Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè camellia sinensis

Nước chè là thức uống tốt, có tác dụng giải khát, chống lạnh, có tác dụng bảo vệ sức khỏe con người khắc phục sự mệt mỏi của cơ thể, kích thích hoạt động của hệ thần kinh trung ương, kíc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG TRUNG THÀNH

NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE

CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DƯƠNG TRUNG THÀNH

NHÂN DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ANTHOCYANIDIN REDUCTASE

CỦA CÂY CHÈ (Camellia sinensis)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Huỳnh Thị Thu Huệ

2 TS Hoàng Thị Thu Yến

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu

và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Dương Trung Thành

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Huỳnh Thị Thu Huệ

- Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam; TS Hoàng Thị Thu Yến - Khoa Công nghệ Sinh học -

Trường Đại học Khoa học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức

và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và các cán

bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Cử nhân Phạm Thị Hằng - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Dương Trung Thành

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ 3

1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè 4

1.1.3 Giá trị của cây chè 7

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 9

1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam 9

1.2.1.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới 9

1.2.1.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.3 CATECHIN VÀ ANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ 16

1.3.1 Catechin và tác dụng của catechin 16

1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp catechin ở chè 19

1.3.3 Anthocyanidin reductase và gen ANR quy định tổng hợp anthocyanidin reductase 20

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 24

2.2.2 Điện di RNA tổng số 25

2.2.3 Tổng hợp cDNA 26

2.2.4 Nhân gen ANR bằng kĩ thuật PCR 26

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 28

2.2.6 Tách dòng gen ANR 29

2.2.7 Xác định trình tự gen 32

2.2.8 Xử lí số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 33

2.2.9 Thiết kế vector biểu hiện 33

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Khuếch đại gen ANR từ mẫu chè nghiên cứu 35

3.2 Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa anthocyanidin reductase 37

3.3 Thiết kế vector biểu hiện vi khuẩn mang gen ANR 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

KẾT LUẬN 48

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết

tắt

Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

ANR Anthocyanidin reductase Anthocyanidin reductase

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide

DNA Axit Deoxiribonucleic Deoxyribonucleic Acid

ECG Epicatechin-3-O-gallate Epicatechin-3-O-gallate

EDTA Axit etylene diamin tetraaxetic Ethylene Diamine Tetraacetic

Acid EGC Epigallocatechin Epigallocatechin

EGCG Epigallocatechin-3-O-gallate Epigallocatechin-3-O-gallate EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide

LAR Leuacoanthocyanidin reductase Leuacoanthocyanidin reductase

NAD Nicotinamid adenine dinucleotide Nicotinamid adenine dinucleotide NADP Nicotinamid adenine dinucleotide

phosphate

Nicotinamid adenine dinucleotide phosphate

ORF Khung đọc mở Open reading frame

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid

RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease

Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus

UTR Vùng không dịch mã untranslated region

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn 2010

- 2016 9

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trên thế giới năm 2016 10

Bảng 1.3 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong những năm gần đây 13

Bảng 1.4 Thành phần amino acid của CsANR 21

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 26

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA 26

Bảng 2.3 Trình tự các đoạn mồi sử dụng nhân gen ANR 27

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR nhân gen ANR 27

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo đầu bằng sẳn phẩm PCR 29

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen ANR và vector pJET1.2 29

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid 32

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số 36

Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide gen ANR của chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank 41

Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa anthocyanidin reductase ở giông chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức tổng quát của catechin 16

Hình 1.2 Các con đường sinh tổng hợp catechin ở chè 19

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của protein CsANR 22

Hình 2.1 Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng nhân gen ANR 27

Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 29

Hình 2.3 Sơ đồ vector biểu hiện pET-32a(+) 33

Hình 2.4 Sơ đò thí nghiệm nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè 34

Hình 3.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 36

Hình 3.2 Kết quả nhân gen ANR từ cDNA của mẫu chè Trung du xanh ở các nhiệt độ khác nhau 37

Hình 3.3 Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du xanh 37

Hình 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong plasmid pJET1.2 38

Hình 3.5 Kết quả phân tích trình tự gen CsANR2 phân lập từ mẫu chè xanh 41

Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid suy diễn của CsANR2 từ giống chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố 43

Hình 3.7 Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của gen ANR trong plasmid pET32a(+) 46

Hình 3.8 Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR bằng NcoI và XhoI 46

Hình 3.9 Kết quả PCR kiểm tra plasmid pET32a(+)_ANR 47

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,

có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu đời, được trồng khá phổ biến ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Sản phẩm từ cây chè đã và đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới dưới nhiều công dụng khác nhau nhưng phổ biến nhất vẫn là đồ uống Theo thống kê, chè là thức uống phổ biến thứ hai trên thế giới chỉ sau nước, với hương vị độc đáo và những tác dụng có lợi cho sức khỏe con người Nước chè là thức uống tốt, có tác dụng giải khát, chống lạnh, có tác dụng bảo vệ sức khỏe con người khắc phục sự mệt mỏi của cơ thể, kích thích hoạt động của hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và chân tay, kích thích hệ tiêu hóa, chữa một số bệnh đường ruột, lợi tiểu (do chứa theofilin, theobromin), kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì, chống sâu răng, hôi miệng, chống lão hóa, phòng ngừa ung thư (do chứa catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết áp, tiểu đường và ngăn ngừa cholesteron tăng cao… Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, chè cũng được cho

là ức chế sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol

có trong chè

Chính vì các đặc tính ưu việt trên, chè đã trở thành sản phẩm đồ uống phổ thông trên toàn thế giới, sản phẩm chè từ lâu đã trở thành một trong những nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia vùng Đông Nam Á Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, góp phần quan trọng trong việc xóa đói giảm nghèo; cây chè và một số cây công nghiệp khác đã trở thành cây trồng mũi nhọn góp phần chuyển dịch cơ cấu

kinh tế, cải thiện đời sống nhân dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn

Thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè là polyphenol Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè Các catechin và dẫn xuất của nó còn được gọi là các flavan-3-ol chiếm khoảng 70% polyphenol tổng số Thành phần của catechin bao gồm Epicatechin (EC), ECG (Epicatechin-3-O-gallate), EGC (Epigallocatechin), EGCG (Epigallocatechin-3-O-gallate), C (catechin) và GC (Gallocatechin) Epicatechin là một trong nhiều loại polyphenol có vai trò quyết định đến hương vị của chè và là hoạt chất chống ôxy hóa có nhiều trong chè Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp polyphenol ở mức độ phân tử được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu, đặc biệt là các gen thực hiện chức năng tổng hợp polyphenol Anthocyanidin reductase (ANR) là enzyme quy định tổng hợp nên epicatechin, phân lập và xác định trình tự gen tổng hợp epicatechin là bước đầu tiên tạo tiền đề nghiên cứu chức năng của gen ANR, nhằm góp phần làm sáng tỏ giá trị của polyphenol nói riêng và cây chè nói chung đối với con người Ở chè Việt Nam, gen mã hóa anthocyanidin reductase vẫn chưa được phân lập và nghiên cứu về chức năng Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nhân dòng

và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè

(camellia sinensis)”.

2 Mục tiêu đề tài

Tạo dòng, xác định, phân tích trình tự và thiết kế vector biểu hiện gen

mã hóa Anthocyanidin reductase phân lập từ cây chè trồng tại Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

+ Khuếch đại gen ANR mã hóa anthocyanidin reductase từ chè

+ Tạo dòng gen, xác định và phân tích trình tự gen ANR thu được

+ Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CHÈ

1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển của cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O Kumtze và thuộc hệ

thống phân loại như sau :

Ngành: Hạt kín (Angiospermae)

Lớp: Song tử diệp (Dicotyledonae)

Bộ: Chè (Theaseae)

Họ: Chè (Theaceae)

Chi: Chè (Camelia hoặc Thea)

Loài: Camellia sinensis

Cây chè có nguồn gốc ở vùng khí hậu gió mùa Đông Nam Á, bao gồm vùng Tây Nam Trung Quốc, Bắc Myanma, Bắc lào và Bắc Việt Nam hiện nay Cây chè được cư dân Bách Việt phương Nam, thuộc nền văn hóa lúa nước phát hiện đầu tiên trên thế giới làm thảo dược; rồi lan truyền lên phương Bắc của dân tộc Hán có nền văn hóa nông nghiệp cạn và du mục Hoàng Hà Từ đó phát triển mạnh mẽ về công nghệ chế biến thành nước chè, một thứ nước uống giải khát phổ cập ở Trung Hoa, rồi truyền bá ra khắp năm châu trên thế giới ngày nay đã có trên 4000 năm lịch sử

Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961- 1976) so sánh về thành phần các chất catechin trong lá chè có nguồn gốc khác nhau, các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã kết luận rằng: Những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp epigalocatechin (-) và các galat của

nó để tạo thành galocatechin (+) Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chúng cũng tổng hợp chủ yếu là epicatechin (-) và epicatechin galat (chiếm

70% tổng số các loại catechin) Năm 1976, Viện sĩ thông tấn Viện Hàn Lâm khoa học Liên Xô, sau những nghiên cứu về tiến hóa của cây chè, bằng phân tích chất catechin trong chè mọc hoang dại ở các vùng chè Tứ Xuyên, Vân Nam Trung Quốc, và các vùng chè cổ Việt Nam (Suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng Sơn, Nghệ An …) đã kết luận: Cây chè cổ Việt Nam tổng hợp các catechin đơn giản nhiều hơn cây chè Vân Nam Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế giới như sau: Chi Camellia  chè Việt Nam  chè Vân Nam lá to (chè Trung Quốc)  chè Assam (Ấn Độ) [3]

Như vậy, có thể kết luận Việt Nam là một trong những cái nôi của cây chè Người Việt Nam biết đến chè sớm hơn nhiều so với các nước, tục uống chè của người Việt Nam đã trở thành một nét văn hóa độc đáo, chiếm vị trí quan trọng trong giao tiếp, lễ nghi…

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè

Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại cây thân gỗ hoặc thân bụi và có một số đặc điểm sinh học sau đây [3]:

a Đặc điểm hình thái

Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

chồi Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng

Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 - 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh trưởng Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm, xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả Chia theo vị trí trên cành có: Chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành)

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, mọc cách; hệ gân lá hình mạng

lông chim; rìa lá có răng cưa, chiều dài từ 4 - 15 cm, rộng từ 2 - 5 cm Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi lõm, láng bóng Lá chè có thể có hình thuôn, mũi mác,

ô van, trứng gà, gần tròn Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện

tự nhiên và điều kiện canh tác

Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, chèng có 5 - 9 cánh màu trắng hay

phớt hồng, bộ nhị đực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim) Bầu nhị cái có 3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1- 4 hạt Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín chuyển sang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt chè

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu nâu,

cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng

Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu

đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà

b Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây chè

Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là

22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 % Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %

c Sinh trưởng và phát triển của cây chè

Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm

d Thành phần hóa học của lá chè

Thành phần hóa học của lá chè rất đa dạng, bao gồm một lượng lớn là nước, các thành phần hữu cơ và vô cơ khác Trong đó, các polyphenol có vai trò rất quan trọng, quyết định đến màu sặc và hượng vị của chè [48]

Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm 75 -

80% khối lượng lá chè, hàm lượng phụ thuộc vào giống chè, thời vụ và độ non già của lá chè Nước trong nguyên liệu chè tham gia trực tiếp vào nhiều phản ứng thủy phân, oxi hóa khử, liên quan trực tiếp đến các quá trình hóa sinh trong búp chè và có ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme.Trong chế biến chè, nước có vai trò quan trọng trong các quá trình biến đổi, tạo nên mùi vị và hình dạng của búp chè, nó có liên quan trực tiếp đến chất lượng chè nguyên liệu và chất lượng chè thành phẩm

Chất khô chiếm 18 - 25 % khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,

pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin, theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro

Hợp chất polyphenol (tannin): tannin của cây chè là một phức hợp của

nhiểu hợp chất hữu cơ tự nhiên có bản chất phenol Hợp chất phenol giữ vai trò chủ yếu trong quá trình tạo màu sắc, hương vị của chè đặc biệt là chè đen Tanin

có đặc tính dễ bị oxi hóa dưới tác dụng của enzym và được cung cấp oxi đầy

đủ Vì vậy, chè nguyên liệu chứa càng nhiều tanin, đặc biệt là tanin hòa tan thì

sản phẩm chè đen có chất lượng càng cao Flavanoids là thành phần quan trọng của tanin, trong đó catechin và flavanoids chiếm tỷ lệ lớn

Hợp chất alkaloid: trong chè có nhiều loại nhưng nhiều nhất vẫn là loại

cafein Hàm lượng cafein trong chè chiếm từ 3 - 5% chất khô Hàm lượng cafein trong chè thay đổi phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác, mùa vụ thu hái và thay đổi theo bộ phận của cây

Protein và amino acid: là hợp chất phức tạp có chứa N, phân bố không

đều ở phần búp chè và thay đổi tùy theo giống và thời vụ, điều kiện canh tác và các yếu tố khác Protein có thể kết hợp trực tiếp với tanin, polyphenol tạo nên những phẩm chất chè Thái Nguyên đen Do đặc điểm của của việc chế biến chè xanh là diệt men ngay từ đầu, nên hàm hượng tanin bị thay đổi và còn quá cao làm cho chè có vị đắng Protein kết hợp với một phần tanin làm cho vị chát và đắng giảm đi

Ngoài ra, trong chè còn có các amino acid, gluxit và pectin, dầu thơm, các loại vitamin trong chè, các enzyme, chất tro…

1.1.3 Giá trị của cây chè

Giá trị của cây chè thể hiện ở nhiều mặt trong đó phải kể đến giá trị dinh dưỡng, giá trị dược tính, giá trị về mặt kinh tế - xã hội và giá trị về mặt văn hóa hết sức to lớn

a Giá trị về mặt thực phẩm

Trong chè có các thành phần hóa học giàu chất dinh dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người, do đó chè xanh đã trở thành nguyên liệu quan trọng để chế biến nhiều loại thức ăn đồ uống khác nhau ở rất nhiểu nước trên thế giới Phần lớn lá chè xanh được sử dụng làm đồ uống Chè được pha chế đúng cách là một loại đồ uống lý tưởng rất tốt đối với cơ thể do có chứa đầy đủ các loại vitamin, muối khoáng, protein và các chất hữu cơ có lợi khác Ngày

nay khuynh hướng sử dụng chè xanh trong chế biến thức ăn rất được phát triển Các loại bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh, kem chè xanh, thạch chè xanh, mỳ ăn liền chè xanh, sandwich chè xanh đang được tiêu thụ mạnh ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ, Úc Trung Quốc và Việt Nam có các loại bánh nướng chè xanh, bánh dẻo chè xanh… [49]

b Giá trị dược tính của chè

Nước chè có thể làm giảm các quá trình viêm như viêm khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu giúp ngăn ngừa tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhiễm độc Mới đây nhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của các chất phóng xạ Người ta

đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu…Chất cafein và một số hợp chất alcaloit trong chè có tác dụng kích thích

hệ thần kinh trung ương làm cho tinh thần minh mẫn, tăng hoạt động các cơ, nâng cao năng lực làm việc và giảm mệt mói sau khi lao động Những giá trị tiềm ẩn của cây chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu [49]

c Giá trị về mặt kinh tế

Chè là cây công nghiệp dài ngày, trồng một lần cho thu hoạch nhiều năm,

từ 30 đến 50 năm, mang lại thu nhập kinh tế hàng năm với năng suất, sản lượng tương đối ổn định Chè có giá trị sử dụng và là hàng hóa có giá trị kinh tế góp phần xóa đói giảm nghèo, tạo nhiều việc làm cũng như thu nhập cho người lao động đặc biệt là các tỉnh trung du và miền núi, được coi là cây trồng mũi nhọn, một thế mạnh của chu vực trung du và miền núi Hiện nay chè đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao của Việt Nam [49]

Bên cạnh đó, cây chè còn có tác dụng phủ xanh đất trống, đồi trọc, chống xói mòn, bảo vệ đất, bảo vệ môi trường sinh thái

d Giá trị về văn hóa

Chè là loại cây đã đi vào đời sống con người một cách sâu sắc, đậm đà Uống chè đã trở thành một phong tục tập quán, là sở thích từ lâu đời của nhiều dân tộc trên thế giới Cũng giống như nhiều nước châu Á và Đông Nam Á khác,

ở Việt Nam tục uống chè đã có từ rất lâu đời, trở thành một nét văn hóa độc đáo chiếm vị trí quan trọng trong giao tiếp, lễ nghi… Thưởng thức chè còn tạo

ra nguồn cảm hứng trong sáng tác nghệ thuật thơ ca, hội họa…

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀNGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI

VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam

1.2.1.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới

Chè là loại đồ uống phổ biến thứ hai trên thế giới với lịch sử trên 4000 năm Đến nay, chè đã được trồng ở 58 quốc gia, phân bố ở khắp 5 Châu Sản xuất chè toàn cầu tăng trưởng ổn định, diện tích trồng chè không ngừng tăng lên hàng năm, đến năm 2016, thế giới có 4.099.230ha chè, đạt sản lượng 5.954.091 tấn

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới

giai đoạn 2010 - 2016 Năm Diện tích (ha) Năng suất (Tạ/ha) Sản lượng (Tấn)

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng chè của một số nước trên thế

1.2.1.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm, Việt Nam có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho cây chè sinh trưởng và phát triển Chè được trồng ở Việt Nam từ khá lâu nhưng nó chỉ thực sự được coi là một loại cây công nghiệp, đưa vào sản xuất đại chè với quy mô lớn khi các đồn điền chè đầu tiên do người Pháp xây dựng ở Việt Nam Ngành chè Việt Nam đến nay đã có lịch sử phát triển gần 100 năm (1918 - 2017), được coi là một trong những ngành sản xuất

có mầm mống công nghiệp sớm nhất ở nước ta trong số các ngành chề biến công nghiệp dài ngày Trải qua gần một thế kỷ tồn tại và phát triển, ngành chè Việt Nam đã trở thành một ngành sản xuất quan trọng Sự phát triển của ngành chè Việt Nam có thể chia thành một số giai đoạn sau [3]:

* Giai đoạn 1890 - 1945

Ngay sau khi chiếm Đông Dương, người Pháp đã phát triển sản xuất chè nhằm khai thác tiềm năng phát triển cây trồng nhiệt đới ở Việt Nam Những đồn điền chè đầu tiên ở Việt Nam được thành lập tại Tĩnh Cương - Phú Thọ với diện tích 60 ha, ở Đức Phổ - Quảng Nam 250 ha Tính đến năm 1938, Việt Nam có 13.405 ha chè với sản lượng 6.100 tấn chè khô Diện tích chè phân bố chủ yếu ở trung du, miền núi (Bắc bộ) và cao nguyên Trung bộ, trong đó trên 75% diện tích do người Việt Nam quản lý

Năm 1939, Việt Nam đạt sản lượng 10.900 tấn chè khô, đứng hàng thứ

6 trên thế giới sau Ấn Độ, Trung Quốc, Srilanka, Nhật Bản và Indonexia

Đặc điểm nổi bật của thời kỳ này là diện tích chè phân tán mang tính tự cấp, tự túc, kỹ thuật canh tác sơ sài, kỹ thuật quảng canh là chính

Ở giai đoạn này có 3 cơ sở nghiên cứu chè được thành lập Đầu tiên là trạm nghiên cứu chè Phú Hộ (Phú Thọ) thành lập năm 1918 Sau đó vào năm

1927 là trạm nghiên cứu chè Plâycu (Gia Lai - Kontum) và trạm nghiên cứu chè Bảo Lộc (Lâm Đồng) được thành lập năm 1931

* Giai đoạn 1945 - 1954

Đây là giai đoạn suy thoái của ngành sản xuất chè Việt Nam Do ảnh hưởng của chiến tranh, các vườn chè bị bỏ hoang, sản xuất chè đình trệ làm cho diện tích chè, sản lượng chè đều giảm sút

* Thời kỳ 1954 - 1990

Ở giai đoạn này các công trình phát triển nông nghiệp được hoạch định Cây chè được xác định là cây trồng có giá trị kinh tế cao, có tầm quan trọng trọng chiến lược phát triển kinh tế - xã hội vùng trung du và miền núi

Trong những năm 1958 - 1960 hàng loạt các nông trường chè được thành lập, dưới sự quản lí của các đơn vị quân đội Từ những năm 1960 - 1970, chè được phát triển mạnh ở cả 3 khu vực: quốc doanh, hợp tác xã chuyên canh chè

và gia đình

Các cơ sở nghiên cứu chè ở Phú Hộ (Phú Thọ), Bảo Lộc (Lâm Đồng) được củng cố và phát triển Hàng loạt các vấn đề như giống, kỹ thuật canh tác, chế biến được đầu tư nghiên cứu Nhiều tiến bộ kỹ thuật được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, góp phần làm tăng nhanh diện tích, sản lượng chè ở Việt Nam

Từ năm 1980 - 1990 diện tích chè của Việt Nam tăng từ 46,9 nghìn ha lên 60,0 nghìn ha Sản lượng chè khô từ 21,3 nghìn tấn lên 32,2 nghìn tấn

Ở giai đoạn này, công nghiệp chế biến được phát triển mạnh, nhiều nhà máy chè xanh, chè đen được xây dựng ở Nghĩa Lộ, Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Thái Nguyên, Phú Thọ … Với sự giúp đỡ về kỹ thuật, vật chất của Liên Xô, Trung Quốc … phần lớn chè được xuất khẩu sang các nước Liên Xô

cũ và các nước Đông Âu, một số khác được xuất khẩu sang các nước Tây Á: Iran, Irắc, Ả Rập Xêut …

* Giai đoạn 1990 đến nay

Từ năm 1990 đến năm 1997 diện tích chè đã tăng từ 60.000 ha lên 81.700

ha, sản lượng chè khô tăng từ 32,2 nghìn tấn lên 52,3 nghìn tấn Tuy nhiên do

có sự biến động lớn về thị trường tiêu thụ nên sản xuất chè gặp nhiều khó khăn, công nghệ chế biến chưa đáp ứng được nhu cầu về chất lượng, chủng loại chè của thị trường mới (thị trường châu Á, Bắc Mỹ và thị trường Tây Âu …) Sự chồng chéo về quản lý ngành chè giữa cơ quan nhà nước và các địa phương đã phần nào làm ngành chè chững lại Diện tích chè vẫn tăng nhưng năng suất chè giảm, đời sống người làm chè gặp nhiều khó khăn

Tước thực trạng đó, Tổng công ty chè Việt Nam được thành lập, thống nhất quản lý ngành chè Một số liên doanh liên kết sản xuất với nước ngoài (Nhật Bản, Đài Loan, Bỉ, Anh, Malaixia) được thành lập, công nghệ chế biến bước đầu được đổi mới, thị trường xuất khẩu bắt đầu mở rộng sang các nước Tây Âu, Bắc Mỹ, Nhật Bản, thị trường xuất khẩu truyền thống (các nước thuộc Liên Xô cũ, Đông Âu…) cũng được mở lại, giá chè bước đầu ổn định, tạo niềm tin cho người làm chè

Những năm gần đây, Việt Nam đã có nhiều cơ chế chính sách đầu tư ưu tiên phát triển cây chè Cây chè được xem là cây cây trồng có khả năng xóa đói, giảm nghèo và làm giàu của nhiều hộ dân Do đó diện tích, năng suất và sản lượng chè không ngừng tăng lên Theo báo cáo của Cục Trồng trọt, năm 2016

cả nước có 133,4 nghìn ha trồng chè, năng suất 86,9 tạ/ha, đạt sản lượng 1.025,2 nghìn tấn Xuất khẩu chè năm 2016 đạt 130,9 nghìn tấn, trị giá 217,2 triệu USD

Bảng 1.3 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam

trong những năm gần đây

Năm Diện tích

(nghìn ha)

Năng suất (Tạ/ha)

Sản lượng (Nghìn tấn)

Xuất khẩu (Nghìn tấn)

Với sản lượng và kim ngạch xuất khẩu như trên, hiện nay Việt Nam đang

là nước sản xuất chè lớn thứ 6 và xuất khẩu chè thứ 5 thế giới, sau Trung Quốc,

Ấn Độ, Kenya và Srilanka Sản phẩm chè Việt Nam đã có mặt tại trên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, trong đó thương hiệu “Chè Việt” đã được đăng ký và bảo hộ tại 70 thị trường quốc gia và khu vực

1.2.2 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu về cây chè Bên cạnh những nghiên cứu liên quan đến vấn đề trồng trọt và chế biến chè, còn có rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều nước trên thế giới công bố tác dụng chữa bệnh của chè xanh Trong cây chè người ta quan tâm chủ yếu đến các hợp chất polyphenol (bao gồm flavonoid, catechin và các flavonoid khác) bởi chúng có nhiều tác dụng sinh - dược học đáng quý như: tác dụng chống ung thư, chống đột biến tế bào, chống phóng xạ, chống viêm… Chè là nguồn cung cấp các hợp chất flavonoid chính cho con người bởi chè được sử dụng nhiều và chứa hàm lượng flavonoid tương đối cao Các flavonoid tìm thấy trong chè xanh chủ yếu là flavan – 3 - ols (catechin), chiếm 90% trong các hợp chất phenol của lá chè Các flavonoid trong chè đen chủ yếu là

theaflavin và thearubigin- phức hợp các sản phẩm oxy hóa của các hợp chất phenol chè xanh Thearubigin là nhóm sản phẩm oxy hóa đã bị polimer hóa của

trong đó có các hợp chất polyphenol Trình tự gen ANR cũng đã được công bố

trên ngân hàng gen [39] Năm 2013, Pang và đtg đã nghiên cứu tạo dòng và xác

định trình tự gen ANR hoàn chỉnh từ giống chè của Viện nghiên cứu chè Sri

Lanka [33]

Ở nước ta, do vị trí quan trọng của cây chè trong nền kinh tế quốc dân nên đã có nhiều nghiên cứu trên đối tượng này Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về cây chè chủ yếu đi sâu nghiên cứu đặc tính hoá sinh, đặc điểm hình thái, giải phẫu lá, thân, đặc điểm sinh trưởng, phát triển, năng suất, chất lượng và chọn tạo giống chè bằng phương pháp truyền thống [2], [12] Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng quan tâm đến việc nghiên cứu các giải pháp để nâng cao tính cạnh tranh của chè trên thị trường và bảo hộ sản phẩm chè [9], [10] Việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử vào việc đánh giá hệ gen của cây chè làm cơ sở cho chọn tạo giống còn là vấn đề mới mẻ Năm 2004, nhóm tác giả Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của một số dòng chè đột biến [5] Năm 2010, Nguyễn Thị Thu Hương và đtg đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích sự đa dạng trình tự genome ở các dòng chè Shan [4] Một số giống chè trồng ở xã Tân Cương - vùng chè đặc sản chè nổi tiếng của Tỉnh Thái Nguyên cũng được phân tích bằng kỹ thuật RAPD bởi Hoàng Thị Thu Yến và đtg [13] Năm 2009, Trần Đức Trung

và đtg đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền 96 giống/dòngchè trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-SSR [11] Năm 2014, Hoàng Thị Thu Yến và đtg

đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đánh giá một số giống/dòng chè trồng tại Thái Nguyên [14] Các nghiên cứu về cấu trúc phân tử và sự biểu hiện của gen liên quan đến sự sinh trưởng, phát triển, quá trình trao đổi chất, sự tổng hợp polyphenol…ở chè vẫn chưa được đề cập đến

1.3 CATECHIN VÀ ANTHOCIANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ

1.3.1 Catechin và tác dụng của catechin

Catechin là tên gọi chung cho các phenol có dạng flavan - 3- ol, một loại phenol tự nhiên và là chất chống oxy hóa Phân tử catechin có từ 15 cacbon bao gồm hai vòng 6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2,3,4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2, 3 và nhóm 4-oxo [18]

1 2 6

B C

Hình 1.1 Công thức tổng quát của catechin

Trong lá chè, các hợp chất catechin tồn tại ở trạng thái tự do và dạng este phức tạp với acid gallic Hợp chất catechin chủ yếu trong chè đó là: EGCG, EGC, EC, ECG, GC và C Catechin trong lá chè tươi chiểm 25 - 30% chất khô

và đóng vai trò quan trọng thực hiện chức năng sinh học trong quá trình hoạt động sống của cây chè, nó luôn biến đổi cả về số lượng và chất lượng trong quá trình phát triển của cây chè Quan trọng nhất trong đó là EGCG, chiếm tới 50%

khối lượng tổng phenol chè và khoảng 8 - 12% chất khô trong lá chè khô, tiếp theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10 – 20% tổng catechin) Hàm lượng của các catechin trong lá chè luôn luôn thay đổi, phụ thuộc vào giống chè, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận của cây chè, vị trí các lá trên búp chè và các yếu tố khác

về thổ nhưỡng, khí hậu…trong quá trình phát triển của lá, dưới tác dụng của enzyme, các catechin chuyển dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành Catechin giữ vai trò chủ yếu trong việc tạo thành màu sắc, hương vị của chè [22], [42], [44]

Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư của chè và các hợp chất

catechin được nghiên cứu mạnh mẽ nhất, khi tiến hành nghiên cứu in vivo,

nhiều công trình công bố đã cho thấy chè và các chất trích ly từ chè như EGCG, EGC, ECG … của chè có khả năng tương tác, ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển của tế bào ung thư Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechin trung hòa các tác nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, tác nhân này có khả năng tương tác làm thay đổi cấu trúc của DNA, ngăn chặn sự tạo thành nitrosamine, một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị vòng trong thịt, cá nấu chín, các tác nhân được cho

là có thể gây ung thư Các thử nghiệm in vivo cho thấy khả năng tương tác trực

tiếp và tăng cường hiệu quả của EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự hình thành của các tác nhân gây biến đổi trong tế bào [15], [23], [31], [45]

Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngăn chặn protein kinase Enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư [23], [29]

Trong quá trình ung thư diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế hoạt động của urokinase, enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển

và biến đổi của tế bào ung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus, hay ngăn chặn quá trình tổng hợp DNA trong ung thư biểu

mô tế bào gan, ung thư máu và ung thư phổi…[31], [45]

Nhiều nghiên cứu cho thấy EC và EGCG có tác dụng phòng chống bệnh ung thư tuyến tiền liệt Hai catechin này có tác dụng ngăn ngừa phát triển khối

u và dẫn đến làm giảm khả năng di căn EGCG làm giảm kích thước khối u và

đó là nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư thuyên giảm, đặc biệt sự ức chế urokinase, vì urokinase bẻ gãy liên kết cơ bản nhân tế bào làm cho khối u phát triển nhanh và bệnh di căn [45]

Catechin có hoạt tính của vitamin P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm, củng cố tính bền thành mạch máu Catechin thường dùng phối hợp với vitamin E trong dự phòng điều trị chảy máu cấp và còn có tác động đến các biểu hiện lâm sàng khác của bệnh nhân như giảm sốt, giảm nhiễm độc, giảm rối loạn hoạt động hệ tim mạch [31] Catechin trong chè có tác dụng chống oxy hóa, tức là chống quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động [30], [37] Do đó catechin trong chè là chất kìm hãm

sự phát triển của khối u, chống phóng xạ và một số bệnh ung thư rất tốt

Ngoài ra còn có một số nghiên cứu đã chứng tỏ rằng các catechin như EGC, ECG và EGCG được chiết từ chè xanh Trung Quốc còn có tác dụng ức chế, gây miễn nhiễm với HIV [32]

1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp catechin ở chè

Catechin của chè được tổng hợp theo 4 nhánh của con đường Flavnoid dưới sự xúc tác trực tiếp của 2 enzyme leucoanthocyanidin reductase (LAR) và

anthocyanidin reductase (ANR) (Hình 1.2) Hai enzyme này đóng vai trò chìa khóa xác định thành phần catechin bao gồm: catechin được epimer hóa còn gọi

là epicatechin (EGCG, ECG, EGC và EC) và catechin không được epimer hóa (GC và C) [33], [34], [43] LAR xúc tác chuyển hóa leucocyanidin, leucoanthocyanin thành C và GC Trong khi ANR xúc tác tổng hợp EC và EGC

từ anthocyanin Sau đó, EC và EGC được ester hóa tạo thành ECG và ECCG [16], [39], [43]

Hình 1.2 Các con đường sinh tổng hợp catechin ở chè [28]

Chú thích: ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase); 4CL coumarate: CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol reductase); F3H (flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-hydroxylase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase); LAR (leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase)

(4-1.3.3 Anthocianidin reductase và gen ANR quy định tổng hợp anthocianidin reductase

Anthocyanidin reductase là một enzyme thuộc siêu họ dehydrogenase,

sử dụng anthocyanidin làm cơ chất để tổng hợp EC, enzyme này hoạt động phụ thuộc vào NAD hoặc NADP [44] Ở chè có 2 isoform của ANR là CsANR1 và CsANR2 Cả hai loại này ở chè đã được chứng minh có thể chuyển hóa

anthocyanidin thành hỗn hợp epicatechin và catechin CsANR có thể có 2 vùng

chức năng chính (domain), vùng 1 (vị trí 15–22: GGTGFVAA) giàu glycine có chức năng liên kết với NAD hoặc NADP; vùng 2 xác định sự đặc hiệu cơ chất

và có chứa các amino acid liên quan đến sự xúc tác của enzyme (130S, 167Y

và 171K) [21].

Nghiên cứu của Pang và cộng sự (2013) đã tạo dòng và xác định trình tự

gen ANR hoàn chỉnh từ giống chè của Viện nghiên cứu chè Sry Lanka Gen

ANR có hai isoform được kí hiệu là CsANR1 và CsANR2, cDNA của CsANR1

có kích thước 1,044 kb (GU992402) mã hóa một protein gồm 347 amino acid

có khối lượng phân tử 37 kD và pI 5,37; cDNA đầy đủ của CsANR2 dài 1.265

bp với 5’ UTR 114 bp và 3’ UTR 137 bp ORF của CsANR2 có kích thước

1,014 kb mã hóa cho một protein gồm 337 amino acid với khối lượng phân tử

36 kD và pI 6,54 Gen CsANR2 có kích thước tương tự cũng được Singh và cộng sự công bố [33], [39] Nhóm tác giả Krishnaraj và đtg (2014), trình tự mã

hóa cDNA của gen CsANR dài 1322 bp và gen này có kích thước tương tự với

các gen mã hóa ANR được tìm thấy ở táo, nho, Arabidopsis Nghiên cứu này

cũng chỉ ra vùng khung đọc mở dài 1011 bp mã hóa cho trình tự protein chứa

337 amino acid, các vùng không dịch mã ở vùng 5' và 3' lần lượt là 112 bp và

196 bp [40]

Bảng 1.4 Thành phần amino acid của CsANR Amino acid Thành phần Tỉ lệ

Phân tích thành phần các amino acid thành phần của CsANR cho thấy tỉ

lệ các aa kị nước chiếm 54% gồm Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Cys và 46% là các amino acid phân cực gồm Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg, Asn, Gln, His, Tyr, 20,47% các amino acid mang điện tích trong đó 10,38% amino acid có tính acid và 10,08% các amino acid có tính bazơ Cấu trúc không gian

3 chiều của protein CsANR chủ yếu gồm các chuỗi xoắn α (41,84%) sau đó là

các vùng cuộn ngẫu nhiên chiếm 37,39%, 13,95% các chuỗi mở rộng và vùng nếp gấp β chỉ chiếm 6,82% [40]

Hình 1.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của protein CsANR

Sự biểu hiện CsANR có sự khác biệt giữa các mùa trong năm, trong đó

mức độ biểu hiện cao nhất là vào mùa hè và thấp nhất vào giai đoạn gió mùa

Mức độ biểu hiện của CsANR cũng tùy thuộc vào từng mô trong đó biểu hiện

tối đa ở lá và tiếp đến ở chồi, thứ tự mức độ biểu hiện từ lá thứ nhất > chồi > lá

thứ 2 > lá thứ 3 Điều này khác với mức độ biểu hiện CsANR ở táo khi mức độ

biểu hiện cao nhất của gen này đạt được vào giai đoạn phát triển của quả và cao

nhất khi quả còn non [40]