Thiết kế vector mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng chống chịu ở cây đậu xanh

Trong thời gian thực tập nghiên cứu, tôi cũng đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị và các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực v

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Võ Thị Minh Hòa

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn

Vũ Thanh Thanh, Khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và TS Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện

và hoàn thành luận văn này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Lê Trần Bình, PGS.TS Chu Hoàng Hà, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những người đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt thời gian thự

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới CN Hoàng Hà, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này Trong thời gian thực tập nghiên cứu, tôi cũng đã nhận được

sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị

và các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin cảm ơn chân thành các thầy cô giáo trong khoa Khoa học sự trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

sống-Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những người thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

, ngày 06 tháng 10 năm 2011

Học viên

Võ Thị Minh Hòa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

2 Mục tiêu nghiên cứu

3 Nội dung nghiên cứu

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ………

1.1.2.2 T

1.2 HẠN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH CHỊU HẠN

1.2.1 đối với cây trồng ………

1.2.2 Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

1.3 GEN VÀ PROTEIN LTP (Lipid Transfer Protein)

1.3.1 Gen LTP ………

1.3.2 Protein (LTP) ………

1.4 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A.tumefaciens ……

1.4.1 Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật

1.4.2

1.4.3 Các ……

Trang

i

ii iii

iv

1

1

2

2

3

4

4

4

6

6

8

10

10

11

15

15

17

18

18

19

20

1.4.4 Thành tựu chuyển gen ở thực vật ………

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ………

2.2 P ………

2.2.1 ………

2.2.2 ………

2.2.3 en LTP ………

2.2.4 ………

A tumefaciens CV58C1 A tumefaciens CV58C1

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP GEN LTP ………

3.1.1 Thiết kế mồi ………

3.1.2 Tách RNA tổng số tổng hợp cDNA …

3.1.3 Kết quả PCR LTP ………

3.1.4

3.1.5 Kết quả xác định trình tự nucleotide

3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

3.2.1 Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3

3.2.2 Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP

3.2.3 Kết quả biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A tumefaciens

3.2.4 Kết quả kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR

3.3 CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở

21

24

24

24

25

26

27

27

27

28

29

33

34

35

36

37

38

38

38

38

39

40

41

43

43

43

46

46

CÂY THUỐC LÁ

3.3.1 Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá

3.3.2 Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48

48

50

51

52

52

53

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)

DEPC Diethyl pyrocarbonat

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr Ethiium bromide

E.coli Escherichia coli

NAA Naphthalene Acetic Acid

OD Optical density (Giá trị mật độ quang)

PCR Polymerase Chaine Reaction

RNA Ribonucleic Acid

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI

2.1 25

2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen LTP 29

2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen LTP 29

2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen LTP vào vector 31

2.5 Thành phần 34

2.6 34

3.1 Trình tự mồi nhân gen LTP 39 3.2 Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá trên môi trường chọn lọc 51

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG ĐỀ TÀI

3.1 Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen LTP 41 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT-LTP bằng BamHI 42 3.3 So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh HN2 và

trình tự đã công bố AY300807 44 3.4 So sánh trình tự amino acid trong protein LTP của giống đậu xanh

HN2 và AY300807 44 3.5 điện di sản phẩm PCR colony pCB301-LTP 46 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCB301-LTP bằng NcoI và NotI 47 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

1

Đậu xanh có tên khoa học Vigna radiata L.Wilczek, là cây đậu đỗ

Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bổ chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở nước ta [11], [13] Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất

do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5]

Những năm gần đây tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh

ở nước ta đang có chiều hướng gia tăng do khai thác được một số ưu điểm quan trọng của đậu xanh như: là cây trồng có giá trị kinh tế cao vì là nguồn thực phẩm có nhiều dinh dưỡng, đa dạng trong đời sống, thích hợp với tiêu dùng trong nước và xuất khẩu Ngoài ra, đậu xanh là loại cây trồng ngắn ngày, dễ luân canh, xen canh, gối vụ và có khả năng cải tạo đất tốt [14]

Hạn hán đang là một trong những vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất của cây đậu xanh , các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém Chính vì vậy, nghiên cứu cây đậu xanh có khả năng chịu hạn đang là một trong những đòi hỏi của thực tiễn Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới và tại Việt Nam

đã đạt được những kết quả nhất định đối với việc tạo ra các giống đậu xanh mới bằng các phương pháp chọn giống truyền thống như chọn dòng tế bào hay sử dụng phương pháp gây đột biến thực nghiệm Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn còn có nhược điểm như thời gian chọn tạo lâu, thí nghiệm đòi hỏi lượng cá thể lớn… Vì vậy, áp dụng các tiến bộ của sinh học

hiện đại vào cải tiến tính chống chịu của đậu xanh là cần thiết và phù hợp với

xu hướng nghiên cứu chung của thế giới [3]

, các nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền và hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

Những kết quả này sẽ rất có ý nghĩa không chỉ đối với thực tế sản xuất cây đậu xanh mà còn đối với

sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong điều kiện tại Việt Nam

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Thiết kế vector

chuyển gen mang gen LTP phân lập từ đậu xanh” nhằm phục vụ việc tạo

cây đậu xanh chuyển gen chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi

2 Mục tiêu nghiên cứu

- T vector mang gen LTP liên quan đến khả năng chịu hạn nhằm tạo cây đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt

3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập gen LTP từ giống đậu xanh đị Mỹ Đức – Hà Nội

n gen mang gen LTP Biến nạ ổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá bằng PCR

Là cơ sở cho việc chuyển gen LTP nhằm tạo cây đậu xanh chuyển gen

có khả năng chống chịu với điều kiện môi trường khô hạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY ĐẬU XANH

1.1.1 Sơ lược về cây đậu xanh

Cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo V radiata thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida, bộ

Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna Chi Vigna là một trong những chi

lớn của họ đậu bao gồm khoảng 150 loài thuộc 7 chi phụ là: Vigna,

Haydonia, Ceratotropic, Macrohynchus, Plectropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis [5]

Cây đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt

Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm Rễ phụ có khoảng 30 – 40 cái và có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là khả năng chịu hạn và chịu úng tương đối kém Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa quả, hạt mẩy [11] Đặc biệt, rễ đậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi

khuẩn cố định đạm Rhizobium Người ta nhận thấy rằng những nốt sần chứa

vi khuẩn hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng Trung bình mỗi vụ, một ha đậu xanh có thể tổng hợp 85 – 107 kg nitơ bù lại cho đất làm đất tơi xốp hơn [9], [10]

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng

40 – 70 cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng Thân đậu xanh có màu xanh hoặc màu tím, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc Trên thân chia 7 – 8 đốt, và có trung bình từ 10 -12 cành, thân

phân cành muộn, có từ 1 – 5 cành mọc ra từ các đốt còn lại các cành mọc ra

từ nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh hơn

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thùy với các hình dạng ovan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thùy Trên thân chính có 7 – 8 lá, cả hai mặt trên và dưới của lá đều có lông bao phủ Diện tích của các lá tăng dần từ các

lá mọc phía dưới lên các lá mọc ở giữa thân rồi giảm dần lên các lá mọc ở phía ngọn Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tùy thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ [5], [13]

Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính tự thụ phấn, mọc thành chùm xếp xen

kẽ nhau ở trên cuống từ các mắt thứ ba thứ tư ở trên thân cây, còn các cành thì tất cả các mắt đều có khả năng ra hoa Sau khi cây mọc 35 – 40 ngày thì nở hoa và kéo dài từ 10 – 15 ngày thì nở hết Hoa đậu xanh thường nở rải rác, các hoa ở thân nở trước, hoa ở cành nở sau, có khi còn chậm hơn các hoa nở ở ngọn cây Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, có màu xanh tím hoặc vàng nhạt Hoa đậu xanh nở sau 24 giờ là tàn, tràng hoa rụng, quả hình thành

và sau đó 20 ngày là quả chín

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ 8

-14 cm đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả,

đa số quả thẳng, có một số hơi cong , khi còn non quả có màu xanh, khi chín quả có màu vàng, nâu hoặc đen Mỗi cây có từ 8 – 35 quả, mỗi quả có từ 5 –

15 hạt Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá) trên lớp vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông mịn dài khoảng 0,3 – 0,4 mm Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây Những giống đậu xanh thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, màu trắng, vào thời kỳ chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [4], [5] Quả

đậu xanh chín rải rác, các quả sinh ra từ các chùm hoa nở trên thân thường nhiều, to, hạt mẩy hơn quả của các chùm hoa nở ở cành cây

Hạt đậu xanh có hình trụ, hình trụ hơi cạnh, hình ovan, hình tròn, hình thoi, Màu sắc vỏ hạt có thể là xanh mốc, xanh bóng (xanh sáng), xanh nâu, xanh lục, vàng mốc, vàng bóng (vàng rơm),… Ruột hạt màu vàng, xanh hoặc xanh nhạt Trọng lượng 1000 hạt từ 50 – 70 gam [4] Hạt đậu xanh chứa 56 – 60% glucid, 23 – 28% protein, 1,3% lipid, 12% nước, các vitamin B1, B2, C,… và các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K,… [13]

Trong những năm gần đây cây đậu xanh được xem là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị Protein đậu xanh được đánh giá là

có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methionine, valine,… và hàm lượng của chúng tương đối trùng với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chứ thế giới (WHO) đưa ra [24] Hạt đậu xanh không những được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon miệng và bổ dưỡng mà còn có giá trị trong y học để giải nhiệt, giải độc

Ngoài ra, cây đậu xanh còn là loại cây trồng ngắn ngày, có thể luân canh, xen canh gối vụ Trồng đậu xanh có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất

do rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi

Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạ

đã để lại một lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch làm cho đất tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [13]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu đậu xanh

Gần đây, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam được nghiên cứu theo hướng tạo giống cho năng suất, chất lượng cao, tạo

giống có khả năng kháng sâu, bệnh hại, tạo giống có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh bất lợi [1], [12]

Ở Việt Nam các nghiên cứu tập trung đi sâu vào hai hướng nghiên cứu

cơ bản trong sản xuất đậu đỗ nói chung và đậu xanh nói riêng đó là:

Giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi

Đưa cây đậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng độc canh hóa ở các vùng và cải tạo các vùng đất bị thoái hóa [4], [5]

Vì vậy, công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta đã được quan tâm phát triển và đã đạt được một số thành tựu đáng ghi nhận như:

Lê Khả Tường và cs (2000) nghiên cứu đực điểm hình thái, sinh lí, khả năng chống chịu sâu bệnh hại và thử nghiệm giống đậu xanh KP11 Kết quả

đã được hội đồng khoa học công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2001 áp dụng cho vùng Bắc Trung Bộ [10]

Chu Hoàng Mậu (2001), đã tạo được hai dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao và có khả năng chịu hạn tốt bằng phương pháp thực nghiệm [15]

Chu Hoàng Mậu (2001), đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein, thành phần và hàm lượng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh đột biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh Kết quả cho thấy hạt của các giống đậu đột biến MX103 có hàm lượng protein là 20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng amino acid của các giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16]

Cùng với sự phát triển ngày càng cao của Công nghệ Sinh học với việc

áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật gen, các nhà khoa học đã thành công trong công việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống

chịu như gen chịu hạn, chịu muối, chịu lạnh,… và đánh giá quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh

Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và xác định trình tự gen PLC3 (Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu xanh KP11 và MN93 [22]

Cây đậu xanh vốn là loại cây trồng chịu hạn kém do đó việc nghiên cứu

về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen chịu hạn của cây đậu xanh cũng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo

ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt

Liu K.H và cs (2003) đã phân lập và xác định trình tự gen LTP ở đậu xanh có liên quan đên tính chịu hạn, đặt tên Vrltpl và Vrltpl2 [39]

Kim Y.J và cs (2003) đã phân lập và xác định trình tự gen PLC3 hay Chen Y J và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh là VrHsc70 – 1, VrHsc70 – 2, VrHsc70 – 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chịu khô hạn [32]

Malgorzata G và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hóa cystatin ở đậu xanh nhằm nghiên cứu, chọn tạo giống đậu xanh chóng chịu tốt [40]

Sonia và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế

enzym α-amylase vào đậu xanh nhờ vi khuẩn A tumefaciens [50]

1.1.2.2 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật cũng như việc khai thác được những ưu điểm của cây đậu xanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh, trong Thái Lan, Ấn Độ, Philipin, Srilanca, Pakistan, Trung Quốc,…được coi là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh Tại trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á đóng tại Đài Loan có một bộ sưu tập giống đậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng từ rất lâu và ở nhiều địa phương trong cả nước Trong những năm trước, đậu xanh chỉ được xem như một loại cây trồng phụ, trồng xen với các loại cây khác nhằm tận dụng đất thừa và không được quan tâm đúng mức nên năng suất đậu xanh thấp Ở nước ta, có thể phân chia các vùng trồng đậu xanh như sau:

Vùng núi phía Bắc tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình, Bắc Kạn, Tuyên Quang Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất thấp

Vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ gồm các tỉnh Hà Nội, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng,

Hà Nam, Ninh Bình, Thái Bình Và Thanh Hóa Do xu hướng thâm canh tăng

vụ vì có hệ thống tưới tiêu và đầu tư khá hoàn chỉnh nên năng suất vùng này cao Việc trồng thí đểm và tiếp nhận mô hình giống đậu xanh cải tiến khả thi hơn Đây là điều kiện cơ bản trong phát triển sản xuất

Vùng duyên hải Trung Bộ Và Tây Nguyên Đây là vùng có diện tích và sản lượng đậu xanh lớn do khí hậu thuận lợi để trồng đậu xanh quanh năm Tuy nhiên, hàng năm tại thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng

Vùng Đông Nam bộ Đây là vùng sản xuất đậu xanh có quy mô lớn chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nước Tuy nhiên, năng suất trung bình của vùng này còn thấp do không có thâm canh và việc sử dụng giống đậu xanh năng suất thấp, khả năng chống chịu kém [5]

Hiện nay, do nhu cầu sử dụng đậu xanh ngày càng cao, do đó diện tích trồng đậu xanh có xu hướng tăng, chất lượng giống cũng như phương pháp canh tác cũng đã được quan tâm nhiều hơn

Cùng với sự biến đổi khí hậu toàn cầu là sự nóng lên của trái đất và hạn hán đang là mối đe dọa rất lớn cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và nền nông nghiệp của Việt Nam nói riêng Vì vậy, bên cạnh sự nỗ lực cải thiện khí hậu toàn cầu nhằm bảo vệ môi trường thì việc nghiên cứu chọn tạo các giống mới có năng suất cao, chống chịu được với các điều kiện bất lợi của môi trường ngoại cảnh là xu hướng của thời đại

1.2.1 Hạn hán và tác động của hạn hán đối với cây trồng

Hạn hán là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, từ đó ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng cây trồng

Hạn hán làm cho hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi, quá trình trao đổi chất bị đảo lộn, hoạt động sinh lý bị kìm hãm, quá trình sinh trưởng

và phát triển bị ức chế [12] Khi hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi

:

Thay đổi các tính chất lý hóa của chất nguyên sinh, làm tăng độ nhớt của chất nguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng thủy hóa và tính đàn hồi của keo nguyên sinh

Thay đổi đặc tính hóa keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi cho các hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở các hoạt động sống

Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển sang hướng phân giải khi thiếu nước Quá trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và acid nucleic, kết quả là giải phóng và giải phóng NH3 gây độc cho cây và có thể làm cây chết

c chế hoạt động quang hợp Do khí khổng đóng nên thiếu CO2, lục lạp thể bị phân hủy, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và khô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp

ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn

Thiếu nước ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu quả sử dụng của năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt

là chính

Hạn làm mất cân bằng nước trong cây: lượng nước thoát ra lớn hơn lượng nước hấp thu vào cây làm cho cây bị héo Dòng vận chuyển vật chất trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chất khoáng giảm do tốc độ dòng hút chất khoáng giảm Thiếu nước kìm hãm tốc độ vận chuyển chất đồng hóa về các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tượng “chảy ngược dòng‟‟ các chất dự trữ về các cơ quan dinh dưỡng Kết quả làm giảm năng suấ của cây trồng Quá trình sinh trưởng và phát triển bị kìm hãm

Ức chế sinh trưởng: thiếu nước thì đỉnh sinh trưởng không tiến hành phân chia được, quá trình dãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trưởng chậm nên nước được xem là yếu tố nhạy cảm trong sự sinh trưởng của tế bào

Ức chế ra hoa, kết quả: thiếu nước ảnh hưởng đến quá trình phân hóa hoa và đặc biệt là quá trình thụ tinh Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ống phấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép dẫn đến giảm năng suất cấy trồng [23]

Thực vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi là tính chống chịu Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, sương,…Khi các nhân tố này vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, dẫn đến năng suất giảm Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nước, giảm quang hợp tăng tích lũy ABA, prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điều

kiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh

Một trong những xu hướng để thực vật chống lại hạn là dựa vào khả năng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng như giảm kích thước tế bào Trên phương diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biến đổi nhằm chống lại hạn hán như giảm phức hợp CO2, giảm tổng hợp protein

và các acid nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lượng prolin, tăng nồng độ các chất hòa tan Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ không để t nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những

sự biến đ i về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên sâu, giảm diện tích lá…[22]

Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của thực vật nói chung và của đậu xanh nói riêng rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý hóa sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ: khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC…) [12]

Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khỏe, to thì có khả năng hút

nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy được nhiều nước

Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng Các giống đậu xanh địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác

Khả năng điều chỉnh áp suất thảm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị mất nước do hạn, nóng, lạnh… Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất Các chất

và gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+ ; các amino acid như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol và các chất khác như glycine betain, β- alanin betain Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+

[22]

Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậc cao ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzym 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase [42] ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tế bào thực vật như: sự phát triển củ hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trưởng phát triển và đáp ứng với stress của môi trường Đối với stress hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích nghi với điều kiện khô hạn Về cơ chế tác động người ta cho rằng ABA làm biến đổi điện thế hóa qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+ [37]

Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xẩy ra, các protein bị biến tính và bị tổn thương Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biến tính Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi là cystatin [40]

Các gen phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào đoạn DNA điều khiển (cis acting element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đã được quan tâm nghiên cứu như: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn có trật tự cis acting element riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã

Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đến là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein – HSP), môi giới phân tử (Molecular chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C (PLC), protein vận chuyển lipid (LTP)

HSP được tổng hợp trong qua trình sinh trưởng, các giai đoạn biệt hóa các mô, thời kỳ sinh sản, đặc biệt được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, muối cao Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress Dựa vào khối lượng phân tử người ta chia HSP thực vật thành 6 nhóm khác nhau: 8.5, 20, 60, 70, 90, 11kDa Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (MGPT), (HSP70), (HSP60) nhưng cũng có những HSP không phải là môi giới phân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin)

Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các điều kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập Chức năng chính của MGPT là tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới được tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự hủy hoại biến tính [12] MGPT có 5 họ chính là HSP70 (Dank), HSP 60 (Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi

giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70 HSP70 đã được phân lập ở đậu xanh [32]

Protein LEA cũng được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu nước [34], [44], [48] Protein LEA được phân chia làm 5 nhóm chính trên cơ

sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11 (dehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5D29 [33] Protein LEA thực hiện chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu Nó không những chỉ được phát hiện trong hạt

mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu nước, do mặn, và

do lạnh Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của

nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự mất nước [47] Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi

Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi Canxi hòa tan được xem như chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có phản ứng bảo vệ Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt quá trình stress hạn và muối đã được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [48] Gen LTP liên quan đến quá trình sinh tổng hợp biểu bì Khi bị stress hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài Ở đậu xanh, gen LTP cũng đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen quốc tế [51]

1.3 GEN LTP

Gen LTP thuộc họ gen pathogensis relate, có khả năng tổng hợp ra

protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng Các nghiên cứu đã cho thấy, LTP có khả năng tạo phức với một số axit béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào LTP được gắn tại một vị

trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một receptor vận chuyển axit béo qua màng tế bào LTP đã được chiết ra từ protein ở các loài thực vật khác nhau và hàm lượng cao nhất LTP đã được tìm thấy ở lớp biểu bì bên ngoài cũng như xung quanh các gân lá [29] Hiện nay, LTP ở thực

vật được biết có 4 nhóm lớn:

Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hóa protein đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả

Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein đã được cô lập

và biểu hiện trong hạt

Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein được biểu hiện trong mô lá Chúng được tạo ra khi có những ảnh hưởng của môi trường như tình trạng khô hạn và các tác nhân có thể gây bệnh

Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗi polypeptid được cô lập và biểu hiện trong hoa [35], [31]

Ở cây đậu xanh, Liu K.H và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [39] Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì mRNA của Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao sẽ làm tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2 Từ đó đưa ra giả thuyết ràng gen LTP có ảnh hưởng

rõ rệt tới sự phát triển của các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn

Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu, … sẽ điều

khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng

nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh,… Những phân tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cystein làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [39]

LTP cũng đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh

như: Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani,

Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola

Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực

vật như: Arabidopsis thaniana L [34], Paphanus sativus L [46], Zea mays L [43], Capsicum annuum, Vigna radiata L., Triticum L., Daucus carota L.,

Nicotiana tabacum L., Oryza sativa L., Valencia orange, Lycopesium esculentum [39]

1.3.2 Protein vận chuyển Lipid (LTP)

LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chyển lipid qua màng tế bào, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử Dạng thứ nhất có khối lượng phân tử 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khối lượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2) Cả hai dạng đều có một vùng bảo thủ gồm tám amino acid loại cystatin và bốn loại amino acid loại prolin [36]

Protein vận chuyển lipid có khả năng tạo phức với một số axit béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó

có đặc điểm như một receptor vận chuyển lipid qua màng của tế bào Phức hợp LTP – linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [42]

LTP cũng có liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu K.H và cs (2003) nhận thấy rằng hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stress hạn, stress muối hay khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao LTP có khả năng xúc tác tới vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng của tế bào LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc các lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp lại những thay đổi của môi trường [39]

LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật Nghiên cứu trên cây lúa, Blilou I và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh

khi có sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi

nấm tấn công vào khoảng gian bào [29] Carvalho A.O và cs (2006) khi

nghiên cứu trên cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy rằng

LTP là peptide kháng khuẩn tham gia việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [31]

1.4 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A tumefaciens

1.4.1 Vi khuẩn A tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật

Trong tự nhiên chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai

lá mầm một loại khối u gồm các loại tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức Theo cơ chế hình thành người ta phân biệt hai loại khối u chính đó là khối u di truyền và khối u cảm ứng Khối u di truyền thường xuất

hiện ở một vài cặp lai các loài khác chi của thuốc lá Nicotiana hoặc chi rau cải Brasica Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là khối u do loại vi khuẩn đất A tumefaciens gây nên Cơ chế hình thành khối u cảm ứng này

được Braun và Schiperoort nghiên cứu năm 1960 và đã đưa lại những thành tựu quan trọng cho việ kỹ thuật di truyền tế bào thực vật

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, là các loài vi khuẩn đất, thuộc

nhóm Gram (-), yếm khí, khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu chứng bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi Trong đó A tumefaciens và A rhizogenes là hai loài được nghiên cứu nhiều nhất là vi khuẩn gây ra bệnh

khối u (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Người ta đã thành công trong việc cải biến Ti-plasmid bằng cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây phát triển khối u chỉ để lại đoạn gen vir và phần T-DNA tối thiểu mang điểm ghép gen Loại vector này rất có hiệu quả cho việc đưa DNA lạ vào tế bào thực vật không những đối với loại cây hai lá mầm mà ở cả cây một lá mầm mà đại diện là ở lúa

1.4.2 Hệ vector nhị thể

Để chuyển gen vào thực vật thông qua A tumefaciens người ta phải sử

dụng một hệ thống vector chuyển gen Có hai loại vector chuyển gen đó là

vector liên hợp và vector nhị thể Vector nhị thể (binary vector) ra đời đã khắc

phục được tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens của vector liên hợp

Một vector nhị thể bao gồm những thành phần sau: vị trí ghép nối đa điểm,

đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả trong E coli và A Tumefaciens, gen chọn

lọc hoạt động cả ở vi khuẩn và thực vật như gen kháng kháng sinh, gen glucuronidase…, phần có khả năng vận chuyển như riV, oriT, trfA, chỉ cần

β-khi chuyển thông qua A tumefaciens, không cần β-khi chuyển gen trực tiếp,

đoạn T-DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại lai bắt buộc phải có

Ngoài ra, còn có một số thành phần phụ khác trợ khác như gen kích thích vận chuyển T-DNA (transfer stimulator sequence =TSS) Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang

GOI giữa đoạn biên của T-DNA và một plasmid bổ trợ có gen vir đảm nhận chức năng vận chuyển gen ngoại lai vào tế bào thực vật Plasmid bổ trợ được cải tiến từ Ti-plasmid tự nhiên bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật Hệ thống vector nhị thể luôn được cải tiến để nâng cao hiệu suất chuyển

gen thông qua A tumefaciens [17]

1.4.3 Các kỹ thuật di truyền áp dụng để xác định cây chuyển gen

Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiến hành ở hầu khắp các phòng thí nghiệm Có nhiều quy trình chuyển gen đã được xây dựng cho rất nhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai tây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau:

a) Phân lập gen mong muốn từ một sinh vật bất kỳ;

b) Tạo dòng và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; c) Biến nạp vector chuyển gen vào thực vật nhận;

c) Chọn lọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển

Quá trình chọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo ba nội dung sau:

(1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang gen chuyển);

(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện là mRNA và protein;

(3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển

Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhà lưới hoặc đồng ruộng Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá

và xác định đặc điểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính di truyền của cây chuyển gen

1.4.4 Thành tựu chuyển gen ở thực vật

Những giống cây trồng mới tạo ra bằng công nghệ gen thường được gọi tắt là cơ thể sống bị biến đổi di truyền-cây trồng biến đổi gen (GMO-Genetically Modified Organism) Tính đến năm 1999 đã có hơn 2000 dòng cây chuyển gen khác nhau đã được tạo ra ở Mỹ, 250 dòng cây chuyển gen tạo

ra ở châu Âu Các loại cây trồng biến đổi gen phổ biến là: ngô, cà chua, đậu tương, khoai tây, bông… Trong các cây được tạo ra bằng con đường chuyển gen này có 761 giống/dòng cây kháng thuốc diệt cỏ, 252 dòng kháng virus,

676 dòng kháng côn trùng, 106 dòng kháng bệnh, 738 dòng mang tính trạng chất lượng và 199 dòng mang các tính trạng khác

Ngoài việc chuyển được vào cây trồng các gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen đề kháng với một số bệnh do virus, vi khuẩn và nấm gây ra ở cây trồng thì chúng ta cũng đã thành công trong việc chuyển gen chịu lạnh cho các cây lương thực, thực phẩm trồng ở các nước ôn đới, đặc biệt là cho thuốc lá và khoai tây, vốn là những cây ít chịu lạnh Hay việc tạo ra cây trồng có khả năng chịu hạn, chịu mặn, và cây trồng mang kháng nguyên thay thế cho vaccin cổ điển đã đạt được những kết quả rất khả quan

Đi cùng với việc tăng lên về số lượng các giống cây trồng biến đổi gen thì diện tính trồng chúng cũng không ngừng gia tăng Năm 2000, diện tích trồng cây chuyển gen trên thế giới là 44,2 triệu ha, năm 2001 tăng lên là 52,6 triệu ha, chiếm 19% tổng diện tích các cây trồng chính như đậu tương, bông, cải dầu, ngô (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [29] Sau 6 năm, vào năm 2007 diện tích cây trồng chuyển gen đã tăng lên 114,3 triệu ha Các nước có diện tích trồng cây chuyển gen (GMO) lớn nhất là: Mỹ, Achentina, Canada, Brazil, Trung Quốc, Ngoài ra, cây trồng biến đổi gen cũng đã được đưa vào trồng tại

nhiều nước châu Phi như: Ai Cập Zimbabue, Kenya và đang góp phần giảm thiểu sự thiếu hụt lương thực tại các nước này Ở châu Á, ngoài Trung Quốc, thì nhiều nước khác như Indonesia, Thái Lan, Philippine cũng đang tiến hành trồng thử nghiệm nhiều giống cây biến đổi gen

Đã có nhiều giống cây trồng biến đổi gen được thương mại hóa, trong

đó chủ yếu là những giống kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ Việc trồng cây chuyển gen góp phần làm giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng, từ

đó làm giảm độc hại của thuốc bảo vệ thực vật đối với con người, môi trường sinh thái và đa dạng sinh học [26] Mặt khác thì cây trồng biến đổi gen còn cho năng suất cao, tạo ra nguồn lương thực ổn định

Việc tạo ra các giống đậu xanh mang các tính trạng mong muốn: kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu, chịu hạn,… góp phần làm tăng năng suất cây đậu xanh trong nước, đem lại hiệu quả kinh tế cao

Chuyển gen ở thực vật có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp chọn tạo truyền thống Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Nó trở thành một phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen Ngoài ra nó còn mở ra triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng

Các nhà khoa học đã phát triển rất nhiều phương pháp chuyển gen, nhưng những phương pháp mang lại thành công nhất vẫn là phương pháp

chuyển gen thông qua A tumefaciens Đến nay nhờ cải tiến các vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển bằng A tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc

đặc biệt là lúa ngoài ra còn ở các cây ngô, cà chua, đậu tương, khoai tây, bông,

Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với chuyển gen ở thực vật Chuyển gen tạo giống đậu xanh chịu hạn đang hứa hẹn và có triển

vọng giải quyết bài toán giống cho sản xuất đậu xanh Những kết quả này sẽ rất có ý nghĩa không chỉ đối với thực tế sản xuất cây đậu xanh mà còn đối với

sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong điều kiện tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

a Thực vật:

* Hạt của giống đậu xanh địa phương tại Mỹ Đức – Hà Nội (ký hiệu HN2) có đặc điểm: năng suất cao, vỏ hạt màu xanh mỡ, khối lượng 1000 hạt khoảng 57,32 g

* Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L K326 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học

cung cấp

b Chủng vi khuẩn:

- Chủng vi khuẩn E coli One Shot TOP 10, E coli DH5α

- Chủng A tumefaciens CV58C1 mang plasmid pGV2260

c Các vector:

Bảng 2.1 Các vector sử dụng trong thí nghiệm

- Các enzyme giới hạn: NotI, NcoI, BamHI, HindIII, của hãng New

England Biolabs

- Enzyme nối T4 ligase do hãng Fermentas cung cấp

2.1.2 Hóa chất, thiết bị

a Hóa chất

- Bộ kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ)

- Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction)

- Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN)

- Kit tinh sạch DNA -AccuPrep®

- Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô như môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, YMP); môi trường nuôi cấy thực vật (WPM, MS, GM, RM) Thành phần của các loai môi trường được trình bày trong phụ lục 1 Các loại kháng sinh như: Kanamycin, Cefotaxim, Carbecillin, Spectinomycine… đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng như: New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ)

bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chuyển vector pCB301-LTP vào