Điều tra nghiên cứu bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua tại hà nội và phụ cận năm 2009 2010

luận văn, khóa luận, cao học, thạc sĩ, tiến sĩ, đề tài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


   -

NGÔ VIỆT BẮC

ðIỀU TRA NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS XOĂN VÀNG NGỌN

CÀ CHUA TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN NĂM 2009 - 2010

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Mã số : 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ BÍCH HẢO

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và ch−a từng đ−ợc sử dụng hoặc công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

đ−ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn Tác giả luận văn

Ngô Việt Bắc Ngô Việt Bắc

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận

được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Ngô Bích Hảo và TS Hà Viết Cường - Giám đốc Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới

- trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin được gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Nông học, Viện Đào tạo Sau đại học

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn các cán bộ tại Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện bản luận văn này

Hà Nội, ngày

Hà Nội, ngày 11116666 tháng tháng tháng 9999 năm 2010 năm 2010 năm 2010

Tác giả luận văn Tác giả luận văn Tác giả luận văn

Ngô Việt Bắc Ngô Việt Bắc Ngô Việt Bắc

2.1.2 Những nghiên cứu về Tomato yellow leaf curl virus 8

3 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 18

3.2.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới 18 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu 18

3.4.1 Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng ruộng 20 3.4.2 Phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh virus hại cà chua 21 3.4.3 Xác ñịnh phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng ngọn cà chua phương

3.4.4 Xác ñịnh tính gây bệnh của virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà

chua bằng kỹ thuật lây nhiễm agroiculation 23 3.4.5 Khảo sát hiệu quả của sử dụng bẫy dính màu vàng ñối với phòng

trừ môi giới truyền virus xoăn vàng ngọn cà chua 24 3.4.6 Khảo sát hiệu lực phòng trừ của thuốc hóa học Actara 25WG

phòng trừ môi giới truyền virus xoăn vàng ngọn cà chua 25 3.4.7 Phương pháp giám ñịnh virus bằng phương pháp huyết thanh 25 3.4.8 Phương pháp giám ñịnh virus gây bệnh bằng phương pháp PCR 27

4.1 Kết quả ñiều tra bệnh do virus hại cà chua tại Hà Nội và vùng

4.1.2 Tình hình bệnh virus tại Hà Nội và vùng phụ cận vụ xuân hè năm

4.1.3 Kết quả ñiều tra bệnh xoăn vàng ngọn cà chua trên ruộng tại Hà

Nội và vùng phụ cận vụ xuân hè năm 2010 35 4.2 Mối quan hệ bọ phấn (Bemisia tabaci) và bệnh xoăn vàng ngọn

cà chua vụ xuân hè năm 2010 tại Hà Nội và vùng phụ cận 37 4.2.1 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ñộ bọ phấn trên giống cà

chua XanhPie vụ xuân hè 2010 tại Cổ Bi - Gia Lâm - Hà Nội 37

4.2.2 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ựộ bọ phấn trên giống cà

chua Mec-89 và VL-2000 vụ xuân hè 2010 tại Văn Lâm - Hưng Yên 39 4.2.3 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn trên tập ựoàn giống cà chua

trồng tại Viện Nghiên cứu Rau quả vụ xuân hè năm 2010 41 4.2.4 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn trên tập ựoàn giống cà chua tại

Khoa Nông học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ xuân hè

4.3 Kết quả phòng trừ bệnh xoăn vàng ngọn cà chua bằng bẫy dắnh

4.3.1 Ảnh hưởng của bẫy dắnh màu vàng ựến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ựộ bọ phấn trên giống cà chua Hồng Ngọc vụ xuân hè 2010

4.3.2 Ảnh hưởng của biện pháp hóa học ựến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ựộ bọ phấn trên giống cà chua 269 vụ xuân hè 2010 tại Tân

4.3.3 đánh giá ảnh hưởng của bệnh xoăn vàng ngọn cà chua ựến một

số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của giống cà chua 269 53 4.4 Kết quả lây nhiễm nhân tạo xác ựịnh phổ ký chủ của virus gây

4.5 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng ngọn cà chua

bằng phương pháp agroinoculation và truyền qua bọ phấn 56 4.6 Kết quả kiểm tra các mẫu bệnh virus hại cà chua thu thập ngoài

ựồng ruộng năm 2010 bằng kỹ thuật ELISA và PCR 57 4.6.1 Kết quả kiểm tra ELISA mẫu bệnh hại cà chua thu thập ngoài

4.6.2 Kết quả kiểm tra PCR mẫu bệnh virus gây hại cà chua bằng cặp

4.6.3 Kết quả kiểm tra PCR mẫu bệnh virus gây hại cà chua bằng cặp

4.6.4 Kết quả kiểm tra PCR mẫu bệnh hại cà chua bằng cặp mồi chung

9 CTAB Cetryl Ammonium Bromide

10 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

11 ICTV International Comittee on Taxonomy of Viruses

12 PCR Polymerase Chain Reaction

13 RNA Ribonucleic Acid

14 RT - PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

15 ToLCVV Tomato leaf curl Vietnam virus

16 TYLCVNV Tomato yellow leaf curl Vietnam virus

4.3 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ựộ bọ phấn trên giống cà

chua XanhPie vụ xuân hè 2010 tại Cổ Bi - Gia Lâm - Hà Nội 38 4.4 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ựộ bọ phấn trên giống cà

chua Mec - 89 và VL-2000 vụ xuân hè 2010 tại Văn Lâm - Hưng

4.5 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn trên tập ựoàn giống cà chua trồng

tại Viện Nghiên cứu Rau quả vụ xuân hè năm 2010 42 4.6 đánh giá tắnh kháng, nhiễm bệnh xoăn vàng ngọn của các

dòng/giống cà chua trồng tại Viện Nghiên cứu Rau quả vụ xuân hè

4.7 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn trên tập ựoàn giống cà chua trồng

tại Khoa Nông học, trường đHNN Hà Nội vụ xuân hè năm 2010 45 4.8 đánh giá tắnh kháng, nhiễm bệnh xoăn vàng ngọn của các

dòng/giống trồng tại Khoa Nông học, trường đHNN Hà Nội vụ

4.9 Ảnh hưởng của bẫy dắnh màu vàng ựến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ựộ bọ phấn trên giống cà chua Hồng Ngọc vụ xuân hè 2010

4.10 Ảnh hưởng của biện pháp hóa học ñến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua 269 vụ xuân hè 2010 tại Tân

4.11 So sánh ảnh hưởng của bệnh xoăn vàng ngọn cà chua ñến một số

chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của giống cà chua 269 53 4.12 Kết quả lây nhiễm nhân tạo xác ñịnh phổ ký chủ của virus gây

4.13 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng ngọn cà chua

bằng phương pháp agroinoculation và truyền qua bọ phấn 56 4.14 Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại cà chua ngoài ñồng

4.15 Kết quả kiểm tra PCR mẫu virus gây hại cà chua bằng cặp mồi ñặc

4.16 Kết quả kiểm tra PCR mẫu virus gây hại cà chua bằng cặp mồi ñặc

4.17 Kiểm tra sự có mặt của begomovirus trên cây cà chua bằng

phương pháp PCR dùng cặp mồi chung BegoA-For1/BegoA-Rev1 67

4.5 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ñộ bọ phấn trên giống cà

chua XanhPie vụ xuân hè 2010 tại Cổ Bi - Gia Lâm - Hà Nội 384.6 Diễn biến bệnh xoăn vàng ngọn và mật ñộ bọ phấn trên giống cà

chua Mec - 89 và VL-2000 vụ xuân hè 2010 tại Văn Lâm - Hưng

4.7 Thí nghiệm dùng bẫy dính màu vàng trong phòng chống bệnh

xoăn vàng ngọn cà chua tại vùng Gia Lâm, Hà Nội năm 2010 484.8 Ảnh hưởng của bẫy dính màu vàng ñến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Hồng Ngọc vụ xuân hè 2010

4.9 Ảnh hưởng của biện pháp hóa học ñến bệnh xoăn vàng ngọn và

mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua 269 vụ xuân hè 2010 tại Tân

4.10 Lây nhiễm bệnh xoăn vàng ngọn cà chua bằng bọ phấn Bemisia

4.14 Kiểm tra sự có mặt của begomovirus trên cây cà chua bằng

phương pháp PCR dùng cặp mồi chung BegoA-For1/BegoA-Rev1 68

Cây cà chua (Lycopersion esculentum Mill) có nguồn gốc ở Bôlivia,

Chilê, Êcuado, Côlômbia, Pêru thuộc Nam Mỹ Ngày nay, cà chua ñã trở thành một trong những loại rau quan trọng ñược trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, ñược dùng trong chế biến thực phẩm, tạo vị ngon và màu sắc hấp dẫn Quả cà chua chín chứa nhiều chất dinh dưỡng như ñường, vitamin A, vitamin C và nhiều chất khoáng quan trọng khác Cà chua có tác dụng khá tốt trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ con người Ngoài ra, cà chua còn có giá trị kinh tế và giá trị sử dụng cao

Ở Việt Nam, cà chua ñược trồng cách ñây trên một trăm năm, diện tích trồng cà chua biến ñộng từ 12 ñến 13 nghìn ha Ở miền Bắc, cà chua ñược trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc vùng ðồng bằng sông Hồng hình thành 3 vụ trồng cà chua bao gồm các vụ: vụ hè thu, vụ ñông xuân và vụ xuân hè

Cây cà chua bị rất nhiều sâu bệnh phá hại, ví dụ như bệnh nấm, bệnh virus, héo xanh vi khuẩn, v.v làm ảnh hưởng trực tiếp ñến năng suất và chất lượng, nhiều khi không cho thu hoạch Bệnh do virus gây ra không

những làm giảm năng suất, chất lượng cà chua, mà ñồng thời gây thoái hoá giống Bệnh do virus ñược coi là tác nhân chính, là trở ngại lớn nhất gây cản trở sản xuất cà chua

Bệnh xoăn vàng lá cà chua là một trong các bệnh hại chính trên cây cà chua, gây tổn thất lớn về năng suất và phẩm chất cà chua Bệnh làm cho lá cà chua xoăn nhỏ lại, cây gần như không có quả Thiệt hại năng suất từ 60 - 90%, thậm chí thất thu hoàn toàn Bệnh xoăn vàng ngọn cà chua thường phát sinh và gây hại nặng vào mùa khô, một số vùng ñôi khi vẫn thấy bệnh xuất hiện trong mùa mưa nhưng không ñại trà như mùa khô

Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng ñã ñược xác ñịnh là do begomovirus gây ra như bệnh xoăn vàng lá cà chua - một bệnh ñược xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới

Bệnh xoăn vàng lá cà chua do Begomovirus thuộc họ Geminiviridae gây hại, bệnh lan truyền trên ñồng ruộng trồng cà chua qua côn trùng môi giới

là loài bọ phấn Bemisia tabaci theo kiểu bền vững tuần hoàn

Việc phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua và các bệnh do begomovirus khác nhìn chung là khó vì virus có tốc ñộ ñột biến và tái tổ hợp rất cao Một trong các chiến lược phòng trừ bệnh là phòng trừ môi giới truyền bệnh là bọ phấn Mặc dù bọ phấn rất khó phòng trừ triệt ñể vì là loài ña thực nhưng nhiều công bố cho thấy có thể hạn chế ñược bệnh nếu duy trì cây sạch bọ phấn trong thời gian sinh trưởng ban ñầu

Do ñó, việc nghiên cứu bệnh xoăn vàng ngọn cà chua do begomovirus nói riêng, các loại virus hại cà chua nói chung là vấn ñề quan trọng ñể từng bước góp phần ñịnh hướng phòng chống bệnh virus hại cà chua phục vụ sản xuất

Xuất phát từ vấn ñề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “ðiều

tra nghiên cứu bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua tại Hà Nội và phụ cận năm 2009 - 2010”

1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài

1.2.1 Mục ñích

ðiều tra và nghiên cứu bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua tại vùng ðồng

bằng sông Hồng; khảo sát một số biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh

1.2.2 Yêu cầu

- ðiều tra bệnh virus hại cà chua một số vùng thuộc Hà Nội

và phụ cận năm 2009 - 2010

- Giám ñịnh virus gây bệnh bằng kỹ thuật ELISA và PCR

- ðiều tra ñặc ñiểm phát triển của bệnh xoăn vàng ngọn cà chua tại vùng Hà Nội và phụ cận

- Thử nghiệm biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh xoăn vàng ngọn cà chua bằng biện pháp hoá học và bẫy dính màu vàng

- Xác ñịnh phổ ký chủ của virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua trong thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Những nghiên cứu ở ngoài nước

2.1.1 Bệnh virus hại cà chua trên thế giới

Ước tính thiệt hại do bệnh virus gây ra trên các loại cây trồng khoảng

15 tỉ ñô la Mỹ (USD) mỗi năm, ñặc biệt là ở các nước nhiệt ñới và bán nhiệt ñới (Van Fanbing, 1999)

Theo Uỷ ban Quốc tế về ñịnh loại virus (ICTV) tháng 5 năm 2000 virus hại thực vật ñược ñịnh loại có hoảng 14 họ trong ñó: 13 họ virus ñã ñược xác ñịnh, 1 họ chưa ñược xác ñịnh Hầu hết các virus thuộc 70 giống khác nhau

Trên cây cà chua có tới 40 loại virus phát sinh phát triển và gây hại bao gồm nhiều loài khác nhau như TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus), ToMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus),… (Gulshan

et al., 1992; Zitter, 1993; Attathom và Sutabutra, 1986; Cerkauskas, 2004) [37], [52], [16], [21]

Các loại virus biểu hiện nhiều triệu chứng khác nhau, làm ảnh hưởng nghiêm trọng ñến sự sinh trưởng, phát triển của cây cà chua Vì vậy, bệnh virus hại cà chua ñã và ñang ñược rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu về ñặc ñiểm sinh học, sinh thái học cũng như phương thức lan truyền ñể ñưa ra biện pháp phòng trừ có hiệu quả, những chủ trương hợp lý trong sản xuất, trong chỉ ñạo phòng trừ dịch hại

Cây cà chua bị nhiều loài dịch hại tấn công, theo CABI (2009) [19] hiện

có 499 loài dịch hại gây hại trên cà chua, trong ñó virus có 41 loài Mặc dù chỉ chiếm một phần nhỏ trong tổng số tất cả các loài dịch hại trên cà chua nhưng bệnh hại do virus gây thiệt hại rất lớn cho các vùng trồng cà chua trên thế giới

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae

Họ Geminiviridae là một trong những họ virus thực vật lớn nhất, bao gồm 209 chi ựã ựược xác ựịnh Các virus thuộc họ Geminiviridae có dạng hình cầu, DNA dạng sợi ựơn, kắch thước chiều dài xấp xỉ 2,7 kb (Fauquet và

Stanley, 2005; Stanley et al., 2005) [28], [50]

Các geminivirus ựều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt , mỗi mặt là một tam giác ựều với số ựơn vị tam giác trên mỗi mặt, nối với nhau ựể tạo ra phân tử hình cầu ựa diện kép (gemini)

Toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 ựơn vị hình thái (Gafni, 2003; Zhang

hai nhóm virus này (Zhou et al., 2003) [54]

Cấu trúc của một DNA-A ựiển hình, có kắch thước 2,8 kb, gồm 6 ORF (khung ựọc mở) ựược sắp xếp theo hai chiều ngược nhau Theo chiều kim ựồng

hồ có hai gen AV1 và AV2

Một phân tử vệ tinh DNA sợi vòng ựơn (DNA-β) thường ựược phát hiện liên quan với nhiều begomovirus bộ gen ựơn trên nhiều loại cây trồng và

cây dại (Fontes et al., 1994; Fauquet et al., 2008) [31], [30]

Cây cà chua bệnh xoăn vàng lá do begomovirus gây hại ựược ghi nhận ựầu tiên trên thế giới từ những năm 1939-1940 tại Israel Theo thống kê có khoảng 50 virus gây hại trên cà chua (Fauquet et al., 2008) [29] Các ựợt dịch bệnh ựã xuất hiện rải rác vào những năm 1960 và bệnh trở nên nghiêm trọng vào ựầu những năm 1970, ở tất cả các vùng trồng cà chua ở Trung đông ựã bị

nhiễm bệnh Bệnh ựã ựược phát hiện ở vùng đông Nam Á thuộc Châu Á, các nước thuộc Châu Phi và Châu Âu vào những năm 1980 (Makkouk và Laterrot, 1983; Czosnek và Ghanim, 2002) [43], [27] Bệnh lần ựầu tiên ựược

công bố tại Châu Mỹ vào năm 1993 (Nakhla et al., 1994) Gần ựây, bệnh còn

lan truyền tới phắa tây địa Trung Hải, Nhật Bản, Iran và các nước cộng hoà nằm trong khu vực Châu Á thuộc Liên Xô (cũ)

Các cây họ cà khác cũng bị begomovirus gây hại, tuy nhiên số lượng loài chưa nhiều, chủ yếu vẫn là Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) và Tomato leaf curl virus (TLCV)

Ngày nay, với sự trợ giúp của các ngành công nghệ mới số lượng begomovirus ựược xác ựịnh khắp nơi trên thế giới ngày càng nhiều Số lượng begomovirus ựược xác ựịnh không ngừng gia tăng 185 loài năm 2005 (Fauquet

và Stanley, 2003) [28] và 266 loài năm 2008 (Fauquet et al., 2008) [30]

* Thi ệt hại kinh tế do begomovirus gây ra:

Bệnh do begomovirus gây ra ựược ghi nhận trên thế giới từ những năm

1939 - 1940 tại Isarel Tuy nhiên, ựến những năm 1960 dịch bệnh mới xuất hiện rải rác và trở nên nghiêm trọng vào những năm 1970 Ở Cộng hoà Dominica năng suất cà chua năm 1993 giảm mạnh tới 80% Ở Sudan, bệnh xoăn vàng lá cà chua làm giảm 70% năng suất khi bệnh nặng Ở Cuba, bệnh hại làm giảm 30% năng suất cà chua Ở Mỹ, bệnh hại không ựáng kể do sự

chăm sóc của con người, trừ năm 1998 năng suất giảm 10 - 50% (Brunt et al.,

1996) [18] Tại các nước thuộc đông Nam Á và các nước nhiệt ựới, cà chua thời kỳ cây con nhiễm bệnh bị sút giảm năng suất từ 80 - 100%

* Tri ệu chứng bệnh do begomovirus gây ra:

Một trong những ựặc ựiểm gây bệnh của begomovirus là các bệnh trên một loài cây trồng thường do nhiều loài begomovirus gây ra với triệu chứng không thể phân biệt ựược

Trên cây cà chua: triệu chứng ñiển hình là lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân lá, lá cuốn cong lên phía trên thành hình thìa lìa, lá non biến vàng nhỏ hẹp, giòn Cuống lá có thể vặn xoắn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, ñốt thân ngắn Cây nhiễm

sớm thường không ra quả do hoa bị rụng nhiều (Pico et al., 1996) [48]

* Ph ổ ký chủ:

Begomovirus có phạm vi ký chủ khá phong phú gồm các loại cây trồng

và cỏ dại Trong ñó, các begomovirus hại trên cà chua thường có phạm vi ký chủ rộng như TYLCV là một trong những begomovirus có phạm vi ký chủ rộng trên nhiều loài thuộc 63 họ thực vật khác nhau Hầu hết các cây họ cà ñều là ký chủ

của virus gây bệnh (Rojas et al., 2001) [49]

Cà chua trồng Lycopersicon esculentum là ký chủ chính của

begomovirus gây bệnh Bên cạnh ñó hầu hết các loài cà chua dại như

Lycopersicon chinense , L hirsutum, L peruvianum, L pimpinellifolium, cây Lisianthus (Eustoma grandiflorum), cây dã yên thảo (Petunia hybrida), cây

ñậu cô ve (Phaseolus vulgaris), cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), cây cà ñộc dược (Datura stramonium) cũng ñều là ký chủ của virus gây bệnh

(Cohen và Nitzany, 1966; Jones et al., 1991; John, 2001) [22], [40], [41]

* S ự lan truyền:

Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn

(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circular)

Bọ phấn là loài ña thực với phổ ký chủ khoảng 500 loài thực vật (Brunt et al., 1996; Pico et al., 1996) [18], [48]

Bọ phấn chích nạp begomovirus trên cây bệnh trong khoảng 15-30 phút, chích truyền trên cây khoẻ cần thời gian ít nhất là 15 phút Begomovirus có mặt

ở tất cả các giai ñoạn trứng, ấu trùng, trưởng thành của bọ phấn (Ghanim et al., 1998) [33] Bọ phấn chứa begomovirus có thể truyền cho con cái ở thế hệ thứ nhất và thứ hai, truyền qua giao phối từ bọ phấn ñực sang bọ phấn cái và ngược

lại Chưa có bằng chứng nào cho thấy begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ

phấn Bemisia tabaci (Ghanim et al., 1998; Czosnek và Ghani, 2002) [33], [27]

2.1.2 Những nghiên cứu về Tomato yellow leaf curl virus

* Vị trắ phân loại:

Virus có tên khoa học là Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae Tên Tomato yellow leaf curl virus ựược ựặt ra từ những năm ựầu thập niên 60 và ựược mô tả là loại virus truyền

qua bọ phấn (Bemisia tabaci) ở Israel (Cohen và Madjar, 1978) [23]

* Phân bố ựịa lý:

Bệnh phân bố rộng ở nhiều nơi trên thế giới, tập trung ở vùng địa Trung Hải, Trung đông, Châu Phi Ở miền Tây Nam, Hoa Kỳ thì TYLCV là virus quan trọng trên cà chua

* Phổ ký chủ:

Theo nghiên cứu của Cohen và Nitzany (1966) [22], phổ ký chủ của virus TYLCV gồm 15 loài cây trồng thuộc 5 họ thực vật Giống cà chua thuần

(Lycopersicon esculentum) là ký chủ chắnh của TYLCV Hầu hết các cây họ

cà ựều là kắ chủ của virus gây bệnh (Jones et al., 1991) [40] Tác giả Brunt và

cộng sự (1996) [18] cho biết có từ 3 - 9 họ thực vật là ký chủ của bệnh

Các loài cà chua dại như Lycopersicon chinense, L hirsianthus, ựậu côve (Phaseolus vulgaris), cà ựộc dược (Datura stramonium), cây dã yên thảo (Petunia hybrida), cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) ựều là ký chủ của

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)

* Triệu chứng bệnh:

Tên của bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua xuất phát từ sự mô tả triệu chứng bệnh Bệnh xoăn vàng ngọn xuất hiện triệu chứng trong vòng 2 - 4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển ựầy ựủ triệu chứng trong vòng 2 tháng Triệu chứng có thể thay ựổi theo ựiều kiện môi trường, giai ựoạn sinh trưởng và ựiều kiện sinh lý của cây tại thời ựiểm nhiễm bệnh (Pico et al., 1996) [48]

Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới và phía trong Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân lás, lá cuốn cong lên phía trên thành hình thìa lìa, lá non biến vàng nhỏ hẹp, giòn Cuống lá có thể vặn xoắn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, ñốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng nhiều

(Pico et al., 1996) [48]

Bệnh xuất hiện và gây hại ngay từ giai ñoạn cây con cho ñến khi kết thúc giai ñoạn sinh trưởng và phát triển Cây bệnh phát triển kém, lá ngọn nhăn nheo thường chùn lại, các lá thường bị xoăn lại cong lõm hình thìa úp, hai mép lá biến vàng từ ngoài vào trong phiến lá, làm cho lá có màu vàng Mùa ñông khi thời tiết lạnh lá có màu tím ðặc biệt triệu chứng thể hiện rất ñiển hình trên lá non và lá gần ngọn Các lá non xoăn mạnh có màu vàng, kích thước nhỏ hơn so với lá cây khoẻ do ñó làm ảnh hưởng ñến sinh trưởng

và phát triển của cây cà chua Cây chậm ra hoa, quả nhỏ

* Nguyên nhân gây bệnh:

Năm 1960, lần ñầu tiên bệnh xoăn vàng ngọn cà chua ñược mô tả và ñịnh tên Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) tại Isarel (Cohen và Harpaz, 1964) Sau ñó nhiều năm người ta mới xác ñịnh chính xác ñược nguyên nhân gây bệnh Ủy ban phân loại virus quốc tế (ICTV, 2000) xác ñịnh virus TYLCV thuộc Begomovirus, Geminniviridae

Virus có hình chày nhỏ, kích thước 20 x 30 nm Sợi DNA của virus có dạng sợi ñơn gồm 2800 nucleotit chứa trong 6 gen Ở dạng sợi ñôi gồm 2 phân

tử DNA: DNA - A và DNA - B, mỗi phân tử có khoảng 2600 nucleotid Sợi DNA - A cơ bản như sợi ñơn, còn sợi DNA - B chỉ gồm có 2 gen Các chủng virus này ngày càng biến ñổi phức tạp do sự tái tổ hợp giữa các loài xảy ra thường xuyên trong họ Geminidae (Moriones và Castillo, 2000; Fauquet và Stanley, 2005) [45], [29]

Monci và cộng sự (2002) [44] khi nghiên cứu bệnh virus hại cà chua ở Tây Ban Nha ñã thấy rằng, có sự kết hợp tự nhiên giữa loài Tomato yellow leaf curl Sardinia virus với loài Tomato yellow leaf curl virus làm cho virus

có tính ñộc cao, có phổ ký chủ rộng hơn so với chỉ có ñơn thuần một virus gây hại

`* Sự lan truyền:

Theo Cohen và Berlinge (1986) [24] chưa có bằng chứng nào cho thấy

sự nhân lên của virus trong cơ thể bọ phấn Virus TYLCV không truyền bằng

cơ học, ñây là tiêu chí quan trọng ñể phân biệt loài virus này với loài virus khác trong họ Geminiviridae

Theo các nghiên cứu của Attathom và Sutabutra (1986) [16], Green và cộng sự (2001) [36], Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) ñược truyền lan

qua bọ phấn Bemisia tabaci theo kiểu bền vững Thời gian bọ phấn nạp virus

là 15 - 20 phút, thời gian bọ phấn truyền virus là 15 phút, triệu chứng xuất hiện trên cây con sau khi bị xâm nhiễm từ 2 - 5 tuần Virus không truyền qua trứng bọ phấn

Bọ phấn hút dịch cây ở giai ñoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng thành chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lại cho ñời sau Có thể phát hiện thấy virus ở bất kỳ giai ñoạn phát triển nào của

bọ phấn trừ giai ñoạn trứng (Ghanim và Czosnek, 2000) [34]

Theo Yuval và cộng sự (2010) [51], khả năng truyền lan của virus gây

bệnh xoăn vàng ngọn cà chua qua bọ phấn Bemisia tabaci tốt hơn khi có mối

tương quan giữa loài bọ phấn này với các loài vi khuẩn cộng sinh

Cho ñến nay chưa có một công trình nào công bố về khả năng lan truyền của bệnh xoăn vàng ngọn qua hạt giống Những nghiên cứu trên cho

thấy bọ phấn Bemisia tabaci là con ñường duy nhất có thể truyền lan Tomato

yellow leaf curl virus (TYLCV)

* Môi giới truyền bệnh:

Bọ phấn Bemisia tabaci Gennadius (1989) thuộc Họ Rầy phấn

(Aleyrodidae ), Bộ Cánh ñều (Homoptera) [1]

Cho ñến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn ñược công nhận ñó là:

Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii ñược tìm

thấy nhiều ở Hoa Kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, …

Sự khác nhau giữa hai loài bọ phấn này là loài B argentifolii ăn tạp, mắn ñẻ

hơn, gây rối loạn ñộc tố cho cây trồng

Kheyr-Pour và cộng sự (1991) [42] cho biết, trên thế giới có khoảng

500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm trên ñồng ruộng ðây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp nhiều khó khăn

Theo Navot và cộng sự (1991) [47], bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành

một vòng ñời khoảng 20 - 30 ngày ở ñiều kiện thích hợp Trung bình có khoảng 11-15 lứa/năm Bọ phấn phát triển mạnh trong ñiều kiện khô và nóng, mưa nhiều làm giảm mật ñộ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều mát ðể tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của

lá, ñiều này phù hợp với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới

Murugan và Uthamasamy (2001) [46] nghiên cứu ñặt bẫy dính bọ phấn theo dõi mật ñộ bọ phấn trên cánh ñồng bông ở Coimbatace (Ấn ðộ) cho thấy:

từ tháng 9 ñến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt ñộ cao, cường ñộ ánh sáng lớn với ẩm ñộ trung bình tạo ñiều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy nở nhanh chóng nên mât ñộ bọ phấn cao, từ tháng 5 ñến tháng 8 mưa nhiều nên mật ñộ bọ phấn thấp, ñỉnh cao của mật ñộ bọ phấn khoảng tháng 11 ñến tháng 1 năm sau

* Biện pháp phòng trừ:

Cohen và Berlinge (1986) [24] ñã ñề xuất các biện pháp ñể trừ bọ phấn bao gồm biện pháp hoá học, biện pháp canh tác và sản xuất giống kháng bệnh TYLCV có phổ ký chủ rất rộng, phân bố rộng khắp trên thế giới nên việc phòng trừ là rất khó khăn Nhiều nhà khoa học ñã và ñang nghiên cứu ñể tìm ra cách phòng trừ hiệu quả nhất

Một số tác giả cho biết, khi trồng cà chua bằng các biện pháp khác nhau bao gồm: bón chất xử lý và phân hữu cơ, phòng trừ sinh học, cây làm rào chắn, công thức bón phân hữu cơ kết hợp với phân hóa học cũng ñược ñưa vào thử nghiệm Kết quả cho thấy hệ thống canh tác nông sinh thái có số lượng bọ phấn trên cây giảm tám lần, cây có biểu hiện bệnh và mức ñộ gây hại giảm một nửa so với canh tác truyền thống Có thể luân canh cây cà chua với cây không ưa thích của bọ phấn như lúa nước, ngô Ngoài ra còn có thể kết hợp biện pháp canh tác với nhổ bỏ cây cà chua bị bệnh nhằm hạn chế nguồn bệnh trên ñồng ruộng

Al-Musa (1982) cho biết nên tránh xen canh cà chua với những cây là

ký chủ của bọ phấn như bí ngô, dưa chuột, … bởi vì chúng là nguồn thu hút

bọ phấn trên ruộng cà chua

ô nhiễm môi trường

Cardona và cộng sự (2001) [20] ñã thông báo về tính kháng thuốc của

bọ phấn với thuốc Imidaclopoid chỉ sau một vài năm sử dụng Ngoài việc sử dụng thuốc hoá học thì dầu khoáng cũng ñược dùng ñể trừ bọ phấn (Hoddle

et al., 1998) [39], sử dụng dầu khoáng sữa nồng ñộ 0,37 - 2% ñể trừ bọ phấn cho kết quả tốt

+ Bi ện pháp sinh học:

Bọ phấn Bemisia tabaci là ñối tượng của nhóm bắt mồi ăn thịt, bị kí

sinh và nấm bệnh như những loại côn trùng khác Trong ñiều kiện tự nhiên ký sinh chỉ ñạt mật ñộ cao vào giai ñoạn cuối của cây trồng và ở nơi sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thấp nhất Các tác nhân sinh học này cũng bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

Theo kết quả nghiên cứu của Hoddle và cộng sự (1998) [39], loài ong

Encasia fomora là loài ñược sử dụng rộng rãi trên thế giới ñể phòng trừ bọ phấn trên cây rau và cây cảnh trong ñiều kiện nhà lưới Tuy nhiên, việc sử dụng thiên ñịch trong phòng trừ bọ phấn còn gặp nhiều khó khăn, do thuốc hoá học

có thể gây chết thiên ñịch và kiến thức cho người nông dân còn thiếu Việc phòng trừ bọ phấn bằng biện pháp sinh học ñang còn là vấn ñề rộng mở, cần ñược các nhà khoa học nông nghiệp tiếp tục nghiên cứu

+ Bi ện pháp cơ giới, vật lý:

Dựa vào xu tính của bọ phấn Bemisia tabaci, các nhà khoa học ñã

nghiên cứu biện pháp bẫy dính màu vàng nhằm làm giảm mật ñộ của chúng trên ñồng ruộng (Murugan và Uthamasamy, 2001) [46]

Shuter và cộng sự (1989) ñã tiến hành nghiên cứu biện pháp che phủ ñất bằng nilon có màu sắc khác nhau nhằm hạn chế mật ñộ bọ phấn trên cà chua Kết quả cho thấy năng suất cà chua cao nhất ở công thức che phủ nilon

vàng (62,3 tấn/ha) sau ñó là da cam (54,8 tấn/ha) rồi ñến màu ánh bạc (52,7 tấn/ha)

Ở Ai Cập, các thí nghiệm ñồng ruộng từ năm 1988-1990 cho thấy khi che phủ vườn ươm cà chua bằng vải muslin trắng ñể bảo vệ cây con không bị

bọ phấn xâm nhập ñã làm giảm sự truyền lan của bệnh xoăn vàng ngọn, vườn ươm ñược che phủ vải ñã làm tăng năng suất từ 413 - 490%

+ Bi ện pháp sử dụng giống chống chịu:

Cây trồng là một sinh vật sống, ñê tồn tại trong tự nhiên và chống lại kẻ thù của mình cũng như các ñiều kiện bất lợi, chúng có các phản ứng tự bảo vệ: có thể chủ ñộng hoặc thụ ñộng Cây cà chua cũng có những ñặc ñiểm có khả năng chống lại kẻ thù nguy hiểm của chúng là bọ phấn và virus TYLCV Các nhà khoa học lợi dụng ñiều này ñể tạo ra những giống cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng ngọn

Theo nhiều tác giả, cơ sở khoa học của sử dụng giống cà chua chống chịu bọ phấn là sử dụng giống cà chua có nhiều túm lông tơ ngăn cản bọ phấn chích hút dịch cây, những giống cây trồng có lông tơ tiết ra nhựa dính giống như bẫy dính hoặc cây trồng có tuyến tiết dịch xua ñuổi bọ phấn ảnh hưởng ñến sinh trưởng phát triển của bọ phấn Trong các mẫu giống cà chua thì một

số giống cà chua có nguồn gốc hoang dại như Lycopersicon hirsutum, L

glabraum , L penellii có ñặc tính này

Trung tâm Nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) ñã lai tạo ra

những dòng cà chua có tính kháng rất cao với bọ phấn Bemisia tabaci cũng

như bệnh xoăn vàng ngọn cà chua như LA1777, LA1418, LA171418, LA716, LA407, PI344818 Sử dụng giống chống chịu nên phối hợp với các biện pháp phòng trừ khác ñể tăng hiệu quả ñồng thời hạn chế sự thích nghi của bọ phấn (Cerkauskas, 2004) [21]

2.2 Những nghiên cứu trong nước

Bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua ñược phát hiện và bắt ñầu nghiên cứu ở Việt Nam vào những năm 60, cùng khoảng thời gian với nhiều nước trên thế giới

Nguyễn Thơ (1984) [11] ñã xác ñịnh ñược bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (TYLCV) ở Việt Nam là khá phổ biến và gây thiệt hại lớn nhất trên cây

cà chua Bệnh lan truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci), từ 3 ñến 4 bọ phấn

tiếp xúc cây bệnh và truyền trên cây khỏe ñã có khả năng lây bệnh tốt

Theo Viện Bảo vệ thực vật (1970) [12], thì cây bị bệnh xoăn vàng ngọn

cà chua trên mặt lá non nhăn nheo, lồi lõm, dọc theo gân lá có màu lục ñậm, mép lá biến vàng và cong lên, lá ra sau càng bị nhỏ, lá màu vàng khi gân lá có màu nâu tím, cây sinh trưởng phát triển chậm, cây bị mắc bệnh sớm chỉ cao

20 - 30 cm, những lá ra trước khi cây bị bệnh vẫn giữ màu xanh bình thường nhưng mép lá hơi cong lên Kết quả ñiều tra giai ñoạn năm 1967 - 1969 cho thấy, tỷ lệ cây bệnh xoăn vàng ngọn thường là 100%, cà chua bị xoăn lá trước khi ra hoa cây không có quả, phải nhổ bỏ ñi

Các kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật (1970) [12] cũng ñã khẳng ñịnh bệnh truyền bằng bọ phấn, 2 bọ phấn truyền thì tỷ lệ cây bệnh là 16,7%; 10 bọ phấn truyền thì tỷ lệ cây bệnh là 100% Cây thuốc lá và lu lu là

ký chủ phụ của bệnh

Theo Lê Lương Tề và cộng sự (2007) [8], trên cây cà chua ngoài bệnh xoăn vàng lá cà chua (TYLCV) còn có các bệnh virus khác thường gặp là virus Y (Potato virus Y), virus X (Potato virus X), TMV (Tobacco mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus)

Nguyễn Thơ (1984) [11] cho biết bệnh xoăn vàng ngọn cà chua gây thiệt

hại ñến 80 - 90% năng suất Cũng theo tác giả, khi mật ñộ bọ phấn (Besmisia

tabaci) từ 56 - 58 con/cây cà chua thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lên tới 99,44% Khi ghép cây mang mầm bệnh với gốc cây khỏe thì tỷ lệ bệnh là 100%

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Viên (1999) [14], bệnh xoăn vàng ngọn là phổ biến, tỷ lệ bệnh cao hơn nhiều so với bệnh khảm lá dương

xỉ và khảm vàng lá Cũng theo tác giả này, bệnh xoăn vàng ngọn lá cà chua (TYLCV) làm giảm năng suất 37,8% khi nhiễm ở giai ñoạn sau ra hoa và giảm tới 83,2% khi cây nhiễm ở thời kỳ trước ra hoa, thậm chí gây thất thu ở nhiều vùng sản xuất cục bộ

Theo Phạm Thị Nhất (2000), bệnh xoăn vàng lá cà chua rất phổ biến ở

nước ta, bệnh do virus gây ra, môi giới truyền bệnh là bọ phấn Bemisia tabaci

và mật ñộ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ bệnh xoăn lá càng lớn Tác giả cho biết bệnh xoăn lá cà chua không truyền qua hạt giống, nguồn bệnh lây lan chủ yếu

do virus ñược giữ lại trong cơ thể của bọ phấn trắng là môi giới truyền bệnh

và ñề xuất biện pháp dùng bẫy dính màu vàng ñể thu hút bọ phấn trắng

Nhiều tác giả cho biết muốn diệt trừ bọ phấn có hai cách là phun thuốc

và dùng bẫy Có thể phun các loại thuốc hóa học ñể trừ bọ phấn Cách thứ hai tuy kém hiệu quả hơn nhưng có thể ñề phòng ñược trước khi bọ phấn lây lan khắp nơi, ñó là dùng các chất keo dính Bọ phấn ưa thích màu vàng nhất là màu vàng sáng hay màu vàng chanh

Từ lâu, người ta ñã sử dụng thuốc hoá học Bi58 diệt bọ phấn theo cách phun ñịnh kỳ và tưới ñể phòng chống bệnh xoăn vàng lá, phun thuốc kết hợp với nhổ bỏ cây bệnh cho hiệu quả phòng trừ bệnh xoăn lá cao nhất

Ngô Bích Hảo (2001) khi nghiên cứu bệnh virus truyền qua hạt giống của một số cây rau và cây họ ñậu (Fabaceae) ñã tìm thấy có 14 loại virus trên hạt giống Trong ñó virus khảm lá cà chua ToMV là một trong những virus truyền qua hạt giống ñã ñược xác ñịnh ở miền Bắc Việt Nam

Theo nghiên cứu của Ngô Bích Hảo và Albrechtsen (2002) [5], trong

41 mẫu hạt giống ñã ñược xác ñịnh gồm cây cà chua, cà tím, cà pháo, ớt cay

và ớt ngọt thì có tới 24% mẫu hạt nhiễm virus ToMV

Ngô Bích Hảo và cộng sự (2003) [6] cho biết trên cây cà chua còn bị các virus khác gây hại là CMV, ToMV, PVY

Ở Việt Nam, ñã phát hiện ra 2 loài begomovirus gây ra bệnh xoăn vàng

ngọn cà chua Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV),

ñược phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở miền Bắc năm 2001

(Green et al., 2001) [36] Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi (TYLCKaV), ñược phân lập ñầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Blawid, 2008) [17] và ñược phát hiện trên cây cà chua tại Việt Nam vào năm 2005

Gần ñây, một loài begomovirus mới cũng ñã ñược phân lập Loài này ñược ñặt tên là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) Trên mẫu cà chua này, một phân tử DNA - β mới cũng ñã ñược phát hiện

(Cuong Ha et al., 2008) [26] Ở Việt Nam, số lượng loài begomovirus gây ra

bệnh xoăn vàng ngọn cà chua ngày càng ñược phát hiện thêm

3 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

* Bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (Tomato yellow leaf curl virus)

3.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

* ðịa ñiểm thực hiện ñề tài:

+ Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội + Các vùng trồng cà chua ở Hà Nội và phụ cận

* Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 1/2010 ñến tháng 7/2010

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới

- Mẫu lá cà chua nghi nhiễm bệnh ñược thu thập trên những cây có triệu chứng bị virus ñiển hình, trên ruộng sản xuất tại các ñiểm ñiều tra Ngắt

3 - 4 lá cho vào lọ nhựa có chứa các hạt silicagel ñã ñược làm khô Mô tả triệu chứng bệnh, ñánh dấu ký hiệu lọ ñựng mẫu

- Hạt, cây chỉ thị và cỏ dại dùng trong lây nhiễm bệnh nhân tạo

- Sử dụng côn trùng môi giới là bọ phấn (Bemisia tabaci)

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu

* Thiết bị nghiên cứu:

Máy ñọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ ñịnh ôn, cân ñiện tử, bể nhiệt

* Dụng cụ nghiên cứu:

- Pipet tự ñộng 1 ñầu côn : 10 - 20 µm, 100 µm, 200 µm, v.v

- Ống ñong, bình thuỷ tinh, phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

- Hộp nhựa có nắp ñể ñựng bản ELISA

- Các khay, chậu nhựa ñể gieo và trồng cây chỉ thị

- Các dụng cụ khác: găng tay cao su, que thuỷ tinh, túi nhựa, v.v

- Bẫy dính mầu vàng tự sản xuất

* Hoá chất:

- Các hoá chất thông dụng và hoá chất ñể pha dung dịch ñệm, chất nền, các kháng huyết thanh của các virus thử nghiệm

- Các hoá chất dùng trong ELISA, PCR, RT - PCR

- Thuốc Actara 25WG, Bion 50WG do Công ty Syngenta Việt Nam cung ứng

* Cây thí nghiệm lây bệnh nhân tạo:

+ Một số giống cà chua

+ Thuốc lá: Nicotiana benthamiana, N tabacum cv Samsun, N tabacum

cv White Burley, N tabacum cv Xanthi - nc

+ Ớt Capsicum annum L

+ Rau muối Chenopodium quinoa L

+ ðậu côve Phaseolus vulgaris L

+ Cà tím Solanum esculenta var esculentum

* Côn trùng môi giới: bọ phấn (Bemisia tabaci)

* Mẫu bệnh virus gây hại cà chua thu thập ở Hà Nội và một số tỉnh khác thuộc phía Bắc Việt Nam

* Nhà lưới trồng cây cách ly, phòng lây bệnh bằng côn trùng, hộp lồng nuôi bọ phấn

3.3 Nội dung nghiên cứu

1 Xác ñịnh diễn biến các loại hình triệu chứng bệnh virus trên một số giống cà chua trồng tại Hà Nội và vùng phụ cận năm 2010

2 Xác định, mơ tả triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra

3 Thu thập mẫu bệnh virus gây hại cà chua tại các điểm điều tra Giám định tác nhân gây bệnh do virus bằng phương pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), phương pháp RT - PCR (Reverse transcription - polymerase chain reaction) và phương pháp cây chỉ thị

4 Khảo sát tình hình bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua trên tập đồn giống cà chua tại Gia Lâm, Hà Nội

5 Lây nhiễm nhân tạo bằng cơn trùng mơi giới nhằm xác định phổ ký chủ của virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (Tomato yellow leaf curl virus)

6 Thử nghiệm một số biện pháp phịng trừ mơi giới lan truyền bệnh virus xoăn vàng ngọn cà chua bằng bẫy dính mầu vàng và bằng biện pháp hĩa học

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp điều tra ngồi đồng ruộng

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại (Bộ Nơng nghiệp và Phát triển thơn, 2003; Viện Bảo vệ thực vật, 2006) [2], [13]

Tiến hành điều tra bệnh hại ngồi đồng chuyên canh rau màu thuộc địa điểm nghiên cứu

ðiều tra định kỳ 7 ngày/lần, trên mỗi giống điều tra theo phương pháp

5 điểm chéo gĩc, mỗi điểm điều tra 50 cây đối với ruộng lớn (trên

360 m2) và tồn bộ số cây đối với ruộng nhỏ (dưới 360 m2)

Theo dõi định kỳ, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh Quan sát và mơ tả đặc điểm cây nhiễm bệnh

Theo dõi diễn biến bệnh virus hại cà chua theo loại hình triệu chứng, thu thập mẫu bệnh để kiểm tra bệnh do virus hại cà chua ngồi đồng ruộng

* ðiều tra diễn biến mật độ bọ phấn: tiến hành điều tra theo 5 điểm chéo gĩc, mỗi điểm cố định 5 cây, điều tra ngẫu nhiên 20 lá/điểm dải đều ở

3 tầng lá

* Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%) và mật độ bọ phấn (con/lá)

3.4.2 Phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh virus hại cà chua

* Phương pháp thu mẫu: mẫu ñựng riêng trong từng túi nilon có ghi các thông tin: tên mẫu, ñịa ñiểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, triệu chứng bệnh

* Phương pháp bảo quản mẫu: có hai phương pháp bảo quản mẫu

+ Phương pháp 1: bảo quản mẫu khô

- Bước 1: Sấy mẫu ở nhiệt ñộ 40oC cho ñến khi mẫu khá khô

- Bước 2: Mẫu ñược gói trong giấy mỏng nhằm cách hạt Silicagel và mẫu sau ñó ñể trong các lọ thuỷ tinh nhỏ

+ Phương pháp 2: bảo quản mẫu tươi

Mẫu thu về ñược ñể nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20oC Không ñưa mẫu ra ngoài khi chưa sử dụng

3.4.3 Xác ñịnh phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng ngọn cà chua phương

pháp cây chỉ thị

3.4.3.1 Giá th ể ñể gieo cây chỉ thị, cây ký chủ phụ

ðất phù sa ñược hấp khử trùng trong nồi hấp chuyên dụng ở nhiệt ñộ từ

115 ñến 1200C trong thời gian 45 phút ñể tiêu diệt các nguồn bệnh vi sinh vật

và các sinh vật khác có trong ñất thí nghiệm ðất sau khi ñã ñược hấp khử trùng ñược bổ sung phân bón vi sinh và vỏ trấu hun tạo ñược giá thể dùng ñể gieo trồng cây chỉ thị Cây chỉ thị ñược gieo trồng, chăm sóc cẩn thận Khi cây lớn, ñạt số lá thật nhất ñịnh thì tiến hành lây nhiễm nhân tạo

Thành phần cây thí nghiệm:

* Họ ðu ñủ Caricaceae: ðu ñủ Carica papaya L

* Họ Bầu bí Cucurbitaceae: Dưa chuột Cucumis sativus L

* Họ Rau muối Chenopodiaceae: Rau muối Chenopodium quinoa W

* Họ ðậu Fabaceae: ðậu cô ve Phaseolus vulgaris L

* Họ Cà Solanaceae: Ớt Capsicum annuum L.; thuốc lá Nicotiana

benthamiana Domin, N tabacum cv Samsun, N tabacum cv White Burley,

N tabacum cv Xanthi - nc; cà chua Lycopersicon esculentum Mill.; cà tím

Solanum melongena cv esculentum

* Nguồn bệnh: Cây cà chua bị nhiễm bệnh xoăn vàng ngọn với triệu

chứng bệnh ñiển hình ñược kiểm tra ELISA, PCR cho kết quả dương tính

* Vector dùng trong thí nghiệm:

Bọ phấn (Bemisia tabaci) ñược thu bắt trên ñồng ruộng sau ñó nuôi

trên cây sạch bệnh cho chúng chích hút và ñẻ trứng, thu bắt bọ phấn trưởng thành ở thế hệ thứ hai ñể lây nhiễm

* Phương pháp tiến hành:

Bọ phấn ñược thả trên cây nguồn bệnh cho chúng chích hút một ñến hai ngày sau ñó chuyển sang cây khỏe ñược trồng trong nhà lưới dùng ñể lây nhiễm, mỗi loại gồm 10 cây, mỗi cây ñặt trong một hộp Mỗi hộp thả 10 con

bọ phấn Cho bọ phấn chích hút truyền virus trên cây thí nghiệm trong thời gian hai ngày sau ñó ñưa ra khỏi hộp và tiến hành phun thuốc Actara 25WG nồng ñộ 0,01% diệt trừ bọ phấn Các cây thí nghiệm ñều có cây ñối chứng

Mỗi công thức dùng 10 cây và thả 10 bọ phấn/cây và có công thức ñối chứng Cây lây bọ phấn ñược giữ trong ñiều kiện cách ly

Cây thí nghiệm ñược ñặt trong lồng lưới cách ly côn trùng và ñể lồng vào trong nhà lưới

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục

3.4.4 Xác ñịnh tính gây bệnh của virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua

bằng kỹ thuật lây nhiễm agroiculation

- Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là:

+ Thấm chân không

+ Tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô

+ Tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào ñất

Chúng tôi sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô:

- Bước 1: Nuôi cây dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm trong 200

ml môi trường LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh (streptomicin 200 µg/ml, refampicin 34 µg/ml và kanamicin 100 µg/ml) trong tủ nuôi cấy có lắc (250 vòng/phút/28oC/2ngày)

- Bước 2: Ly tâm dịch vi khuẩn (3000 g/ 5 phút)

- Bước 3: Hòa cặn vi khuẩn với 5 ml môi trường LB chứa 3 loại kháng

sinh trên

- Bước 4: Dùng kim tiêm tiêm dịch vi khuẩn vào chồi và 4 nách lá tiếp

theo, mỗi vị trí tiêm 10 µl

Chuẩn bị tế bào E coli tiềm năng

* Chuẩn bị môi trường:

(môi trường LB có thể là lỏng (không

có agar) hoặc ñặc (có agar), ñể rót ra ñĩa petri

Nếu bổ xung kháng sinh thì phải ñể môi trường nguội khoảng 55oC

7 Ly tâm giống bước 5 Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn

8 Cho tiếp 80 ml TB lạnh và lặp lại giống bước 6 và 7

9 Hòa cặn vi khuẩn với 20 ml TB lạnh

10 Bổ sung DMSO tới nồng ñộ 7% (9.3 ml dịch TB/vi khuẩn + 0.7 ml DMSO)

11 Cho 150 µl dịch competent cells vào tube 0,5 ml Giữ các tube ở - 80oC Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục

3.4.5 Khảo sát hiệu quả của sử dụng bẫy dính màu vàng ñối với phòng trừ

môi giới truyền virus xoăn vàng ngọn cà chua

Sử dụng bẫy dính màu vàng trên một ñơn vị diện tích trong phòng trừ

bọ phấn

Thí nghiệm ñược bố trí 3 lần nhắc lại trên giống cà chua Hồng Ngọc

ðịa ñiểm thí nghiệm: xã ða Tốn - Gia Lâm - Hà Nội

Sử dụng bẫy dính màu vàng: kích thước 17,8 x 12,6 cm ðặt 4 bẫy/10 m2

Áp dụng phương pháp điều tra như mơ tả ở mục 3.4.1

* Chỉ tiêu theo dõi:

+ ðiều tra 2 ngày/lần: mật độ bọ phấn vào bẫy (con/bẫy)

+ ðiều tra 7 ngày/lần: tỷ lệ bệnh (%) và mật độ bọ phấn (con/lá)

3.4.6 Khảo sát hiệu lực phịng trừ của thuốc hĩa học Actara 25WG phịng

trừ mơi giới truyền virus xoăn vàng ngọn cà chua

Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá khả năng phịng trừ bọ phấn của thuốc hĩa học Actara 25WG

Nồng độ: phun thuốc Actara 25WG 0,01%

Thí nghiệm được bố trí 3 lần nhắc lại trên giống cà chua 269

ðịa điểm thí nghiệm: xã Tân Quang - Văn Lâm - Hưng Yên

* Chỉ tiêu theo dõi:

- Mật độ bọ phấn vào bẫy (con/bẫy) và mật độ trên cây cà chua (con/lá), tiến hành điều tra bọ phấn trên bẫy 5 ngày/lần, mật độ bọ phấn trên cây cà chua định kỳ 7 ngày/lần

- ðiều tra tỷ lệ bệnh bệnh xoăn vàng ngọn cà chua 7 ngày/lần

3.4.7 Phương pháp giám định virus bằng phương pháp huyết thanh

Các phương pháp huyết thanh dựa theo tài liệu mơ tả của Green (1991) [35] và Vũ Triệu Mân (2003) [7]

Sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect - ELISA) để chẩn đốn một số bệnh virus gây hại cà chua

Các bước tiến hành:

Bước 1: Cố định dịch cây cần kiểm tra vào bản, cần mỗi mẫu 0,2 g lá cho chày cối sứ đã được hấp khử trùng nghiền trong dung dịch Carbonate 0,05M pH 9,6 với tỷ lệ lá/dung dịch đệm (g/ml) 1/10 - 1/50 Hút lấy dịch trên tủa, nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 µl/giếng Sau đĩ để bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua một đêm ở nhiệt độ 40C

Bước 2: Chuẩn bị mẫu cây khoẻ nghiền trong dung dịch ñệm pha huyết thanh (PBST-PVP-Ovalbumin) theo tỷ lệ 1/20 (g/ml) Cho kháng huyết thanh vào dịch cây khoẻ theo nồng ñộ ñã pha loãng tuỳ từng loại kháng huyết thanh khuấy ñều và ñể 45 phút trong ñiều kiện 370C

Bước 3: Rửa bản ELISA với ñệm PBS - Tween 1X 3 lần và 2 lần bằng nước cất Mỗi lần cách nhau 3 phút

Bước 4: Cố ñịnh kháng huyết thanh vào bản ELISA, nhỏ vào mỗi giếng 100 µl kháng huyết thanh ñã pha loãng trong dịch cây khoẻ Sau ñó cho bản ELISA vào trong hộp ẩm và ñể ở ñiều kiện nhiệt ñộ 370C trong thời gian 1h30 phút

Bước 5: Rửa bản ELISA như ở bước 3

Bước 6: Cố ñịnh kháng huyết thanh của kháng nguyên IgG thỏ (conjugate AP-alkaline phosphate) với ñệm PBST-PVP-Ovalbumin với ñộ hoà loãng 1/2000 Nhỏ vào mỗi giếng 100 µl ðặt bản ELISA vào hộp ẩm và

ñể ở nhiệt ñộ 370C trong 1h30 phút

Bước 7: Rửa bản ELISA như bước 3

Bước 8: Cố ñịnh chất nền và ñánh giá kết quả:

- Pha 0,5 mg NPP (p - nitrophenyl phosphate)/1ml ñệm substrate rồi hoà tan bằng máy khuấy từ

- Sau ñó nhỏ dung dịch trên vào bản ELISA, nhỏ 100 µl/giếng

ðưa bản ELISA vào hộp ẩm và ñể trong bóng tối ở ñiều kiện nhiệt ñộ phòng thí nghiệm với thời gian từ 60 - 90 phút

Bước 9: ðọc kết quả:

Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) tức là cây nhiễm bệnh Giếng không màu là cây không bị nhiễm bệnh ðọc kết quả tiếp bằng cách ñưa vào máy ñọc ELISA ở bước sóng 405 nm Dừng phản ứng bằng NaOH 3M với lượng 50 µl/giếng

3.4.8 Phương pháp giám định virus gây bệnh bằng phương pháp PCR

Qua quá trình điều tra thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng, chúng tơi đã

sử dụng phương pháp PCR (Polymenraza Chain Reaction) để chẩn đốn virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua

Cĩ hai phương pháp chiết DNA:

* Phương pháp 1: DNA tổng số từ mơ lá được chiết nhanh bằng kiềm

(NaOH) theo phương pháp của Wang et al (1993) như sau:

+ Bước 1: Cho khoảng 50 mg mơ lá vào tube 1,5 ml tiếp tục cho 0,5 ml

dung dịch NaOH 0,5M vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn mẫu lá

+ Bước 2: Hịa lỗng dịch nghiền 50 lần với đệm Tris 0,1M, pH 8

(5 µl dịch nghiền hịa lỗng với 245 µl đệm Tris)

+ Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -20oC

* Phương pháp 2: Chiết tách DNA tổng số bằng CTAB

1 Các b ước tiến hành

+ Bước 1:

- Cho 0,1 g mơ lá tươi hoặc 0,02 g mơ lá khơ vào tube 1,5 ml

- Cho 0,5 ml đệm CTAB + β-ME đã ủ ở 60oC trong 10 phút vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn

- Ủ 10 phút ở 65oC sau đĩ để nguội ở nhiệt độ phịng

+ Bước 2:

- Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đều

- Sau đĩ ly tâm 12.000 vịng /phút trong 10 phút, hút dịch trên của tủa sang một tube mới (0,35 ml)

Rửa cặn hai lần etol 70o (0,7 ml/lần), ñảo nhẹ, ñổ hết etol Sau ñó, spin

và dùng pipet hút hết etol thừa

+ Bước 7: ðể khô cạn trong không khí ít nhất 30 phút

+ Bước 8: Hoà cặn trong 0,1 ml nước cất 2 lần và giữ ở -20oC

2 Ti ến hành phản ứng PCR

+ Thành phần của mỗi phản ứng PCR

H2O : 16,4 µl

10 Dream Taq BF : 2,5 µl dNTPs : 0,5 µl Mồi F : 0,5 µl Mồi R : 0,5 µl Dream Taq : 0,25 µl DNA : 0,5 µl

- Cặp mồi ñặc hiệu ToLCVV (sản phẩm = 454 bp)

Mồi xuôi dòng là ToLCVV-sp-F2 có trình tự: (vị trí 1245) 5’ GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 3’ (vị trí 1276)

Mồi ngược dòng là ToLCVV-sp-R2 có trình tự: (vị trí 1683) 5’ ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 3’ (vị trí 1708)

- Cặp mồi ñặc hiệu TYLCVNV (sản phẩm = 1386 bp)

Mồi xuôi dòng là TYLCVNV-sp-F1 có trình tự : (vị trí 1094) 5’ TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 3’ (vị trí 1117)

Mồi ngược dòng là TYLCVNV-sp-R1 có trình tự: (vị trí 2456) 5’ AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 3’ (vị trí 2480)