Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ smv soybean mosaic virus gây bệnh khảm lá ở đậu tương

Theo kết quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật trên cây trồng, đã xác định 20 loài bệnh hại, trong đó có các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu tương và hiệ

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn đã được sự đồng ý của của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Ly

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thị Mai Thu, cảm ơn Thạc sĩ Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA và Ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các Thầy, Cô trong khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Nguyễn Thị Hương Ly

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Cặp base

cs Cộng sự

đtg Đồng tác giả

DNA Deoxiribonucleic acid

RNA Ribonucleic Acid

kb Kilo base

PCR Polymerase Chain Reaction

TAE Tris acetat EDTA

CP Coat Protein

DEPC Diethyl pyrocarbonate

RNAi RNA interference

RNase Ribonuclease

X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung)

IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase

SMV Soybean Mosaic Virus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013 8 Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR nhân gen CP 24 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CP 25

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen CP vào vector tách

dòng pBT

27

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 29 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV 17 Hình 1.2 Sơ đồ protein vỏ của SMV 18 Hình 1.3 Vùng Poty_coat 18 Hình 2.1 Cấu trúc vecto pBT 26 Hình 3.1 Các mẫu lá đậu tương nghi nhiễm bệnh thu thập ở các

tỉnh Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Nội

31

Hình 3.2 Kết quả xác định đoạn tương đồng của 96 trình tự gen

CP khi so sánh bằng BLAST trong NCBI

La và trình tự gen CP của dòng virus SMV được đăng

ký GenBank có mã số X63771

41

Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân

lập từ virus SMV dòng SL và trình tự amino acid của

42

vùng Poty-coat của protein có mã số CAA45307 trên

GenBank Hình 3.9 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen CP phân

lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina

43

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự gen CP phân

lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina

44

Hình 3.11 Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid

suy diễn từ gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada,

Ucraina

45

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có

giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao Một đặc tính quan trọng của cây đậu tương là có nốt sần ở rễ có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tương góp phần cải tạo đất

Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở mức thấp là do nhiều giống hiện trồng có tính ổn định chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các miền, các vùng Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang trồng là rất thấp và chưa có những dự báo về thời vụ gieo trồng thích hợp cho từng vùng và chưa xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất cho từng vùng sinh thái

Theo kết quả điều tra về bệnh của Cục Bảo vệ thực vật trên cây trồng, đã xác định 20 loài bệnh hại, trong đó có các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho năng suất đậu tương và hiện nay vẫn chưa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ bệnh do virus Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tương (Bean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá và một

số bệnh virus trên lá khác Vì vậy, nghiên cứu tạo cây đậu tương kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương sạch bệnh là rất cần thiết

Bệnh khảm lá đậu tương do virus SMV gây nên Virus lan truyền do rệp, bọ trĩ làm môi giới Sự lan truyền cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu, bệnh còn truyền qua hạt Hiện nay các biện pháp phòng bệnh phổ biến là: Chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống; vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng; diệt trừ

côn trùng truyền bệnh Các biện pháp truyền thống thường phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả không cao và kém bền vững Biện pháp hiệu quả nhất để phòng virus là sử dụng giống kháng virus, tuy nhiên, các nguồn kháng bệnh tự nhiên đối với các loại virus này không nhiều Do vậy, phương pháp chuyển gen để tạo cây kháng virus đặc biệt tỏ ra hữu ích đối với các loài thực vật mà trong tự nhiên khan hiếm nguồn kháng bệnh Từ những lí do trên chúng tôi tiến hành

đề tài: “Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ SMV (Soybean mosaic

virus) gây bệnh khảm lá ở đậu tương”

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Phân lập và xác định được trình tự đoạn gen CP của virus SMV nhằm tạo nguyên liệu và thu thập thông tin để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi phục vụ nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus SMV gây bệnh khảm lá

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1 Thu mẫu lá nghi nhiễm virus SMV từ các vùng trồng đậu tương ở một số địa phương thuộc phía Bắc Việt Nam Lưu giữ và bảo quản mẫu theo quy

phạm

3.2.Tách chiết RNA của virus SMV và tạo cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược Nhân bản đoạn gen CP của virus SMV

3.3 Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP của virus SMV Phân tích và

so sánh với trình tự đã công bố trên GenBank

3.4 Phân tích sự đa dạng của một số dòng virus SMV dựa trên trình tự đoạn gen CP và trình tự amino acid suy diễn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng được biết đến từ rất sớm Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương

có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây lương thực ở Trung Quốc và thế kỉ XVII trước công nguyên Cây đậu tương được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỉ thứ XVIII, du nhập vào nhiều nước châu Á khác như : Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ , Việt Nam… vài thế kỉ sau đó Cây đậu tương được trồng ở châu Âu vào thế kỉ XVII và ở Hoa Kì vào thế kỉ XVIII [1]

Về phân loại học, cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là

Glycine max (L.) Merrill (2n=40) thuộc họ đậu (Lengminoceae), họ phụ cánh

bướm (Papilionoideae) Về nguồn gốc và phân loại của cây đậu tương đã

được công bố bởi công trình của Hymowitz và Newell (1981) Đối với cây đậu tương trồng được phân biệt theo đặc điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trưởng, thời vụ Hiện nay, đậu tương được trồng ở Việt Nam có nguồn gốc là các giống địa phương và các giống nhập nội

Đậu tương là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ cái và các

rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả

năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu

Đậu tương là cây 2 lá mầm, thân thảo Thân có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi già chuyển mà nâu nhạt Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ màu trắng, thân màu tím hoa sẽ màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 – 1m tùy theo giống Thân cây đậu tương hình tròn mang nhiều đốt, thường đứng có khi bò hay nửa bò Mỗi thân có từ 8 – 14 đốt, các cành mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang 2 lá mầm, đốt thứ 2 mang 2 lá đơn đối nhau, từ đốt thứ 3 trở lên mỗi đốt mang 1 lá kép Mỗi lá kép có 3 lá chét Phiến lá có hình dạng khác nhau : trứng, tròn, dài, lưỡi mác… Hình dạng của

lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt nhưng năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng đồng thời cũng chịu hạn kém hơn

Đậu tương là cây tự thụ phấn Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa mọc thành chùm, mỗi chùm có 3-5 hoa Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5-1%, hoa có màu tím hay trắng Thời kì cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tùy thuộc vào giống và thời vụ gieo bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ

Quả đậu tương là loại quả giáp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ,

vỏ khi quả chín thường có màu vàng hay xám đen Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài 2-7cm Mỗi quả thường có 2-3 hạt Hạt đậu tương có hình tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen…đa số hạt màu vàng Những giống hạt vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng 1000 hạt thường dao động từ 100-200g Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần,

đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt

sần có thể dài 1cm, đường kính 5-6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0-20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30-60kg/ha

Dựa vào thời gian sinh trưởng đậu tương được chia thành các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90-100 ngày; chín trung bình: thu hoạch sau 100-110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110-120 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130-140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140-150 ngày [1] [2]

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao khó có thể tìm thấy cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương Sản phẩm của nó làm thức ăn cho người và gia súc, làm nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu, ngoài ra cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất

Về mặt thực phẩm: Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao,

protein chiếm khoảng 30 -45 %, thậm chí là 52-56% , 19-25% lipid và 20% gluxit Đây là loại hạt duy nhất mà giá trị được tính đồng thời cả protein và lipid Trong các protein của thực vật, protein của đậu tương là loại có phẩm chất tốt nhất bởi nó có đầy đủ và cân đối các loại amino acid cần thiết Protein của đậu tương là loại dễ tiêu hóa và không có thành phần tạo cholesterol Lipid của đậu tương chứa tỷ lệ lớn các acid béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137) có tác dụng phòng chống bướu cổ cho người, đặc biệt là đối với vùng trung du và miền núi Hạt đậu tương còn chứa nhiều loại muối khoáng và có khả năng cung cấp năng lượng khá lớn (4710

kcal/kg), cho nên người ta đã chế biến hạt đậu tương thành hơn 600 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng khác nhau Mặt khác, sử dụng protein và lipid của đậu tương còn có tác dụng phòng chữa bệnh đái tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não…

Về mặt công nghiệp : Những sản phẩm của đậu tương là nguyên liệu

cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp ép dầu, công nghiệp sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp nguyên liệu từ đậu tương Về xuất khẩu, đậu tương là mặt hàng nông sản có giá trị ổn định trên thị trường thế giới Lượng hạt đậu tương xuất khẩu hàng năm là 24-26 triệu tấn hạt/năm và 2-4 triệu tấn dầu/năm Từ sau đại chiến thế giới lần II, đậu tương giữ vị trí hàng đầu trên thị trường nông sản thế giới

Trong chăn nuôi : Đậu tương là nguồn thức ăn rất cần thiết cho gia

súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn Cùng với thân

và lá, các chất hữu cơ này làm thay đổi tính chất vật lý, hóa và làm tăng độ phì nhiêu cho đất Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kì sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hóa học và thuốc trừ sâu Cây đậu tương có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm, có thể xen canh, gối vụ… rất thuận lợi cho việc phát triển đậu tương để khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới [1]

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở thế giới và Việt Nam

Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương với 3 mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất Cả nước hình thành 6 vùng trồng đậu tương : Nam Bộ, miền núi Bắc Bộ, đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long, đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên Tuy nhiên, sản lượng đậu tương ở trong nước vẫn thấp

và phải nhập khẩu từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức

ăn cho gia súc

Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nhiều địa phương hiện nay với sản lượng trung bình từ 2001-

2009 là 239,1 nghìn tấn Theo thống kê năm 2009 cho thấy cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [1], [61] Trong khu vực ASEAN, năng suất đậu tương của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước trồng đậu tương là Lào, Campuchia, Myanmar, Philipines, Thái Lan và Việt Nam Khi so sánh số liệu trên với năng suất của các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa Kì thì khá thấp [61] Do không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước nên Việt Nam vẫn phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc gia khác đặc biệt là Hoa Kì

Bên cạnh những yếu tố như kĩ thuật canh tác chưa cao, ảnh hưởng của sâu bệnh thì yếu tố hạn hán hay không chủ động được nguồn nước trong quá trình canh tác cây đậu tương là một trong những nguyên nhân chính làm cho năng suất, sản lượng đậu tương của nước ta rất thấp Tình trạng hạn hán trầm trọng ảnh hưởng không nhỏ đến tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả ở những nước sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới như Argentina Thống kê cho thấy ở vụ mùa năm 2009 sản lượng đậu tương ở Argentina giảm so với cùng thời điểm của năm 2008 là 11,7 triệu tấn

Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [61] Đậu tương

là cây trồng thuộc nhóm cây có khả năng chịu hạn kém Chính vì vậy, nghiên

cứu tạo giống đậu tương có khả năng sống trong điều kiện bất lợi về nước ta đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các nhà chọn giống [1]

Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng như ảnh hưởng của bệnh hại cây đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo

1.2 BỆNH VIRUS HẠI CÂY TRỒNG

1.2.1 Tình hình bệnh virus hại cây trồng

Cây trồng rất dễ bị tổn thương do tác hại của sâu bệnh, cỏ dại và đặc biệt là các loại bệnh do virus gây nên Vì thế, để đạt năng suất và chất lượng cây trồng tốt chúng ta cần có cách phòng trừ hiệu quả những loại dịch bệnh này Theo phương pháp truyền thống chúng ta phòng trừ bệnh cho cây trồng

bằng cách phun trực tiếp hóa chất lên thân, lá cây Tuy nhiên, biện pháp này không mang tính lâu dài và triệt để, đặc biệt đối với các bệnh do virus gây nên, mặt khác, nó còn gây hại cho vi sinh vật có ích Cho đến nay, chúng ta đã biết đến rất nhiều loại bệnh ở cây trồng do virus gây nên Virus hại thực vật được phát hiện cuối thế kỉ XIX do nhiều nhà bác học như Mayer (1886), Ivanopski (1892), Baijerinck (1898), Loeffler và Frosh (1898) [5] Đến đầu thế kỉ XX, các virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm dưa chuột, virus khảm thuốc lá, virus khảm khoai tây, virus xoăn lá khoai tây, xoăn lá cà chua… Nhưng mãi tới năm 1939, khi Pfankuch và Ryska sử dụng kĩ thuật hiển vi điện tử quan sát thấy virus khảm thuốc lá thì việc nghiên cứu và phát triển nhóm nguyên nhân gây bệnh này mới diễn ra nhanh chóng và thu được nhiều thành tựu to lớn [4], [5]

Bệnh do virus không chỉ làm giảm năng suất cây trồng mà còn là một trong những nguyên nhân gây thoái hóa giống cây trồng [5] Virus có thể gây thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong vụ trồng đối với cây ngắn ngày, như virus gây bệnh lúa vàng lụi, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh virus khoai tây, virus hại táo, lê, đào, nho… Bệnh virus hại lúa và sắn đã từng hủy diệt hàng chục vạn ha ở châu Á và châu Phi chỉ trong thời gian chưa tới 30 ngày Ở Việt Nam, trong thập niên 60, bệnh vàng lá cam quýt đã hủy diệt nhiều vườn cam

ở hầu hết các tỉnh trong cả nước; cây bông, hồ tiêu, ca cao đều bị bệnh vàng lá gây hại, các loại cây như thuốc lá, khoai tây, cà chua, các cây họ đậu, các cây

ăn quả đều bị nhiễm bệnh bệnh do virus gây nên [5]

Không chỉ gây ra hiện tượng chết ngay hay từ từ ở cây trồng, virus còn ảnh hưởng xấu đến phẩm chất cũng như năng suất của các sản phẩm do cây trồng mang lại Virus còn nguy hiểm ở chỗ nó kí sinh bắt buộc trong tế bào cây kí chủ Vì vậy, khi tế bào non phát triển mạnh thì virus cũng phát triển rất

mạnh, tạo ra những hiệu ứng rất điển hình trên cây non hoặc những bộ phận non của cây

Ngoài cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả… virus còn gây hại đối với các loại cây thuốc, cây cảnh… Có thể nói, virus là một loại dịch nguy hiểm phá hoại hầu hết các loại cây trồng Virus gây bệnh không những làm giảm năng suất cây trồng mà còn làm giảm phẩm chất của sản phẩm Vì thế, bệnh do virus gây ra là loại bệnh gây hại toàn diện và rất nguy hiểm cho ngành trồng trọt ở nước ta cũng như trên thế giới [5]

1.2.2 Bệnh do virus ở cây đậu tương

Bệnh trên cây đậu tương xuất hiện là do nhiều nguyên nhân như : bệnh

do sâu, do vi khuẩn hoặc virus… trong đó bệnh do virus thường gây thiệt hại nặng nhất Bệnh khảm lá đậu tương do virus SMV gây nên là một trong những bệnh quan trọng nhất ở nhiều nơi trên thế giới Mức độ của bệnh tùy thuộc vào giống và khí hậu Ở nhiệt độ cao, bệnh không biểu hiện triệu chứng bệnh ra ngoài Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Mỹ vào những năm đầu của thập niên 90 Bệnh hiện diện ở khắp các vùng trồng đậu nành trên thế giới Khi bệnh xuất hiện sớm sẽ dẫn đến thất thu nặng

Ở đồng bằng sông Cửu Long, từ vụ đông xuân 1979-1980, bệnh do virus tỏ ra khá phổ biến Bệnh do virus có thể xuất hiện khá sớm (vào 4 tuần sau khi gieo) và gây thiệt hại nặng ở những ruộng không được trị bệnh kịp thời

Lá bị mất màu, loang lổ giống như tấm khảm Lá nhỏ lại, phát triển không đều, bìa lá cong xuống làm lá biến dạng Phiến lá bị xếp nếp nhăn nhúm, có màu loang lổ xanh nhạt và xanh đậm và thường dày hơn lá bình thường Dọc gân lá, mô tế bào nổi rộp lên những mụn màu xanh đậm Cây lùn

do các lóng thân phát triển kém Quả và hạt phát triển chậm lại, nhất là các

quả ở phần trên của cây Qủa chín chậm, hạt nhỏ, vỏ hạt bị đổi thành màu nâu nhạt và đậm không đều Triệu chứng bệnh được biểu hiện rõ ở 18,50C Trên 29,50C triệu chứng bệnh sẽ ở dạng tiềm ẩn

1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus

Cây trồng có tính kháng khác nhau với các loại virus khác nhau và có thể là vật chủ hoặc không là vật chủ của những loại virus xác định Virus có thể xâm nhập vào cây chủ, lan truyền, gây bệnh làm cây chủ giảm hay mất khả năng sinh trưởng, phát triển và sinh sản Trong quá trình tiến hóa, virus dần hình thành những cơ chế tự bảo vệ khỏi tính kháng tự nhiên của vật chủ,

dễ dàng xâm nhập và gây bệnh [3]

Thực vật có thể kháng các chủng virus gây bệnh nếu trước đó lây nhiễm chúng với các virus cùng loại Với cây chuyển gen, chúng cũng tạo ra tính kháng tích cực và hiệu quả đối với virus Có lẽ protein vỏ của virus đóng vai trò quyết định tính kháng của virus, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA được biểu hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hóa protein vỏ ở mức độ cao) thì tính kháng với virus biểu hiện Có nhiều cách giải thích về tính kháng của cây chuyển gen Theo Baulcombe (1996), tính kháng của cây chuyển gen có được là nhờ yếu tố gây bệnh PDR (pathogen – derived resistance) Cơ chế gây bệnh của PDR có thể thông qua RNA sợi đôi cũng như sợi đơn ngắn Năm 1998, Fire và Mello đã đưa ra thuật ngữ “RNA interference” (RNAi) để giải thích tính kháng của cây chuyển gen đối với virus thông qua RNA sợi đôi RNAi là một quá trình bất hoạt gen đòi hỏi sự tham gia chủ động của bộ máy nội bào Đầu tiên, enzyme ribonuclease Dicer gắn vào cắt các phân tử RNA sợi đôi thành những đoạn sợi đôi ngắn (21-23 cặp bazơ) với 2 bazơ thymin ở cuối đầu dính sợi đơn của mỗi đoạn,

các đoạn này được gọi là các RNA ức chế nhỏ Dưới tác động của enzyme helicase, các RNA này bị phân tách và bị gắn kết vào một phức hợp đa protein Sau đó, các RNA ức chế nhỏ gắn với các mRNA đích, làm giảm lượng khuôn mRNA cho quá trình dịch mã dẫn tới ức chế sự biểu hiện của gen tương ứng [15], [16] Tính kháng của cây chuyển gen đối với virus thông qua RNA sợi đơn cũng được dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa RNA của virus với RNA do gen chuyển sao mã ra Gen của virus chuyển vào cây sẽ sử dụng

bộ máy nội bào của cây chuyển gen để sao mã ra RNA, các RNA này sẽ bắt cặp bổ sung với RNA genome của virus khi virus xâp nhập vào tế bào cây chủ

và tạo ra đoạn RNA sợi đôi Ngay lập tức RNA sợi đôi này sẽ bị các RNase nhận biết là các biến dị và sẽ thủy phân chúng Như thế, virus không thể thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào

RNAi là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân chuẩn và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hoà sự phát triển, tổ chức lại nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus [20],[28]

Gần đây, RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [16] Nguyễn Thị Hải Yến (2012) đã sử dụng kỹ thuật RNAi thành công tạo cây cà chua chuyển gen kháng virus khảm vàng lá cà chua [14]

Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) Thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) Biến nạp vector chuyển mang cấu trúc

RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt

các mRNA của virus gây bệnh, (3) Sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen

Để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi trong kỹ thuật chuyển gen kháng virus, công việc đầu tiên là việc thu thập và kiểm tra mẫu cây nhiễm virus từ các vùng sinh thái khác nhau Kiểm tra sự có mặt của virus từ các mẫu thu được bằng phương pháp sinh học phân tử Bước tiếp theo tiến hành phân lập gen hoặc một số vùng gen khác trong hệ gen của virus trên cơ sở thu thập thông tin về genome của virus, đặc biệt những thông tin của gen CP và một số gen trong hệ gen của virus, thiết kế các cặp mồi để nhân gen CP và

một số gen khác, tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen đích Trên

cơ sở phân tích so sánh trình tự gen của các dòng virus, chọn vùng bảo thủ (khoảng 400bp) để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi để chuyển vào đối tương thực vật Phân tích cây chuyển gen và đánh giá tính kháng của các dòng cây chuyển gen, tuyển chọn dòng cây chuyển gen kháng bệnh do virus gây bệnh [14]

Ngoài ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus bằng kỹ thuật RNAi,

kỹ thuật RNAi có thể giúp cho việc nghiên cứu chức năng của gen trong hệ gen thực vật Điều này đã mở ra triển vọng sử dụng các thư viện siRNA để nhận biết và phân tích sự biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan đến các bệnh của thực vật Thư viện các nhân tố RNAi có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu để phân tích chức năng hệ gen cây trồng Xây dựng thư viện RNAi của tất cả các bệnh virus trên một đối tượng cây trồng cụ thể sẽ góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus [53]

Ứng dụng công nghệ RNAi trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus

là một lĩnh vực rất mới mẻ và được cả thế giới quan tâm Việc tạo cây chuyển gen kháng virus đã mở ra một triển vọng mới trong tạo thực phẩm sạch và an toàn cho môi trường Đã có nhiều công trình trên thế giới tập trung nghiên cứu và thu được các kết quả khả quan

Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen

mã hoá protein của virus (CP, Rep ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế Nhiều giống cây trồng kháng virus đã tạo ra bằng kỹ thuật này đó là kháng PVY(Potato Virus Y) [42] [49] [56], BYDV-

PAV (barley yellow dwarf virus-PAV) [54], CMV (Cucumber mosaic virus) [34], PPV (plum pox potyvirus) [43], TMV (Tobacco Mosaic Virus) [33], CGMMV (Cucumber green mottle mosaic virus) [44]… Trong những nghiên

cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây Người ta

đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự câm gen là cao nhất [49], [57] Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen

kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%

[49] Cũng năm 2007, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo

ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này Nhìn chung hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus hoặc làm giảm nhẹ các triệu chứng bệnh [49]

Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus mới chỉ đang được bắt đầu Từ việc tổng kết các công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong thực tiễn, Đỗ Năng Vịnh (2007) đã khẳng định RNAi là một kỹ thuật mạnh mẽ và có triển vọng to lớn trong việc ứng dụng tạo cây chuyển gen kháng virus và là kỹ thuật có thể chủ động tạo ra các giống cây trồng kháng các bệnh do virus gây ra ở thực vật [8] Sự kết hợp kỹ thuật chuyển gen

và RNAi sẽ là biện pháp công nghệ sinh học có hiệu quả trong việc cải thiện

và tăng cường khả năng kháng virus ở cây trồng

Việc phân lập các gen thành phần của virus làm vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen để chuyển vào thực vật tạo cây chuyển gen kháng virus tại Việt Nam là rất cần thiết Chu Hoàng Hà và đtg (2004) [6] đã phân tích tính

đa dạng trên cơ sở so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP) của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam Tiếp đến là nghiên cứu sự đa dạng trong trình tự gen CP của virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua [13], của virus gây bệnh đốm của cây đu đủ [6], của virus Y ở cây khoai tây [9] Ứng dụng kỹ thuật RNAi để tạo cây trồng kháng virus đã và đang được tiến hành nghiên cứu ở một số phòng thí nghiệm và thu được thành công nhất định Nhóm nghiên cứu do Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà thuộc Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là một trong những đơn vị đi đầu và thành công trong việc ứng dụng công nghệ RNAi để tạo cây trồng kháng virus và một số cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật này [6], [7] Thành công đầu tiên có

thể kể đến là thuốc lá chuyển gen kháng CMV (Cucumber mosaic virus) và TMV (Tobacco mosaic virus) Những dòng thuốc lá chuyển đoạn gen ghép nối mang đồng thời gen CP của TMV và CMV đã cho thấy hiệu quả kháng

lên tới 60% đối với hai chủng virus này Các cây biểu hiện khả năng kháng cao sau 3 lần lây nhiễm đồng thời 2 chủng virus đã cho thấy khả năng kháng bệnh được duy trì cho thế hệ [11] Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đã thiết kế thành công 6 cấu trúc RNAi, tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 ở thế hệ T0 mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng virus CMV là 70,9% (100/141), PVY

là 84,1% (58/69), TMV là 74,5% (70/94) và đồng thời hai loại virus TMV và CMV là 70,8% (34/48) [11] Tiếp đến là đu đủ kháng bệnh đốm vòng do virus

PRSV (Papaya ringspot virus) Kết quả ban đầu cho thấy, trong số 45 dòng

đu đủ chuyển gen được chọn tạo, có 34/45 dòng có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng Dù trồng trong môi trường nhiễm bệnh nhưng các cây đu

đủ chuyển gen vẫn phát triển mạnh, cho quả đều, đẹp, năng suất cao (Chu Hoàng Hà, 2011) [7], tạo được dòng cà chua kháng virus TYLCV bằng kỹ thuật RNAi [10], [12]

Tuy nhiên, các nhóm tác giả cũng cho thấy, tỷ lệ kháng bệnh của các dòng cây chuyển gen phụ thuộc nhiều vào đoạn gen được lựa chọn để thiết kế vector chuyển gen Cấu trúc vector chứa nhiều gen quan trọng của TYLCV có khả năng kháng cao hơn cấu trúc vector chứa đơn gen virus [10],[12],[14] Điều này phụ thuộc vào một số gen virus có khả năng ức chế con đường hoạt động của RNAi Ngoài ra còn một số loại cây trồng khác cũng đang được tiến hành nghiên cứu chuyển gen để tạo dòng cây kháng bệnh virus như cam, quýt, dưa hấu…

1.3 VIRUS SMV VÀ HỆ GEN CỦA SMV

Soybean Mosaic Virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, họ Potyviridae, là

một trong những loại virus gây bệnh quan trọng nhất ở cây đậu tương

(Glycine max [L.] Merrill.) và bệnh khảm lá đậu tương do SMV gây ra gặp ở

hầu hết các quốc gia trên thế giới SMV có thể gây ra thiệt hại đáng kể về sản lượng, làm suy giảm năng suất đậu tương tới 40% khi các cây bị nhiễm hoặc trước khi ra hoa và 91% hạt đậu có vết lốm đốm; ở một số trường hợp có thể gây thiệt hại lên tới 94% tổng sản lượng Sau khi nhiễm SMV, đậu tương sẽ

giảm năng suất và chất lượng hạt Họ Potyviridae có số lượng lớn nhất trong

số các loại virus thực vật được biết đến

Các hạt SMV dài khoảng 750 nm, có đường kính là 11-15 nm, và bao gồm protein vỏ bố trí đối xứng xoắn ốc xung quanh sợi RNA có khoảng gần

10.000 bp Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa cho 3066 amino acid, gồm

10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genome-linked protein (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) (Hình 1.1)

(HC-Hình 1.1 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV

Won-Seok Lim và đtg (2003) đã phân tích trình tự nucleotide hoàn chỉnh của RNA genome của SMV chủng G5 (SMV-G5) và G7H (SMV-G7H)

và so sánh với trình tự của các chủng SMV khác Mỗi RNA virus SMV dài

9588 nucleotide (chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 protein chức năng So sánh trình tự amino acid của 2 chủng này với các chủng SMV khác cho thấy có tỉ lệ lớn trình tự amino acid tương đồng Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99% Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các chủng này có thể cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tương, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho đậu tương

Gen CP là gen đặc trưng nhất trong họ potyvirus Protein vỏ (CP) do gen CP mã hóa được chia thành ba phần: đầu N, vùng cốt lõi và đầu C Gen

CP dài 807 bp, trong đó vùng mã hóa dài 804 bp [62] Protein của gen CP bao gồm 267 amino acid, trong đó vùng Poty-coat bắt đầu từ amino acid thứ 33 đến amino acid 264 đƣợc thể hiện ở hình 1.2 và hình 1.3 [62]

Hình 1.2 Sơ đồ protein CP của SMV

Hình 1.3 Vùng Poty_coat của CP

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu lá đậu tương nghi bị nhiễm bệnh khảm được thu từ một số vùng thuộc miền Bắc nước ta, đó là Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Nội Các mẫu lá được kí hiệu như sau: Thái Nguyên (TN), Sơn La (SL), Tuyên Quang (TQ), Hà Nội (HN)

Mẫu lá thu ở mỗi vùng của các tỉnh được kí hiệu như sau:

Chủng vi khuẩn E.coli DH5α do phòng Công nghệ tế bào thực vật của

viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

- Thang DNA 1kb (GeneShun Biotech)

- Kit tách RNA (GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit) (Thermo Scientific)

- Kit tổng hợp cDNA và RT-PCR (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)

- Bộ kit tách dòng (Fermentas)

- Kit tinh sạch DNA (QIAGEN)

- Các hóa chất thông dụng khác (cồn, agarose, enzyme…) của các hãng GeneShun Bioteck, Fermentas

Thiết bị :

- Máy quang phổ UV – Vis

- Máy điện di DNAvà bộ nguồn PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ)

- Máy phân tích trình tự gen ABI 3100 Genetic Analyzer (Mỹ)

- Bể ổn nhiệt (Techne, OSI, Anh)

- Pipetman các loại (Gilson, Pháp)

- Máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ)

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phòng công nghệ ADN&Ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tại các phòng thí nghiệm thuộc

Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Dụng cụ thu mẫu bao gồm: túi polyetylen cỡ lớn dùng để đựng mẫu, kéo cắt cây, giấy báo, nhãn, dập ghim, cồn khử trùng, sổ ghi chép, băng dính các loại, máy ảnh

Phương pháp thu mẫu được thực hiện như sau: Để thu mẫu hiện nay người ta dùng túi polyetylen để đựng mẫu mà không dùng cặp gỗ dán như trước đây vì vừa cồng kềnh vừa khó bảo quản Sau khi quan sát thấy cây có dấu hiệu nghi nhiệm bệnh, chúng tôi tiến hành nhổ cả cây cho vào túi polyetylen cỡ lớn, dập ghim lại và bọc bằng giấy báo Ghi lại đặc điểm, màu sắc, dấu hiệu bệnh của cây đó và dán lên túi polyetylen Cây sau khi nhổ lên phải nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm để xử lý, không được để quá 12 tiếng

Mẫu sau khi thu được đưa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn, chúng tôi dùng kéo đã khử trùng cắt lấy những lá có khả năng nhiễm bệnh cao cho vào túi polyetylen nhỏ Dán nhãn, ghi lại đặc điểm mẫu của từng vùng Sau đó, bảo quản mẫu ở tủ -300

C

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Hãng Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng

số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước:

1) Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng

2) Hút 500 µl Plant RNA Lysis Solution, thêm 10 µl DTT 2M cho vào ống 1,5 ml

3) Ủ trong 3 phút, 560C sau đó li tâm 5 phút 20.000g (14.000rpm)

4) Thu dịch nổi (khoảng 450 – 550 µl) chuyển vào ống sạch

10) Li tâm 1 phút 12.000g (11.000rpm), sau đó loại bỏ dịch trong ống

11) Cho tiếp 500 µl Wash Buffer WB2 vào cột lọc

12) Sau đó li tâm nhanh 1 phút 20.000g (14.000rpm) , loại bỏ dịch và chuyển cột sang ống 1,5ml

13) Tách RNA ra khỏi màng bằng cách thêm 50 µl H2O vào đúng giữa màng, để 1 phút tại nhiệt độ phòng, sau đó li tâm 1 phút, 11000 vòng 14) Bảo quản RNA ở - 200C Giữ RNA trên đá trước và trong khi tiến hành thí nghiệm

15) Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết được bằng điện di trên gel agarose 1%

2.2.2.2 Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số, các thành phần cho phản ứng

tổng hợp cDNA được trình bày theo bảng sau:

- Ủ ở 650C/5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh

- Thêm các thành phần sau theo thứ tự :

- Li tâm nhanh

- Cho vào máy PCR ủ theo chu trình nhiệt : 420C/60 phút; 700C/5 phút

- Sản phẩm cDNA có thể sử dụng trực tiếp, giữ ở -200C trong 1 tuần hoặc giữ lâu hơn ở -700C

2.2.2.3 Phương pháp PCR

Gen CP được khuếch đại từ cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình từ của gen CP có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế là X63771, ký hiệu cặp mồi là SMVcp-F/SMVcp-R

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR nhân gen CP