Nghiên cứu khả năng sử dụng các sản phẩm của cây neem trồng tại ninh thuận để phát triển thuốc thảo mộc trừ mọt hại ngô (sitophilus zeamais motsxhulsky)

luận văn, thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, khóa luận, đề tài

BỘ GIÁO DỤC & ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

==========&&&========

ðOÀN THỊ LƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÁC SẢN PHẨM CỦA CÂY NEEM TRỒNG TẠI NINH THUẬN ðỂ PHÁT TRIỂN THUỐC THẢO MỘC TRỪ MỌT HẠI NGÔ

( Sitophilus zeamais Motschulsky)

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC & ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

==========&&&========

ðOÀN THỊ LƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CÁC SẢN PHẨM CỦA CÂY NEEM TRỒNG TẠI NINH THUẬN ðỂ PHÁT TRIỂN THUỐC THẢO MỘC TRỪ MỌT HẠI NGÔ

( Sitophilus zeamais Motschulsky)

Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học

TS Nguyễn Trường Thành

HÀ NỘI, 12- 2010

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trường Thành - Trưởng Bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường Ờ Viện Bảo vệ thực vật, người thầy ựã tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện ựề tài và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ựốc viện Bảo vệ thực vật, Bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường ựã cho phép, tạo mọi ựiều kiện giúp ựỡ về cơ sở vật chất, kỹ thuật, vật liệu trong quá trình thực hiện ựề tài

Lời cảm ơn chân thành tôi xin ựược gửi tới các Thầy, Cô giáo và tập thể cán bộ Ban đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

ựã tận tình dạy bảo và giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ựỡ nhiệt tình của các ựồng nghiệp, nhóm chế phẩm, nhóm phân tắch và tập thể cán bộ Bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường Ờ Viện Bảo vệ thực vật về cơ sở vật chất cũng như phương pháp nghiên cứu , cảm ơn Trung tâm cây trồng bán khô hạn Viện Duyên Hải Nam Trung Bộ ựã phối hợp nghiên cứu và tạo mọi ựiều kiện cho tôi thực hiện, hoàn thành luận văn

Cuối cùng là lòng biết ơn những người thân trong gia ựình, bạn bè và ựồng nghiệp ựã ựộng viên, khắch lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Hà N ội, tháng 12 năm 2010

Tác giả

đoàn Thị Lương

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan toàn bộ các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng sử dụng cho bảo vệ một học vị nào

Mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn ñều ñã ñược cảm ơn và thông tin tài liệu ñều ñược ghi rõ nguồn gốc

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu của luận văn này

Tác giả luận văn

ðoàn Thị Lương

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, phát triển thuốc thảo mộc trừ dịch hại

trên thế giới

5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng các cây ựộc sản xuất thuốc

thảo mộc trừ dịch hại trên thế giới

7

1.1.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng các sản phẩm cây Neem trừ

dịch hại trên thế giới

11

1.1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng các sản phẩm Neem trừ côn

trùng hại kho trên thế giới

13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu, sử dụng thuốc thảo mộc trừ sâu hại ở

Việt Nam

17

1.2.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng thảo mộc trừ côn trùng hại

kho tại Việt Nam

19

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

25

2.3.1 Phương pháp xác ựịnh hàm lượng Azadirachtin trong lá và

hạt Neem

26

2.3.2 đánh giá trong phòng tác ựộng của các sản phẩm từ cây

Neem và các sản phẩm từ cây Neem kết hợp với chất phụ

29

gia, chất trợ lực thảo mộc ựối với mọt hại ngô 2.3.3 Phương pháp ựánh giá ựộ an toàn của các sản phẩm Neem

ựối với bảo quản ngô

38

3.1 Kết quả xác ựịnh hàm lượng dầu Neem và hoạt chất

Azadirachtin trong hạt và lá Neem

41

3.1.1 Kết quả hàm lượng dầu Neem và hoạt chất Azadirachtin

chiết xuất từ hạt Neem bằng dung môi

41

3.1.2 Kết quả xác ựịnh hàm lượng dầu Neem tự nhiên bằng ép

nguội và hàm lượng hoạt chất Azadirachtin

45

3.2 Kết quả tạo các sản phẩm từ cây Neem và ựánh giá hiệu lực

phòng chống mọt hạt ngô của chúng

48

3.2.2 đánh giá hiệu quả phòng chống mọt ngô của các sản phẩm

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Bột nghiền lá Neem Phần bã của hạt Neem sau khi ép Dầu Neem tự nhiên

Trung bình Ngày sau xử lý

Bảng 3.2 Hàm lượng dầu Neem chiết xuất ñược trong hạt Neem 43

Bảng 3.3 Hàm lượng Azadirachtin trong hạt Neem trồng tại

NinhThuận

44

Bảng 3.4 Hàm lượng dầu Neem tự nhiên thu ñược bằng ép nguội

giống Senegan mới

Bảng 3.8 Kết quả theo dõi sự xâm nhập từ bên ngoài của mọt

ngô sau xử lý ngô bằng bột lá Neem

54

Bảng 3.9 Hiệu quả phòng chống mọt bằng lớp bảo vệ bột bánh

dầu Neem

56

Bảng 3.10 Kết quả theo dõi sự xâm nhập của mọt sau khi xử lý 57

Bảng 3.11a Kết quả theo dõi mọt chết sau khi thả vào ngô ñã ñược

Bảng 3.12a Kết quả mọt chết do xử lý hai sản phẩm dạng lỏng triển

vọng nhất từ dầu Neem ép nguội

61

Bảng 3.12b Hiệu lực trừ mọt của hai sản phẩm dạng lỏng từ dầu

Neem ép nguội triển vọng nhất

61

Bảng 3.13 Khảo nghiệm hiệu lực của các sản phẩm dạng lỏng

triển vọng từ dầu Neem với ngô ñã ñược xử lý mọt

trước bảo quản tại Ninh Thuận

63

Bảng 3.14 Kết quả hiệu lực các sản phẩm dạng lỏng triển vọng từ

dầu Neem xử lý nông sản ñang bị mọt gây hại tại Ninh

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ðỒ

Hình 3.2 Cất quay chân không ñể thu azadirachtin 42 Hình 3.3 Thu dầu Neem tự nhiên bằng máy ép nguội 47

Hình 3.5 Các dạng sản phẩm ñược tạo ra từ hạt và lá Neem 49 Hình 3.6 Thí nghiệm ñánh giá nhanh các sản phẩm Neem 51 Hình 3.7 Hiệu quả của các sản phẩm Neem dạng bột với mọt

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Thiệt hại do các loại sâu hại gây ra trên nông sản bảo quản thường rất nghiêm trọng Thiệt hại trên các loại hạt trong kho do sâu hại và các ñối tượng khác ở Mỹ ước tính khoảng hơn 1 tỷ ñô la mỗi năm (Cuperus G và Krischik V., 1995) [29] và ở các nước ñang phát triển thiệt hại này khoảng trên 30%

(ThroneJE vàEubanks MW., 2002)[74].Taizania, riêng loài mọt Prostephanus

truncates ở các kho nông trại làm mất 34% sản lượng ngô (Hodges RJ et al.,1983) [41] Ở Việt Nam, tổn thất do côn trùng gây ra cho ngũ cốc trong bảo quản khoảng 10% (Lê Doãn Diên,1990) [6] Trong những năm gần ñây thiệt hại do các loài mọt gây ra trên ngô sau thu hoạch của các hộ gia ñình ở các tỉnh miền núi phía bắc nước ta là rất nghiêm trọng Ở vùng Bắc Hà- Lào Cai, tỷ lệ hao hụt trọng lượng hạt do các loài mọt gây ra sau 12 tháng trên ngô ñịa phương và ngô lai bảo quản sau thu hoạch tương ứng là 17,22 và 38,95% (Nguyễn Văn Liêm và nnk, 2005) [13] ðây là một tổn thất rất lớn ñối với ñồng bào dân tộc ở vùng này vì ngô là nguồn thu nhập quan trọng nhất của các gia ñình

ðể khắc phục tình trạng này, các biện pháp phòng trừ mọt hại kho ngũ cốc ñã ñược sử dụng trong ñó chủ yếu vẫn là dùng thuốc hóa học ñể xông hơi Tuy nhiên, nhiều khi việc sử dụng thuốc hoá học như vậy không những không mang lại hiệu quả mong muốn mà còn ñể lại dư lượng thuốc trên nông sản, ảnh hưởng xấu ñến môi trường sinh thái và sức khoẻ con người, làm suy giảm tính ña dạng của sinh quần, tạo tính chống thuốc của dịch hại Do ñó việc nghiên cứu chế phẩm sinh học, thảo mộc có khả năng xua ñuổi, tiêu diệt mọt hại kho, an toàn với môi trường và con người là yêu cầu ñòi hỏi cấp thiết và

có ý nghĩa lâu dài

Dự án “ðiều tra ñánh giá các cây có ñộc tính trừ sâu ñể sản xuất thuốc trừ sâu thảo mộc (2000-2001)” do Viện Bảo vệ thực vật chủ trì ñã phát hiện

23 cây ñộc thuộc nhóm 1 có tính ñộc cao, hiệu quả sinh học rõ rệt, tiềm năng nguyên liệu lớn có triển vọng khai thác và phát triển tốt, trong ñó có cây Neem Thông qua dự án ñã xác ñịnh Neem cũng là cây bản ñịa tại vùng Ninh Thuận, Bình Thuận Chúng mọc rất phổ biến trong rừng, xen lẫn trong khu vực sản xuất và sinh sống của nông dân (Nguyễn Duy Trang, Nguyễn Thị Me

và nnk, 2000) [8]

Hiện nay cây Neem ñang phát triển tốt ở nước ta ngay cả trên các vùng ñất khô cằn.Mặt khác, chi phí cho ñầu tư trồng cây Neem rất thấp, chủ yếu là cây giống và chi phí trồng ban ñầu Cây Neem sinh trưởng và phát triển tốt, thích ứng cao với khí hậu vùng khô hạn Do ñó việc phát triển cây Neem ñang

có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chống sa mạc hóa, phủ xanh ñất trống và ñất nghèo dinh dưỡng ở nhiều tỉnh Nam Trung Bộ

Tuy nhiên, ñể ñem lại lợi ích và tạo ñộng lực cho nhân dân phát triển cây Neem chúng ta cần có kế hoạch khai thác và sử dụng các sản phẩm của loài cây này Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy các hoạt chất trong cây Neem có tác dụng xua ñuổi, gây ngán, phá vỡ biến thái và làm suy giảm nghiêm trọng thế hệ tiếp theo của sâu hại song rất an toàn với con người và môi trường nên chúng rất thích hợp trong bảo quản ngũ cốc Sản phẩm từ cây Neem có thể ức chế sự phát triển của 200 loài sâu và bệnh hại cây trồng và sản phẩm cây trồng ở các mức ñộ khác nhau và chúng lại rất khó gây nên tính chống thuốc của dịch hại (Gabriele S.,2000; Jilani G.; MalikM.M,1973; Mahfuz I.,2007) [37,5,52] Theo Viện Nghiên cứu nông nghiệp Ấn ðộ, dầu Neem, bột nhân hạt Neem, bánh Neem (sản phẩm phụ ñược ép lại sau khi thu hoạch dầu), lá Neem ñều có tiềm năng quản lý sâu hại trong kho chứa hạt ngũ cốc Việc chế áp có hiệu quả sự phát triển của mọt hại kho sau khi xâm nhập ñảm bảo giảm tổn thất rất nhiều và lâu dài Do ñó việc nghiên cứu sử dụng các sản phẩm từ cây Neem ñể sản xuất thuốc thảo mộc bảo quản ngũ cốc là

một hướng ưu tiên không chỉ giúp bảo quản ngũ cốc an toàn mà còn nhằm tăng thu nhập cho nông dân vùng trồng Neem (ựa số là nông dân nghèo) do có

cơ hội tốt tiêu thụ ựược sản phẩm thu hoạch từ cây Neem hoặc tự chế biến thuốc bảo quản bằng nguồn nguyên liệu sẵn có

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành ựề tài : ỘNghiên cứu khả

n ăng sử dụng các sản phẩm của cây Neem trồng tại Ninh Thuận ựể phát triển thu ốc thảo mộc trừ mọt hại ngô Sitophilus zeamais MotschulskyỢ

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

2.1 Ý nghĩa khoa học

đề tài ựã xác ựịnh ựược hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem trồng tại Ninh thuận ựồng thời cung cấp dẫn liệu khoa học về hoạt chất từ các sản phẩm của cây Neem trồng tại Ninh Thuận và tác ựộng của nó ựến mọt hại ngô trong bảo quản, làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng các sản phẩm từ cây Neem làm thuốc thảo mộc trừ mọt hại kho

môi trường và sức khỏe con người

3 Mục tiêu của ựề tài

- Xác ựịnh ựược hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem bản ựịa

và nhập nội tại Ninh Thuận

- đánh giá ựược tác ựộng từ các sản phẩm của cây Neem ở Ninh Thuận ựối với mọt ngô từ ựó ựề xuất ựược sản phẩm có triển vọng làm nguyên liệu sản xuất thuốc thảo mộc phòng trừ mọt ngô từ cây Neem

4 ðối tượng , ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

4.1 ðối tượng nghiên cứu

- Hạt và lá từ cây Neem 7-9 tuổi ñược thu hoạch tại Ninh Thuận

- Mọt hại ngô (Sitophilus zeamais Motschulsky)

4.2 ðịa ñiểm nghiên cứu

- Nguồn Neem: Thu thập lá, hạt của cây Neem tại một số vùng ở Ninh Thuận

- Nguồn mọt: Thu mẫu mọt hại ngô tại các kho bảo quản ngô của nông dân Hà Nội và Ninh Thuận

- Nơi triển khai các thí nghiệm:

Các thí nghiệm xác ñịnh hoạt chất trong lá, hạt Neem; xác ñịnh hiệu lực của các sản phẩm từ cây Neem với mọt ngô; ñánh giá ñộ an toàn của các sản phẩm từ Neem ñược tiến hành trong phòng thí nghiệm phân tích - Bộ Môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường - Viện Bảo Vệ Thực Vật

Một số thí nghiệm thử nghiệm ñánh giá hiệu lực của sản phẩm ñược thực hiện tại Ninh Thuận

4.3 Thời gian nghiên cứu

ðề tài ñược thực hiện từ tháng 11 năm 2009 ñến tháng 11 năm 2010

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, phát triển thuốc thảo mộc trừ dịch hại trên thế giới

Từ xa xưa con người ựã biết khai thác sử dụng những cây hoang dại có tắnh ựộc ựể săn bắn, trừ rệp, chấy, rận, hại người và gia súc, diệt trừ sâu bọ bảo vệ mùa màng Thời kỳ này các cây hoang dại ựược sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm của mỗi nước, mỗi vùng riêng (Smith A.E và Secoy D.M.,1981) [73] Tiếp theo là thời kỳ sử dụng cây ựộc có tắnh chất tập trung và chọn lọc, ngoài cây ựộc hoang dại con người còn biết trồng trọt những cây ựộc ựể có sản lượng cao hơn

Vào những năm 1960, người châu Âu ựã biết sử dụng cây thuốc lá (

Nicotiana tabacum) lấy từ các nước thuộc ựịa châu Mỹ ựể sản xuất bột hoặc chiết bằng nước lã phun lên cây trồng trừ rệp và các sâu ăn lá Dần dần

Nicotin trở thành một trong những chất trừ sâu chủ yếu từ cuối thế kỷ 19 ựầu thế kỷ 20 ( Beinhezt E.C,1950) [25]

Theo Roack R.C (1932), giai ựoạn từ 1747 Ờ 1931 là thời kỳ phát triển mạnh mẽ của chất trừ sâu rotenone và các rotenoids ựược chiết xuất từ rễ của

các loài Derris, Lonchocarpus và Tephrosia Chúng ựược trồng phổ biến ở

vùng nhiệt ựới: Ấn ựộ, đông Nam ÁẦVào năm 1933 các nước như Braxin, Indonexia ựã trồng tới 5000 ha cây Derris ựể lấy rễ (Fucami J, 1956) [36] Trong thời gian từ năm 1931- 1947 hàng năm Bắc Mỹ ựã nhập tới 6.500 tấn bột Derris ựể chiết lấy rotenone làm thuốc trừ sâu

Thế kỷ thứ 19 cây cúc Pyrethrum cinerariaefolium Trev có nguồn gốc Trung

ựông ựược ựưa vào Châu Âu (1828), Bắc Mỹ (1876) rồi sau ựó là Nhật Bản, Châu Phi, Nam Mỹ (Fine B.C.,1963) [35] đầu thế kỷ 20 Nam Tư và Nhật

Bản là những nước sản xuất chính loài cây này ðến năm 1966 tổng sản lượng sản phẩm từ cây cúc sát trùng ñạt khoảng 20.000 tấn, sản xuất bởi các nước Kenia, Tanzania, Uganda, Congo, Ecuador và Nhật Bản Sản phẩm lúc này chủ yếu là các dung dịch chiết xuất bằng dung môi làm thuốc trừ sâu dạng nước có hàm lượng ñộc cao hơn bột thô ( Jacobson M., 1986) [42] Cũng trong thời gian này có rất nhiều tác giả ñã công bố các công trình nghiên cứu

về thuốc trừ sâu chiết suất từ cây cỏ tự nhiên

Từ sau những năm 1940 thuốc hóa học hữu cơ tổng hợp liên tiếp ra ñời tiêubiểulàcácnhóm:Clohữucơ,Lânhữucơ,Carbamate,Pyrethroids…(Mandava N.B,1985) [51] Sự ra ñời của các hợp chất hữu cơ tổng hợp trừ sâu bệnh, cỏ dại ñã mở ra kỷ nguyên mới của sự phát triển nông nghiệp, dập tắt nhanh chóng ñược dịch hại mùa màng Từ ñó, việc nghiên cứu thuốc thảo mộc dần dần bị lắng xuống Tuy nhiên, việc ra ñời và phát triển ồ ạt thuốc hóa học sau một thời gian dài ñã gây ra rất nhiều hậu quả xấu ñến sức khỏe con người và ô nhiễm môi trường như: ñể lại dư lượng thuốc trên nông sản gây ra rất nhiều bệnh tật hiểm nghèo, phá vỡ cân bằng bền vững của hệ sinh thái, gây tính chống thuốc của quần thể sâu hại

Do ñó song song với việc dùng thuốc hóa học người ta lại ñặc biệt quan tâm chú ý ñến việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc chọn lọc ít ñộc hơn như thuốc thảo mộc Trong vòng 30 năm gần ñây, việc nghiên cứu sử dụng thuốc thảo mộc lại sôi nổi ở nhiều nước trên thế giới với hàng ngàn công trình ñã công bố, nhiều tổ chức và hội nghị quốc tế về nghiên cứu thuốc thảo mộc trừ dịch hại ñược tổ chức như : Hội nghị quốc tế về cây Neem (1980), Hội thảo

về phòng trừ sâu bệnh hại lúa bằng thuốc thảo mộc (1987)… Nhiều dự án nghiên cứu thuốc trừ sâu thảo mộc ở các nước ñược chính phủ hoặc các tổ chức quốc tế tài trợ (Jacobson M.,1990) [43] Nhìn chung, tùy từng giai ñoạn khác nhau mà việc nghiên cứu và sử dụng thuốc thảo mộc trừ dịch hại trên thế

giới cũng có những bước thăng trầm Song cho ñến nay thuốc thảo mộc trù dịch hại vẫn ñược coi là hướng ưu tiên phát triển nhằm thay thế một phần thuốc hóa học tổng hợp ñáp ứng mục tiêu quản lý dịch hại bền vững, nâng cao chất lượng sản phẩm, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường

1.1.2.Tình hình nghiên cứu, sử dụng các cây ñộc sản xuất thuốc thảo mộc trừ dịch hại trên thế giới

Cây cỏ trong thiên nhiên rất ña dạng và phong phú trong ñó có những loài cây có lợi dùng trong y học ñể tăng cường sức khỏe cho con người, chữa bệnh, có những loài có tính ñộc thích hợp cho phòng trừ dịch hại

Người Trung Quốc biết ñến cây ñộc từ hàng ngàn năm nay nhưng ñến năm

1943 mới chính thức giới thiệu 35 loài (Hansberry R and Lee C., 1943) ðến năm 1959 “ Trung Quốc thổ nông dược chí” ñã tập hợp và giới thiệu trên 500 loài cây có tính ñộc trừ sâu

Ở Ấn ðộ, năm 1926 cây ñộc sản xuất thuốc thảo mộc ñã ñược giới thiệu 6 loài ðến năm 1941, Chopra R.N và nnk ñã báo cáo kết quả nghiên cứu của 164 loài cây ñộc trừ dịch hại Cùng với khoảng thời gian này, rất nhiều nước khác trên thế giới cũng công bố các kết quả nghiên cứu của mình

về cây ñộc trừ dịch hại như: Braxin có 89 loài (Fagundes B.A.,1935) [33], Liên Xô cũ có 200 loài (Petrischev P.A.,1945) [60], Nhật Bản có 24 loài ( Yamaguchi, K.et al, 1950), Mỹ có 186 loài…

Những cây ñộc chủ yếu nhất thường tập trung ở các họ Asteraceae, Fabaceae và Euphorbiaceae Các loại sản phẩm thảo mộc nổi tiếng ñược chiết xuất từ Pyrethrum, Rotenone… ñều từ các họ này (Morallo Rejesus

B.,Maini H.A and Sayboc A.S., 1990) [59]

Vào ñầu thế kỷ 20 người ta phát hiện Nicotine có trong 18 loài Nicotina , trong ñó phổ biến nhất trong 2 loài thuốc lá N.tabacum Lim và

thuốc lào N.rustica l Ngoài ra, người ta còn tìm thấy Nicotine trong cây cỏ sữa (Asclepia syriaca), cây ớt mả (Atropa belladonna), cây ñuôi ngựa (Equisetum arrense), cây thạch tùng (lycopodium clavatum)…(Beinhert E.C.,

1950; Leete E., 1965) [25] Nicotine tinh khiết ñược chiết xuất ñầu tiên vào năm 1828, mặc dù trước ñó người ta ñã dùng bột khô hoặc nước chiết từ cây thuốc lá ñể trừ sâu hại hoặc chấy rận

Ngoài Nicotine trong các alkaloids của thuốc lá còn có 2 chất ñộc quan trọng khác là nomicotine và anabasine (Metcalf R.L.,1945-1955) [57] Hàm lượng Nicotine trong thuốc lá từ 2-10%, trong thuốc lào là 16% Nicotine tác

ñộng chủ yếu lên hệ thống ñầu dây thần kinh, qua bụng lên não, làm các cơ rối loạn cuối cùng làm sâu hại bị tê liệt và chết (Mcindoo N.E., Roark R.C

and Busbey R.F.,1936) [55] Nicotine còn ñược coi là chất có tác dụng xua

ñuổi côn trùng (Liu C.Y and Hsu Y.F, 1941) [49] Do những tác ñộng trên

mà nicotine ñược coi là 1 trong 3 loại thảo mộc quan trọng nhất ở thế kỷ 19

và ñầu thế kỷ 20 (Beinhert E.C.,1950) [25].Tuy nhiên nicotine cũng rất ñộc với người và ñộng vật máu nóng Liều gây chết của nicotine cho người là

0,06 gr, LD50ñối với ñộng vật 10- 22 mg/kg (Feurt.S.D ,1958) [34] Chính vì

tác ñộng mạnh và không có tính chọn lọc của nicotine mà nó bị cấm sử dụng

làm thuốc trừ sâu ở nhiều nước trên thế giới

Năm 1909, nhà hóa học người Nhật Fujitani là người ñầu tiên nghiên cứu sâu về tính chất hóa học của các chất trừ sâu có trong hoa cúc trừ sâu

Chrysanthemum cinerariacfolium Vis thuộc họ cúc Asteraceae Năm 1924, Staudinger và Ruzicka ñã xác ñịnh trong dịch chiết Pyrethrum có chứa 2

esters của các acid chrysanthemic và pyrethric và ñặt tên cho 2 chất này là Pyrethrin I(C21H28O3),Pyrethrin II(C22H28O5) Năm 1965, Godin và nnk ñã phân lập thêm 2 chất phụ nữa là Jasmolin I (C21H30O5) và Jasmolin II (C22H30O5) Các hoạt chất này là các chất ñộc thần kinh cơ, tác ñộng chủ yếu

vào hệ thần kinh của cá và sâu bọ làm cho cơ bị liệt, co quắp rồi chết ðối với người và ñộng vật máu nóng các họat chất này tương ñối an toàn vì chúng bị phân hủy trong cơ thể và bị thải ra ngoài qua nước tiểu (Miyamoto J and Yamamoto K.,1968) [58] Tuy nhiên, ñến cuối những năm 1970 thuốc trừ sâu hóa học mới ra ñời, cây cúc trừ sâu ít ñược chú ý ñến cả trong nghiên cứu lẫn ứng dụng

Năm 1912, NagaiK lần ñầu tiên ñã tách chiết ñược một chất hoàn toàn ñồng nhất, có ñiểm sôi 163o C từ cây Derris chinensis, tên ñịa phương gọi là

“Roten” và do ñó chất này ñược ñặt tên là Rotenone Tiếp ñến là một loạt chất khác gần giống Rotenone ñã ñược phân lập từ cây cùng họ với Derris, chúng

ñược gọi là “rotenoids” Cho ñến năm 1971 người ta ñã xác ñịnh ñược 11 rotenoids trong tự nhiên, biết rõ công thức cấu tạo phân tử cũng như ñặc tính hóa lý của chúng (Jacobson M and Crosby D.G.,1971) [44]

Rotenone cũng ñược phát hiện có trong nhiều loài cây, tập trung nhất trong họ Leguminosae với các chi chính như: Derris, Lochocarpus, Tephorosia… Trong ñó Derris có 80 loài khác nhau, Lochocarpus có trên 10 loài, Tephorosia có 150 loài Chúng ñược phân bố rộng rãi ở Châu Âu, Châu

Úc, Bắc và Nam Mỹ (Roark R.C.,1941; Bottomley W.,Nottle R.A and White D.E.,1945) [62,26]

Rotenone cũng như một số rotenoids khác có hiệu quả cao ñối với cá và các loài sâu ăn lá Cơ chế tác ñộng chủ yếu của chúng ñối với sâu hại là ức chế hô hấp, ức chế tác dụng dẫn truyền thông tin ñến các bộ phận cơ thể (Tischler N.,1935) [76] Tuy nhiên, rotenone lại khá an toàn ñối với người và ñộng vật có vú khác Liều gây ñộc cấp tính của rotenone ñối với thỏ là 3000 mg/kg trong khi ñó của Nicotine là 30 mg/kg (Brown A.W.A,1954) [28] Do tính an toàn ñối với người và môi trường mà rotenone ñược coi là một trong 3

loại thảo mộc trừ sâu quan trọng và hiệu quả suốt thời gian dài trước khi thế

hệ thuốc trừ sâu hóa học mạnh ra ựời

Trong vòng 2 thập kỷ gần ựây, một loài cây ựược tập trung nghiên cứu nhiều nhất với hoạt chất chắnh là azadirachtin, rất an toàn với người và môi trường nhưng gây ựộc hại với sâu bệnh hại cây trồng đó là cây Neem

Azadirachtaindica A.Juss.(Haasler C.,1984; Schmutterer H.,1990) [40,71] Cây Neem từ xa xưa ựã ựược trồng khắp nơi của Ấn độ và Miyanma Sau ựó chúng di thực ựến: Cameroon, đông Nam Á, Australia, Cuba (Jacobson M.,1990) [43] Cho ựến nay ựã có nhiều hội nghị quốc tế tổng kết các công trình nghiên cứu, chế biến sử dụng cây Neem và nó ựược xem như cây trồng mũi nhọn có triển vọng trong lĩnh vực nghiên cứu thuốc trừ sâu thảo mộc

Ngoài Nicotine, Rotenone, Pyrethrum, Azadirachtin còn có rất nhiều các chất ựộc tự nhiên khác ựã ựược phát hiện như : Tinh dầu, các Alkaloids, Amaroids, GlucozidsẦ

Tuy nhiên, những nghiên cứu về cây ựộc trong thiên nhiên ựể sản xuất thuốc thảo mộc trên thế giới thường gặp những vấn ựề chung như: ựộ bền hữu hiệu kém do chất ựộc là những chất thiên nhiên dễ bị phân hủy Hàm lượng chất ựộc tự nhiên trong cây thường thấp nên muốn có lượng chất ựộc nguyên chất từ thực vật con người phải chiết tách rất khó khăn và tốn kém (Bowers W.S.,1977) [27] Do công nghệ chiết xuất phức tạp, cần nhiều các dung môi hữu cơ ựắt tiền ựồng thời không bảo quản ựược lâu nên các sản phẩm này khó

có lượng dự trữ lớn cho sản xuất trên diện rộng (Meisner J.,1981) [56]

Tuy nhiên, theo chúng tôi trong những kết quả nghiên cứu của thế giới chủ yếu mới tập trung vào các cây ựộc ựược quan tâm nhiều mà chưa có nhiều nghiên cứu, khai thác những cây ựặc thù của các ựịa phương Những công trình nghiên cứu ựược công bố trên thế giới tuy khá phong phú song chỉ chú ý tới các mặt tác ựộng trực tiếp của các chất ựộc chắnh trong cây mà chưa

ñi sâu vào khai thác các mặt tác ñộng phụ như: ức chế sinh trưởng, gây ngán

ăn, xua ñuổi, xông hơi…Vì ñôi khi những tác ñộng này lại gây hiệu quả chính của một loại cây ñộc nào ñó trong ñiều kiện thích hợp

Những nghiên cứu thuốc thảo mộc như là một chế phẩm sử dụng cho sản xuất khá phức tạp Nếu không kiên trì, xác ñịnh ñúng phương pháp, ñúng ñối tượng thì khó có thể thành công Những kết quả nghiên cứu trên thế giới phần nhiều là thăm dò, còn ít những công trình ñồng bộ khép kín ñể tạo ra những sản phẩm hoàn chỉnh ñưa ra phục vụ sản xuất trên diện rộng

1.1.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng các sản phẩm cây Neem trừ dịch hại trên thế giới

Cây Neem (Azadirachta indica A Juss) là cây trồng bản ñịa ở Ấn ðộ

và một số nước khác Hiện nay chúng ñược di thực và phát triển mạnh ở nhiều nước trên thế giới, ñược coi là “Cây trồng ñể giải quyết ñược vấn ñề toàn cầu”

Hoạt chất trong cây Neem tồn tại chủ yếu trong hạt Neem bao gồm: Azadirachtin,Salanin,Nimbidin,Meliantriol,Salanol,1-

3Diacetylvilasinin…Tuy nhiên hợp chất chính có ý nghĩa trừ sâu hại là Azadirachtin Trên thế giới có những nghiên cứu tác ñộng chính của cây Neem ñối với dịch hại bao gồm:

Dịch chiết từ hạt Neem có thể trừ ñược các loài sâu chích hút, bảo vệ ñược các lá mới mọc sau khi phun thuốc trên các cây : Ngô, lúa, mía, nho, khoai tây, bông…(Radwanski S.A.,1980) [61] Những sản phẩm chiết bằng nước hoặc dung môi hữu cơ từ lá và hạt Neem có tác ñộng làm giảm tỷ lệ trứng ñẻ

ở sâu hại (Mansour F.A , Asher K.R.S,1983) [53], sâu non không lột xác ñược, nếu các sản phẩm này tiếp xúc ở cuối giai ñoạn sâu non, sâu sẽ không hóa nhộng ñược Dịch chiết từ hạt Neem còn làm rối loạn các hormone sinh trưởng, làm sâu non chậm phát triển, giảm khối lượng cơ thể rồi chết (Rembol H.,1984) [63]

Một số nghiên cứu khác về cây Neem trên thế giới cho thấy nó thực sự, thắch hợp cho việc hạn chế lâu dài dịch hại cây trồng.Các nước như Mỹ, Anh

ựã phát triển một mảng của khoảng 40 sản phẩm từ cây Neem ựể sử dụng trong nông nghiệp, lưu trữ và y học

Các sản phẩm thân, lá, hạt, vỏ ựều sử dụng rất có ắch cho cuộc sống của con người.Các nghiên cứu ựều cho một kết luận là các hoạt chất từ cây Neem tuy không có tác dụng trừ sâu cao theo kiểu gây chết ngay (Ộknock outỢ) song chúng lại có các tác ựộng rất phù hợp với IPM và ựảm bảo phát triển nông nghiệp an toàn, bền vững là gây ngán ăn, xua ựuổi, gây rối loạn hocmon, ức chế giao phối, lột xác, ựẻ trứng làm cho thế hệ sâu hiện tại bị suy yếu, giảm mức ựộ gây hại và làm cho các thế hệ sau suy giảm mạnh cả về số lượng và chất lượng quần thể Sản phẩm từ cây Neem có thể ức chế sự phát triển của 200 loài sâu và bệnh hại cây trồng và sản phẩm cây trồng ở các mức ựộ khác nhau, lại rất khó gây nên tắnh chống thuốc của dịch hại (JacobsonM., 1986; JohnsonS., Morgan E.D.etal., 1996 RuskinF.R.,1992) [42,47,65]

Hoạt chất có trong Neem có tác ựộng tới sâu hại ựược nhiều tác giả nghiên cứu đó là nhóm các chất thuộc một lớp chung của các sản phẩm tự

nhiên là ỘTriterpeneỢ hoặc hẹp hơn là các ỘLimonoid Ợ Chắnh tác ựộng với

phổ rất rộng của sâu hại và cả bệnh hại là nhờ vào tổ hợp các limonoid này Hàm lượng Limonoid của chúng có trong nhân hạt Neem thay ựổi theo từng giống, từng vùng song thường nằm trong khoảng 0,2 - 6,2% (Ruskin F.R.,1992) [65] Các limonoid quan trọng ựược nghiên cứu nhiều nhất trong

sản phẩm Neem là Azadirachtin, Salannin, Melantriol, Nimbin, Nimbidin

Azadirachtin là một hoạt chất quan trọng nhất ựối với sâu hại Hàm lượng của

nó trong nhân hạt Neem thường nằm khoảng 3.000 - 10.000ppm (Jacobson M.,1986; Ruskin F.R.,1992) [42,65] Nó có tác ựộng tương tự như một hocmon côn trùng, can thiệp vào quá trình biến thái, làm suy giảm quá trình

vũ hoá, lột xác, ñẻ trứng, xua ñuổi sâu hại Meliantriol và Salannin với hàm

lượng rất thấp song nó có tác dụng ức chế quá trình ăn và có thể gây ngừng ăn ñối với côn trùng Nimbin và Nimbidin lại có tác ñộng chống virus Nimbidin

có hàm lượng lớn (khoảng 2% nhân hạt Neem), là chất chủ yếu gây nên vị ñắng (Jacobson M.,1986; Ruskin F.R.,1992) [42,65] Nhiều nghiên cứu ñã tập trung vào sản xuất dầu Neem, ñánh giá ñộc lực của chúng ñối với côn trùng hại cây và gia công chế phẩm trừ sâu Có chế phẩm từ dầu Neem trừ muỗi Anopheles ñạt 100% ở tuần ñầu và 80% ở tuần thứ 3 sau xử lý (Dua V.K.,Pandey A.C.et al,2009) [30] Bằng phương pháp xác ñịnh LD50 dựa vào màng tồn dư (Residual film bioasay), các tác giả ñã so sánh ñộc lực của dầu Neem với một số dầu thực vật có khả năng trừ sâu và ñã xác ñịnh LD50 của

dầu Neem ñối với bọ cánh cứng Callosobruchus maculatus là khoảng 500

mg/cm2 (Mahfuz I.,Khalequzzaman M.,2007) [52] Theo Saxena, dịch chiết

từ hạt Neem có hiệu quả tốt với bọ trĩ hại hoa cây họ ñậu với chi phí ñầu vào thấp (Saxena R.C., Kidiavai E.L.,1997) [70] Nghiên cứu của Umar cho thấy, trong các dung môi chiết, sử dụng benzene, acetone, ethanol, methanol ñều

cho LC50 (v/v) ñối với ấu trùng Aedes aegypi khá nhỏ (0,09 - 1,23), thấp hơn

chiết bằng nước rất nhiều (Umar A.et al.,2007) [73].Tuy nhiên, sử dụng dung môi cũng là một vấn ñề về chi phí ñầu vào, kể cả tăng ñộ ñộc ñối với ñộng vật máu nóng (như methanol, benzene) hoặc chi phí nhiều năng lượng ñể cô và thu hồi dung môi (như với ethanol)

1.1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng các sản phẩm Neem trừ côn trùng hại kho trên thế giới

Theo ñánh giá của FAO, hàng năm tổn thất về ngũ cốc dự trữ là khoảng trên 10% Con số thiệt hại này còn cao hơn ñối với vùng nhiệt ñới và á nhiệt ñới khoảng 20% Gây thiệt hại trong kho ngũ cốc chủ yếu là côn trùng, ngoài

ra là các vi sinh vật nhất là các vi sinh vật hoại sinh, ñộng vật gặm

nhấm…(Jilani G.,Malik M.M.,1973) [45] Trên thế giới, ñể phòng trừ sâu hại kho, người ta ñã áp dụng hệ thống các biện pháp phòng trừ bao gồm biện pháp cách ly (kiểm dịch, ngăn ngừa lây lan, cách ly nguồn nhiễm), biện pháp

ñề phòng (chọn hàng hoá bảo quản, kiểm tra thường xuyên kho, thiết bị bảo quản ), biện pháp diệt trừ Biện pháp này bao gồm biện pháp cơ lý (làm sạch sản phẩm, dùng nhiệt ñộ và ñộ ẩm, ánh sáng, vợt, tia phóng xạ), biện pháp sinh học (sử dụng thiên ñịch, hocmon triệt sản, thuốc sinh học và thảo mộc), biện pháp hoá học Biện pháp hoá học ñược sử dụng có hiệu quả và áp dụng rộng rãi nhất, song hàng loạt vấn ñề môi trường và kỹ thuật nảy sinh khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, ñể lại tồn dư trong nông sản, hình

thành tính chống thuốc của sâu hại ðặc biệt, thuốc xông hơi Methyl bromide

dùng ñể khử trùng nông sản rất có hiệu quả lại ñang bị hạn chế sử dụng và loại trừ hoàn toàn vào năm 2015 theo Nghị ñịnh thư Motreal ðể khắc phục những tác ñộng tới mức báo ñộng của các hóa chất bảo vệ thực vật ñang ñược

sử dụng ồ ạt như hiện nay cần phải có các loại thuốc có hiệu quả trừ dịch cao, vừa an toàn cho người sử dụng, cộng ñồng và môi trường Ngay từ khi thuốc hóa học tổng hợp ra ñời (một bước ngoặt lịch sử trong lĩnh vực bảo vệ thực vật) thì ñồng thời cũng là lúc thế giới bắt ñầu cuộc chạy ñua tìm kiếm các giải pháp nhằm giảm thiểu các tác ñộng tiêu cực của chúng Do ñó, người ta chú ý nhiều ñến các loại thuốc phi hóa học như thuốc trừ sâu sinh học, thuốc thảo mộc nhằm tiến tới tương lai với một nền nông nghiệp sinh thái và nông nghiệp hữu cơ

Thuốc thảo mộc là thuốc sử dụng các chất ñộc có sẵn trong cây cỏ thiên nhiên ñể phòng trừ hoặc hạn chế tác hại của dịch hại Chúng có nhiều ưu ñiểm

cơ bản như: Chất ñộc là các hợp chất thiên nhiên nên sau khi sử dụng hầu hết chúng nhanh chóng ñược phân hủy, không ñể lại dư lượng ñộc trong nông sản

và môi trường, ít ñộc hại với sinh vật có ích Chúng có nhiều tác ñộng tới dịch

hại như: gây chết, gây ung trứng, gây ngán ăn, xua ñuổi, hấp dẫn, ức chế sinh trưởng, gây bất dục nên rất dễ tham gia mục tiêu của phòng trừ dịch hại tổng hợp

Từ những ưu ñiểm cơ bản trên, trong những năm vừa qua và hiện nay các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu và ñã có những ứng dụng quan trọng trong sản xuất

Nghiên cứu về sử dụng sản phẩm từ cây Neem sản xuất thuốc thảo mộc

trừ côn trùng hại kho ngũ cốc trên thế giới ñược chia theo hai hướng lớn sau:

Một là, nghiên cứu sản xuất các chế phẩm phòng côn trùng hại tại chỗ

mà người nông dân có thể tự sản xuất ñược Viện Nghiên cứu Nông nghiệp

Ấn ðộ và nhiều tác giả khác ñã xuất bản tài liệu dùng nước chiết xuất ñơn giản nhân hạt Neem hoặc bánh Neem (Neem cake), tạo huyền phù dầu hạt Neem trong nước, sản xuất bột hạt Neem ñể phòng trừ sâu hại trong ñó có sâu hại kho ngũ cốc.Các sản phẩm này, chủ yếu là dịch chiết, dầu Neem, bột hạt Neem cần ñược sản xuất và sử dụng ngay, thay thế một phần quan trọng các thuốc trừ sâu hoá học, có thể áp dụng thuận lợi cho nông dân nghèo ở các vùng ñất khô cằn Các sản phẩm phòng trừ sâu hại kho thường dùng ñể trộn ñều với hạt ngũ cốc, nhúng bao bì ñựng, tạo lớp bảo vệ, Các sản phẩm sản xuất tại chỗ dùng phòng trừ sâu hại kho thường ñược các tác giả ñưa ra là bột

lá Neem khô, bột nhân hạt Neem thô, dầu Neem thô (Dua V.K.,2009; Jacobson M.,1986; Saxena R.C.,2003) [30,42,69] Tuy nhiên, theo chúng tôi, trong sản xuất nông nghiệp hiện ñại không có các sản phẩm thuốc BVTV dạng sẵn sàng ñể sử dụng mà phải ñợi qua chế biến mỗi lần sử dụng sẽ thiếu tính chủ ñộng và mất nhiều công lao ñộng, ít hấp dẫn với người nông dân vùng thâm canh cao Chất lượng hạt Neem dùng sản xuất thuốc thảo mộc trừ sâu hại kho cần phải ñảm bảo ñể không dễ bị nhiễm nấm mốc gây ô nhiễm aflatoxin ñối với nông sản (Schmutterer H.,1990; Singh R.P.,2000) [71,72]

.Theo Viện Nghiên cứu nông nghiệp Ấn ðộ, dầu Neem, bột nhân hạt Neem, bánh dầu Neem (sản phẩm phụ ñược ép lại sau khi thu hoạch dầu), lá Neem ñều có tiềm năng quản lý sâu hại trong kho chứa hạt ngũ cốc ðặc biệt, việc trộn các chế phẩm trên với hạt giống trong quá trình bảo quản là một biện pháp lý tưởng (Akou-Edi D.,1984; Singh R.P.,2000) [22,72] Hiện nay, việc trộn lá Neem 2-5 % với hạt mì, lúa và ngũ cốc khác ñể bảo quản chúng ñang ñược thực hành phổ biến ở các thôn làng tại Ấn ðộ và Pakistan (Saxena R.C.,2003) [69] Có tác giả ñi theo hướng sử dụng sản phẩm từ cây Neem như một chất xua ñuổi sâu hại kho có hiệu quả (Jilani G.,Malik M.M.,1973) [45]

Hai là, nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc thảo mộc trừ sâu hại dạng công nghiệp là một hướng ñã và ñang phát triển mạnh ở nhiều nước và một

số bản quyền (Patent) ñã xuất hiện nhiều nhất ở Mỹ, Ấn ðộ và một số nước khác Các chế phẩm thường sản xuất dựa trên quá trình chiết công nghiệp, tạo dạng với các phụ gia cần thiết ñể không những chúng có thể ñảm bảo có hiệu lực trong thời gian dài và nâng cao hơn hiệu quả trừ sâu Các sản phẩm ñược nghiên cứu thường bao gồm dạng dầu Neem, bột hạt Neem có ñộ tinh khiết cao, dạng huyền phù, dạng nhũ dầu chứa hoạt chất từ cây Neem hoặc dẫn xuất của chúng ðây là một hướng quan trọng mà mỗi nước cần nghiên cứu ñể có sản phẩm ứng dụng tốt phù hợp với chủng loại cây Neem bản ñịa hoặc nhập nội, với các dịch hại và ñiều kiện canh tác cây trồng hoặc bảo quản nông sản

ở ñịa phương (Jacobson M., 1986; Johnson S.,Morgan E.D.et al.,1996) [42,47] ðặc biệt, khâu tạo dịch chiết hoặc dầu Neem có ñộ tinh khiết cao và hàm lượng hoạt chất cao ñược nhiều tác giả chú ý nhất (Johnson S.,Morgan E.D.et al.,1996; Liauw M.Y.et al,2008) [47,50] Liauw và ñồng nghiệp ñã nghiên cứu sao cho chiết dầu Neem tối ưu bằng ethanol và n-hexane và ñạt ñược tỷ lệ dầu tối ưu của nhân hạt Neem là 44% ở nhiệt ñộ 500C và kích cỡ hạt ñược nghiền là 0,425 -0,720 mm (Liauw M.Y.et al,2008) [50] Việc sử

dụng dầu Neem bằng công nghệ ép thắch hợp ựể xử lý bao ựựng hạt ngũ cốc 1mg/cm2 hoặc trộn dầu Neem với hạt ngũ cốc theo tỷ lệ 0,05 - 0,1% có thể ựạt hiệu quả bảo vệ hạt ựược 70-80%, tốt hơn cả việc sử dụng phosphine xông hơi (1g/1m3) (Saxena R.C,2003) [69] Sanguanpong và ựồng nghiệp ựã tạo ra hạt hỗn hợp dầu trên cơ sở dầu Neem (Neem-Oil-based Pellets) ựể phòng

chống mọt hại kho Sitophilus oryzae L Kết quả cho thấy sau khi trộn các hạt

thuốc vào hạt ngũ cốc, không có sự khác nhau có ý nghĩa về mức ựộ gây ngán

ăn của mọt trưởng thành Song hỗn hợp dầu Neem và một số tinh dầu khác cho hiệu quả khá rõ với lượng trứng ựẻ và số lượng vũ hoá của bọ trưởng thành (Sanguanpong U.et al,2001) [66] Dầu Neem ép nguội với hiệu suất 15% (so với nhân hạt), trộn với hạt ựậu ựỗ 0,2-0,5% có thể trừ mọt ựậu

Callosobruchus spp ựược 8 tháng với thiệt hại nhỏ hơn 15% Trong ựó có 40 loại ựược sử dụng dưới dạng dịch chiết Các chế phẩm này có tác ựộng phức tạp và khác nhau ựối với sâu hại (Gabriele S.,2000) [37]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu, sử dụng thuốc thảo mộc trừ sâu hại ở Việt Nam

Từ xa xưa nhân dân ta ựã có kinh nghiệm sử dụng một số cây ựộc trong thiên nhiên ựể trừ giun sán, chấy rận như cây bách bộ, hạt na, hạt củ ựậu đặc biệt, ựối với các dân tộc miền núi thì việc khai thác các cây ựộc còn ựược mở rộng ở mục ựắch sử dụng như dùng hạt thàn mát, cây dây mật ựể làm ruốc cá

đến ựầu thế kỷ 20 ựã có những công trình nghiên cứu thăm dò hiệu lực trừ sâu hại của một số loài cây ựộc như: Hạt thàn mát, hạt bã ựậu, hạt mần ựể,

rễ dây mật (Trương Thanh Giản,1961) [16] Năm 1979-1981 Cục bảo vệ

thực vật ựã tiến hành phân loại, ươm trồng cây ruốc cá (Derris sp.,) và sản

xuất một số chế phẩm chiết xuất từ rễ cây này ựể thử trên một số loại sâu hại như: Rệp hại bông, sâu tơ, bọ xắt muỗi hại chè đã chiết tách và xác ựịnh

ñược hàm lượng rotenone trong rễ cây Derris elliptica (Trần Quang Hùng và CTV,1985; Lê Trường,1987; Nguyễn Xuân Dũng,1993) [21,5,7] Hiện nay bột rễ cây ruốc cá chủ yếu sử dụng ñể trừ cá dữ trong các vùng nuôi tôm nhân tạo (Bùi Văn Ngạc, 1985) [2]

Năm 1990- 1991 trung tâm sinh học trường ðHTH cho ra ñời sản phẩm Nicotex từ chất nicotine trong cây thuốc lá dù hiệu lực trừ sâu khá cao song lại rất ñộc với người và môi trường

Bộ môn sinh thái – Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật ñã sản xuất thử chế phẩm ST3 từ cây thanh hao hoa vàng và phối hợp với viện Bảo Vệ Thực Vật, nghiên cứu thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm này với một số sâu hại rau

và lúa( Vũ Quang Côn và CTV,1993) [20]

ðặc biệt ñến năm 1995 qua dự án VNM 9510 -017- CHLB ðức, Viện Bảo vệ thực vật, Cục BVTV và khoa sinh ðại học tổng hợp Hà Nội ñã tập hợp và giới thiệu ñược 53 loài cây ñộc ở 10 tỉnh phía Bắc Việt Nam, trong ñó

có nhiều cây triển vọng chế biến và sử dụng làm thuốc trừ sâu thảo mộc như:

Cây Derris spp trừ sâu tơ hiệu lực ñạt 70- 80%, trừ rầy xanh hại chè ñạt 70%, trừ rệp hại bông; Cây xoan ta Melia azedarach L Trừ sâu cuốn lá, sâu

khoang, sâu xanh, sâu tơ ñạt trung bình 50-60%; Cây thuốc lào, thuốc lá có thể trừ ñược bọ trĩ, bọ xít dài, cuốn lá nhỏ hại lúa, rệp hại ngô, rệp cải, sâu tơ, sâu xanh bướm trắng hại rau họ thập tự, nhện ñỏ hại cam; Hạt củ ñậu trừ sâu hại rau họ thập tự, Bọ xít ñùi to, bọ nẹt (Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết, 2000) [11] Tuy nhiên các cây ñộc ñược ñược phát hiện chủ yếu chỉ dừng lại

ở việc sử dụng dưới dạng bột , dạng dịch chiết thủ công hay sử dụng hỗn hợp với các thuốc hóa học ít ñộc khác ñể tăng hiệu lực trừ sâu hại chưa có chế phẩm ñáp ứng yêu cầu sản xuất ñược ñăng ký sử dụng rộng rãi

Năm 2000-2001 Bộ môn Thuốc, Cỏ dại và Môi trường – Viện Bảo vệ thực vật công bố kết quả thực hiện dự án: “ðiều tra ñánh giá các cây có ñộc

tắnh trừ sâu ựể sản xuất thuốc trừ sâu thảo mộcỢ Dự án tiến hành ựiều tra trên

11 tỉnh trong phạm vi cả nước ựã phát hiện ựược 137 loài cây ựộc ựược chia làm 3 nhóm:

Nhóm I: Gồm 23 loài có ựộc tắnh cao, hiệu quả sinh học rõ rệt, tiềm năng nguyên liệu lớn, triển vọng khai thác sử dụng tốt như: Bã ựậu, bình bát,

Cà ựộc dược, Cơi, Củ ựậu, Cứt lợn, Ruốc cá, Gấu tầu, Na, Neem, Sở, Thàn mát, Nghể, Thanh hao hoa vàng, Thuốc lá, Thuốc lào, Trẩu, Xoan

Nhóm II: Gồm 55 loài có ựộc tắnh cao, hiệu quả sinh học, tiềm năng nguyên liệu khá, có triển vọng khai thác sử dụng như: Bạch ựàn, Bồ hòn, Bồ kết, Cỏ lào, Cỏ sữa lá to, Cúc vạn thọ, đào, Húng chanh, Keo dậu, Ké ựầu ngựa, Lá ngón, Mần tưới

Nhóm III: Gồm 59 loài có tắnh ựộc thấp cần tiếp tục nghiên cứu khai thác như: Bạc hà, Bìm bìm, Cà gai, Hương nhu tắa, Long não, Hương lâu Ngoài ra còn một số kết quả nghiên cứu ở Việt Nam về ảnh hưởng của các cây ựộc như: bình bát, lá bạch ựàn chanh, hạt na, hạt thàn mát, cây Neem ựối với sâu hại trong bảo vệ thực vật

Tuy nhiên những kết quả nghiên cứu về thốc thảo mộc trừ dịch hại ở Việt Nam còn rất hạn chế, ựa số có tắnh chất thăm dò, thử nghiệm ban ựầu, thiếu tắnh ựồng bộ, hệ thống Cho ựến nay ở Việt Nam có rất ắt chế phẩm thảo mộc ựược sản xuất trong nước ựáp ứng yêu cầu sản xuất thực tế

1.2.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng thảo mộc trừ côn trùng hại kho tại việt Nam

Mọt hại cũng ựược xác ựịnh là ựối tượng gây hại chắnh trong kho ngũ cốc ở nước ta, ựặc biệt là các loài mọt thuộc bộ cánh cứng Coleoptera (mọt gạo

Sitophylus oryzae F., mọt ựục hạt nhỏ Rhzopertha dominica F., Mọt thóc ựỏ Triolium ferrugineum F, ) và bộ cánh phấn (ngài thóc Plodia interpuncrella H.,ngàigạoCorcyracephalonica S., )(VũQuốc Trung,1981) [18]

Ở nước ta, việc bảo quản ngũ cốc trong nhiều năm qua chủ yếu vẫn dựa vào biện pháp cơ lý và biện pháp hoá học với hai loại hóa chất chủ yếu dùng

trong xông hơi là Phosphine và Methyl bromide Vấn ñề sâu hại kho kháng

mạnh với thuốc Phosphine và yêu cầu hạn chế tiến tới chấm dứt việc sử dụng thuốc xông hơi Methyl bromide ñòi hỏi phải có các công cụ, chế phẩm mới trong bảo quản ngũ cốc, ñặc biệt là các thuốc thảo mộc Tuy nhiên, cho ñến nay, rất ít chế phẩm thảo mộc ñược sản xuất hoặc sử dụng ñể bảo quản kho ngũ cốc

Viện Bảo vệ thực vật ñã nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm Guchongjing 25DP (GCJ) ñược sản xuất tại Trung Quốc từ nhiều loài cây có tính ñộc trừ sâu (không chứa thành phần Neem) có bổ sung một hàm lượng nhỏ 0,024% Deltamethrin và ñã ñăng ký sử dụng ở nước ta năm 2004 Thuốc có tác ñộng tiếp xúc, vị ñộc, xua ñuổi, làm sâu ngừng ăn Thuốc có hiệu quả cao và kéo dài nhiều tháng với thóc ñổ rời bằng cách tạo lớp bảo vệ phía trên khối lương

thực bảo quản, ñặc biệt ñối với các dòng mọt ñục hạt nhỏ Rhyzopertha dominica ñã kháng thuốc Phosphine và Fenithrothion Thuốc có thể trộn lẫn với hạt ngũ cốc trước khi cho vào dụng cụ chứa song chi phí cao và chỉ nên làm với hạt giống Tuy nhiên, nguồn cung cấp thuốc thảo mộc GCJ từ Trung Quốc nhìn chung không ổn ñịnh và khối lượng sử dụng ở nước ta còn rất ít và trong chế phẩm còn chứa hoá chất nhóm Pyrethroids (Nguyễn Tiến Thắng,2005) [9]

Chi cục Bảo vệ thực vật Thanh Hóa cũng nghiên cứu thành công hợp chất chiết xuất từ thảo mộc làm chậm quá trình phát triển của côn trùng và bảo quản nông sản sau thu hoạch Hợp chất này ñược chiết xuất từ hỗn hợp tinh dầu Long não, kết hợp với dịch chiết ra từ cây ñinh lăng tạo thành dung dịch BQ – 09 BQ - 09 không phải ñể tiêu diệt côn trùng hại kho như một loại thuốc trừ sâu mà nó làm chậm ñược quá trình xâm nhiễm - phát triển của côn trùng vào khối nông sản cần bảo quản trong một khoảng thời gian nhất ñịnh

BQ - 09 hầu như vô hại với người, vật nuôi và hoàn toàn không làm nhiễm bẩn cho nông sản Lần ñầu tiên ở Việt Nam, tính "tương kỵ" với côn trùng của một số các hợp chất hoá học tự nhiên, ñã ñược tác giả nghiên cứu, ứng dụng thành công trong việc bảo quản cho nhiều loại nông sản sau thu hoạch

Trong 2 năm 2005-2006, Viện Bảo vệ thực vật ñã tiến hành ñánh giá hiệu lực của 2 loại thuốc thảo mộc dạng bột PN-Funaton 1 và PN- Funaton 2 ñối với mọt hại ngô trong ñiều kiện phòng thí nghiệm và thực tế bảo quản ngô tại Bắc Hà -Lào Cai Kết quả cho thấy trong ñiều kiện phòng thí nghiệm, thuốc PN-Funaton 1 ở liều lượng 0,5% và 0,1% gây chết 100% số mọt sau 72 giờ; thuốc PN- Funaton 2 ở liều lượng 0,5% chỉ ñạt hiệu quả 82,89% và liều lượng 0,1% chỉ gây chết 67,81% số mọt thí nghiệm cùng sau 72 giờ Quan sát còn cho thấy ở các công thức xử lý như trên mọt trưởng thành còn tránh tiếp xúc với hạt ngô có thuốc ðiều này cho thấy ngoài tác dụng diệt mọt, thuốc thảo mộc còn có tác dụng xua ñuổi mọt khá rõ rệt Thí nghiệm bảo quản ngô bắp giống tẻ vàng ñịa phương có xử lý thuốc thảo mộc PN-Funaton 1 tại các

hộ gia ñình ở Bắc Hà – Lào Cai Cho thấy thuốc có ảnh hưởng rõ rệt ñến mức

ñộ gây hại và mật ñộ mọt ngô, giảm tỷ lệ bắp bị hại, tỷ lệ hạt bị hại, tỷ lệ hao hụt trọng lượng hạt và mật ñộ mọt tương ứng là: 9,58; 2,84; 7,72 và 74,38 lần

so với ñối chứng sau 1,5 tháng bảo quản (Nguyễn Văn Liêm và cs, 2006) [13]

2005-Cây Neem ñược nhập nội vào nước ta từ Ấn ðộ, Thái Lan, Xênêgan và

ñã ñược nghiên cứu trên 10 năm qua Hàm lượng hoạt chất Azadirachtin trong

lá Neem ñã ñược Nguyễn Tiến Thắng và ñồng nghiệp xác ñịnh biến ñổi rất mạnh từ 5ppm ñến 349 ppm tuỳ theo từng vùng (Nguyễn Tiến Thắng, 2005) [9].Trong các năm 1990 – 2002, Viện Bảo vệ thực vật ñã nghiên cứu thử nghiệm các chế phẩm tự sản xuất trong nước và của nước ngoài ñã cho kết luận: Các sản phẩm trừ sâu từ cây Neem có hiệu lực trừ sâu tức thời không

cao, kể cả dịch chiết hạt Neem 4% cũng chỉ có hiệu lực 51% ñối với sau tơ hại rau song tỷ lệ sâu vào nhộng ñã giảm 3 lần, tỷ lệ bướm vũ hoá giảm 3,7 lần, tỷ lệ bướm ñẻ trứng và sâu nở ñược là 0% so với ñối chứng (Nguyễn Duy Trang, Nguyễn Thị Me và nnk, 2000; Nguyễn Văn Tuất và nnk 2001) [8,10] Một số ñơn vị như Công Ty Thuốc sát trùng Việt Nam (VIPESCO) ñã nghiên cứu một số sản phẩm từ Neem trồng tại Việt Nam trừ sâu hại cây trồng như VINEEM 1500EC Viện Bảo vệ thực vật ñã phối hợp với Công ty TNHH KAWA (Nhật) ñể sản xuất thuốc thảo mộc từ cây Neem bản ñịa của Ninh Thuận với chế phẩm ñăng ký có tên VINANEEM 2SL Tuy nhiên, cho ñến nay chưa có chế phẩm trừ sâu hại kho từ cây Neem ñược ñăng ký sử dụng ở nước ta

Dự án “ðiều tra ñánh giá các cây có ñộc tính trừ sâu ñể sản xuất thuốc trừ sâu thảo mộc (2000-2001)” do Viện Bảo vệ thực vật chủ trì ñã phát hiện 23 cây ñộc thuộc nhóm 1 có tính ñộc cao, hiệu quả sinh học rõ rệt, tiềm năng nguyên liệu lớn có triển vọng khai thác và phát triển tốt, trong ñó có cây Neem Thông qua dự án, chúng tôi ñã xác ñịnh cây cóc hành bản ñịa tại Ninh Thuận mọc rất phổ biến trong rừng và xen lẫn trong khu vực sản xuất và sinh sống của nông dân chính là một loài Neem và chúng có hàm lượng chất ñộc tương ñương với cây Neem nhập từ ấn ðộ

Hiện nay, Ninh Thuận, Bình Thuận là các tỉnh ñang phát triển mạnh diện tích trồng cây Neem bản ñịa và Neem nhập từ Xênêgan Tại Hội thảo khoa học "Nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất các sản phẩm từ cây Neem" diễn ra tại Ninh Thuận, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Ninh Thuận cho biết, trong các loài cây trồng rừng hiện nay, cây Neem (Neem nhập nội) và cây Cóc hành (Neem ñịa phương) vẫn ñược coi là hai loại cây trồng chủ lực, là cây ña mục ñích và có giá trị kinh tế cao, do ñặc tính ưa sáng, mọc nhanh, có chu kỳ kinh doanh ngắn, dễ trồng trên vùng ñất nghèo

dinh dưỡng ñặc biệt ñối với các vùng ñất có chế ñộ khí hậu khô hạn với ñặc trưng là mùa khô kéo dài từ 8-9 tháng trong năm Hiện nay, chỉ tính riêng Ninh Thuận ñã có trên 3000 ha Neem , 2000 ha ñã cho thu hoạch và ñến năm

2010, tỉnh này sẽ tập trung mở rộng diện tích trồng 6.000 hecta cây Neem trên ñịa bàn toàn tỉnh Một số tỉnh khác ở miền Nam Trung Bộ cũng có xu hướng phát triển mạnh cây Neem trong thời gian tới như Bình Thuận Tại Hà Tĩnh

và Hoà Bình, Công ty TNHH Kawa cũng ñang thử nghiệm trồng mỗi nơi 10

ha Neem bản ñịa của Ninh Thuận Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện Bảo

vệ thực vật, cây Neem bản ñịa và Neem nhập nội ở Việt Nam có những mặt mạnh và yếu sau trong việc sử dụng sản phẩm của chúng làm thuốc thảo mộc: + Ưu ñiểm: Hàm lượng chất ñộc trong hạt và lá tương ñương với Neem ở Ấn ðộ; Thời tiết khô ở Ninh Thuận, Bình Thuận khi thu hạt ñảm bảo

rất thuận lợi cho việc thu hoạch quả, ít khi bị nấm mốc vàng Aspergilus flavus xâm nhiễm hạt làm giảm phẩm chất hạt nhanh như ở một số nước có ñộ

ẩm khi thu hoạch Cây Neem có thể phát triển khá tốt ở vùng ñất xấu và theo ñánh giá ban ñầu của chúng tôi, ñất trồng càng khô cằn, hàm lượng chất ñộc trừ và xua ñuổi sâu hại trong cây Neem càng cao

+ Hạn chế: Nhìn chung cây Neem bản ñịa ở nước ta cho năng suất hạt không nhiều Kể cả ở Ninh Thuận, trung bình mỗi cây chỉ ñạt 3-5 kg quả ở vụ chính Tại phía Bắc, cây Neem tuy phát triển mạnh song cho quả thất thường

và năng suất thấp hơn hẳn ở phía Nam Nếu có quả, khi thu hoạch dề gặp ẩm

ñộ và bị nấm xâm nhiễm nhanh Các vùng ñất tốt, cây Neem phát triển nhanh song hàm lượng chất ñộc trừ sâu thấp hơn hẳn cây Neem trồng ở vùng ñất khô cạn Tuy nhiên, trong trên dưới 10 năm trở lại ñây, cây Neem Xênêgan nhập nội ñã phát triển rất tốt ở vùng ñất bán khô hạn Nam Trung bộ với năng suất

có thể ñạt trung bình 10 kg/ cây 7 năm tuổi trở lên

Do vậy, nếu sử dụng ñược cả lá và hạt làm thuốc thảo BVTV và bảo quản ngũ cốc như một số nước ñã làm thì loại cây này có cơ hội phát triển rất nhanh ở các vùng ñất khó khăn, ñất tận dụng, nơi làm cây bóng mát ở nước ta Việc tạo dạng thuốc BVTV thảo mộc ñòi hỏi như một ñiều quan trọng hàng ñầu là phải có nghiên cứu công nghệ phù hợp nhằm nâng cao và ổn ñịnh hiệu quả phòng chống dịch hại của chúng

Hiện nay, nhìn chung công nghệ sản xuất chế phẩm thảo mộc BVTV và chế phẩm bảo quản nông sản từ cây Neem sẵn có ở nước ta còn rất sơ khai

và cần ñược tập trung nghiên cứu ñể thúc ñẩy việc phát triển loại cây bản ñịa rất có giá trị này Ý nghĩa quan trọng của nó không chỉ góp phần bảo vệ nông sản an toàn mà còn là ñòn bảy quan trọng ñể duy trì và thúc ñẩy việc phát triển cây Neem, một cây chống sa mạc hoá trên hàng trăm nghìn ha ñất vùng bán khô hạn ở nước ta

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các sản phẩm từ cây Neem

Hạt và lá Neem thu hoạch tại Phước Dân-Ninh Phước - Ninh Thuận (cây Neem 7-9 tuổi)

2.1.2 Máy móc và dung môi hóa chất

+ Dung môi ACN, MeOH, EtOH, n-hexane

+ Các chất ổn ñịnh dầu Neem: NEPI

+ Các chất trợ lực như DEPI ; SPYR, INDE

+ Các chất hoạt ñộng bề mặt: TWIN 20, ESOR

+ Chất nhũ hoá: RPOL

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100

+ Các thiết bị nghiền, chiết xuất, làm sạch

+ Máy khuấy Agitator; Máy tách vỏ hạt Neem

+ Máy ép nguội dầu Neem; Thiết bị khuấy và lọc dầu Neem

2.1.3 Mọt ngô (Sitophilius zeamais Motschulsky) và ngô hạt ñã ñược phơi

hoặc sây khô

2.1.4 Vật liệu ñánh giá ñộ ñộc cấp tính của các sản phẩm Neem

- Chuột bạch 2 tháng tuổi có khối lượng trung bình 20 – 25 g/con

- Thức ăn hỗn hợp

- Lồng nuôi chuột

- Bình nước uống cho chuột

- Trấu ñã ñược tiệt trùng

- Dụng cụ bơm thuốc qua ñường miệng vào chuột

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xác ñịnh hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem bản ñịa và nhập nội tại Ninh Thuận

2 đánh giá trong phòng tác ựộng của các sản phẩm từ cây Neem và các sản phẩm từ cây Neem kết hợp với chất phụ gia, chất trợ lực thảo mộc ựối với mọt hại ngô (Sản xuất dầu Neem từ hạt Neem bằng phương pháp ép nguội tự nhiên và phương pháp chiết sử dụng dung môi, sản xuất bột Neem bằng nghiền lá, hạt Neem sau khi ựã làm khô,ẦCác sản phẩm tạo ra ựược kết hợp với phụ gia và thử hiệu lực ựối với mọt kho)

3 đánh giá ựộ an toàn của các sản phẩm từ cây Neem ựối với bảo quản ngô 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác ựịnh hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem

Muốn xác ựịnh hàm lượng Azadirachtin trong lá và hạt Neem trước hết phải chiết tách ựể lấy dầu Neem và chiết hoạt chất azadirachtin sau ựó mới tiến hành ựịnh lượng hàm lượng hoạt chất Azadirachtin trên máy sắc ký lỏng

Phương pháp chiết dầu bằng n-hexane: Lấy 100 g nhân hạt Neem nghiền nhỏ (0,3-0,5mm), cho vào 300 ml n-hexane khuấy ựều, ngâm trong 12

h , sau ựó ly tâm thu pha n-hexane, lọc qua 30g Na2SO4, cất quay chân không

thu ựược dầu Neem

* Ph ương pháp chiết lấy dầu (Neem oil) ựồng thời với hoạt chất (Azadirachtin)

Nguyên tắc là dùng hệ dung môi không phân cực (n-hexan, benzen) và dung môi phân cực (MeOH , EtOH) ựể chiết dầu Neem và hoạt chất azadirachtin một cách ựồng thời

Phương pháp chiết ñồng thời bằng n-hexane và EtOH: Lấy 100 g nhân hạt Neem nghiền nhỏ (0,3-0,5mm), cho vào 300 ml n-hexane và 200 ml EtOH, khuấy ñều, ngâm trong 24 h, sau ñó ly tâm thu pha n-hexane, lọc qua 30 g Na2SO4 , cất quay thu ñược dầu Neem

* Ph ương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dịch chiết

+ Ph ương pháp chiết tạo dịch chiết:

B ước 1: 100 g hạt/lá Neem ñược nghiền nhỏ (d= 0,5 mm ± 0,2mm) cho vào

cốc dung tích 1000 ml

B ước 2: Cho 300 ml n-hexane, rung siêu âm 30 phút (hoặc ngâm trong 24

h), chuyển sang ly tâm (3000 vòng/ 2 phút), gạn lấy pha n-hexane

B ước 3: Lặp lại bước 2 với phần bã, thu và gộp pha n-hexane với bước 2 Lọc

qua 30 g Na2SO4 , cất quay chân không thu ñược lượng dầu Neem

B ước 4: Cho 200 ml MeOH 95% vào phần bã, rung siêu âm 30 phút (hoặc

ngâm trong 24 h), chuyển sang ly tâm (3000 vòng/ 2 phút), thu phần dung dịch

B ước 5: Lặp lại bước 4, thu và gộp phần dung dịch, xác ñịnh thể tích dung

dịch chiết thu ñược

+ ðịnh lượng azadirachtin trong dịch chiết:

B ước 1: Lấy 50 ml dịch chiết cho vào bình chiết, bổ sung 100 ml n-hexane,

lắc kỹ và bỏ lớp n-hexane chứa dầu còn sót lại

B ước 2: Lọc qua giấy lọc No.2 pha MeOH, có 20 Na2SO4 khan ñể loại nước

B ước 3: Thu dịch lọc, ñịnh mức bằng MeOH cho ñủ 50 ml

B ước 4: Lấy 1 ml, pha loãng 100 lần

B ước 5: Lấy 1,5 ml dung dịch ñã pha loãng, lọc qua bơm lọc,cho vào lọ mẫu

B ước 6: Chạy mẫu trên HPLC Agilent 1100

Phương pháp ngoại chuẩn:

Cột C18(4mm X 250mm), Hệ dung môi: MeOH/ water=65/35(v/v)

Tốc ñộ dòng: 0.5 ml/min; Bước sóng thu nhận tín hiệu: 217nm

Lượng mẫu bơm: 5ul; Thời gian chạy mẫu: 10 phút

* Ph ương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dầu Neem ép nguội và

bã h ạt Neem sau khi ép nguội

Phương pháp chiết xuất dầu bằng hệ dung môi rất phức tạp và tốn kém, mặt khác lượng dầu thu ñược rất khó triệt ñể Do ñó chúng tôi nghiên cứu thử nghiệm thêm phương pháp ép dầu bằng thiết bị ép nguội ñã ñược thiết kế mới

phù hợp (dạng trục xoắn - côn ép) tại Việt Nam

Cách tiến hành: Hạt neem ñược phơi khô,tách vỏ bằng máy sau ñó ép nhân hạt Neem không dùng nhiệt và hoá chất, sử dụng máy ép dạng rãnh xoắn ,

ép côn với áp lực ép lớn và có kèm thiết bị lọc ñể thu ñược dầu Neem tự nhiên(bao gồm dầu và cả các hoạt chất có trong nhân hạt Neem), bã hạt Neem

Bã hạt Neem (Bánh ép dầu): là sản phẩm còn lại của nhân hạt Neem sau khi ép nguội (ñược cán mỏng)

Lá Neem: lá bánh tẻ của cây Neem 7- 9 tuổi, phơi khô kiệt trong bóng râm Cách chiết và ñịnh lượng hoạt chất của hai loại này theo phương pháp chiết và phương pháp ñịnh lượng dịch chiết

+ Phương pháp ñịnh lượng Azadirachtin trong dầu Neem ép nguội

B ước 1: Lấy 20 ml dầu cho vào bình chiết, bổ sung 100 ml ete dầu hỏa;

Lắc ñều và rung siêu âm 30 phút

B ước 2: Thu lớp dịch chứa aza ñã kết tủa vào một bình cầu nhỏ

ðể lắng và gạn nhẹ nhàng loại phần lỏng giữ lại phần aza kết tủa

B ước 3: Cho vào bình cầu 15 ml MeOH, rung siêu âm ñể hoà tan azadirachtin

ðịnh mức bằng MeOH cho ñủ 20 ml

B ước 4: Lấy 1,5 ml lọc qua bơm lọc, cho vào lọ mẫu

B ước 5: Chạy mẫu trên Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Agilent 1100 )như

ở bước 6 của phương pháp ñịnh lượng azadiractin trong dịch chiết

* Ph ương pháp ựịnh lượng Azadirachtin trong bã Neem sau khi ép nguội

B ước 1: Cân 20 g bã nhân hạt Neem xay ựồng nhất với 20 ml n- Hexan và 30

ml EtOH Ngâm dung dịch trong 5 giờ ở 550c

B ước 2: Dung dịch ựể sau 5 tiếng ựược cho ra máy quay ly tâm trong vòng 3

phút, thu phần dịch lỏng ở phắa trên

B ước 3: Cho phần dịch lỏng vào bình cầu nhỏ cất quay chân không

B ước 4: Sau ựó tiếp tục bổ xung 30 ml n- hexan lắc ựều và rung siêu âm 10

phút Phần lỏng và aza kết tủa thu vào bình cầu nhỏ để lắng gạn loại phần lỏng, giữ phần kết tủa

B ước 5: Cho 10 ml MeOH vào bình cầu hòa tan phần kết tủa Chuyển ra ống

ựong và thêm MeOH ựịnh mức ựủ 20 ml Lấy 1 ml và phân tắch trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2.3.2 đánh giá trong phòng tác ựộng của các sản phẩm từ cây Neem và các sản phẩm từ cây Neem kết hợp với chất phụ gia, chất trợ lực thảo mộc ựối với mọt hại ngô

Sản phẩm từ cây Neem trong ựề tài sử dụng là lá Neem và hạt Neem ựược lấy từ các cây Neem 7- 9 tuổi ở Ninh Thuận Tuy nhiên ựể ựánh giá tác ựộng của chúng ựến mọt ngô phải tiến hành xử lý ựể tạo thành các dạng sản phẩm thảo mộc khác nhau nhằm mục ựắch tiện cho việc sử dụng cũng như nâng cao hiệu quả phòng trừ mọt của chúng Do ựó trước khi tiến hành thắ nghiệm ựánh giá tác ựộng các sản phẩm Neem phải tạo dạng chúng Các sản phẩm khác nhau từ hạt và lá Neem bao gồm : dịch chiết, dầu tự nhiên, bột lá,

bã chiết, bánh dầu Chúng tôi ựã sử dụng thêm các chất phụ gia bao gồm chất tăng ựộ loang dắnh (TSE), chất trợ lực (INDE, SPYR) Các chất phụ gia rất ắt ựộc và các chất trợ lực là các chất thảo mộc và có nguồn gốc thảo mộc, rất ắt ựộc ở liều lượng sử dụng

* Ph ương pháp tạo các sản phẩm Neem dạng dung dịch:

+ Dung dịch chiết (SE)

Chiết nhân hạt Neem ñã nghiền nhỏ ñồng thời bằng EtOH + n-hexane : 1kg nhân hạt Neem (hạt Neem ñã ñược tách vỏ) + 1400 ml EtOH + 700

ml n-hexane Hỗn hợp thu ñược rung siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc No.2 thu lấy dịch chiết

Dịch chiết thu ñược kết hợp với các chất phụ gia thảo mộc hay có nguồn gốc thảo mộc như: INDE, SPYR, TSE ñể tạo thành các sản phẩm khác nhau dạng dung dịch như: SE-DE, SE-PY, SE- TE…giúp tăng hiệu quả trừ mọt của các sản phẩm chiết xuất từ Neem

+ Dung dịch dầu tự nhiên (SO)

Hạt Neem ñược tách vỏ, cho vào máy ép nguội, lọc dung dịch qua thiết

bị lọc thu ñược dung dịch dầu Neem tự nhiên SO

Dung dịch SO ñược bổ sung thêm các chất phụ gia dạng lỏng và dạng rắn tạo thành SO- DE và SO- PY, nhằm tăng hiệu lực của dung dịch dầu Neem tự nhiên ban ñầu

* Phương pháp tạo các sản phẩm Neem dạng bột: