fructose-transporter 1; SPP: sucrose phosphate phosphatase; SPS: sucrose phosphate synthase; SSy: starch synthase; SuP: sucrose phosphorylase; SuSy: sucrose synthase; SXD1: sucrose export defective 1; UDPase: uridine diphosphate- glucose pyrophosphorylase

Nói một cách ngắn gọn, bước đầu tiên không thể thiếu được là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP được xúc tác bởi AGPase Một khi được hoạt hóa, enzyme starch synthase chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan được dùng như là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (SBEs hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin (Hình 1.2) Cuối cùng amylopectin được tinh thể hóa tạo thành tinh bột dưới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme) Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng được dự đoán tham gia vào bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột [45]

Hình 1.2 Các phản ứng quan trọng trong quá trình tổng hợp tinh bột [48]

bột được dự trữ ở lá Trong khi đó, các loài khác như đậu Pháp (Phaseolus vulgaris) [13], rau bina (Pisum sativum) [41] thì lưu trữ nhiều sucrose thay cho tinh bột Ngoài

ra, carbohydrate còn được lưu trữ ở lá dưới dạng raffinose và fructan [3], [32] Ở một

số loài như Pisum sativum và rau chân vịt, tinh bột chỉ được tổng hợp khi mà lượng

sucrose được tạo ra vượt ngưỡng dự trữ của lá, khi đó lượng tinh bột được tăng dần và

sucrose giảm dần trong quá trình quang hợp [41] Tuy nhiên, ở Arabidopsis, thuốc lá

và các loài khác, luôn có một phần glucose từ quang hợp được tổng hợp thành tinh bột [46] Khi đó, quá trình tổng hợp tinh bột và sucrose diễn ra song song, tốc độ tổng hợp của hai quá trình này được kiểm soát và phụ thuộc vào điều kiện môi trường (đặc biệt

là thời gian chiếu sáng) Cây trồng trong điều kiện ngày ngắn tích lũy nhiều tinh bột ở

lá hơn so với trồng trong điều kiện ngày dài, khi đó, tinh bột được dự trữ nhiều hơn để cung cấp năng lượng cho trao đổi chất vào ban đêm [7], [17]

1.2 ENZYME AGPASE

1.2.1 Enzyme AGPase ở thực vật

Ở thực vật, AGPase là một trong những enzyme xúc tác cho các bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột AGPase được phát hiện ở hầu hết các nhóm thực vật bao gồm thực vật bậc thấp, thực vật một lá mầm và hai lá mầm Nó xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P và ATP thành ADPG và pyrophosphate AGPase được xác định là enzyme dị lập thể (240 kDa), được cấu tạo bởi hai tiểu phần lớn (AGPL hoặc

β, 51-60 kDa) và hai tiểu phần nhỏ (AGPS hoặc α, 50 – 55 kDa) do hai gen tương tứng

mã hóa (Hình 1.3) Các tiểu phần nhỏ ở các loài khác nhau có độ tương đồng cao (85–95%) trong khi tiểu phần lớn thì đa dạng hơn (độ tương đồng 50 – 60%) [29]

Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase ở khoai tây [20]

Ghi chú: Mã số 1YP2 được đăng ký trên RCSB Protein Data Bank ( www.rcsb.org ), các tiểu phần được thể hiện với các màu khác nhau)

Trong các tế bào quang hợp, sự hoạt động của AGPase trong lục lạp chủ yếu đƣợc điều khiển bởi 3-Phosphoglyceric acid (3-PGA), thế ôxy hóa khử (redox) và phosphate (Pi) [40] (Hình 1.4) Hợp chất 3-PGA là sản phẩm tham gia vào chu trình Calvin, xuất hiện khi xảy ra quá trình cố cacbon từ CO2 Sự xuất hiện của 3-PGA đồng nghĩa với việc bộ máy quang hợp đang hoạt động trong lục lạp, cơ chất glucose 1-phosphate đƣợc tạo ra Lúc này, AGPase đƣợc kích hoạt bởi 3-PGA biến đổi glucose 1-phosphate và ATP thành ADP glucose và pyrophosphate Pyrophosphate đƣợc thủy phân thành Pi Sự tích lũy nhiều Pi (đồng nghĩa với việc sản phẩm ADP glucose đƣợc tạo ra nhiều) trong lục lạp làm ức chế hoạt tính của AGPase Nhƣ vậy, tỉ lệ 3-GPA/Pi quyết định khả năng hoạt động của AGPase Cơ chế điều hòa bằng thế ôxi hóa khử xảy ra ở tế bào quang hợp và không quang hợp, có ý nghĩa quan trọng trong vào ban đêm AGPase bị bất hoạt khi các gốc sulfur cysteine của tiểu phần nhỏ bị ôxi hóa, cầu disulfide đƣợc hình thành giữa hai tiểu phần AGPase đƣợc hoạt hóa trở lại nếu các cầu disulfide này đƣợc cắt bỏ Tuy nhiên, cơ chế điều hòa gen AGPase các tế bào dự trữ tinh bột vẫn chƣa đƣợc rõ ràng

Hình 1.4 Con đường tổng hợp tinh bột ở lục lạp và cơ chế điều hòa AGPase [37]

Ghi chú: Fructose-6-P tạo ra từ chu trình Calvin được chuyển hóa thành Glucose -1-P Glucose-1-P được hoạt hóa bởi ATP thành ADP-Glucose nhờ sự xúc tác của enzyme AGPase AGPase được hoạt hóa bởi thế ôxi hóa khử và/hoặc 3-Phosphoglyceric acid được tạo ra từ chu trình Calvin và bị bất hoạt bởi nồng độ cao của Pi (Viết tắt trên hình: Fru6P, fructose 6-phosphate; Glc1P, glucose 1-phosphate; Glc6P, glucose 6-phosphate; TPT, triose-phosphate/phosphate translocator 3PGA: 3-Phosphoglyceric acid)

Mặc dù được mã hóa bởi hai gen, tuy nhiên, trong cùng một loài có thể có nhiều

isoform khác nhau Ở lúa có 3 isoform được mã hóa bởi AGPS và 4 isoform mã hóa

bởi AGPL [31] Các isoform khác nhau có các tính chất khác nhau về khả năng xúc

tác, mức nhạy cảm với các cơ chế điều hòa… Các isoform ở lá thường nhạy cảm với 3-PGA/Pi trong khi ở các mô dự trữ thì có thể khác nhau Ở tế bào nội nhũ lúa mì,

phôi đậu Hà Lan, phôi đậu răng ngựa (Vicia faba) chứa những isoforms của AGPase

có độ nhạy thấp hoặc không nhạy cảm với cơ chế điều hòa 3-PGA/Pi [12] Đặc biệt, AGPase ở tế bào nội nhũ lúa mạch (Barley) có thể hoạt động mà không cần hoạt hóa

bởi 3-PGA và ít nhạy cảm với sự ức chế của Pi [21] Những isoform này mang lại

nhiều ứng dụng trong việc tạo cây trồng biến đổi gen tăng cường khả năng tích lũy tinh bột

AGPase là một trong những enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp tinh

bột Nghiên cứu trên cây A.thaliana bị đột biến ở cả hai gen mã hóa cho hai tiểu phần

lớn nhỏ cho thấy lượng tinh bột giảm còn 2% so với cây bình thường [27] Khi biểu

hiện các đoạn đối mã của 2 gen AGPS và AGPL trong cây khoai tây cũng cho kết quả

sự tích lũy tinh bột ở các dòng cây chuyển gen ít đi từ 1,5 - 3 lần trong khi đó hàm lượng các loại đường tan như glucose, sucrose và fructose tăng khoảng 5 lần Các nghiên cứu tăng cường khả năng biểu hiện của một trong hai hoặc cả hai gen đều thu được các dòng chuyển gen có hàm lương tinh bột tích lũy cao hơn so với cây đối chứng

1.2.2 AGPase ở sắn

Gen AGPase ở sắn đã được phân lập và giải trình tự thành công [19] Nghiên

cứu trên các giống sắn TMS 30572 và CM 2177-2, vùng mã hóa (CDS) cho AGPS dài

1572 bp và AGPL dài 1593 bp Trình tự AGPS và AGPL có độ tương đồng thấp (40%) Kết quả phân sàng lọc thư viện cDNA ở hai giống sắn này chỉ thu được một isoform của AGPS và AGPL Chuỗi AGPS dài 524 amino acid, 57,3 kDa và AGPL

dài 531 amino acid, 58,7 kDa Cả hai chuỗi AGPS và AGPL đều chứa đoạn Transit

peptide (dài khoảng 69 – 74 amino acid) ở đầu N giúp vận chuyển vào lạp thể Ở sắn,

tiểu phần AGPS chỉ biểu hiện mạnh ở các mô tổng hợp tinh bột (lá, củ) trong khi AGPL biểu hiện đồng đều ở tất cả các mô Điều này dẫn tới AGPase biểu hiện mạnh nhất trong lá khi quang hợp, tiếp đó là mức biểu hiện ở củ sắn (thấp hơn 4 lần so với lá), mức độ biểu hiện ở các mô khác là rất ít hoặc không biểu hiện Cơ chế điều hòa AGPase có sự khác nhau ở lá và củ sắn AGPase ở lá chịu tác động mạnh của 3-PGA

và bị bất hoạt tới 90% khi có mặt Pi (2 mM) Trong khi đó, AGPase ở củ không bị ảnh hưởng bởi 3-PGA nhưng bị bất hoạt mạnh bởi Pi [19]

Phân tích dữ liệu genome sắn (V6.1) trên Phytozome 11 (https://phytozome.jgi.doe.gov) [51] cho thấy gen AGPS nằm trên nhiễm sắc thể số 12 (nucleotide số 6583306 đến 6588233) và AGPL nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (nucleotide số 11864610 đến 11871278) Vùng mã hóa AGPS có độ tương đồng cao

(89%) với gen mã hóa tiểu phần lớn của glucose-1-phosphate adenylyltransferase

(glgC)

1.3 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHẰM CẢI BIẾN

QUÁ TRÌNH TRAO ĐỔI TINH BỘT

Việc biến đổi quá trình trao đổi tinh bột trong cây trồng có thể góp phần tăng khả năng tích lũy tinh bột trong các cơ quan dự trữ, tăng tốc quá trình tích lũy tinh bột, ngăn chặn hoặc tăng việc phân hủy tinh bột (tùy thuộc vào loại cây trồng hay nhu cầu

sử dụng), biến đổi cấu trúc tinh bột để tăng hoặc đa dạng chức năng của tinh bột trong thực phẩm và nguyên liệu của công nghiệp

Với số lượng lớn các enzyme tham gia vào việc xác định cấu trúc của tinh bột trong một bộ phận nhất định của cây, có thể thấy rằng số tinh bột khác nhau có thể được biến đổi qua việc điều khiển của các gen liên quan là rất lớn Trong các loài lưỡng bội mà sinh sản hữu tính thì phương pháp tốt nhất là kết hợp các đột biến ảnh hưởng đến các gen mã hóa cho các enzyme trao đổi tinh bột Các phương pháp công nghệ sinh học có thể có nhiều ưu thế và cần thiết nếu cây trồng quan tâm là đa bội và sinh sản vô tính, các gen quan tâm cần biểu hiện mạnh hơn hoặc giảm một phần hoạt tính, tính trạng mong muốn là kết quả của việc biểu hiện gen từ loài khác

1.3.1 Tăng khả năng tích lũy tinh bột

Cho đến nay những cố gắng nhằm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập trung vào

việc tăng hoạt tính AGPase trong cây Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS Một loạt đột biến của gene AGPase Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của enzyme này đã được dùng để biểu hiện mạnh trong cây Khi glgC16

được biểu hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60% Tuy nhiên với các cây khác như sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt được mức như vậy Vì thế

việc biến đổi một mình AGPase có thể có hoặc không đạt được kết quả mong muốn

tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ Ngoài ra, có một số bằng chứng về việc tăng nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc tạo ra ADPG và dẫn đến việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột Biểu hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở

vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai tây làm tăng ADPG lên 2 lần và hàm lượng

tinh bột tăng lên từ 16-36% so với đối chứng Khi kìm hãm adenylate kinase của

plastic (enzyme chuyển hóa hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADPG tăng lên 10 lần và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và ngoài đồng ruộng [35]

Nghiên cứu của Li N và cộng sự (2011) [26] chuyển gen mã hóa cho tiểu phần

lớn (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) được phân lập từ sắn dưới sự điều khiển bởi promoter

CaMV 35S vào cây ngô cho làm tăng cường hàm lượng tinh bột và khối lượng hạt

Kết quả biểu hiện vượt ngưỡng Sh2 hoặc Bt2 đều làm tăng hàm lượng tinh bột và khối lượng hạt Tuy nhiên, biểu hiện đồng thời Sh2 và Bt2 (Hình 1.5) cho kết quả cao nhất,

khối lượng hạt tăng 15%, hàm lượng tinh bột tăng 13,8% so với cây chưa chuyển gen

Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen của Li và cộng sự (2011) [26]

Ghi chú: Gen mã hóa cho tiểu phần lớn của AGPase (Sh2) và tiểu phần nhỏ (Bt2) được điều khiển bởi promoter P27kD, hai gen được biểu hiện trên hai khung đọc mở khác nhau

1.3.2 Tăng khả năng phân hủy tinh bột

Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung cấp nguyên liệu sản xuất ethanol Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô đã được ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột sang ethanol Amylase được biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hưởng đến việc tích tụ tinh bột trong quá trình phát triển của cây Khi hạt xay ra được làm nóng trong nước để hồ hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men [45]

1.3.3 Thay đổi thành phần tinh bột

Mục đích chính để thay đổi cấu trúc của tinh bột trong cây là biến đổi tỷ lệ amylopectin và amylose, thay đổi phân bố chiều dài chuỗi trong amylopectin hoặc để tăng hàm lượng phosphate của tinh bột Do thành phần hóa lý của amylose và amylopectin nên tính chất có lợi cho công nghiệp là chủ yếu là các tinh bột chỉ có một

trong hai thành phần trên Nhiều đột biến đã được mô tả trong nhiều loài ngũ cốc và họ đậu có chứa tinh bột chỉ có amylopectin hoặc có phần lớn là amylose Những gen liên quan đến quá trình tổng hợp tinh bột này mở ra khả năng ứng dụng trong việc tạo ra các loại củ hoặc hạt có chất lượng tinh bột và đường khác nhau với tỷ lệ amylose/amylopectin khác nhau

Gen Puroindoline từ lúa mì PINA và PINB đã được chuyển vào lúa để thay đổi

thành phần tinh bột Hạt chuyển gen rất mềm và được gọi là "Soft Rice" Viêc thay đổi này có rất nhiều lợi thế trong ngành công nghiệp thực phẩm cho phép tạo ra loại gạo mới có chất lượng tốt hơn [23]

Các enzyme SBE (starch branching enzyme) và DBE (debranching enzyme) có vai trò quan trọng trong việc quyết định thành phần amylose và amylopectin Quá trình phân nhánh được xúc tác bởi SBE Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác SBE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II Nhóm I vận chuyển các chuỗi dài hơn Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong tổng hợp amylopectin Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tăng cường biểu

hiện SBE trong cây chuyển gen làm tăng hàm lượng amylopectin [9]

1.4 CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN NHỜ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Việc sử dụng Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) bắt đầu từ 1970, khi

người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị

thương, được gọi là khối u cổ rễ Agrobacterium là một loài vi khẩn đất thuộc vi khuẩn gram âm Cả chủng A tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đều được sử dụng

phổ biến trong chuyển gen vào thực vật Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots) [42] Những tế bào của

khối u hay lông rễ có thể phát triển in vitro khi vắng mặt bất cứ hormone thực vật nào

Khả năng này có được do tế bào của các dạng hoang dại A tumefaciens hay A

rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid)

Ti-Plasmid có kích thước khoảng >200 kb đã được xác định trình tự, chứa một đoạn

DNA có chiều dài khoảng 25 Kb gọi là T-DNA có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ

chế tự nhiên [16] Do đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên Bằng

cách cải biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-DNA những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển

gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens

A tumefaciens nhận biết acetosyringone nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng

một gen ở vùng vir (virulence), vùng vir bao gồm nhiều gen Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen vir Một sản phẩm gen vir khác là một

endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T-DNA ở những vị trí này Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào

thực vật cũng nhờ tác dụng của các sản phẩm gen vir

Ti-plasmid tự nhiên khó được dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen

vì có kích thước lớn (>200kb) và mang các gen gây khối u bất lợi cho thực vật Hơn nữa, trên trình tự DNA của Ti-plasmid có rất nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn, điều

đó gây ra những trở ngại trong quá trình tạo vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu để

chuyển vào tế bào thực vật Mặt khác, khi chuyển Ti-plasmid vào vi khuẩn E coli

chúng không có khả năng tự tái bản Tuy nhiên, bên cạnh đó Ti-plasmid có thể cung cấp những yếu tố cần thiết quan trọng cho kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium Do đó, cần thiết kế lại để có thể sử dụng Ti-plasmid trong kĩ thuật

chuyển nạp gen vào thực vật

Ngày nay, hầu hết quy trình chuyển gen sử dụng vector nhị thể (binary vector)

vì những ưu điểm vượt trội trong thiết kế vector và hiệu suất biến nạp Hệ thống vector nhị thể thiết kế gồm hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong

Agrobacterium Một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E coli, trong đó có thiết kế vùng

bờ trái và bờ phải, nằm giữa hai bờ là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải

bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng gen vir hỗ trợ chuyển gen vào tế bào thực vật, plasmid này

được gọi là plasmid hỗ trợ Hệ thống vector nhị thể luôn được cải tiến để nâng cao

hiệu suất chuyển gen thông qua Agrobacterium Chính vì vậy, đây là một hệ thống

vector đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay

Trong báo cáo này sử dụng vector chuyển gen pBI121 mang gen chọn lọc cây

chuyển gen NPTII, gen chọn lọc khuẩn biến nạp KanR và gen chuyển (GUS) đƣợc điều khiển bởi promoter 35S [33] Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58

mang vector pGV2260 đƣợc nghiên cứu phù hợp với chuyển gen ở cây thuốc lá và nhiều loại cây trồng khác [11]

1.5 BIỂU HIỆN NHIỀU GENE TRÊN CUNG MỘT KHUNG ĐỌC MỞ VỚI 2A

PEPTIDE

Hình 1.6 Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động của P2a [47]

Ghi chú: 1 - 3: Ribosome hoạt động bình thường đến bộ ba mã hóa cho praline 4: Chuỗi peptide LLNFDLLKLAGDVESNPG và Paraline bất hoạt Peptidyl transferase 5-6: Chuỗi polypeptide bắt đầu tổng hợp từ paraline

Ở virus gây bệnh lở mồm long móng Teschovirus hay FMDV (foot-and-mouth

disease virus) và một số Picornaviruses khác, đoạn oligopeptide (khoảng 20 axit

amino) nằm giữa hai protein 2A và 2B trong polyprotein có nhiệm vụ phân cắt tạo ra hai protein 2A và 2B [36] Vị trí cắt nằm giữa hai axit amino glycine và praline của

p2a (−LLNFDLLKLAGDVESNPG↓P-) [2] (Hình 1.6) Các nghiên cứu cho thấy, P2a

có khả năng hoạt động khi nằm giữa hai protein trong hầu hết hệ thống biểu hiện gen ở sinh vật có nhân thật P2a hoạt động như một hệ thống độc lập và là công cụ quan trọng để biểu hiện nhiều protein trên cùng một khung đọc mở

Trên thực vật, P2a cũng được chứng minh có hoạt động trên cây A thaliana [5], thuốc lá [25] … Nghiên cứu của Buren (2012) trên cây A thaliana với các gen khác

nhau cho hiệu quả phân cắt khác nhau Khả năng phân cắt cao nhất (95%) với cấu trúc CFPGUS-2A-RABD2a, trong đó CFPGUS có chiều dài lớn nhất trong số các protein được thử nghiệm Trong khi đó hiệu suất phân cắt của CFP-2A-RABD2a chỉ đạt 20%

Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy, P2a có ưu thế vượt trội so với IRES (Internal ribosome entry site được phân lập từ Encephalomyocarditis virus - EMCV)

về hiệu suất biểu hiện và tỉ lệ giữa hai chuỗi peptide được tạo ra Chuyển gen tổng hợp tiền vitamin A (β-carotene ) là một trong những thành tựu lớn của công nghệ chuyển

gen thực vật Để tổng hợp β-carotene trong hạt lúa, hai gen cấu trúc, PSY và crt1 được

điều khiển bởi promoter Glu1 [30] Nghiên cứu gần đây của Ha và cộng sự (2010) [18]

đã biểu hiện hai protein PSY và crt1 trên cùng một khung đọc mở với hệ thống biểu hiện P2a hoặc IRES Kết quả cho thấy, PSY –P2a-crt1 hoạt động hiệu quả hơn gấp 9 lần so với PSY –IRES-crt1 Các nghiên cứu cũng cho thấy, cấu trúc Protein1–IRES-

protein2 thường biểu hiện không đều, protein đứng sau IRES thường có mức dịch mã

thấp hơn so với protein đứng trước [15]

Như vậy, P2a là một công cụ hữu hiệu trong biểu hiện nhiều gen trên cùng khung đọc mở

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu

Giống sắn KM140 được sử dụng để phân lập gen AGPS và AGPL do Trung tâm

nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cung cấp

Cây thuốc lá N tabacum K326 in vitro, chủng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens C58/pGV2260, vi khuẩn Escherichia coli DH5(α), vector chuyển gen

pBI121 và vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất tách chiết RNA: TRIzol® Reagent, kit tổng hợp cDNA: RevertAid

RT Reverse Transcription Kit, thang ADN 1kb (cho điện di gel agarose), kit tinh sạch

ADN Gene JET gel extraction (Thermo Fisher Scientific) Kit PCR GoTaq® Green Master Mix (Promega)

Các hóa chất khác được trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu Mồi PCR (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách mồi PCR sử dụng

1 AGPLcds_F TGGAATGGATTCTTGCTGTGTG 22 Nhân bản AGPL

12 M13 F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24 Kiểm tra vector

2.2.1 Một số phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Phương pháp PCR với GoTaq® Green Master Mix

GoTaq® Green Master Mix 2X là dung dịch master mix cho phản ứng PCR đã đƣợc bổ sung dNTPs, Buffer PCR, enzyme và đệm load mẫu Khi thực hiện phản ứng PCR cần bổ sung thêm mồi PCR và DNA khuôn Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X

Trong đó:

Mẫu DNA là DNA tổng số thực vật, plasmid, hoặc tế bào vi khuẩn (gọi là cloni-PCR)

Tm được tính Tm(ºC) = 64.9 + 41(((G+C) -16.4)/N)-3 (N là chiều dài mồi)

Chạy 25 chu kỳ cho cloni-PCR và 30 chu kỳ cho phản ứng PCR từ DNA tổng số

2.2.1.2 Phương pháp nối hai hoặc nhiều đoạn DNA bằng phản ứng ligase với T4

DNA ligase

Các phân đoạn DNA đã tinh sạch đƣợc ghép nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp nhờ T4 DNA ligase, thành phần phản ứng trình bày ở Bảng 2.3 Để đạt đƣợc hiệu quả tốt nhất, vector và đoạn chèn đƣợc đƣa vào với tỉ lệ 1 : 3 theo nồng độ Mol Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 22oC trong 30 phút Sau đó đặt hỗn hợp phản ứng lên đá lạnh

và tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối hai hoặc nhiều đoạn DNA với T4 ligase

STT Thành phần phản ứng Thể tích(µl)

4 T4 DNA ligase Buffer 10X 2

5 T4 DNA ligase (5U/µl) 1

2.2.1.3 Phương pháp cắt DNA với enzyme cắt giới hạn

Các mẫu DNA hoặc Plasmid đƣợc cắt enzyme để tạo đầu đính hoặc để kiểm tra Plasmid Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở Bảng 2.4 Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 37ºC trong ít nhất 2 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, một lƣợng nhỏ sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% Hoặc điện di lƣợng lớn phục vụ thu hồi các phân đoạn cắt

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn

2.2.1.4 Phương pháp biến nạp vector vào E coli

Sản phẩm nối với enzyme T4 ligase được biến nạp vào tế bào khả biến E coli

bằng phương pháp vi sóng Lấy 5 µl hỗn hợp phản ứng trộn cùng 50 µl tế bào khả biến

E coli DHα Giữ trên đá 10 phút Biến nạp bằng lò vi sóng ở 150 W trong 1 phút, giữ

ngay trên đá Dịch khuẩn sau biến nạp được bổ sung 400 µl LB, nuôi phục hồi ở 37ºC trong 1 h và cấy trải lên đĩa LB đặc có kháng sinh thích hợp Nuôi đĩa khuẩn qua đêm

ở 37ºC

2.2.1.5 Phương pháp tách chiết plasmid

Plasmid được tách từ dịch khuẩn bằng phương pháp ly giải kiềm (alkaline lysis)

- Ly tâm dịch khuẩn ở 7000 rpm/5 phút để thu dịch khuẩn

- Bổ sung 200 µl Sol I (25 mM Tris HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Glucose), trộn đều

- Bổ sung 400 µl Sol II (0,2 M NaOH và 1% SDS) , đảo đều, giữ 5 phút nhiệt độ phòng

- Thêm 300 µl Sol III (CH3COOK 2,5 M pH 5.2), đảo đều, giữ 3 phút, li tâm 12000 rpm/10 phút Thu dịch nổi

- Thêm 700 µl isopropanol, đảo đều, ly tâm 12000 rpm/10 phút Thu cặn

- Rửa cặn 2 lần với ethanol 70% Làm khô

- Hòa cặn vào 40 µl nước

Plasmid sau khi tách được kiểm tra bằng phương pháp điện di agarose 0,8%, tinh sạch và đo nồng độ bằng máy đo nanodrop

2.2.2 Phân lập gen AGPS và AGPL từ cây sắn

2.2.2.1 Tách RNA tổng số từ củ sắn KM140

Mẫu RNA được tách từ lá của giống sắn KM140 bằng TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific):

- Nghiền 0,1 g lá sắn trong nito lỏng

- Thêm 1 ml Trizol, đảo đều

- Thêm 200 µl Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1, lắc đều Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Thu dịch pha trên (500 µl)

- Thêm 500 µl Isopropanol, đảo đều, li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Thu cặn RNA

- Rửa cặn RNA với ethanol 75% Làm khô

- Hòa cặn vào 40 µl nước

- Kiểm tra RNA tổng số sau khi tách bằng điện di trên gel agarose 0.8% không biến tính

2.2.2.2 Nhân dòng gen AGPS và AGPL bằng phản ứng RT-PCR

Mẫu RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp cDNA theo hướng dẫn của bộ kit RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific):

Chạy chương trình tổng hợp cDNA 25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút Kết thúc phản ứng ở 70°C/5 phút Mẫu cDNA sau khi tổng hợp được sử dụng để thực hiện phản ứng

PCR Hai gen AGPS và AGPL được nhân dòng bằng phản ứng PCR với cDNA tổng số bằng cặp mồi AGPScds-F/R cho AGPS và AGPLcds-F/R (được thiết kế dựa trên trình

tự hệ gen Manihot esculenta v6.1 genome – Phytozoe) cho AGPL Thành phần phản

ứng và chu kỳ nhiệt được trình bày ở Bảng 2.5 Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân dòng

đoạn AGPS và AGPL

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Bước Phản ứng Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ

2.2.2.3 Tách dòng gen AGPS và AGPL bằng vector pBT

Sản phẩm RT-PCR từ hai gen AGPS và AGPL được điện di và thu hồi theo hướng dẫn của kit thôi gel Gene JET gel extraction (Thermo Fisher Scientific) Sản phẩm này được tạo đầu A bằng phản ứng với GoTaq® Green Master Mix ở 72ºC trong

10 phút Tiếp đó, sản phẩm tinh sạch được nối với vector tách dòng pBT và biến nạp

vào E.coli DHα Cấy trải khuẩn trên đĩa LB đặc chứa Carbenicillin 75 mg/l, IPTG 1

mM, X-gal 20 mg/l và nuôi qua đêm ở 37ºC Các khuẩn lạc màu trắng được chọn và kiểm tra PCR với cặp mồi M13F/R Khuẩn lạc dương tính nếu xuất hiện băng lớn hơn 164bp so với kích thước đoạn gen chèn vào

Các khuẩn lạc dương tính được nuôi lỏng và tách plasmid Plasmid được kiểm tra lần nữa với mồi M13F/R, sau đó, đọc trình tự với mồi M13-F và M13-R

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL

2.2.3.1 Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI

Để nối với vector pBI121, AGPS được bổ sung thêm điểm cắt của enzyme giới hạn XbaI và SmaI ở hai đầu bằng phản ứng PCR với cặp mồi XbaI-AGPS-F và

AGPS-SmaI-R Sản phẩm là đoạn XbaI-AGPS-SmaI

Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc và vị trí của các mồi PCR

Đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI được tổng hợp từ vùng CDS của AGPL, được bổ sung thêm trình tự P2A và C-myc cùng vị trí cắt của enzyme SmaI và SacI

bằng 2 phản ứng PCR: (1) nhân vùng CDS của AGPL với mồi P2A-AGPL-F và AGPL-CMYC-R băng phản ứng PCR; (2) Thực hiện phản ứng nối PCR (overlap

extension PCR) với các mồi XmaI-P2A-F, P2A-R, và Cmyc-sacI-R2 để tạo phân đoạn SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI hoàn chỉnh (Hình 2.1)

Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp

SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI đƣợc trình bày ở Bảng 2.6 Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra và tinh

sạch bằng kit thôi gel Gene JET gel extraction

Bảng 2.6 Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp

2.2.3.2 Nối XbaI-AGPS-SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121

Đoạn XbaI-AGPS-SmaI đƣợc cắt với XbaI và SmaI,

SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI cắt với SmaI và SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI Sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel Vector

pBI121 cắt với XbaI và SacI để loại bỏ gen GUS, sản phẩm cắt điện di và thu hồi băng

12,8 kb bằng kit thôi gel

Tiếp đó, 3 phân đoạn trên được nối với nhau bằng T4 ligase (Hình 2.2) Sản

phẩm nối được biến nạp vào Ecoli DH5α, cấy trải lên đĩa LB đặc bổ sung Kanamycin

50mg/l Chọn lọc khuẩn lạc bằng phản ứng clony PCR với các cặp mồi XmaI P2A-F /Cmyc-sacI-R2 và XbaI-AGPS-F / Cmyc-SacI-R2 Nuôi lỏng các khuẩn lạc dương tính và tách chiết Plasmid pBI-35S-AGPSL Plasmid này được kiểm tra bằng phản ứng

cắt enzyme SacI và XbaI

Hình 2.2 Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS và P2a-AGPL-Cmyc

2.2.3.3 Biến nạp pBI-35s-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A tumefacien C58

Tế bào khả biến đặt trong đá 10-15 phút Bổ sung 1 µl vector chuyển gen vào tế

bào khả biến và trộn nhẹ Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A.tumefaciens C58 + vector

chuyển gen vào Cuvette Xung điện: 2,5 kv, 25µF và điện trở 400 Đặt ngay vào đá Sau 5-10 phút bổ sung 400 µl LB và trộn nhẹ Chuyển sang ống eppendorf 2 ml Nuôi

28oC trong 1 giờ trên máy lắc Cấy trải dịch vào đĩa LB đặc chứa Kanamycin 50 mg/l, Rifampicin 50 mg/l Ủ ở 28oC trong hai ngày Khuẩn lạc được sàng lọc bằng phương pháp cloni-PCR với mồi XbaI-AGPS-F và Cmyc-SacI-R2 Các khuẩn lạc dương tính được cấy vạch sang đĩa mới và nuôi giữ chủng

2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A tumefaciens

2.2.4.1 Chẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens

Khuẩn lạc A tumefaciens được nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng

sinh chọn lọc (Kanamycin 50 mg/l, Rifampicin 50 mg/l), nuôi qua đêm (16h) Sau đó nuôi phục hồi thêm 4h trong 100 ml LB lỏng Khuẩn sau khi nuôi được đem đo

OD650=0,5-0,7 thì sử dụng để biến nạp Vi khuẩn được thu hồi bằng li tâm và hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyền phù vi khuẩn OD600 = 0,7

2.2.4.2 Chuyển gen

Lá thuốc lá được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 1 cm2, tiền nuôi cấy trong môi trường GM (MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose) sau 2 ngày Mảnh lá được

ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens trong 15 phút ở nhiệt độ phòng,

tiếp đến được đặt lên môi trường đồng nuôi cấy GM (MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH=5,8 ) trong 2 ngày Sau đó tiếp tục nuôi cấy trên môi trường

GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cefotaxime 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l để tái sinh chồi Sau 4 đến 5 tuần các chồi 2-3 cm tái sinh trên môi trường chọn lọc được cắt chuyển sang môi trường ra rễ RM (MS + 0,1 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar +

500 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin, pH 5,8) Sau 3 đến 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3 đến 4 lá thật sẵn sàng cho ra bầu đất nhỏ chứa giá thể TN1 Cây chuyển gen được huấn luyện với môi trường ngoài ở nhiệt nhiệt độ ở 25oC, độ

ẩm 80 - 90%, điều kiện chiếu sáng 14/24 h, độ rọi 2500 lux Cây phát triển có 4 đến 5

lá thật thì chuyển ra trồng trong chậu đất chứa giá thể TN1 (viện nông hóa thổ nhưỡng) trong buồng sinh trưởng để phân tích cây chuyển gen Quy trình được tóm tắt

ở Bảng 2.7

Bảng 2.7 Tóm tắt quy trình chuyển gen và phân tích cây chuyển gen

Chuẩn bị vật liệu chuyển gene

Cắt lá thành các mảnh hình vuông kích

thước 1 cm2 (K326) đặt ngửa lên GM 2

ngày

Chẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn

- Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù

- Ly tâm thu cặn khuẩn, hòa cặn trong ½ MS (OD600 = 0,7)

Chuyển gen (2 ngày)

- Lây nhiễm 15 phút

- Đồng nuôi cấy trên GM ở điều kiện tối (2 ngày)

Chọn lọc đa chồi (4-5 tuần)

Nuôi mảnh lá trên môi trường GM với kháng sinh chọn lọc

Chọn lọc ra rễ (3-4 tuần)

Cắt chồi, nuôi trên môi trường ra rễ RM

Huấn luyện cây non (1 – 2 tuần)

Trồng trong bầu đất nhỏ, trong phòng nuôi cấy mô

Nuôi cây trong buồng

sinh trưởng

15 ngày: Kiểm tra PCR

20 ngày: kiểm tra tinh bột bằng nhuộm Iodine

30 ngày: Kiểm tra tốc độ tích lũy tinh bột 2h sau chiếu sáng

50 ngày: kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột 14h sau chiếu sáng

Phân tích Western blot cây in-vitro

Kiểm tra các cây dương tính với PCR

2.2.5 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp PCR

DNA tổng số được tách từ lá cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng 15 ngày trong chậu đất theo quy trình:

- Nghiền 0,1 g lá trong nitơ lỏng

- Thêm 500 µl đệm chiết TES (Tris HCl pH8 100 mM, EDTA 50 mM, NaCl 1M), đảo đều Li tâm 12000 vòng/phút trong 12 phút Hút dịch chiết sang ống mới

- Thêm thể tích tương đương Isopropanol, đảo đều Li tâm 12000 vòng/phút trong 12 phút Thu cặn

- Rửa cặn DNA với Ethanol 70%, làm khô và hòa vào 40 µl nước

- Kiểm tra DNA tổng số sau tách bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 0,8%

Mẫu DNA tổng số được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR (Gotaq) với các cặp mồi: ITS2/ITS4, VirC F/R, NPTII F3/R730 và XbaI-AGPS-F / P2A-R

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% Các dòng thuốc lá dương tính với phản ứng PCR nếu xuất hiện băng kích thước tương đương đối chứng dương và đúng với kích thước tính toán lý thuyết

2.2.6 Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng Western blot

Lá cây chuyển gen (100 mg) nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng, bổ sung 100

µl đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X Thu dịch nghiền vào ống eppendorf 2

ml, ly tâm 10.000 vòng ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên Protein tổng số sau tách được định lượng bằng phương pháp so màu của Bradford (1976) Protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% theo phương pháp của Laemmli (1970) Sau đó

protein được chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast blotter của

hãng Thermo Scientific Pierce ở 25V, trong 30 phút Màng nitrocellulose tiếp tục được

phủ bằng Blocking solution trong 5 giờ, sau đó màng được ủ qua đêm với kháng thể 1 (anti-cmyc) pha loãng trong Blocking solution với tỉ lệ 1:100 Sau khi ủ kháng thể 1,

màng được rửa sạch 2 lần, 5 phút/lần với TBST và tiếp tục được ủ với kháng thể 2

(anti-mouse IgG cộng hợp HRP) pha trong Blocking solution với tỉ lệ 1:2500 trong 2

giờ Màng lai tiếp tục được rửa 2 lần (mỗi lần 5 phút) với TBST Sự có mặt phức hệ

“protein tái tổ hợp + kháng thể 1 + kháng thể 2” trên màng được phát hiện nhờ phản ứng hiện màu bằng cơ chất 3,3′-Diaminobenzidine (DAB)

Thành phần dung dịch:

 Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline Tween): 11,5 g/L Na2HPO4.2H2O, 2,96 g/L NaH2PO4.2H2O, 5,84 g/L NaCl, 1 ml/L Tween 20, pH 7,5

 Đệm biến tính protein (Laemmli sample buffer 4X): 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 200

mM DTT, 4% (w/v) SDS, 50% (v/v) Glycerol, 0,01% (w/v) Bromophenol blue

 Dung dịch chuyển màng: 25 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,2% (w/v) SDS, 20% methanol

 Đệm TBST: 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 ml/L Tween 20, pH 7,5

 Blocking solution: Thành phần của Blocking solution gồm 5% skim milk (sữa tách béo) trong TBST solution

2.2.7 Kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột của cây thuốc lá chuyển gen

Các dòng chuyển gen và không chuyển gen sau khi huấn luyện thích nghi với môi trường bên ngoài được nuôi trong buồng sinh trưởng Điều khiển nhiệt độ ở 25oC

vào ban ngày và 20ºC vào ban đêm, độ ẩm 70%, điều kiện chiếu sáng 14/24 h, độ rọi

7500 lux Thu lá cùng độ tuổi ở các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng không chuyển gen vào buổi sáng sau 2h chiếu sáng Hàm lượng tinh bột trong lá được kiểm tra định tính bằng phương pháp nhuộn iodine và định lượng bằng phương pháp Anthrone [44]

2.2.7.1 Phương pháp nhuộm iodine

Cây thuốc lá sau khi nuôi 20 ngày được kiểm tra tinh bột bằng phương pháp nhuộm iodine Thu lá cùng độ tuổi ở các dòng thuốc lá chuyển gen và dòng không chuyển gen, sau 2h chiếu sáng Nhúng lần lượt từng lá vào nước sôi, giữ khoảng 1 phút Chiết sạch diệp lục trong lá bằng cách nhúng lá trong cồn 80oC sôi Rửa lá dưới vòi nước để loại bỏ cồn dư Tiến hành nhuộm lá với dung dịch nhuộm (0,2% I2; 0,4%

KI)

2.2.7.2 Phương pháp đo hàm lượng tinh bột bằng Anthrone

Cây thuốc lá sau nuôi 30 ngày (thu sau 2h chiếu sáng) được thu lá và kiểm tra tốc độ tích lũy tinh bột Cây sinh trưởng được 50 ngày (thu sau 12h chiếu sáng) được kiểm tra khả năng tích lũy tinh bột tối đa

Cây trồng trong buồng sinh trưởng được định lượng tinh bột bằng phương pháp Anthrone Trong phương pháp này, các mẫu lá được sấy khô và loại bỏ diệp lục bằng cách chiết với acetone 100% Đường tự do trong mẫu được loại với cồn 80º, sau đó thủy phân tinh bột trong mẫu với acid HCl để tạo ra các phân tử đường glucose Cuối cùng thực hiện phản ứng màu với Anthrone và đo độ hấp thụ ở bước sóng 630 nm Quy trình dựa trên mô tả của Yemm và cộng sự (1954) [44] có cải tiến:

- Thu 1 lá thứ 2 hoặc 3 được chiếu sáng hoàn toàn, giữ trong khay đá

- Sấy khô ở 80ºC đến khối lượng không đổi Nghiền vụn bằng cối chày sứ

- Cân lấy 5 – 15 mg bột lá Nghiền mịn trong nito lỏng

- Thêm 1,5 ml aceton, lắc đều Li tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút Thu cặn Lặp lại 2 – 3 lần cho đến khi thu được cặn trắng

- Thêm 2 ml cồn 80%, lắc đều Li tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút Thu cặn Lặp lại 1 lần nữa

- Hòa cặn vào 5 ml HCl 1,25% trong ống facol 15 ml Ủ 95ºC trong 1h