Biểu hiện tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b seb phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường

Ngộ độc thực phẩm là bệnh cấp tính xảy ra khi ăn, uống phải thức ăn, đồ uống bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính chất độc hại đối với con người.. Điều đá

NGUYỄN BÍCH LOAN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN BÍCH LOAN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGHIÊM NGỌC MINH

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng

sự nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 06 năm 2012 tới tháng 06 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Bích Loan

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS TS Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường

- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới KS Nguyễn Thị Hoài Thu và các

anh chị, cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy

cô giáo trong nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; các thầy

cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiện luận văn này

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Học viên

Nguyễn Bích Loan

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm 3

1.1.1 Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung 3

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam 5

1.2 Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc điểm phân loại 9

1.2.3 Tính chất và phân bố 11

1.2.4 Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 12

1.2.5 Độc tố và khả năng gây bệnh 12

1.3 Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B 16

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc 16

1.3.2 Cơ chế gây bệnh 18

1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng 19 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 22

2.1.2 Chủng vi khuẩn và plasmid 22

2.1.3 Các bộ kit 22

2.1.4 Hóa chất, máy móc và thiết bị 22

2.1.5 Môi trường và đệm 23

2.1.6 Phần mềm 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24

2.2.2.1 Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli BL21(DE3) 24

2.2.2.2 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) 25

2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 26

2.2.2.4 Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 27

2.2.2.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 28

2.2.2.6 Phương pháp sạc cột Ni - NTA 31

2.2.2.7 Phương pháp tinh sạch protein 32

2.2.2.8 Định lượng protein theo phương pháp Bradford 33

2.2.2.9 Phương pháp kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến 35

2.2.2.10 Phương pháp gây miễn dịch trên chuột 38

2.2.2.11 Phương pháp Western blot 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B 41

3.1.1 Biến nạ pET21a+ mang gen seb vào chủng E coli 41

3.1.2 Nghiên cứu biểu hiện gen seb với các điều kiện tối ưu 44

3.2 Tinh sạch protein tái tổ hợp 46

3.3 Định lượng protein theo phương pháp Bradford 48

3.4 Kiểm tra độc tính của protein 50

3.4.1 Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 51

3.4.2 Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50 51

3.5.Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B 54

3.5.1.Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C 54

3.5.2.Kết quả kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên 54

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Tài liệu Tiếng Việt 60

Tài liệu Tiếng Anh 61

Tài liệu internet 65

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NBB Native Binding buffer

electrophoresis

DANH MỤC BẢNG

3.3 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều

3.4 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều

DANH MỤC HÌNH

1.4 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của tế bào T 19

2.2 Mô hình nghiên cứu độc tính protein SEB đột biến trên

3.3 Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI,

3.6 Đồ thị đường chuẩn định lượng protein bằng BSA có

3.9 Phản ứng Western blot của protein tái tổ hợp SEB với

3.10 Phản ứng Western bot của các nồng độ kháng nguyên SEB

MỞ ĐẦU

Khái niệm “vệ sinh an toàn thực phẩm” được định nghĩa là các điều kiện

và biện pháp cần thiết để đảm bảo thực phẩm không gây hại cho sức khỏe, tính mạng con người Mặc dù được Nhà nước và các cơ quan liên quan nỗ lực kiểm soát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm song vấn đề này vẫn đang diễn biến phức tạp

Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Đặc biệt là những trường hợp ngộ độc thực phẩm do mầm bệnh vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng, chiếm khoảng 50% trên tổng số ca ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là bệnh cấp tính xảy ra khi ăn, uống phải thức ăn, đồ uống bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc có chứa các chất có tính chất độc hại đối với con người Trong số các vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh

đó có tụ cầu vàng Staphyloccoccus aureus (S aureus) là một trong những

nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng

có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Điều đáng chú ý là một số độc tố của chúng bền với nhiệt và khó bị phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó phải kể tới là độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với nhiệt là tác nhân

chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus gây ra

Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh Đứng trước tình hình

này, bên cạnh việc khảo sát thực trạng nhiễm mầm bệnh S aureus trong thực

phẩm, việc chế tạo và ứng dụng các bộ kít phát hiện nhanh các mầm bệnh chủ yếu gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm ở Việt Nam nói chung và mầm

bệnh S aureus nói riêng là vô cùng cần thiết

Hiện nay trên thế giới và Việt Nam cũng đã phát triển một số phương pháp phát hiện độc tố SEB dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch như:

ELISA, huỳnh quang miễn dịch, cảm biến sinh học… Tuy nhiên các phương pháp này chỉ được thực hiện tại những phòng thí nghiệm có điều kiện về cơ

sở vật chất, trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ cao Trước tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đang ở mức báo động cao như ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu chế tạo thành công bộ kit dưới dạng que nhúng với nhiều lợi thế hơn như cho kết quả trong thời gian ngắn, đơn giản, dễ sử dụng

và áp dụng ở nhiều nơi như bệnh viện, nhà hàng, các vùng quê; phương pháp này đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu

Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên SEB tái tổ hợp không

có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Biểu hiện, tinh

sạch kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố SEB trong thực phẩm và môi trường”

Mục tiêu nghiên cứu:

Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) đặc hiệu làm nguyên liệu phục vụ cho việc tạo kháng thể đa và đơn dòng phục vụ chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố ruột SEB do vi khuẩn tụ cầu

vàng (S aureus) gây ra trong thực phẩm và môi trường

Nội dung nghiên cứu:

- Biểu hiện gen seb đột biến

- Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB đột biến

- Định lượng protein SEB đột biến theo phương pháp Bradford

- Kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến

- Gây miễn dịch thực nghiệm trên chuột

- Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên SEB bằng kỹ thuật Western blot

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm

1.1.1 Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung

Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề nổi cộm đối với tất

cả các nước trên thế giới Sự hiểu biết của con người về căn nguyên, tác hại

và hậu quả của bệnh truyền qua thực phẩm ngày càng sâu sắc hơn Tuy nhiên những biện pháp, kĩ thuật nhằm kiểm soát chúng lại chưa đem lại hiệu quả tích cực như mong đợi Những nguyên tắc phòng chống, các kĩ thuật vệ sinh

đã được nghiên cứu và áp dụng, tuy nhiên ngay cả những nước công nghiệp như Hoa Kì và Nhật Bản lại thường xuyên thông báo về bệnh do thực phẩm bị nhiễm khuẩn nhiễm độc [31]

Ngộ độc thực phẩm là hội chứng cấp tính xảy ra do ăn phải thức ăn có chất độc đối với người ăn Bệnh thường xảy ra có tính chất đột ngột, nhiều người cùng mắc do ăn cùng một loại thức ăn, có những triệu chứng của một bệnh cấp tính biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy… kèm theo các triệu chứng khác tùy theo từng loại ngộ độc Ngộ độc có thể do:

+ Thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật

cả nước Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố nhiễm vi khuẩn tương đối cao với tỷ lệ 46,7%, trong đó chủ yếu do nhiễm Coliform [4] Điều tra tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy 100% các mẫu thực phẩm được kiểm tra gồm

bánh mỳ, thịt nguội, thịt quay và dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm

về mặt vi sinh [8] Tại Hải Phòng, có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn

vệ sinh, trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9% [11] Với thực phẩm ăn liền tại các chợ, có tới 85% mẫu thử nghiệm không đạt tiêu chuẩn về vi sinh, với số lượng vi khuẩn có trong thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể cả các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [6] Không chỉ ở các thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở rất nhiều địa phương khác trên cả nước [10] Tuy chưa được nghiên cứu đầy đủ, kết quả điều tra sơ bộ tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng cho thấy có 73,7% số thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh, trong đó cao nhất là các sản phẩm từ sữa (97,5%), các loại kem (77,5%), nước giải khát (67,5%) và cuối cùng là nhóm thực phẩm chế biến từ thịt (40%) [1] Khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thức ăn đường phố tại 137 cơ sở kinh doanh thức ăn đường phố tại Thị xã Kon Tum cho kết quả 100% cơ sở không đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thức ăn tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ở rau sống từ 88

- 100% , thực phẩm chín từ 29 - 66% và bàn tay người chế biến 1%; 100% dụng cụ chứa đựng thực phẩm không nhiễm vi sinh [3] Hiện nay, loài người đang phải đối mặt với nguy cơ nhiễm hơn 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Trong số đó có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh Trong số hơn 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật đã được xác định vai trò gây bệnh Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng và virus Trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh tử vong ở người Trong số các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp tính rất

nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Salmonella,

Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibro chlorea, Campylobacter, Yersinia enterocolitica v.v [15]

Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) là nguyên nhân hàng đầu

gây ra ngộ độc [9]

Staphylococcus aureus: thường có trong kem, thịt tươi, cá bảo quản lâu

ngày, xúc xích, lạp xường, đôi khi có trong phomat Vi khuẩn có độc tố ruột gây buồn nôn và nôn, đau bụng và ỉa chảy cấp Độc tố tụ cầu bao gồm các enzym: hyaluronidase gây phá hủy tổ chức, hemolysine và leukocidine gây phá hủy hồng cầu và gây chết các tế bào hạt cũng như đại thực bào, exfoliatine: là các men phá hủy lớp thượng bì Men này gây tổn thương da tạo các bọng nước Điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: là nguyên nhân gây nên hội chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng

Các enterotoxin mà quan trọng nhất là enterotoxin B (SEB) là một độc

tố ruột được sinh ra bởi chủng S aureus, nó là một trong những độc tố liên

quan đến nhiễm độc thức ăn ở người do vi khuẩn tụ cầu và độc tố còn được

sử dụng như một tác nhân sinh học nguy hiểm trong chiến tranh sinh học SEB là một siêu kháng nguyên, nó có tác động kích thích viêm và tăng tiết sytokin ở tất cả các mô, cơ quan SEB gây độc cho đường tiêu hóa, đường hô hấp, các vết thương thậm chí có thể xâm nhập qua da lành, trong tấn công sinh học nó có thể được phân tán vào thức ăn, nguồn nước hoặc phun trong không khí

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố

ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam

Thực phẩm bị ô nhiễm do các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các nước

có nền khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [38]

Tụ cầu S aureus là một trong những loại vi khuẩn gây bệnh được ghi

nhận sớm nhất vào đầu những năm 1880 Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm

trùng, nhiễm độc thức ăn được biết đến từ những năm 1914, nhưng mãi đến năm 1930, Dack và cs mới xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [2]

Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc

thực phẩm do S aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc

biệt là ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan tới sữa, 7% từ cá, sò, ốc… và 3,5% từ trứng [41]

Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S aureus được ghi nhận trong

hai năm (1999 – 2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là phomat) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [19]

Tại Hoa Kì, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S aureus

được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt 5,1%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản [41] Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau

Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì (CDC) công bố vi khuẩn tụ

cầu vàng kháng methicilline MRSA (methicilline-resistant Staphylococcus

aureus) đang lây lan mạnh ở quốc gia này với tỷ lệ nhiễm là 32/100.000

người và số người chết vì MRSA đã vượt quá số người chết vì bệnh AIDS (trong tạp chí chuyên đề của Hiệp hội Y học Mỹ số ra ngày 18/10/2012) Theo ước tính của Trung tâm Phòng và Kiểm soát bệnh Hoa Kì, mỗi năm trên thế giới có ít nhất 100.000 người đã vô tình bị lây nhiễm MRSA sau khi nhập viện Trung bình cứ 10 trẻ em Mỹ đã từng vào viện thì có một trẻ bị lây nhiễm loại vi khuẩn đặc biệt nguy hiểm này và đến nay đã có gần 19.000 người bị chết ở Mỹ vì nhiễm MRSA Các ghi nhận y tế khác cũng cho thấy, MRSA hiện có mặt và ẩn nấp vô số trong mọi ngóc ngách của các bệnh viện và đang

là mối đe dọa lớn với ngành y tế Mỹ [50]

Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của S aureus rất

đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt hun khói (100%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), pate (83,3%) v.v

Đáng chú ý là vi khuẩn S aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm

bị nhiễm khuẩn [4]

Ở nước ta, trong nhiều năm trở lại đây xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ của Cục ATVSTP khoảng tháng 4, tháng 5/2012, cả nước xảy ra 10 vụ ngộ độc thực phẩm làm 927 người mắc, trong đó có 726 người nhập viện và đã có

4 trường hợp tử vong Phần lớn các vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân ngộ độc chủ yếu do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật Điển hình là vụ ngộ độc tập thể tại một đám cưới tại tại bản Hùn, xã Chiềng

Cọ, thành phố Sơn La là do thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn S.aureus làm 300

người mắc phải nhập viện cấp cứu Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày 16/4/2012 khiến hơn 200 công nhân của Công ty Dream MeKong thuộc xã

An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc [45]

Ngoài ra, kết quả kiểm nghiệm giám sát mối nguy ô nhiễm thức ăn của Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Quảng Trị từ tháng 4/2010 đến nay cho thấy nhóm thức ăn chế biến ăn ngay (nộm, rau sống, nước chấm các loại)

có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn cao nhất 72 - 88% với các vi khuẩn chủ yếu: E.coli 88%; Staphylococcus aureus 72,2% Trong tháng 3/2013 vừa qua, hàng chục

người bị ngộ độc, phải nhập viện do ăn phải bánh mì sốt trứng gà với chả bò nhiễm vi khuẩn tụ cầu vàng vượt quá giới hạn cho phép 6 đến 10 lần tại một của hàng bánh mì ở Đà Nẵng [42] Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB:

1) Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các

cơ sở chuyên khoa

2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh

3) Việc tiến hành các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian dài Do đó, khi bệnh nhân ăn phải thức ăn bị nhiễm độc

tố của tụ cầu như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh, có thể dẫn tới tử vong ở người

Trong các vụ ngộ độc thức ăn tập thể, ngộ độc do độc tố ruột của tụ cầu

S aureus (Enterotoxin) được cho là phổ biến nhất do tụ cầu phát triển nhanh

trong môi trường thực phẩm ở điều kiện khí hậu nóng ẩm và tiết ra độc tố Enterotoxin Trong các loại độc tố của tụ cầu thì Enterotoxin B (SEB) là một độc tố mạnh, gây tử vong cao và lại bền với nhiệt và môi trường nên còn được

tổ chức y tế thế giới (WHO) và CDC cảnh báo có thể là một trong những tác nhân bị lợi dụng trong khủng bố sinh học

Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S aureus và độc tố SEB gây

nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và cấp thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm đang nhiễm độc, nhiễm trùng

Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu cấp thiết và thực tiễn

1.2 Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với „staphyle” có nghĩa là chùm nho) là vi khuẩn gram dương, có hình cầu, đường kính khoảng 0,8 - 1 µm, có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho (hình 1.1) Đây là loại vi khuẩn không di

động, không có lông, cầu khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn Chlammydomonas perfringens,

Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy

trong các thực phẩm nhiễm khuẩn, và thường không có vỏ [41]

Năm 1871, Recklinghausen thu được cầu khuẩn trong thận của bệnh nhân chết do bệnh nhiễm khuẩn huyết Năm 1880, Alexander Ogston chứng minh được abcess sinh mủ là do cầu khuẩn dạng chùm Vào năm 1982, Ogson được công nhận là người khám phá và đặt tên cho tụ cầu –

Staphylococcus aureus

Hình 1.1 Cầu khuẩn S aureus dưới kính hiển vi (ảnh Sanger) [49]

1.2.2 Đặc điểm phân loại

Đặc điểm phân loại của Staphylococcus aureus được trình bày trong

bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại khoa học Staphylococcus aureus

Phân loại khoa học

Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của men coagulase Men này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzym này cùng với yếu tố kết cụm (một enzym vách tế bào vi khuẩn) giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó

Tụ cầu có men coagulase:

Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng

Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này là: Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng); Staphylococcus intermedius

Tụ cầu không có men coagulase:

Do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu

trắng Các vi khuẩn nhóm này có thể kể đến: Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus

capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri, cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người

Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn

Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm I, II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại

Staphylococcus aureus Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men

penicillinase (beta-lactamase) Men này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc

cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng [2]

1.2.3 Tính chất và phân bố

Staphylococcus aureus là những vi khuẩn kị khí tùy ý, có cả sự trao đổi

chất, hô hấp và lên men Chúng cho phản ứng catalase dương tính và có thể

sử dụng nhiều loại carbonhidrat khác nhau tạo acid lactic nhưng không sinh hơi Khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như Trypticase soy agar thường có màu kem đến màu cam

Thành tế bào chứa peptidoglican hình thành một hàng rào cứng chắc xung quanh tế bào và acid teichoic giúp duy trì môi trường ion thích hợp cho

màng cytoplasma, đồng thời góp phần bảo vệ bề mặt tế bào tụ cầu S aureus

có thể mọc ở nhiều điều kiện, môi trường khác nhau, nhưng tốt nhất ở nhiệt

độ từ 30 - 37o

C và pH: 7 - 7,2 Chúng kháng được các chất diệt trùng, độ khô nóng và có khả năng tăng trưởng trong môi trường có chứa đến 15% NaCl

Sắc tố carotenoid Sataphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của S

aureus Sắc tố đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính chất chống oxy

hóa giúp cho vi khuẩn không bị chết bởi các chủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch

S aureus cư trú trên người và động vật máu nóng, có trong sữa bò bị

bệnh, thịt heo tươi, có trong đất, vết thương mưng mủ… Đầu tiên chúng phát triển với số lượng thấp, sau đó phát triển lên số lượng lớn nếu không có bước

gia nhiệt hợp lý để phá hủy chúng hoàn toàn S aureus dễ dàng phát triển ở

những thực phẩm không qua xử lý nhiệt hoặc các sản phẩm làm bằng tay và làm lạnh không hợp lý Nguồn thực phẩm chủ yếu gây bệnh: thịt heo, bánh kem, trứng, thịt bò, thịt gà tây, shusi…

1.2.4 Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus

Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giai đoạn giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122 [12, 18, 20] Điển hình như Steven và

cs đã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S

aureus COL Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số:

CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh

Gram dương khác [33]

Trong số các chủng S aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ

giống enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% Ở Pháp, trong số 332

chủng S aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa các gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa các gen

sea và see trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [41]

1.2.5 Độc tố và khả năng gây bệnh

Các loại độc tố: Dựa theo các cuộc nghiên cứu và các báo cáo khoa học:

Tụ cầu S aureus sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng nhiễm

độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh

mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin

(staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β-lactamase và độc tố ruột (enterotoxin) – trong đó có SEB là một trong những nhóm độc tố được liệt kê trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học [2]

Hình 1.2 Các độc tố quyết định của S aureus [44]

Độc tố ruột (enterotoxin )

* Cấu trúc:

Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt, nên khó bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000 - 30000 Dalton, mỗi chuỗi có vị trí kháng nguyên chuyên biệt Đặc điểm chính là có vòng cystein

ở giữa giúp ổn định cấu trúc phân tử và kháng sự phân giải protein Có các chuỗi acid amin, trong đó nhiều nhất là aspartic, glutamic lysine, tyrosine

* Phân loại:

Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng Năm 1962, người ta đã đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố theo bảng chữ cái [25] Đầu tiên 5 loại SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính

kháng nguyên của chúng, đó là độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE) Trong đó, SEC được chia thành SEC, SEC2, SEC3 Ngoài ra, các độc tố này bao gồm 6 loại type được kí hiệu

từ A tới F [2] Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và

SET cũng nằm trong những độc tố ruột do S aureus tạo ra [27] Trong số các dạng độc tố ruột do S aureus sinh ra thì các độc tố SEA, SEB, SEC, SED là

những độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm

* Cơ chế gây bệnh:

Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence) của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ Các bề mặt này bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô) Giống như các vi khuẩn Gram dương

khác là Streptococcus và Mycobacteria, S aureus bám dính vào bề mặt tế bào

vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide Một khi đã bám dính vào

tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S aureus mới có khả năng khởi động

các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm

nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ S aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion) S

aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase;

hemolysine; leukocidin; exfoliatine… phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [46].Ước tính khoảng 0,1 µg S aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm

ở người Tuy nhiên, lượng này cũng có thể thay đổi tùy thuộc nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [41]

Triệu chứng gây bệnh của Staphylococcus aureus:

- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus

aureus: Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S aureus và độc tố của nó thường có các

triệu chứng cấp tính Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1 - 6

giờ), thời gian ủ bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2 - 3 giờ) Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân

và chất nôn chủ yếu là nước Triệu chứng tiêu chảy do tụ cầu không kèm theo

máu và ít mất nước hơn so với tả và E coli Bệnh nhân không sốt hay phát

ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người bệnh bình thường Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong 8 - 24 giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải Khác với ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hay sốt nhẹ mà sẽ bị sốt cao [5]

- Viêm ruột cấp tính: thường gặp ở các bệnh nhân hay uống thuốc kháng sinh có kháng khuẩn phổ rộng, kháng sinh tiêu diệt những vi khuẩn thông thường ở ruột, làm phát triển chủng tụ cầu sinh độc tố ruột gây nên bệnh

- Các nhiễm trùng da và niêm mủ sâu: là một hình thức đặc biệt, nặng là đỉnh râu, tiếp đến là chốc lở, viêm tủy xương, viêm màng phổi, viêm màng ngoài tim, viêm màng não

- Nhiễm trùng huyết: từ những điểm nung mủ, vi khuẩn có thể đi vào máu và gây nên nhiễm trùng huyết Nhiễm trùng huyết do tụ cầu là một bệnh thường gặp trong bệnh viện, thường xảy ra ở những người có sức đề kháng giảm sút

- Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrom): Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin, gây viêm da hoại tử và phồng rộp Bệnh này thường gặp ở trẻ mới sinh

- Hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndrome): thường gặp ở những phụ nữ có kinh nguyệt dùng băng vệ sinh dày, nhiễm bẩn, bị nhiễm vi khuẩn tụ cầu vàng Bệnh khư trú ở âm đạo và căn nguyên là tụ cầu vàng, liên

quan đến độc tố gây hội chứng shock nhiễm trùng, cấy máu không tìm thấy tụ cầu vàng

1.3 Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc

SEB là một trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S aureus

Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các

hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc

tố ruột Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất

trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus [14]

Độc tố ruột được hình thành khi tụ cầu vàng sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sư mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu v.v [5]

Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S

aureus nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết Trình tự acid amin của SEB đã

được xác định từ năm 1970 [21]

Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S aureus thường

được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 acid amin

ở đầu N‟ Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 acid amin trong một chuỗi polypeptit đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 kDa Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắc α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị trí 120 và 140 [48] Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống lại sự tác động của các protease gồm trysin, chymotrypsin và papain có trong ruột [14]

Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với

các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G, S, T cùng do vi khuẩn S aureus tạo

ra Đặc biệt, trình tự acid amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự acid amin độc tố ruột C1 cũng có 239 acid amin [17] SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2

và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử MHC nhóm II Phân tích vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt

dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [14]

Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của chủng vi khuẩn S aureus S6 Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được

tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là khung đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042

[17] Đoạn gen seb phân lập từ các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý

khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết Trình tự gen

seb của các chủng khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458,

AY518386), COL (CP000046, AF410775) v.v được công bố trên ngân hàng

dữ liệu gen (NCBI) [18, 26, 40] Cấu trúc tinh thể của protein SEB (hình 1.3) được xác định ở độ phân giải 1,5A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên

1.3.2 Cơ chế gây bệnh

Staphyloccoccal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các lympho T

SEB được coi là một “siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên

và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD4, CD8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có quá

trình thực bào và trình diện kháng thông thường

Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên; 1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích sản xuất cytokin một cách

ồ ạt gây nên hiện tượng shock độc tính trong cơ thể (hình 1.4) Điều này sản sinh ra một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn và tiêu chảy Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra một cách ồ ạt

SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định SEB có khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi trong vòng 10 phút Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể được lưu trữ trong hơn một năm [14]

Hình 1.4 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của tế bào T [51]

1.3.3 Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng

Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học, chống khủng bố sinh

học và chiến tranh sinh học Biểu hiện gen seb thành protein tái tổ hợp không

độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm do SEB gây nên Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo vaccine tiềm năng phòng chống SEB dựa trên việc sử dụng hệ vector từ virus mang gen mã hóa SEB đột biến Chuột sau khi tiêm vaccine này có khả năng chống lại được 5 liều trung bình SEB [23] Tiếp đó, Woody và cs (1997) đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại

vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc Theo đó, khi thử nghiệm 10 µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽ thúc đây phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột [39] Ngoài ra, Lowell và cs cũng nghiên cứu thấy SEB qua xử lý với formalin sẽ trở nên mất độc và được gọi là giải độc tố B của tụ khuẩn Khi chuột dùng qua đường mũi vaccine proteosome SEB giải độc tố sẽ tạo ra được mức cao kháng thể IgG kháng lại SEB trong máu và kháng thể IgA kháng lại SEB ở niêm mạc đường

hô hấp và ruột Vaccine proteosome SEB giải độc tố này cũng đã chứng tỏ hiệu quả bảo vệ tối ưu với 100% số khỉ thực nghiệm [24]

Năm 1992, Swaminathan và cs đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ khả năng miễn dịch của phân tử [34] Năm 1994, Thibodeau

đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm 14 acid amin nằm trong vùng từ acid amin 113 -

126 (rãnh α4) 14 acid amin nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 acid amin có 11 acid amin là giống nhau với mọi SEs Tại rãnh α4 có từ 3 tới

5 vị trí có histidine (H32, h121 và h166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào [35] Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidine trong cấu trúc protein SEB Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carboxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng [32] Vì tyrosine có cấu trúc gần giống với histidine nên thay thế histidine tích điện dương bằng tyrosine ưa

nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm trên Dựa trên cơ

sở đó, năm 2003, Korolev và cs đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các acid amin histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121) [22] Tác giả Savransky và cs sau đó 1 năm (2004) cũng khẳng định SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105; 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái

tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [30]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

- Chuột Balb/C thuần chủng từ 4 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình là

8 - 20 g sử dụng cho thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch

C; tế bào vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) được sử dụng cho

mục đích biểu hiện protein SEB do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp

2.1.3 Các bộ kit

- Kít tách chiết Plasmid (GeneJettmPlasmid Miniprep kit, Fermentas)

- Kít tinh sạch protein (Purification Protocols của hãng Invitrogen)

2.1.4 Hóa chất, máy móc và thiết bị

Các hóa chất chính được sử dụng: Bacto pepton, yeast extract, NaCl,

agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, BSA, ethanol 70%, Reagent Bradford, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất thông dụng khác (ethidium bromide,.v.v.), thang chuẩn DNA, protein

(Fermentas (Mỹ)), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI, HindIII), Taq DNA

polymerase được mua từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Hóa chất sử dụng cho phản ứng Western blot: màng PVDF, Tris-HCl,

Glycine, Methanol, Dung dịch Ponceau, Cộng hợp kháng IgG chuột gắn Horseradish peroxidase (HRP), cơ chất 4-chloro-1-naphtol

Thiết bị sử dụng: Bộ điện di DNA (Labnet), hệ thống máy chạy Western

blot của Biorad, lò vi sóng (Sanyo (Nhật Bản)), máy soi DNA transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Viện Công nghệ sinh học

(Mini-2.1.5 Môi trường và đệm

Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và cs (2001) [29] hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất

2.1.6 Phần mềm

Xử lý số liệu bằng Exel, Gel Doc - IT System (hệ thống ghi hình ảnh và

phân tích gel sau điện di protein)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Đề tài được tiến hành theo sơ đồ nghiên cứu hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu

2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli

BL21(DE3)

Nguyên lý:

Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp

Tiến hành:

- Đặt chủng biểu hiện BL21 vào đá trong vòng 15 phút

- Bổ sung 2,5 µl DNA plasmid vào 100µl BL21, trộn hỗn hợp trên trong eppendorf (epp) 2ml

- Đặt ổn định hỗn hợp trong đá 15 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút

- Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 60 phút nhiệt độ 37oC ở thiết bị nuôi lắc ổn định

- Cấy trải 50 - 150 µl mẫu trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/l (tỉ lệ kháng sinh với LB là 1:1000)

- Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, qua đêm

2.2.2.2 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli

BL21(DE3)

Nguyên lý:

Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và gây biến tính các phân tử protein Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng li tâm tốc độ cao DNA plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol Lượng RNA còn tồn tại trong dung dịch chứa DNA plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung Rnase

Dùng kit tách plasmid của hãng fermentas:

- Bổ sung: 250 µl Resuspension Solution, vortex cho đều cặn

- Bổ sung: 250 µl Lysis solution đảo đều tay (invert)

- Bổ sung: 350 µl Neutralization solution, đảo đều tay (invert)

- Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 25oC

- Chuyển sang cột spin column: chỉ hút pha trên (không hút dịch trắng)

- Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại hết dịch phía dưới cột

- Bổ sung: 500 µl Wash Solution vào cột, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, sau đó loại dịch phần dưới

- Lặp lại bước trên 1 lần nữa

- Sau đó ly tâm 1 lần nữa để loại hết Wash Solution

- Chuyển sang eppendorf 2 ml sạch Bổ sung 50 µl Elution Buffer vào trung tâm cột, không được chạm vào màng

- Để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 2 phút, bỏ cột, ghi nhãn cho sản phẩm

- Kết quả được điện di trên gel agarose

- Bảo quản sản phẩm trong tủ ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

vector này Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và DNA mẫu

Tiến hành:

Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các

Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ

37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%

2.2.2.4 Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi

khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)

Nguyên lý:

E coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa T7 RNA

polimerase trong genome Khi trong môi trường có IPTG, enzym này sẽ được kích hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch

mã sản xuất protein SEB

Tiến hành:

- Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 15 ml môi trường LB lỏng có

bổ sung 15 µl kháng sinh ampicillin ở nhiệt độ 37oC, lắc 200 v/p qua đêm

- Hoạt hóa tế bào: Lấy 4,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 50

ml môi trường LB lỏng có bổ sung 50µl kháng sinh amp, nuôi ở 37oC, lắc