Đánh giá khả năng tiêu hoá protein của enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn, ứng dụng trong chế tạo môi trường hottinger

luận văn, khóa luận, cao học, thạc sĩ, tiến sĩ, đề tài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

ðÀO QUANG THỤ

ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIÊU HOÁ PROTEIN CỦA ENZYME PROTEASE CÓ TRONG TỤY TẠNG LỢN, ỨNG DỤNG TRONG CHẾ TẠO MÔI TRƯỜNG HOTTINGER

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: THÚ Y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG QUANG

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan ựây là công trình nghiên cứu của tôi, những số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và kết quả nghiên cứu chưa từng

ựược sử dụng Mọi thông tin trắch dẫn trong báo cáo này ựã ựược ghi rõ

nguồn gốc, tác giả

TÁC GIẢ

đào Quang Thụ

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành ựề tài này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi

còn nh ận ựược rất nhiều sự quan tâm giúp ựỡ và ủng hộ của các thầy cô

giáo, gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp

Quang Khoa Thú y Tr ường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, người ựã tận tình

Xin chân thành c ảm ơn các thầy cô giáo trong Viện ựào tạo sau đại học,

Ban ch ủ nhiệm Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm Khoa Thú y

vacxin vi trùng, Xắ nghi ệp thuốc thú Y TW ựã giúp ựỡ tạo ựiều kiện cho tôi

trong quá trình nghiên c ứu, thực hiện thắ nghiệm và thu thập số liệu tại cơ sở

Xin trân tr ọng cảm ơn!

Tác giả

đào Quang Thụ

2.4 Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật 24

3.2 Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ nghiên cứu 34

4.1.1 Hoạt ñộ của enzyme protease trong tuỵ tạng lợn ngay sau khi giết

4.1.2 Hoạt ñộ enzyme protease trong tuỵ tạng lợn sau khi bảo quản

tạng lợn vào quá trình chế tạo môi trường Hottinger 54 4.2.1 So sánh kết quả hoá nghiệm môi trường Hottinger của giai ñoạn

4.2.2 Khảo sát sự tương quan giữa các thành phần trong môi trường

Hottinger bằng phương trình hồi quy ở hai giai ñoạn SX (2007 –

DANH MỤC VIẾT TẮT TRONG ðỀ TÀI

BQðL : Bảo quản ñông lạnh

DANH MỤC BẢNG

4.1 Kết quả ñánh giá hoạt ñộ enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn

4.2 Kết quả ñánh giá hoạt ñộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng

lợn sau khi bảo quản ñông lạnh tại các thời ñiểm khác nhau 48 4.3 Phân nhóm các giá trị hoạt ñộ enzyme protease trong tuỵ tạng lợn

sau khi bảo quản ñông lạnh tại các khoảng thời gian khác nhau 52 4.4 Thống kê các kết quả hoá nghiệm môi trường Hottinger ñược

4.5 Thống kê kết quả hoá nghiệm môi trường Hottinger ñược sản

4.6 Số lượng vi khuẩn THT gia cầm trong 1ml canh trùng tại thời ñiểm

thu hoạch ñể sản xuất vacxin các năm: 2007, 2008, 2009 và 2010 73

DANH MỤC HÌNH

3.1 Sơ ñồ minh họa quy trình chế biến, bảo quản tuỵ tạng 36 3.2 Sơ ñồ minh họa quy trình ñiều chế dung dịch pancreatin 0,02% 37 3.3 Sơ ñồ minh họa quy trình ñiều chế dung dịch casein 0,2 % 38 3.4 Mô tả thí nghiệm xác ñịnh hoạt ñộ enzyme protease 40

4.1 Hoạt ñộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn lấy ngay

4.2 Hoạt ñộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn giết mổ sau

khi bảo quản ñông lạnh tại các thời ñiểm khác nhau 49 4.3 Hoạt ñộ trung bình của enzyme protease có trong tuỵ tạng của

lợn tại các thời ñiểm khác nhau sau khi bảo quản ñông lạnh 53 4.4 So sánh hàm lượng tổng ñạm trong môi trường Hottinger ñược

sản xuất ở hai giai ñoạn (2007 – 2008) và (2009 – 2010) 59 4.5 So sánh hàm lượng ñạm toan trong môi trường Hottinger ñược

sản xuất ở hai giai ñoạn (2007 – 2008) và (2009 – 2010) 62 4.6 So sánh hàm lượng axit amin tryptophan trong môi trường

Hottinger ñược SX ở hai giai ñoạn (2007 – 2008) và (2009 –

4.7 So sánh hiệu suất tiêu hoá protein trong quá trình chế tạo môi

trường Hottinger ở hai giai ñoạn SX (2007 – 2008) và (2009 –

4.8 Phương trình hồi quy tương quan giữa hàm lượng ñạm toan và

tổng ñạm trong môi trường Hottinger ñược SX ở giai ñoạn (2007

4.9 Phương trình hồi quy tương quan giữa hàm lượng ñạm toan và

tổng ñạm trong môi trường Hottinger ñược SX ở giai ñoạn (2009

4.10 Phương trình hồi quy tương quan giữa hàm lượng axit amin

tryptophan và hàm lượng ñạm toan trong môi trường Hottinger ở

4.11 Phương trình hồi quy tương quan giữa hàm lượng axit amin

Tryptophan và hàm lượng ñạm toan trong môi trường Hottinger

4.12 Số lượng vi khuẩn THT gia cầm có trong 1 ml canh trùng tại

thời ñiểm thu hoạch ñể sản xuất vacxin ở các năm: 2007, 2008,

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Tiêm phòng bằng vacxin là biện pháp phòng bệnh không thể thiếu ñược trong phòng chống dịch bệnh hàng năm tại các cơ sở chăn nuôi nhằm tạo ra miễn dịch ñặc hiệu chủ ñộng bảo hộ cho ñàn gia súc, gia cầm chống lại mầm bệnh xâm nhập từ bên ngoài [5, tr.72]

Vacxin là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên dùng ñể tạo miễn dịch ñặc hiệu chủ ñộng, nhằm tạo ra sức ñề kháng của cơ thể ñối với tác nhân gây bệnh cụ thể [9, tr.44]

Kháng nguyên là chất mà ñược hệ thống miễn dịch nhận biết một cách

ñặc hiệu, là một chất gây ra ñáp ứng miễn dịch (tính sinh kháng thể hay tính

gây mẫn cảm) và rồi phản ứng với các sản phẩm của ñáp ứng này (tính ñặc hiệu) [1, tr.26]

Chế tạo vacxin là tạo ra kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên tương tự vi sinh vật gây bệnh nhưng ñược làm vô hoạt hoặc mất tính ñộc, ñã ñược bào chế ñảm bảo ñộ an toàn cần thiết, kích thích cơ thể tự tạo ra tình trạng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh [16, tr 146-150]

Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương là một trong những ñơn vị ñầu ngành trong cả nước có truyền thống sản xuất các loại vacxin phòng bệnh cho gia súc, gia cầm Tại ñây tất cả các loại vacxin ñược sản xuất ñều là vacxin thế hệ I

Tại phân xưởng vi trùng của Xí nghiệp thuốc thú y TW, quy trình chế tạo vacxin là quá trình nhân giống liên tục từ giống gốc ban ñầu trên môi trường nuôi cấy: giống gốc → giống nhỏ → giống lớn → cấy sản xuất → thu hoạch canh trùng → xử lý canh trùng → ra chai → kiểm nghiệm vacxin

Trong tất cả các công ñoạn thì môi trường nuôi cấy ñóng một vai trò hết sức quan trọng cho sự nhân lên của vi trùng Môi trường nuôi cấy là nơi có ñầy ñủ các nguyên liệu và ñiều kiện ñể vi trùng có thể sinh trưởng và phát triển

Tại tổ Môi trường thuộc Phân xưởng vi trùng, khi phối hợp chế tạo môi trường nuôi cấy thành phẩm cho các loại vi trùng sản xuất vacxin ñều phải dựa trên một môi trường cơ bản là môi trường Hottinger Môi trường Hottinger là môi trường ñược chế tạo dựa trên nguyên lý sử dụng enzyme protease có trong tuỵ tạng của lợn xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid của protein trong ñiều kiện thích hợp (quá trình tiêu hoá chế tạo môi trường Hottinger), tạo thành các tiểu phần là amino axit và các peptid ñơn giản tan vào trong nước Môi trường Hottinger là thành phần chính và chủ yếu của tất

cả các môi trường thành phẩm trong sản xuất vacxin vi trùng

Chế tạo môi trường Hottinger, ngoài yếu tố nguyên vật liệu ñầu vào thì quá trình tiêu hoá cơ chất ñóng một vai trò rất quan trọng Quá trình tiêu hoá cơ chất triệt ñể sẽ giải phóng ra nhiều các amino axit (ñạm toan) mà ñây chính là nguyên liệu chính ñể vi sinh vật sử dụng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Hàm lượng ñạm toan trong môi trường cao sẽ làm tăng số lượng vi trùng mọc trong 1ml canh trùng khi thu hoạch, qua ñó sẽ quyết ñịnh

ñến chất lượng của vacxin khi xuất xưởng

Những năm qua, quá trình chế tạo môi trường Hottinger tại phân xưởng

vi trùng sử dụng enzyme protease có trong tuỵ tạng lợn, nhưng tuỵ tạng lợn khi ñem sử dụng ñể tiêu hoá cơ chất là thịt bò, thường không ñược kiểm tra

ñánh giá hoạt ñộ enzyme protease, tỷ lệ phối hợp giữa tuỵ tạng với cơ chất

khi tiêu hoá thường cố ñịnh (theo tỷ lệ: 1,3 kg tuỵ tạng + 10 kg thịt bò + 100 lít nước cất) Tỷ lệ này chủ yếu dựa trên kinh nghiệm là chính, do vậy hiệu suất của quá trình tiêu hoá chế tạo môi trường Hottinger chưa ổn ñịnh, phần nào ảnh hưởng tới chất lượng của vacxin

Xuất phát từ thực tế sản xuất: muốn nâng cao chất lượng vacxin phải

ổn ựịnh chất lượng môi trường nuôi cấy vi trùng, trong ựó phải chú trọng ựến

khâu tiêu hoá chế tạo môi trường Hottinger Trong khâu này hoạt ựộ của enzyme protease và tỷ lệ phối hợp giữa tuỵ tạng với thịt bò sử dụng trong quá trình tiêu hoá chế tạo môi trường Hottinger ựóng một vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra chất lượng môi trường thu ựược

Dựa trên những yêu cầu thực tế sản xuất ựã ựược nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài khoa học:

Ộđánh giá khả năng tiêu hoá protein của enzyme protease có trong tuỵ tạng của lợn, ứng dụng trong chế tạo môi trường Hottinger Ợ

1.2 Mục ựắch, ựối tượng nghiên cứu

đề tài chủ yếu tập trung nghiên cứu hoạt ựộ của enzyme protease có

trong tuỵ tạng của lợn qua ựó xác ựịnh tỷ lệ phối hợp thắch hợp giữa tuỵ tạng

và cơ chất (thịt bò) ựể sản xuất môi trường Hottinger

1.3 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của ựề tài

- Ý nghĩa thực tiễn của ựề tài:

Xác ựịnh tỷ lệ phối hợp thắch hợp giữa tuỵ tạng và thịt bò khi tiêu hóa chế tạo môi trường Hottinger thông qua việc xác ựịnh hoạt ựộ của enzyme protease có trong tuỵ tạng sẽ làm tăng hiệu suất của quá trình tiêu hoá, tăng hàm lượng ựạm toan có trong môi trường thu ựược, từ ựó tăng số lượng vi trùng khi cấy sản xuất, qua ựó nâng cao chất lượng của vacxin

- Ý nghĩa khoa học của ựề tài:

Nghiên cứu về hoạt ựộ enzyme protease chắnh là cơ sở khoa học của phương pháp chế tạo môi trường Hottinger

2 TỔNG QUAN

2.1 Enzyme học cơ bản

2.1.1 Khái niệm về enzyme

Enzyme là những chất xúc tác sinh học do cơ thể sống tổng hợp nên Chúng xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, nhờ có enzyme mà các quá trình hoá sinh xảy ra rất nhạy với tốc ñộ rất nhanh trong những ñiều kiện sinh lý bình thường (nhiệt ñộ cơ thể và pH môi trường mô bào) [14, tr 74]

Enzyme cũng giống như các chất xúc tác hoá học khác chỉ làm tăng tốc ñộ phản ứng mà không tham gia vào sản phẩm cuối cùng của phản ứng, bởi vì nó làm tăng tốc ñộ cả hai chiều phản ứng, làm cho phản ứng sớm ñạt tới trạng thái cân bằng Chiều của phản ứng không phụ thuộc vào chất xúc tác mà phụ thuộc vào nồng ñộ, năng lượng trong hệ thống phản ứng

[8, tr 1]

Hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong hệ thống sống ñều do các protein xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay fecmen (ferment) Enzyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống chúng vẫn có thể xúc tác cho phản ứng ở ngoài tế bào (invitro) [4, tr 110]

2.1.2 Cấu trúc và các dạng enzyme

Enzyme là protein vì chúng có cấu tạo từ các axit amin với các cấu trúc bậc I, II, III, IV như protein và chúng có ñầy ñủ các tính chất vật lý, hoá học của protein như ñặc tính keo, ñiểm ñẳng ñiện, hiện tượng sa lắng và cũng bị phá huỷ bởi các yếu tố nhiệt ñộ, axit, kiềm mạnh như protein

Enzyme thuộc loại protein hình cầu, phần lớn (60-70%) có bản chất là các protein phức tạp Enzyme có khối lượng phân tử thay ñổi rất rộng từ

12,000 Dalton ñến hàng triệu Dalton [14, tr 74-75]

Cho ñến nay, trên 3000 enzyme ñã ñược mô tả một cách chi tiết, trong

ñó nhiều enzyme ñã ñược phân lập Người ta ñã khám phá ra cấu trúc bậc

nhất, cấu trúc không gian và mô tả khá chi tiết cơ chế tác ñộng của một số enzyme [8, tr 2-3]

2.1.3 Trung tâm hoạt ñộng của enzyme

Trung tâm hoạt ñộng của enzyme là nơi tiếp xúc giữa enzyme với ñối tượng tác ñộng của nó (cơ chất), là nơi enzyme thực hiện phản ứng

[14, tr 75]

Theo Fischer (1894), các phản ứng enzyme xảy ra trong một vùng tương ñối nhỏ của phân tử enzyme Vùng này ñược gọi là trung tâm hoạt

ñộng (TTHð) của enzyme TTHð là vùng không gian giới hạn nhỏ, chứa các

nhóm chức năng ñược phân bố, ñịnh hướng một cách chính xác Các nhóm chức năng này là thành phần của các gốc axit amin ñôi khi khá xa nhau trên chuỗi polipeptide, tuy nhiên lại gần nhau trong không gian nhờ sự cuộn lại, gấp nếp lại của chuỗi (nhờ cấu trúc bậc ba).[8, tr 12]

2.1.4 Tính ñặc hiệu của enzyme

Tính ñặc hiệu cao của enzyme là một trong những sai khác chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất ñịnh theo một kiểu phản ứng nhất ñịnh ðặc tính tác dụng lựa chọn cao này gọi là tính ñặc hiệu hay tính chuyên hoá của enzyme [4, tr 115]

2.1.5 Những quan ñiểm về cơ chế xúc tác của enzyme

* Thuyết bổ sung (complementarity) hay thuyết “chìa khoá (cơ chất)

và ổ khoá (enzyme)” của E.Fischer (1894)

* Thuyết lập hợp chất trung gian Henri, (1902), sau này ñược Michaelis và Menten phát triển

* Cơ chế tác ñộng nhờ cấu trúc phân tử của enzyme

* Vai trò của sự thay ñổi cấu hình

* Bản chất hoá học của quá trình xúc tác enzyme

Các nhóm xúc tác trong TTHð trước hết là các nhóm ái nhân (tức là nhóm có cặp ñiện tử tự do), có khả năng tạo liên kết với các nhóm ái ñiện tử của cơ chất Ví dụ: nhóm hydroxyl của Ser, thiol của Cys, các nguyên tử nitơ nitơ ở vòng imidazol của His

Trong một số trường hợp thì ngược lại, các nhóm xúc tác của enzyme lại có thể nhận ñiện tử, mà chất cho ñiện tử là các nhóm ái nhân của cơ chất Những nhóm xúc tác ái ñiện tử này có thể là ion kim loại và nhóm NH 3 + trong TTHð của một số enzyme

Nhiều enzyme làm việc theo cơ chế xúc tác axit-bazơ, nghĩa là hoạt tính của một trong các chất phản ứng tăng lên khi nhận proton hay khi bị tách mất proton Các nhóm có tính axit hay tính bazơ trong trung tâm hoạt ñộng có hoạt tính xúc tác này, ví dụ nhóm cacboxyl, amin, phenol, thiol và ñặc biệt là vòng imidazol Giá trị pKa ≈ 6,5 tạo ñiều kiện cho các nhóm này hoạt ñộng

ñồng thời như chất cho hay chất nhận proton trong ñiều kiện pH sinh lý

[8, tr 17-28]

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme:

Tốc ñộ các phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào:

* Nồng ñộ cơ chất và nồng ñộ enzyme

* Các chất gây hiệu ứng: Bao gồm các chất kìm hãm và các chất kích hoạt enzyme

- Các chất kìm hãm:

Hoạt ñộ của enzyme có thể bị thay ñổi dưới tác dụng của một số chất

có bản chất hoá học khác nhau Các chất làm giảm hoạt ñộ enzyme gọi là các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế (inhibitor), thường ký hiệu là I Các chất

này có thể là những ion , các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein Các chất ức chế tham gia trong ñiều hoà, kiểm tra các quá trình trao ñổi chất trong

hệ thống sống

Các chất gây biến tính protein là những chất kìm hãm không ñặc hiệu enzyme Nhiều chất khác không làm biến tính protein nhưng vẫn làm giảm hoạt ñộ xúc tác của nó theo cơ chế khác

Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzyme Nếu là kiểu kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp giữa enzyme

và chất kìm hãm (I) nhanh chóng ñạt ñến cân bằng:

Trong trường hợp kìm hãm không thuận nghịch, k-i rất bé, có thể xem như bằng 0, I kết hợp với E bằng liên kết ñồng hoá trị hoặc kết hợp rất chặt chẽ tới mức khó lòng tách khỏi E, sự phân li phức EI là rất chậm

+ Các ch ất kìm hãm không cạnh tranh: Chất kìm hãm này kết hợp

với enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt ñộng, làm thay ñổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme do ñó theo hướng không có lợi cho hoạt ñộ xúc tác của nó, làm giảm tốc ñộ phản ứng xúc tác Sau khi kết hợp với chât kìm hãm không cạnh tranh, enzyme vẫn có thể kết hợp với cơ chất tạo thanh phức EIS, phương trình phản ứng khi có chất kìm hãm không cạnh tranh như sau:

Khi có chất kìm hãm không cạnh tranh, vận tốc cực ñại bị giảm, vận tốc phản ứng bị giảm tương ứng Dưới tác dụng của chất kìm hãm không cạnh tranh, mức ñộ kìm hãm không phụ thuộc vào tương quan nồng ñộ giữa S và I, nồng ñộ cơ chất lớn cũng không loại trừ ñược tác dụng kìm hãm Trong một số trường hợp sản phẩm của phản ứng có thể có tác dụng như chất kìm hãm không cạnh tranh của enzyme Ngoài ra cũng có trường hợp chất kìm hãm chỉ kết hợp với ES mà không kết hợp với E tự do Các chất kìm hãm nhất là những chất có tính ñặc hiệu cao có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu hoa học cũng như trong thực tế

+ Các ch ất kim hãm protein: thường có tính ñặc hiệu khá cao, kìm hãm

thuận nghịch enzyme, chúng có vai trò quan trọng trong việc ñiều hoà, kiểm tra quá trình trao ñổi chất trong hệ thống sống Thuộc loại này, các protein

ñiều hoà hoạt ñộ của proteinase ñược nghiên cứu nhiều hơn cả và ñã ñược sử

dụng trong y học, trong nghiên cứu khoa học [4, tr 126-133]

- Các chất kích hoạt (activator):

Các chất kích hoạt góp phần làm tăng hoạt ñộ xúc tác enzyme Bản chất hoá học của chúng khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại, hoặc các chất hữu cơ Các chất này thường kết hợp trực tiếp với phân tử enzyme làm thay ñổi cấu trúc không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt ñộ xúc tác Tuy nhiên, tác dụng kích hoạt cũng chỉ giới hạn ở những nồng ñộ nhất ñịnh, nếu vượt quá giới hạn thì tác dụng ngược lại [13, tr 116]

* Các yếu tố lý hoá của môi trường:

- Nhi ệt ñộ:

Tốc ñộ phản ứng tăng khi nhiệt ñộ tăng Tuy nhiên khi nhiệt ñộ tăng

ñồng thời cũng làm enzyme mất hoạt tính (vì apoenzyme biến tính và cofactor

có thể bị tách ra) Vì hai hiện tượng trên mà enzyme hoạt ñộng tốt nhất ở nhiệt ñộ tối ưu [8, tr 31]

Nhiệt ñộ thích hợp ñể các enzyme hoạt ñộng là nhiệt ñộ của thân nhiệt (37-40 0 C) Nhiệt ñộ cao quá làm cho chuyển ñộng nhiệt của các ion tăng quá mạnh làm ñứt các dây nối, phá vỡ cấu trúc bậc ba do ñó enzyme bị tê liệt hoặc

bị phá huỷ hoàn toàn Nhiệt ñộ thấp quá (0 0 C) phân tử không chuyển ñộng, sự

va chạm giữa enzyme với cơ chất giảm làm cho hoạt tính của enzyme giảm hoặc mất hẳn Tác ñộng của nhiệt ñộ chưa sâu sắc thì enzyme có thể phục hồi Nhiệt ñộ tăng ở mức thích hợp thì có tác dụng kích thích hoạt ñộng của enzyme (sốt nhẹ) [14, tr 76]

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên theo nhiệt ñộ trong một giới hạn xác ñịnh mà ở ñó phân tử enzyme vẫn còn bền chưa bị biến tính [4, tr 133]

Nhiệt ñộ ứng với hoạt ñộ enzyme cao nhất gọi là nhiệt ñộ hoạt ñộng thích hợp của enzyme (t opt ) ða số enzyme có t opt vào khoảng 40 0 -50 0 C Tuy nhiên topt của một enzyme không cố ñịnh mà có thể thay ñổi tuỳ từng cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng Nhiệt ñộ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt ñộ tới hạn, thường vào khoảng trên 70 0 C Ở nhiệt ñộ tới hạn enzyme bị biến tính, ít có khả năng phục hồi lại ñược hoạt

có thể tăng khi ñưa về nhiệt ñộ bình thường

ðộ bền của mỗi enzyme thường tăng lên khi có cơ chất, coenzyme,

ðồ thi minh hoạ ñường

biểu diễn ảnh hưởng nhiệt

ñộ ñến tốc ñộ phản ứng

enzyme

- pH:

Mỗi enzyme có một vùng pH hoạt ựộng tốt nhất của mình, ngoài vùng

ựó hoạt ựộ enzyme bị giảm sút hoặc mất hẳn Bản chất của sự ảnh hưởng này

là do nồng ựộ H + thay ựổi ựã ảnh hưởng ựến sự phân ly của các gốc tạo nên cấu trúc bậc III của enzyme, ảnh hưởng tới sự phân ly, phân cực giữa enzyme

và cơ chất có nghĩa là pH ảnh hưởng tới pKa của các nhóm ion chức năng

của enzyme cũng như cơ chất [14, tr 76]

Hoạt tắnh xúc tác của enzyme phụ thuộc vào pH là do các nhóm chức

có thể bị phân ly cho H + ở trung tâm hoạt ựộng của enzyme hay của cơ chất quy ựịnh; phản ứng của enzyme và cơ chất phụ thuộc vào khả năng tách proton của các nhóm chức này Do ựó phần lớn các enzyme chỉ có khả năng xúc tác ở một khoảng pH nhất ựịnh, ngoài khoảng này tốc ựộ xúc tác sẽ giảm Enzyme ựạt tốc ựộ xúc tác cực ựại ở pH tối ưu

đa số các enzyme có pH tối ưu khoảng 5 Ờ 7 Một số enzyme tiêu hoá lại hoạt ựộng tốt ngoài khoảng này, vắ dụ: pepsin pH= 1,5-2, trysin và chymotrypsin pH = 8 Ờ 11, arginase pH = 9,5 Ở một số enzyme, khoảng pH tối ưu khá hẹp, ở một số khác lại khá rộng đôi khi pH tối ưu có thể khác và phụ thuộc vào loại cơ chất, vắ dụ pH tối ưu của enzyme phân giải protein có thể thay ựổi phụ thuộc vào loại protein ựược phân giải [8, tr 31]

pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt tới phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng

ựến mức ựộ ion hoá cơ chất, enzyme và ảnh hưởng tới ựộ bền của protein

enzyme độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có cơ chất coenzyme, Ca ++ v.v

đường biểu diễn ảnh hưởng của pH ựến vận tốc phản ứng cho thấy pH

thắch hợp (pH opt ) cho hoạt ựộng nhiều loại enzyme vào khoảng 7 Tuy nhiên

có một số enzyme có pH opt rất thấp hoặc khá cao pH opt của một enzyme cũng không cố ựịnh mà phụ thuộc nhiều vào nhiều yếu tố khác nhau như cơ chất, tắnh chất dung dịch ựệm, nhiệt ựộ v.v

Ngoài một số yếu tố chính ñã nêu trên, hoạt ñộ của enzyme còn phụ thuộc nhiều vào yếu tố khác như: ánh sáng (ñặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu

âm, tia bức xạ v.v Trong hệ thống sống, hoạt ñộ enzyme còn phụ thuộc vào giai ñoạn sinh trưởng và phát triển v.v [4, tr 134]

Hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào thế oxy hoá khử, lực ion và tính thấm tương ñối của môi trường [8, tr 31]

2.1.7 Enzyme protease

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit ñến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất ña dạng về chức năng từ mức ñộ tế bào, cơ quan ñến cơ thể nên ñược phân bố rất rộng rãi trên nhiều

ñối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) ñến thực vật (ñu ñủ,

dứa ) và ñộng vật (gan, dạ dày bê ) So với protease ñộng vật và thực vật, protease vi sinh vật có những ñặc ñiểm khác biệt Trước hết, hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể ñồng nhất Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính ñặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ

ðồ thi minh hoạ ñường

biểu diễn ảnh hưởng của

pH tới hoạt ñộ của enzyme

phân triệt ñể và ña dạng

* Ngu ồn thu nhận enzym protease:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu

ñược từ nhựa của lá, thân, quả ñu ñủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ

quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này ñược sử dụng ñể chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu ñược từ nhựa cây cọ (Ficus carica) là enzyme ñược sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

- ðiều chế dung dịch ñạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, làm chất tăng hương vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có ñộ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn

trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

- ðiều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật ñể sản xuất vacxin, kháng sinh, [7, tr 113-115], [17, tr 58-59]

2.1.8 Xác ñịnh hoạt ñộ của enzyme

* Khái ni ệm về hoạt ñộ của enzyme

Khác với trong hoá học phân tích bình thường, trong enzyme học người

ta không ñịnh lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác ñịnh gián tiếp thông qua việc xác ñịnh ñộ hoạt ñộng ( hoạt ñộ) của enzyme Trong phản ứng

có enzyme xúc tác, sự hoạt ñộng của enzyme ñược xem xét bằng cách ñánh giá sự thay ñổi các tính chất vật lý, hoá lý cũng như tính chất hoá học của hỗn hợp phản ứng Theo dõi những biến ñổi ñó có thể biết ñược chính xác mức ñộ hoạt ñộng của enzyme thông qua xác ñịnh cơ chất bị mất ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành trong phản ứng

ðể xác ñịnh hoạt ñộ của enzyme ở các dịch chiết hay ở chế phẩm,

người ta thường dùng phương pháp vật lý hay hoá học Các phương pháp: so màu, ño khí, ño ñộ phân cực, ño ñộ nhớt, chuẩn ñộ ñược dùng phổ biến trong nghiên cứu ñịnh lượng các phản ứng enzyme

Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

1 ðo lượng cơ chất bị mất ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành trong một thời gian nhất ñịnh ứng với một nồng ñộ enzyme xác ñịnh

2 ðo thời gian cần thiết ñể thu ñược một lượng biến thiên nhất ñịnh của cơ chất hay sản phẩm với một nồng ñộ enzyme nhất ñịnh

3 Chọn nồng ñộ enzyme như thế nào ñể trong một thời gian nhất ñịnh thu ñược sự biến thiên nhất ñịnh về cơ chất hay sản phẩm [7, tr 42-43]

- Bản chất các enzyme là protein nên thường không bền vững, rất nhạy

cảm với các tác nhân lý, hoá Vì vậy khi làm thí nghiệm với enzyme cần tránh các yếu tố có thể gây biến tính, vô hoạt enzyme như: nhiệt ñộ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, kim loại nặng và muối của chúng tránh tạo bọt dung dịch vì một số enzyme có thể bị kìm hãm trên bề mặt phân chia pha

Các ñiều kiện (thông số) phản ứng (t o , pH, áp suất ) phải ở trong giới hạn enzyme có thể tồn tại bền vững và ñược giữ cố ñịnh trong suốt thời gian phản ứng Muốn vậy phải tiến hành phản ứng trong dung dịch có pH xác ñịnh, bình phản ứng phải ñặt trong máy siêu ổn nhiệt, các chất phản ứng (cơ chất, cofactor ) phải có nhiệt ñộ của bình phản ứng trước khi nạp vào

Thời gian xác ñịnh hoạt ñộ không nên quá lâu, thường trong khoảng 5-

30 phút Tốt nhất là xác ñịnh tốc ñộ phản ứng ở phút ñầu tiên (30-60s) vì tốc ñộ phản ứng ổn ñịnh, enzyme chưa bị các tác ñộng ảnh hưởng nhiều ñến hoạt ñộ Trong một số trường hợp nếu hoạt ñộ enzyme quá thấp hay cần nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hoá học, hoá sinh (kim loại, gốc axit, bazơ ) cần phải ủ enzyme với cơ chất có yếu tố khảo sát trong thời gian ñủ lâu (> 1h)

Khi xác ñịnh hoạt ñộ enzyme, bên cạnh mẫu thí nghiệm (enzyme tác dụng với cơ chất) cần làm mẫu kiểm tra (kiểm chứng, mẫu trắng) trong ñó enzyme ñã bị mất hoạt ñộng (hoặc không có enzyme) trước khi tiếp xúc với

cơ chất Mẫu này cũng thực hiện giống mẫu thí nghiệm nhưng chỉ khác là phải vô hoạt (ñình chỉ hoạt ñộ) của enzyme hoặc là không thêm enzyme Hoạt

ñộ enzyme ñược tính bằng hiệu số lượng cơ chất (hay sản phẩm phản ứng)

giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra

* Các ph ương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzyme

Có thể phân chia thành hai loại phương pháp: liên tục và gián ñoạn

- Phương pháp liên tục: sử dụng máy móc, thiết bị ñặc biệt hoạt ñộng

tự ñộng liên tục (chuẩn ñộ, so sánh, ño ñạc) với cơ cấu tự ñộng ghi lại sự biến

ñổi của các chất và các thông số phản ứng (hiển thị bằng bảng, biểu, ñồ thị,

enzyme ñồ ) trong suốt thời gian tác dụng của enzyme

Như vậy phương pháp này có nhiều ưu ñiểm, hoàn toàn tự ñộng, có kết quả ngay, cùng một lúc có thể xác ñịnh hoạt ñộ của nhiều mẫu enzyme theo một chương trình ñịnh sẵn ðây là xu hướng thực tiễn hiện nay với công nghệ cao

- Phương pháp gián ñoạn: cho enzyme tác dụng với cơ chất, sau những khoảng thời gian nhất ñịnh thì lấy mẫu phản ứng ñể phân tích kết quả

Có thể gọi phương pháp này là phương pháp cổ ñiển nhưng hiện nay vẫn còn ñược sử dụng phổ biến trong nghiên cứu thăm dò, sơ bộ , thí nghiệm

ñại cương, ñịnh tính Chỉ có một số ít thao tác với enzyme tinh khiết ñược

xem là hiện ñại

Thường dùng cơ chất của enzyme có ñộ nhớt lớn hơn (hoặc nhỏ hơn) sản phẩm phân huỷ của nó Sự biến ñổi ñộ nhớt này là thước ño hoạt ñộ enzyme Phương pháp này thường dùng ñể xác ñịnh hoạt ñộ enzyme thuỷ phân amylase, proteinase

Thường dùng khi cơ chất của enzyme hoặc sản phẩm phân giải của nó

có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và góc quay riêng của chúng có khác nhau Người ta thường dùng phương pháp này ñể xác ñịnh hoạt ñộ của saccarase Cơ chất của enzyme này là ñường sacarose có góc quay riêng là +66.5 o (phía phải) Sản phẩm thuỷ phân của nó là glucose (góc quay riêng +52,5 o ) và fructose (góc quay riêng là – 92,4 o phía trái) Khi enzyme tác ñộng lên saccarose tuỳ theo mức ñộ thuỷ phân mà góc quay tổng cộng giảm dần và chuyển từ phải sang trái ðây là phản ứng nghịch ñảo rất kinh ñiển trong nghiên cứu ñộng học phản ứng, ñường tạo ra gọi là ñường

nghịch ñảo (từ phải sang trái mặt phẳng ánh sáng phân cực) Tác nhân xúc tác thông thường (không phải enzyme) là axit vô cơ (HCl, H 2 SO 4 )

- Phương pháp áp kế:

ðược dùng khi phản ứng enzyme tạo thành hay hấp thụ khí, chẳng hạn các loại phản ứng oxy hoá có sự tham gia của phân tử oxy (oxy hoá hiếu khí), decacboxy hoá, deamin hoá (loại CO 2 , NH 3 ) Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp này ñể xác ñịnh hoạt ñộ của enzyme trong quá trình phản ứng không trực tiếp làm biến ñổi thể tích nhưng khó thông qua các phản ứng trung gian tiếp theo (thể hiện gián tiếp hoạt ñộng của enzyme và do ñó thể hiện hoạt ñộ của nó) tạo thành hoặc hấp thụ khí

Ví dụ: - Các phản ứng tạo axit hữu cơ do enzyme oxy hoá khử lipase xúc tác có thể ở dạng dung dịch ñệm bicacbonat (HCO 3 ) ñể tạo thành CO 2 theo phản ứng:

là do hoạt ñộ enzyme Phương pháp này ñược sử dụng rộng rãi ñể nghiên cứu các enzyme thuộc nhóm oxy hoá khử oxydoreductase, chẳng hạn:

+ Các dehydrogenase với coenzyme NAD + hoặc NADP + Tốc ñộ phản

ứng enzyme ñược xác ñịnh theo mức ñộ khử hoặc oxy hoá coenzyme của

chúng Dạng khử NADH, NADPH và dạng oxy hoá của các coenzyme này

khác nhau rõ rệt về khả năng hấp thụ bước sóng 340nm, sự biến ñổi này phản ánh mức ñộ chuyển hoá giữa hai dạng và cũng chính là tốc ñộ và hoạt ñộ phản

ứng enzyme

Phương pháp này chỉ cần lượng nguyên liệu ít nhưng lại có ñộ nhậy rất cao cho phép xác ñịnh chính xác, nhanh chóng hoạt ñộ enzyme Vì vậy ñây là một trong những phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu enzyme học

ðược dùng ñể nghiên cứu các phản ứng enzyme mà kết quả của nó tạo

thành axit hoặc bazơ Lúc ñó dùng thiết bị tự ñộng thêm kiềm hoặc axit vào

ñể giữ pH môi trường phản ứng cố ñịnh ñồng thời tự ñộng ghi ñường biểu

diễn kiềm hoặc axit ñã tiêu tốn vào phản ứng trung hoà Lưu lượng kiềm hoặc axit này phản ánh tốc ñộ phản ứng enzyme

Phương pháp này có thể ñược mô tả mở rộng ra ñể nghiên cứu các ñôi tượng khác nhưng trên nguyên tắc liên tục ñịnh lượng (sản phẩm tạo thành hay lượng cơ chất tiêu hao), chẳng hạn gián tiếp ño thế oxy hoá khử với ñiện cực tiêu chuẩn khi nghiên cứu các enzyme oxy hoá

Dùng các phản ứng hoá học khác nhau ñể ñịnh lượng cơ chất bị hao

hụt hoặc sản phẩm phản ứng tạo thành dưới tác dụng của enzyme Các phản

ứng này thuộc loại tạo màu ñặc trưng, tạo màu với thuốc thử ñặc trưng, nói

chung là một dấu hiệu ñể nói lên mức ñộ hay thời ñiểm kết thúc phản ứng (ví

dụ ñiểm tương ñương khi ñịnh phân axit bazơ ñược xác ñịnh bởi sự ñổi màu của phenolphtalein, quỳ tím )

Trong tất cả các phương pháp nêu trên, tuỳ theo ñiều kiện, yêu cầu nghiên cứu thực tế mà quyết ñịnh phương thức tiến hành (chẳng hạn tiến hành trong ñiều kiện thời gian như nhau, hay nồng ñộ enzyme, nồng ñộ cơ chất không ñổi ) qui hoạch thực hiện ñể xác ñịnh các thông số tối ưu

* Chuẩn bị dịch chiết enzyme ñể xác ñịnh hoạt ñộ:

Chế phẩm enzyme có thể ở dạng rắn, lỏng, bao gồm (cơ chất, chất

ñộn, hạt cốc), các bộ phận khác nhau của cơ thể sinh vật sinh enzyme (mô,

tế bào, khuẩn ty, bào tử ) và môi trường sinh tổng hợp enzyme (chủ yếu là nước) có thể chứa cả enzyme trong ñó Vì vậy cần phải xử lý nhằm lấy enzyme ñể xác ñịnh

Nếu quá trình nuôi cấy hay tích luỹ enzyme bằng phương pháp bề sâu trong môi trường lỏng Sau khi lấy mẫu xong cần làm lạnh nhanh chóng xuống 0 o C rồi ly tâm tốc ñộ cao 5000 – 6000 vòng /phút ñể thu ñược dung dịch trong suốt

Nếu quá trình nuôi cấy hay tích luỹ enzyme bằng phương pháp bề mặt trên môi trường rắn (hay hạt cốc) thì lấy mẫu 10-20 gam, chiết rút bằng dung dịch ñệm tương ứng với pH xác ñịnh trong ñiều kiện lạnh (O o C) ñể enzyme không bị biến tính hay giảm hoạt tính, lượng dung dịch này khoảng 200ml (gấp 10-20 lần chế phẩm) Lọc qua phễu hay ly tâm vắt ñể thu ñược dung dịch trong suốt

Phải phá vỡ tế bào ñể giải phóng enyme tự do bằng nhiều phương pháp:

+ Phương pháp cơ học: Phổ biến nhất là nghiền (thông thường trong cối chày sứ, thuỷ tinh, máy nghiền quay tay, máy nghiền có ñộng cơ), nghiền với cát, vụn thuỷ tinh

+ Phương pháp hoá sinh: dùng enzyme thích hợp (xenlulose, pectinase) ñể phân huỷ màng tế bào, mô ñể giải phóng enzyme (trước hết

có thể nhận ñược tế bào trần rất có giá trị trong nghiên cứu tế bào học, enzyme học)

Tiếp ñó có thể dùng các phương pháp chiết rút thích hợp (dùng dung dịch ñệm, dùng (NH 4 ) 2 SO 4 , axeton ) ñể nhận ñược dung dịch trong suốt

Trong trường hợp sau khi xác ñịnh xong hoạt ñộ của dịch chiết cần tính toán hoạt ñộ của chế phẩm ban ñầu (quy về hàm lượng chất khô tuyệt

ñối) [17, tr 68-72]

2.2 Dịch tuỵ và chức năng tiêu hoá:

Dịch tuỵ do tuyến tuỵ tiết ra theo ống dẫn tuỵ Wirsung ñổ vào tá tràng (chức năng ngoại tiết) Tuyến tuỵ có 1 hoặc hai ống dẫn riêng, chó và ngựa thường có hai ống dẫn Dịch tuỵ có ý nghĩa rất quan trọng ñối với sự tiêu hoá: dịch tuỵ có tác dụng phân giải từ 60-80% protein, gluxit, lipit của thức ăn

- Thành phần của dịch tuỵ có 90% nước và 10 % vật chất khô

Trong thành phần chất vô cơ:

+ Muối vô cơ gồm: NaHCO 3 , NaCl, CaCl 2 , Na 2 HPO 4 , và NaH 2 PO 4 ,

trong ñó NaHCO 3 chiếm nhiều nhất

+ Hợp chất hữu cơ bao gồm protein và các enzyme Trong dịch tuỵ có chứa các enzyme bao gồm: trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, cacboxipolipeptidase, dipeptidase, protaminase và một số enzyme enzyme phân giải gluxit, lipit và axit nucleic [22, tr 135-136]

2.2.2 Tác dụng tiêu hoá của dịch tuỵ:

- Nhóm enzyme phân giải protein ( protease) là thành phần chất hữu cơ

có trong dịch tuỵ Các enzyme này bao gồm:

+ Trypsin: là enzyme chủ yếu của dịch tuỵ Khi mới tiết ra nó ở dạng không hoạt ñộng (trypsinogen) Nhờ tác dụng của enterokinase của dịch ruột trypsinogen biến thành trypsin hoạt ñộng, một phần trypsin này lại tiếp tục hoạt hoá trypsinogen còn lại thành toàn bộ trypsin hoạt ñộng - gọi là tự xúc tác Trypsin tác dụng lên protein mạnh, triệt ñể và nhanh hơn pepsin, nó phân giải protein thành polypeptit và một ít axit amin

Trypsin là loại albumin kiềm có phân tử lượng ≈ 23000, ñiểm ñẳng

ñiện ở pH: 10,8 ; cấu tạo từ 223 amino axit tạo thành chuỗi peptid có 6 nối

disunfua, mút cuối cùng N là isoleuxin, mút cuối C là asparagin Trypsin tinh khiết tồn tại ở dạng bột màu vàng nhạt hay vàng xám, tan trong nước, không tan trong rượu etylic và glyxerin Tác dụng tối ưu ở pH = 8 [3, tr 432]

enterokinaza

Trypsin Trypsin *

Peptit + axit amin Protein

+ Chymotrypsin: khi mới tiết ra ở dạng không hoạt ñộng Chymotrypsinogen, sau ñó ñược hoạt hoá bởi trypsin.

Chymotrypsin phân giải protein và polypeptit phân tử lớn thành axit amin và peptit Chymotrypsin có tác dụng yếu hơn trypsin

+ Elastase: Phân giải protein (gân, bạc nhạc) thành peptit và axit amin + Cacboxipolipeptidase: tác dụng lên polypeptit về phía nhóm cacboxyl

tự do và tách axit amin ra khỏi phân tử

+ Dipeptidase: phân giải dipeptit thành 2 axit amin tự do

+ Proteminase: chỉ thuỷ phân protamin thành peptit và axit amin

[22, tr 136]

2.3 Dinh dưỡng vi sinh vật

Các chất dinh dưỡng ñối với vi sinh vật là bất kỳ chất nào ñược vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh và ñược chúng sử dụng làm nguyên liệu ñể cung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc ñể cung cấp cho các quá trình trao ñổi năng lượng [6, tr 141]

Những vi sinh vật khác nhau yêu cầu những loại chất dinh dưỡng khác nhau và chúng thường chỉ ñòi hỏi một dạng dinh dưỡng ñặc thù Không phải tất cả các chất dinh dưỡng ñều ñược yêu cầu với số lượng như nhau ; một số chất (các nguyên tố ñại lượng) ñược ñòi hỏi với lượng lớn, trong khi những chất khác ñược gọi là nguyên tố vi lượng ñược ñòi hỏi với số lượng ít hơn,

ñôi khi thậm chí chỉ cần ở dạng vết [2, tr 255]

Quá trình vi sinh vật hấp thu các chất dinh dưỡng ñể thoả mãn mọi nhu cấu sinh trưởng và phát triển của chúng ñược gọi là quá trình dinh dưỡng [6, tr 141]

Trypsin (hoạt hoá) Chymotrypsin Chymotrypsinogen

Các chất ñược vi sinh vật hấp thu từ môi trường xung quanh và ñược chúng sử dụng làm nguyên liệu ñể cung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp tạo thành các thành phần của tế bào hoặc ñể cung cấp cho các quá trình trao

ñổi năng lượng ñược gọi là chất dinh dưỡng Trong ñiều kiện phòng thí

nghiệm, vi sinh vật thường ñược nuôi cấy trong những môi trường nhân tạo gồm một thành phần các chất thích hợp cho loài vi sinh vật cần nuôi cấy phát triển Tuy nhiên, không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy nhân tạo ñều là chất dinh dưỡng Một số chất cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo ñảm các ñiều kiện thích hợp về môi trường như pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion Chất dinh dưỡng là những chất có tham gia vào các quá trình trao ñổi chất nội bào [19, tr 55]

Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết ñịnh nhu cầu dinh dưỡng của chúng Thành phần hoá học cấu tại bởi các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng ña lượng và các nguyên tố khoáng vi lượng [6, tr 141]

Nhiệt ñộ mà ở ñó các hoạt ñộng trao ñổi chất của một sinh vật tạo nên

tốc ñộ sinh trưởng cao nhất là nhiệt ñộ sinh trưởng tối ưu [2, tr 267-268]

- pH:

Sinh vật mẫn cảm với sự thay ñổi ñộ axit vì rằng các ion hidro và các ion hidroxyl can thiệp vào các liên kết hidro trong các phân tử protein và axit nucleic Kết quả là các vi sinh vật có những biên ñộ axit mà chúng phù hợp và

có thể chịu ñựng ñược Hầu hết vi khuẩn và nguyên sinh ñộng vật bao gồm hầu hết các tác nhân gây bệnh, sinh trưởng tốt nhất ở một biên ñộ hẹp xung quanh pH trung tính, tức là giữa 6,5- 7,5 ðây cũng là biên ñộ pH của hầu hết các mô, cơ quan trong cơ thể con người Các vi sinh vật này ñược gọi là vi sinh vật ưa trung tính [2, tr 271-272]

- Hiệu quả vật lý của nước:

Vi sinh vật cần nước, chúng phải sống trong môi trường ẩm nếu chúng muốn ở trong trạng thái hoạt ñộng về trao ñổi chất Nước không chỉ cần ñể hoà tan các enzyme và các chất dinh dưỡng mà nó còn là chất phản ứng quan trọng trong nhiều phản ứng trao ñổi chất [2, tr 272-273]

- Áp suất thẩm thấu:

Áp suất thẩm thấu của một dung dịch là áp suất tạo nên trên một màng bán thấm nhờ một dung dịch chứa các chất hoà tan không thể ñi qua màng một cách tự do Áp suất thẩm thấu có thể gây nên nhiều hiệu quả ñối với tế bào Chẳng hạn một tế bào ñược ñặt trong nước tinh khiết (dung dich nhược trương so với tế bào chất của tế bào) sẽ lấy nước từ môi trường của chúng và trương lên khi bị giới hạn bởi thành tế bào tới khi chúng bị nổ tung trong dung dịch Ngược lại một tế bào ñặt trong nước biển khoảng 3,5% chất hoà tan và do vậy là ưu trương ñối với hầu hết các tế bào sẽ bị mất nước vào môi trường nước biển xung quanh [2, tr 273-275]

- Dưỡng khí (oxy):

Oxy có vai trò hết sức quan trọng trong hoạt ñộng sống của vi sinh vật tuỳ thuộc vào nhu cầu oxy mà người ta chia vi sinh vật thành cac nhóm:

+ Hiếu khí bắt buộc: là các vi sinh vật chỉ sinh trưởng khi có mặt oxy phân tử (O 2 ) ða số vi nấm và phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm này

+ Hiếu khí không bắt buộc: là các vi sinh vật có thể sinh trưởng ñược

cả trong ñiều kiện có oxy lẫn không có oxy Có oxy chúng sinh trưởng tốt hơn Phần lớn nấm men và nhiều vi khuẩn thuộc nhóm này

+ Vi hiếu khí: là các vi khuẩn chỉ có thể sinh trưởng ñược trong ñiều

kiện áp lực oxy rất thấp Thuộc nhóm này có loài Vibrio cholerae,

Hydrogenomonas spp, Zymononas spp, Bacteroides spp

+ Kị khí chịu dưỡng: là các vi khuẩn kị khí nhưng lại tồn tại ñược khi

có mặt oxy, chúng không sử dụng oxy, không có chuỗi hô hấp nhưng sự có

mặt của oxy không có hại ñối với chúng Thuộc nhóm này có Streptococcus

lactic, S.faecalis, Lactobacilus lactic

+ Kị khí: ñối với các vi sinh vật thuộc nhóm này, sự có mặt của oxy phân tử là có hại Chúng không sinh trưởng ñược trên môi trường ñặc hoặc bán ñặc khi ñể trong không khí hay có từ 10% CO 2 Chúng chỉ sinh trưởng ở lớp dich thể sâu nơi không có oxy, không có quá trình lên men hay quá trình photphoryl hoá quang hợp và quá trình metan Nhóm kị khí có nhiều loại

thuộc nhóm Clostridium, Fusobacterium, Bifidobacterium [19, tr 69]

2.4 Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

Theo dõi sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong ñiều kiện phòng thí nghiệm thấy số lượng của chúng nhân lên rất nhanh vì với ñiều kiện thích

hợp thời gian thế hệ t (hay là thời gian tăng ñôi) của nhiều loài vi khuẩn chỉ

vào khoảng 30 phút Rõ ràng các quá trình sinh tổng hợp cũng như quá trình

dị hoá (hô hấp) nhằm cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho các phản ứng tổng hợp diễn ra trong tế bào với tốc ñộ rất nhanh, hoàn toàn không thấy ở các sinh vật khác Tế bào có khối lượng khô khoảng 2.5 x 10 -13 g và thể tích khoảng 10 -12 cm 3 , sau 48 giờ ta có một quần thể vi khuẩn chừng 10 29 tế bào,

với khối lượng khô cứng 10 10 tấn và thể tích 10 11 m 3 Dĩ nhiên tình hình ñó sẽ không bao giờ xảy ra vì sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn trong một hệ thống ñóng chỉ sau một thời gian nhất ñịnh, vì nhiều nguyên nhân khác nhau

sẽ bị ngừng lại [6, tr 360]

Trong chế tạo vacxin việc nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của

vi sinh vật ñóng một vai trò rất quan trọng, dựa vào quy luật này người ta có thể chọn thời ñiểm cấy giống thích hợp và thời ñiểm thu hoạch canh trùng sao cho ñạt ñược số lượng vi trùng theo mong muốn

- ðường cong sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật:

Trong một mẻ nuôi cấy thích hợp vi khuẩn thường tăng trưởng theo 4 giai ñoạn chính là các giai ñoạn chuẩn bị, giai ñoạn tăng trưởng nhảy vọt, giai

ñoạn ổn ñịnh và giai ñoạn chết:

Giai ñoạn chuẩn bị (pha lag):

Trong pha lag tế bào ñiều chỉnh theo môi trường mới của chúng, hầu hết các tế bào ñều không sinh trưởng ngay, ngược lại tổng hợp mạnh các enzyme ñể sử dụng các chất dinh dưỡng mới trong môi trường Chẳng hạn vi khuẩn ñược cấy từ môi trường chứa glucose là nguồn cacbon duy nhất vào một môi trường chứa lactose sẽ phải tổng hợp hai loại protein: protein màng

ñể vận chuyển lactose vào tế bào và enzyme lactase ñể phân giải lactose Pha

lag có thể kéo dài dưới 1giờ hoặc nhiều ngày tuỳ thuộc vào loài và vào các

ñiều kiện vật lý và hoá học của môi trường [2, tr 291-292]

Pha lag ñược tính từ lúc bắt ñầu cấy ñến khi vi khuẩn ñạt ñược tốc ñộ sinh trưởng cực ñại Ở giai ñoạn này vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa

có khả năng sinh sản) nhưng thể thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt

do quá trình tổng hợp các chất trước hết là các cao phân tử (protein, enzyme, axit nucleic .) diễn ra mạnh mẽ Chẳng hạn, một số enzyme cần cho quá trình tổng hợp thuộc các endoenzyme loại proteinase, amilase và các enzyme

nằm trong quá trình chuyển hoá gluxit, ựều ựược hình thành trong pha này

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng ựến sự phát triển của vi khuẩn trong giai ựoạn này đáng lưu ý nhất là 3 yếu tố sau ựây:

+ Tuổi giống cấy: Tuổi của quần thể giống cấy tức là chúng ựang ở giai ựoạn sinh trưởng nào Thực nghiệm chứng minh nếu giống cấy ở giai

ựoạn pha lag thì pha lag sẽ ngắn Ngược lại nếu giống cấy ở giai ựoạn pha log

hay pha tử vong thì pha lag sẽ kéo dài

+ Lượng cấy giống: Lượng cấy giống nhiều thì giai ựoạn pha lag ngắn và ngược lại

+ Thành phần môi trường: môi trường có thành phần dinh dưỡng phong phú (thường là có môi trường có cơ chất thiên nhiên) thì giai ựoạn pha lag ngắn [6, tr 360-363]

Giai ựoạn tăng trưởng nhảy vọt (pha log):

Vi sinh vật bắt ựầu nhân mật số lên theo cấp số nhân Kắch thước của

tế bào, thành phần hoá học, hoạt tắnh sinh lý của vi khuẩn không thay ựổi theo thời gian Tế bào ở trang thái ựộng học và ựược gọi như là ′′những tế bào tiêu chuẩn″ [19, tr 62]

Trong pha log, do tốc ựộ trao ựổi chất của các tế bào riêng lẻ ựạt cực

ựại nên pha này ựôi khi có ý nghĩa lớn với mục ựắch công nghiệp và mục ựắch

phòng thắ nghiệm Các quần thể trong pha log mẫn cảm hơn với các loại thuốc kháng vi sinh can thiệp vào quá trình trao ựổi chất như erythromixin và với các loại thuốc can thiệp vào sự tạo thành các cấu trúc tế bào như sự kìm hãm tổng hợp thành bởi penixillin Hơn nữa, các quần thể trong pha log cũng có ý nghĩa ựối với việc bắt màu Gram vì thành phần hầu hết các tế bào ựều còn nguyên vẹn - một ựặc tắnh quan trọng cho sự bắt màu chắnh xác [2, tr 292]

Trong ựiều kiện thắ nghiệm có thể ựiều chỉnh sao cho tốc ựộ sinh trưởng của vi khuẩn chỉ mẫn cảm (nghĩa là chỉ phụ thuộc vào một yếu tố) còn

các yếu tố khác của môi trường không có ảnh hưởng gì Trong trường hợp

như vậy yếu tố ựã cho là yếu tố hạn chế tốc ựộ sinh trưởng Monod (1942) là

người ựầu tiên ựã chứng minh ựược rằng nếu tất cả các chất dinh dưỡng ựều ở

nồng ựộ dư thừa, trừ một chất hạn chế thì hằng số tốc ựộ phân chia (hoặc sinh

trưởng) sẽ là hàm số của nồng ựộ chất dinh dưỡng hạn chế này Chất hạn chế

dinh dưỡng có thể là ựường, (saccasose, glucose), axit amin (tryptophan,

acginin), chất vô cơ (photphat, CO 2 ) Nếu biểu diễn các kết quả thu ựược

thành ựồ thị (với hằng số tốc ựộ phân chia C và hằng số tốc ựộ sinh trưởng ộ

phụ thuộc vào nồng ựộ chất dinh dưỡng han chế) ta sẽ nhận ựược ựường cong

tương tự dạng hypecbol ứng với phương trình:

, nghĩa là gần với ựường cong biểu diễn sự phụ thuộc của nồng

ựộ phản ứng enzyme vào nồng ựộ cơ chất:

Vì vậy Monod ựã nêu nên một cách tương tự mối quan hệ giữa các

hằng số c và ộ với nồng ựộ chất dinh dưỡng hạn chế qua các phương trình

và

dưỡng hạn chế Giống như hằng số Michaelis K m , hằng số bão hoà K s biểu

thị ái lực của tế bào ựối với chất dinh dưỡng: giá trị K s càng nhỏ thì ái lực

càng lớn đó là nồng ựộc của chất dinh dưỡng hạn chế mà ở ựó ộ ựạt nửa giá

Giá trị của K s thường rất thấp [6, tr 366 ]

ðồ thị ñường cong sinh trưởng của vi sinh vật [19, tr 61]

+ Giai ñoạn cân bằng (pha ổn ñịnh):

Nếu sinh trưởng vi khuẩn ñược tiếp tục ở tốc ñộ số mũ của pha log, thì chẳng bao lâu vi khuẩn sẽ bao phủ trái ñất ðiều này không xảy ra vì rằng khi các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt và các chất thải ñược tích luỹ thì tốc ñộ sinh sản sẽ giảm xuống Cuối cùng con số tế bào chết sẽ bằng con số tế bào ñược sinh ra và ñộ lớn quần thể sẽ trở nên ổn ñịnh hơn Trong pha này tốc ñộ trao

ñổi chất ở các tế bào sống sót giảm xuống Sự bắt ñầu của pha cân bằng có thể

bị hoãn lại vĩnh viễn (và như vậy sinh trưởng logarit có thể ñược duy trì vĩnh

viễn) bằng một thiết bị ñặch biệt ñược gọi là chemostat, thiết bị này loại bỏ

liên tục các chất thải (cùng với môi trường cũ và một số tế bào) và bổ sung

vào môi trường mới Nhiều chemostat ñược sử dụng trong các quá trình lên

men công nghiệp [2, tr 292-293]

Số lượng vi sinh vật không tăng thêm mà giữ ở mức ổn ñịnh Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng về ñộng học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết ñi Kết quả là tế bào và cả sinh khối không tăng

cũng không giảm Tốc ựộ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng ựộ cơ chất Cho nên khi giảm nồng ựộ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc ựộ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm Do ựó việc chuyển từ pha lag sang pha

ổn ựịnh diễn ra dần dần [19, tr 62]

Nguyên nhân tồn tại của pha ổn ựịnh rõ ràng là do sự tắch luỹ các sản phẩm ựộc của quá trình trao ựổi chất (các loại rượu và axit hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng ựộ thấp nhất) Nguyên nhân khác: do sự tăng sinh sinh khối tổng cộng tỷ lệ thuận với nồng

ựộ ban ựầu của chất dinh dưỡng hạn chế [6, tr 367]

+ Giai ựoạn chết (pha tử vong):

Nếu các chất dinh dưỡng không ựược thêm vào và chất thải không

ựược lấy ựi thì quần thể sẽ ựạt tới một ựiểm mà ở ựó tế bào chết ựi với tốc ựộ

nhanh hơn so với tốc ựộ chúng ựược sinh ra Trong một số trường hợp mọi tế bào ựều chết trong khi các trường hợp khác một số sống sót có thể duy trì vĩnh viễn Trường hợp sau ựặc biệt hay gặp ở những bình giống vi khuẩn có thể tạo nên các cấu trúc nghỉ ựược gọi là các nội bào tử [2, tr 293]

Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm) đôi khi các tế bào bị

tự phân nhờ các enzyme của bản thân Một số enzyme thể hiện hoạt tắnh xúc tác cực ựại trong pha tử vong như: deaminase, decacboxylase, các amilase và proteinase ngoài bào Ngoài chức phận xúc tác một số quá trình tổng hợp những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác các quá trình phân giải [6, tr 369]

2.5 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật rất ña dạng về hình thức và thành phần tuỳ theo ñặc tính sinh lý và sinh hoá của loài vi sinh vật và mục ñích của quá trình nuôi cấy Hai loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến nhất là:

- Môi trường nuôi cấy tự nhiên: còn ñược gọi là môi trường thực nghiệm là những môi trường có sẵn trong tự nhiên như sữa, nước chiết thịt

bò, nước chiết các loai rau củ hoặc ngũ cốc chứa ñựng nhiều chất hữu cơ và

vô cơ tan trong nước có thể ñáp ứng ñược yêu cầu về dưỡng chất của một số lớn vi sinh vật Môi trường nuôi cấy tự nhiên có nhiều ưu ñiểm là rẻ tiền nhưng có nhược ñiểm không thể biết chính xác thành phần dinh dưỡng

Môi trường nuôi cấy tổng hợp: Các thành phần dinh dưỡng của môi trường

ñược biết rõ và ñược kiểm soát về hàm lượng và chất lượng Môi trường này

cho phép người nuôi cấy vi sinh vật theo dõi một cách dễ dàng tác ñộng của chất dinh dưỡng ñối với vi sinh vật, ñặc biệt những loài vi sinh vật ñã ñược biết rõ Tuy nhiên môi trường nuôi cấy tổng hợp thường rất ñắt tiền, chỉ sử dụng cho từng loài vi sinh vật thích hợp, chuẩn bị khá phức tạp và tốn nhiều thời gian [19, tr 60]

* Môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong chế tạo vacxin:

ðể có thể thu ñược lượng giống là tế bào dinh dưỡng người ta thường

tạo ñiều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần môi trường ñảm bảo tối ưu cho

sự sinh trưởng nhanh (tức là tăng về số lượng không tạo sản phẩm) trong trường hợp này sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch thể (nuôi cấy chìm) [20, tr 44]

Trong chế tạo vacxin, môi trường nuôi cấy vi sinh vật ñóng vai trò rất quan trọng Thông thường các loại môi trường dùng trong sản xuất vacxin hiện nay là môi trường tự nhiên hỗn hợp, là sản phẩm của quá trình phân giải protein, gluxit hoặc là nước chiết của các tổ chức cơ thể ñộng vật như: cơ, gan, tim, ; dịch chiết của cơ thể như: máu, huyết thanh ; sản phẩm của các

quá trình lên men sinh học sử dụng các nguyên liệu là thực vật như: mạch nha, mầm lúa, ngô, ñậu tương, tảo biển, cao nấm men

Tại xí nghiệp thuốc thú y TW, các loại môi trường nuôi cấy vi trùng hiện nay ñều dựa trên quy trình chế tạo môi trường Hottinger cơ bản Môi trường Hottinger ñược nhà khoa học người ðức có tên là Hottinger phát minh

ra vào những năm ñầu thế kỷ XX Cho ñến nay môi trường này vẫn ñang

ñược sử dụng rộng rãi trong ngành vi sinh vật ñặc biệt là trong chế tạo vacxin

Ngoài môi trường Hottinger còn có một số thành phần khác thường dùng ñể phối hợp cùng với môi trường Hottinger như: nước gan chiết xuất, nước thịt bò chiết xuất, nước dạ dày tiêu hoá, pepton, huyết thanh, máu Các loại vi trùng khác nhau thì thành phần môi trường nuôi cấy sản xuất cũng khác nhau về tỷ lệ phối hợp các thành phần và ñộ pH môi trường thành phẩm

Năm 1976, bác sỹ thú y Nguyễn Văn Lãm và cộng sự ñã chế tạo thành công môi trường Hottinger từ ñậu phụ thay thế cho thịt bò và ñã thu ñược những kết quả nhất ñịnh

Hình 2.1 Mô tả quy trình chế tạo vacxin vi trùng

MT Hottinger

MT kiểm tra, kiểm nghiệm

MT thành phẩm nhân giống SX Vacxin

MT thạch thường

MT nước thịt

MT thạch máu

MT yếm khí

Kiểm tra thuần khiết, vô trùng Vacxin

thành phẩm

MT giữ nhân giống gốc VSV

Kiểm nghiệm Vacxin