Nghiên cứu khả năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất paenol tách chiết từ cây xích thược việt nam trên chuột được gây u thực nghiệm

luận văn, thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, khóa luận, đề tài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

ðẶNG THỊ HOÈ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG VÀ CHỮA TRỊ UNG THƯ CỦA HOẠT CHẤT PAENOL TÁCH CHIẾT TỪ CÂY XÍCH THƯỢC VIỆT NAM TRÊN CHUỘT ðƯỢC GÂY U THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi, những số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và kết quả nghiên cứu chưa từng ñược sử dụng Mọi thông tin trích dẫn trong báo cáo này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

TÁC GIẢ

ðặng Thị Hoè

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp

Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Ngọc Thạch trưởng bộ môn Nội chẩn dược và ñộc chất, Khoa Thú y, trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội và TS ðỗ Thị Thảo Tổ trưởng Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, người ñã tận tình hướng dẫn giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện ñào tạo sau ñại học, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y, Bộ môn Nội chẩn dược và ñộc chất Khoa Thú y, Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện trong suốt thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh ñạo, các anh chị tổ thử nghiệm sinh học, viện công nghệ sinh học Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã giúp

ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm, thu thập số liệu tại cơ

sở

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 04 tháng 12 năm 2010

Tác giả

ðặng Thị Hoè

MỤC LỤC

Danh mục viết tắt trong ñề tài Error! Bookmark not defined

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 26

4.1 Kết quả tạo mô hình u thực nghiệm trên chuột thí nghiệm bằng tế

4.4 Kết quả xác ñịnh liều ñộc cấp LD50 của hoạt chất paeonol chiết

4.5 Mức ñộ tăng trọng của chuột thí nghiệm khi cho uống bán trường

4.6 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá máu và hoạt ñộ một số enzyme cơ bản của chuột khi cho uống bán trường diễn của

4.7 Kết quả mổ trực quan nội tạng chuột thí nghiệm khi cho uống bán

4.8 Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ của PAN 49 4.9 Khả năng duy trì và tăng trọng lượng cho ñộng vật bị u của PAN 52 4.10 Khả năng ức chế khối u phát triển và chống di căn 55 4.11 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của PAN ñến các chỉ tiêu huyết học

và chức năng gan và thận của chuột bị gây u thông qua một số chỉ

4.12 Ảnh hưởng của chế phẩm PAN trên mô bệnh học của gan, thận,

4.13 Kết quả tiêu bản thu ñược từ khối u chuột thí nghiệm 64

DANH MỤC VIẾT TẮT TRONG ðỀ TÀI

- ALT: Alanine aminotransferase (SGPT)

- AST: Aspartate aminotransferase (SGOT)

- CDDP: Cisplatin

- DDSL: Dung dịch sinh lý

- DMEM: Dullbecco Modified Eagle Medium

- DMSO: Dimethyl Sulphoixide

- DOX: Doxorubicin

- EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid

- Eca-109: Human Esophageal Epithelial Cancer Cell Line

- FBS: Fetal Bovince Serum

- 5-FU: 5-fluorouracil

- HepA: Hepar

- HPLC: High Performance Liquid Chromatography

- LD: Lethal Dose

- LLC: Lewis lung carcinoma

- NCI: National Cancer Institute

- Nxb: Nhà xuất bản

- PAN: Hoạt chất paenol

- PBS: Phosphate Butfered saline

- SEG-1: Human oesphageal adenocarcinoma cell line

- TN: Thí nghiệm

- WHO: World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

4.1: Thời ñiểm chuột xuất hiện khối u sau khi tiêm tế bào LLC 35

4.2: Mức ñộ tăng trọng của chuột thí nghiệm (gram) và tỉ lệ chuột

sống/chết ở từng lô thí nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 (n=10 chuột) 36

4 3: Kết quả tạo khối u trên chuột bằng tế bào LLC 38 4.4: ðộc tính cấp của PAN trên chuột thực nghiệm 42 4.5: Ảnh hưởng của PAN lên sự tăng trọng của chuột khi cho uống

4.6: Ảnh hưởng của chế phẩm PAN lên các chỉ tiêu sinh lý và sinh hoá

4.7: Kết quả mổ trực quan nội tạng chuột thí nghiệm ñược uống chế

4.8: Số lượng chuột ñược gây u chết sau khi cho uống PAN là chất

4.11: Ảnh hưởng của PAN lên chỉ tiêu huyết học và một số enzyme

4.12: Ảnh hưởng của PAN trên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi

DANH MỤC HÌNH

2 1 Ảnh cây Xích thược (Paeonia veitchii Lynch.) 17

2 2 ðề xuất cơ chế chuyển hóa của paeonol trong cơ thể chuột 19

2 3a Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương trình của paeonol ñối với dòng tế bào ung thư thực quản 21

2 3b Khả năng gây chết tế bào theo chương trình của paeonol ñối với

2 4a Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol ñến

2 4b Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol ñến

2 5a Hệ số tương tác của cisplatin và paeonol ñến dòng SEG-1 23

2 5b hệ số tương tác của cisplatin và paeonol ñến dòng Eca-109 23

2 6 Sự kết hợp của paeonol và cisplantin gia tăng khả năng gây chết

4 1 Mức ñộ tăng trọng của chuột ñược gây u bằng tế bào LLC 37

4 2a Khối u sần ở khu vực hậu môn chuột bị tiêm LLC sau 30 ngày thí

4 2b Khối u cứng ở nách trái chuột bị tiêm LLC sau 30 ngày thí nghiệm

4 3 Ảnh hưởng của PAN lên sự tămg trọng của chuột thí nghiệm khi

4 5 Khả năng tăng trọng lượng cho vật bị u của PAN tại các lô thí

4 6 Thể tích khối u của chuột ñược uống PAN ở các lô thí nghiệm tại

4 7 Ảnh hưởng của PAN lên một số enzyme chức năng gan chuột ñược

4 9b Cơ ñùi chuột bị u với tế bào ung thư ñang phân chia bất thường 64

4 10a Ảnh tiêu bản mô phổi chuột thí nghiệm bị ung thư 65

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, bệnh dịch xảy ra rất nhiều cả trong nhân y và thú y Ngồi những bệnh đặc thù của thú y như bệnh Dịch tả lợn, bệnh Tai xanh, bệnh Lở mồm long mĩng, bệnh Newcastle gia cầm, … cịn cĩ các bệnh cĩ căn nguyên

từ động vật nhưng lại lây lan và gây nguy hiểm trực tiếp đến con người như bệnh cúm gia cầm (H5N1), bệnh cúm lợn (H1N1), bệnh dại, … ðể điều trị và tiêu diệt bệnh dịch thì địi hỏi sự kết hợp chặt chẽ giữa nhân y và thú y ðặc biệt trong các phịng thí nghiệm để tìm ra nguyên nhân, triệu chứng và cách điều trị các bệnh nan y của con người như bệnh ung thư khơng thể thiếu các con vật trong thú y để thí nghiệm như chuột, thỏ, chim, …

Ung thư hiện đang là một căn bệnh nan y và gây tỉ lệ tử vong cao cho người bệnh Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) thì cĩ khoảng 7,9 triệu người chết (chiếm 13% tổng số người chết) vào năm 2007 vì bệnh ung thư Những bệnh ung thư phổ biến và dẫn đến tỉ lệ tử vong cao hàng năm

là ung thư phổi, gan và ung thư vú Theo dự đốn, trên thế giới tỉ lệ tử vong

do căn bệnh này sẽ tiếp tục tăng cao cĩ thể lên tới con số 9 triệu người chết vào năm 2015 và 11,4 triệu người chết vào năm 2030 Tại Việt Nam, căn bệnh ung thư đang hồnh hành ở khắp mọi miền đất nước và ngày càng tăng cao, với ước tính mỗi năm cĩ 150.000 ca mắc mới và 75.000 người tử vong,

gấp 7 lần số người chết do tai nạn giao thơng (http:// www.ungthu.net.vn)

Việc tìm ra phương cách chế ngự và chữa trị ung thư thực sự là một thử thách được đặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới

Việc chữa trị ung thư thực sự gặp rất nhiều khĩ khăn mặc dù hiện nay

đã sử dụng nhiều liệu pháp chữa trị như liệu pháp gen, liệu pháp miễn dịch, hố trị, xạ trị, phẫu thuật hoặc kết hợp các liệu pháp này Các nhà khoa học

cũng ñã ñưa ra liệu pháp phòng chống ung thư (cancer chemoprevention) sử dụng các hoạt chất có tác dụng ngăn chặn bệnh hình thành, tiến triển, phát bệnh và di căn (Boone và cs, 1990 [10]) Tuy nhiên, dù là liệu pháp nào thì

khả năng phòng chữa bệnh của chúng sau khi ñược chứng minh ở mức ñộ in

nghiên cứu tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng

Trong nỗ lực tìm kiếm thuốc chữa trị ung thư, các nhà khoa học ñã

hướng sự tập trung vào các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật

Cây Xích thược có tên khoa học Paeonia veitchii Lynch.Var beresowskii

Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Xích thược là một loại cây thuốc quí ñược trồng lâu ñời ở Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Triều Tiên Vào ñầu những năm 1970, cây ñã ñược di thực trồng ở Việt Nam, nhiều nhất là ở tỉnh Lào Cai (Sa Pa) Theo ñông y Xích thược ñược dùng ñể chữa ñau vùng ngực, bụng, sườn và mồ hôi trộm Xích thược phối hợp với nhiều dược liệu khác trong bài thuốc chữa sốt xuất huyết Ngoài ra, trong các bài thuốc Xích thược dùng ñể chữa băng huyết, bạch ñới, ñau tức ngực, ñau nhói vùng tim, chảy máu dưới

da, chảy máu do bệnh nhĩêm khuẩn, viêm tắc ñộng mạch, lao xương và lao khớp xương,

Với những ñặc tính trên, nhiều nghiên cứu in vitro ñã chứng minh rằng

một số thành phần hóa học của cây Xích thược có khả năng diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển, có khả năng tác ñộng ñến quá trình tự chết của tế bào thông qua kích hoạt enzyme Caspase, tác ñộng và ức chế nhiều yếu tố liên quan quá trình tăng sinh, phát triển và bất tử của tế bào ung thư

ðể ñánh giá hoạt tính phòng chống ung thư ñầy tiềm năng, ñặc biệt là

hoạt chất Paenol ñược chiết xuất từ cây Xích thược của Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng phòng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol ở

mức in vivo trên chuột ñược gây u thực nghiệm Kết quả nghiên cứu của ñề

tài sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm

ñi ñến ñích cuối cùng làm ra thuốc phòng và chữa trị ung thư có hiệu quả kinh

tế, an toàn cho nhân dân

Với các lí do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu khả năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất Paeonol tách chiết từ cây Xích thược Việt Nam trên chuột ñược gây u thực nghiệm”

1.2 Mục ñích nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành ñề tài này với mục ñích:

1 Gây u thực nghiệm trên chuột bằng tế bào LLC ñể tạo mô hình cho nghiên cứu khả năng phòng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol

2 Nghiên cứu khả năng phòng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol ở mức

1.3 Ý nghĩa của ñề tài

1.3.2 Ý nghĩa khoa học

Từ các kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần tìm ra giải pháp, phương thuốc chữa trị căn bệnh ung thư gây tử vong cao trên thế giới

2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Khái quát về bệnh ung thư

2.1.1 Ung thư là căn bệnh của tế bào

Khối u ung thư thường phát triển từ một tế bào ban ñầu và phải mất một thời gian cho tới khi có một kích thước ñủ lớn ñể có thể có các dấu hiệu nhận biết ñược Thông thường, các tế bào lành có một tuổi thọ nhất ñịnh và tuân thủ chặt chẽ theo một quy luật chung là “phát triển- già- chết” Các tế bào chết ñi lại ñược thay thế bằng các tế bào mới Cơ thể có một cơ chế kiểm soát quy luật này rất nghiêm ngặt và duy trì số lượng tế bào của mỗi cơ quan, mỗi tổ chức ở mức ổn ñịnh Bệnh ung thư bắt ñầu khi có một tế bào vượt qua

cơ chế kiểm soát của cơ thể, phát triển, sinh sôi không ngừng, hình thành một ñám tế bào có chung một ñặc ñiểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn

ép vào các cơ quan, tổ chức sống xung quanh gây tử vong cho người bệnh (Hiệp hội quốc tế chống ung thư UICC,1993)

2.1.2 Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào

Hiện tại, các loại ung thư ñược các nhà khoa học phân chia theo nguồn gốc phát sinh tế bào của chúng (Nguyễn Chấn Hùng, 1994) gồm:

• Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): là dạng ung thư phổ biến nhất, xuất phát từ những tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong (endoderm) và lá phôi ngoài (ectoderm) Các ví dụ hay gặp nhất về loại ung thư này là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng.v.v

• Sarcoma: là dạng ung thư ít gặp hơn, xuất phát từ những tế bào có nguồn gốc là phôi giữa (mesoderm) và là những tế bào thuộc vào hệ thống chống ñỡ cho cơ thể như xương, sụn, mỡ, mô liên kết và cơ

• Lymphoma: là dạng ung thư tương ñối hiếm gặp, xuất phát từ các hạch bạch huyết và các mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể Ví dụ về loại

• Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm do biểu hiện bệnh rất sớm, ở

cả trẻ em và người trẻ tuổi, xuất phát từ các tế bào máu non thuộc tuỷ xương

và có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong hệ máu như trong trường hợp ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia)

2.1.3 Các giai ñoạn của bệnh ung thư

Quá trình phát triển từ một tế bào ung thư ban ñầu thành một khối u ung thư và ñe doạ tính mạng người bệnh trải qua nhiều giai ñoạn Giai ñoạn ñầu là hình thành tế bào ung thư khởi phát do ảnh hưởng của các tác nhân nội bào hay ngoại bào nào ñó Diễn biến tiếp theo là quá trình phân chia liên tục không ngừng của tế bào ung thư này thành một khối u ñược gọi là quá trình phát triển bệnh Các tế bào ung thư trong khối u sẽ tiếp tục tăng sinh, tự mất

ñi các thụ cảm thể nhận biết giới hạn không gian phát triển với các tế bào lân cận, sản xuất ồ ạt các cytokine (cell signals) và các enzyme protease dẫn tới phá huỷ màng ñệm lót và môi trường ngoại bào bao quanh khiến chúng có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di chuyển tới các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh

vô tổ chức Quá trình này gọi là sự di căn (metastatic process) Các tế bào ung thư chèn ép hay di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống trong cơ thể như não, phổi, gan, thận… khiến bệnh nhân tử vong (Hiệp hội quốc tế chống ung thư UICC, 1993)[5], (Darnell J và cs, 1990)

Như vậy, căn bệnh ung thư có thể ñược tóm tắt theo sơ ñồ:

2.1.4 Tác nhân gây bệnh ung thư

2.1.4.1 Tác nhân môi trường:

Là hàng loạt các tác nhân hoá học, vật lí như:

Tế bào ung thư

Tế bào

bình thường hoặc ngoại bào Tác nhân nội

Quá trình tăng sinh

và phát triển

Bệnh ung thư

Ớ Trong số rất nhiều các tác nhân gây ung thư, khói thuốc lá ựược xem

là mối nguy hại tiềm ẩn lớn nhất cho sức khoẻ cộng ựồng với hơn 20 chất hoá học có khả năng gây ung thư Các khắ ựốt xăng dầu, ựộng cơ, khắ thải nhà máy công nghiệp.v.v cũng ựược xem là ựộc hại và gây ô nhiễm môi trường,

có khả năng gây ung thư cao cho con người (đái Duy Ban và cs, 2000), (National Cancer Institute Ờ NCI, 2005)

Ớ Các nhóm hoá chất gây ung thư (chemical carcinogens) rất ựa dạng về mặt cấu trúc hoá học và có mặt ở khắp mọi nơi như các nitrosamin có rất nhiều trong thành phần thuốc lá, các alcohol trong rượu, các polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), polyvinyl chlorid (PVC), các thuốc trừ sâu thuộc nhóm halogen hữu cơ (DDT), chlobenzylat, formaldehydev.vẦ

Tác nhân hoá chất gây ung thư theo 2 cách: tác ựộng trực tiếp ựến hệ gen hoặc gián tiếp thông qua việc kắch hoạt protein enzyme kinase chịu trách nhiệm trong việc ựiều khiển quá trình phân chia của tế bào (đái Duy Ban và cs,2000), (Darnell J và cs,1990)

Ớ Các yếu tố phóng xạ như tia X, tia gamma, các ựồng vị phóng xạ như

3H, 14C, 32P v.v dùng trong quân sự, y học, nghiên cứu khoa học v.v,Ầ hay nguồn phóng xạ tự nhiên từ vũ trụ, từ các ựồng vị phóng xạ trong không khắ, ựất và nước cũng là một trong số những tác nhân có khả năng gây ung thư rất cao cho con người (đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân, 1995), (Nguyễn Chấn Hùng, 1994)

Ớ Ngoài ra còn có một số tác nhân khác như các gốc tự do trong cơ thể tác ựộng ựến hệ gen và gây ựột biến nghiêm trọng như tia tử ngoại môi trường, tia UV, sóng ựiện từ, chế ựộ ăn uống giàu lipit, ựạm v.vẦ(đái Duy Ban và cs, 1995), (Nguyễn Chấn Hùng, 1994)

2.1.4.2 Tác nhân sinh học

Tác nhân sinh học ựược ựề cập ở ựây chủ yếu là một số loại virus và vi khuẩn có khả năng khởi ựộng sự phát triển ung thư khi lây nhiễm vào tế bào

bình thường (đái Duy Ban và cs, 2000), (Darnell J và cs, 1990)

Virus gây ung thư có hai loại là virus DNA và virus RNA Cơ chế gây ung thư của các virus này tương ựối phức tạp và chưa ựược hiểu hết tuy nhiên

có thể xem như chúng gây biến ựổi và chuyển dạng tế bào chủ bằng cách hợp nhất một số gen của mình vào hệ gene của tế bào bị chúng lây nhiễm khiến cho hoạt ựộng bình thường của các gene bị kắch hoạt bất thường, các Proto- oncogene biến ựổi thành Oncogene mở ựầu cho sự hình thành căn bệnh ung thư (Darnell J và cs, 1990)

2.1.5 Khái quát về tế bào ung thư

2.1.5.1 Các ựặc tắnh của tế bào ung thư

Các tế bào ung thư thường có rất nhiều nhiễm sắc thể bất thường và không ổn ựịnh Xét về mặt hình thái, các tế bào ung thư có tỉ lệ nhân/ TBC (tế bào chất) cao, nhân to, xuất hiện rất nhiều sợi phân bào so với tế bào bình thường khác Tế bào ung thư nhìn chung kém biệt hoá so với tế bào bình thường do sự phân chia quá nhanh chóng và diễn ra liên tục (Darnel J và cs, 1990)

đặc tắnh ựặc trưng, nguy hiểm nhất của tế bào ung thư là khả năng xâm lấn và di căn Các tế bào ung thư không khu trú tại chỗ mà chúng tăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận, xâm nhập vào cả hệ thống tuần hoàn và bạch huyết ựể di chuyển tới những vị trắ cách xa nơi tế bào ung thư phát sinh Hiện nay, ựặc thù này của tế bào ung thư vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ trên cơ

sở khoa học (Darnel J và cs, 1990)

Trong cơ thể con người, mỗi phút có tới 10 triệu tế bào sinh sôi Quá trình phân chia này diễn ra theo một khuôn mẫu và ựược kiểm soát chặt chẽ Tuy nhiên, khi một tế bào trở thành ung thư, nó sẽ có hoạt ựộng phân chia bất thường Cụ thể, quá trình phân chia diễn ra nhanh hơn và các tế bào con cháu ựược sinh ra sẽ không trưởng thành và chết ựi như các tế bào bình thường khác, ngược lại chúng lại tiếp tục phân chia vô tổ chức và ngày càng trở nên

khác biệt di truyền với tế bào mẹ ban ñầu (Darnel J và cs, 1990)

Một trong những ñặc tính ñáng chú ý khác của tế bào ung thư là chúng

có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch ñể tồn tại và phát triển Trong hệ máu có những tế bào “giết tự nhiên”(Natural Killer Cell) có thể ngay lập tức nhận dạng và tiêu diệt những tế bào lạ xâm nhập hay xuất hiện trong cơ thể Tuy vậy, ñáng ngạc nhiên là tế bào ung thư có những thay ñổi ñáng kể khác lạ với tế bào bình thường nhưng lại thoát khỏi sự phát hiện và tìm diệt của hệ miễn dịch Tế bào ung thư là tế bào của chính cơ thể bệnh nhân nhưng thoái hoá, biến chất nguy hiểm mà hệ miễn dịch không nhận biết ñược (Darnel J và cs, 1990)

2.1.5.2 Tình hình nuôi cấy in vitro tế bào ung thư phục vụ nghiên cứu

Tế bào là ñơn vị sống toàn vẹn của một cơ thể ñộng vật Cách ñây trên

100 năm các nhà khoa học ñã tìm cách nuôi cấy tế bào ñộng vật và ñã thành công ðến năm 1991, khi H Lewis thành công trong việc sản xuất môi trường nhân tạo ñể nuôi cấy tế bào ñộng vật thì công nghệ nuôi cấy tế bào ñộng vật invitro ñược xem là chính thức hình thành Việc nuôi cấy tế bào ñộng vật phục vụ cho các nghiên cứu khoa học trở thành các kĩ thuật rất hiệu quả trong phòng thí nghiệm (Bradley L A và cs, 2002)

Từ những nguyên lý chung của công nghệ tế bào ñộng vật, một câu hỏi ñược ñặt ra: “ Tế bào ñộng vật có thể nuôi cấy ñược vậy tế bào ung thư thì sao?” Câu trả lời ñã xuất hiện khi tế bào ung thư Hella tách từ tử cung một phụ nữ là dòng tế bào ung thư ñầu tiên ñược nuôi cấy và vẫn ñược nuôi cấy cho ñến nay ñể sử dụng vào mục ñích nghiên cứu ung thư và tìm thuốc ñiều trị ung thư Tới nay, hơn 200 loại ung thư ñều ñã có các dòng tế bào chuẩn ñược nhân nuôi, lưu giữ trong các ngân hàng tế bào (như ATCC ở Hoa Kỳ, HTCB ở ðức, RIKEN ở Nhật v.v…) ñể cung cấp cho các phòng nghiên cứu (Bradley L A và cs, 2002)

bệnh ung thư là tế bào LLC (Lewis lung carcinoma) Tế bào LLC ñược tiến sĩ MargaretR Lewis phân lập vào năm 1951 (http:// cancerweb.ncl.ac.uk/cgi-bin) Sau ñó nó tiếp tục ñược các nhà khoa học khác nghiên cứu, ví dụ như Sacchi ñã nhận thấy các khối u hình thành ở chuột thí nghiệm sau khi tiêm LLC một thời gian và phát triển rất ác tính (Sacchi và cs, 1979),v.v…Cho ñến nay, tại nhiều viện nghiên cứu trên thế giới, dòng tế bào LLC ñược sử dụng như dòng chuẩn ñể ñánh giá hiệu quả thử nghiệm invivo của thuốc phòng chống ung thư mới (Yang và cs, 2007)

2.1.6 Nuôi cấy tế bào ñộng vật

2.1.6.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro

Việc nuôi cấy tế bào ñộng vật bắt ñầu từ công trình của Withelm Roux vào năm 1885, ông ñã duy trì ñược sự sống của tế bào phôi gà trong vài ngày trong dung dịch sinh lý

Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào ñược xem là thực sự bắt ñầu từ công trình của Harrison vào năm 1907 Giai ñoạn ñầu của nuôi cấy tế bào ñộng vật chỉ

có ý nghĩa về mặt lý thuyết, nhưng càng về sau khả năng ứng dụng của nuôi cấy tế bào ñộng vật vào thực tế càng ñược nhiều người thừa nhận (Phan Thị Phi Phi,1990)

Việc nuôi cấy tế bào không chỉ sử dụng ñể giải quyết những vấn ñề thuộc phôi thai học, virus học, truyền nhiễm học mà còn sử dụng trong nghiên cứu sinh lý học tế bào, di truyền học… và ñặc biệt là trong ung thư học (Willmer E.N và cs, 1965)

2.1.6.2 ðặc ñiểm nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro

Nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro phải ñảm bảo các ñiều kiện gần giống

in vitro Một số ñiều kiện cơ bản là;

Vô trùng

Việc nhiễm khuẩn là vấn ñề lớn trong nuôi cấy tế bào Vi khuẩn, vi nấm, nấm men, bào tử nấm và thực khuẩn thể có thể nhiễm vào chai nuôi cấy

thông qua người làm việc, không khí, bề mặt nơi làm việc…Do vậy, việc áp dụng nghiêm ngặt các kỹ thuật vô trùng là rất quan trọng

Sự lây nhiễm có thể rất nhỏ, giới hạn trong một hoặc hai chai môi trường nhưng có thể lan rộng giữa một vài môi trường và ảnh hưởng ñến toàn

bộ thí nghiệm Theo Willmer E N ,1965 nuôi cấy tế bào cần có:

- Phòng nuôi cấy vô trùng, trong ñó có tủ cấy và tủ nuôi ủ tế bào

- Phòng chuẩn bị nuôi cấy

- Phòng rửa dụng cụ hấp sấy, khử trùng, …

Kỹ thuật vô trùng ñúng sẽ tạo ra hàng rào bảo vệ ngăn giữa các vi sinh vật ở bên ngoài với môi trường nuôi cấy sạch Do vậy, tất cả các nguyên vật liệu mà tiếp xúc với môi trường nuôi cấy phải ñược khử trùng cẩn thận và môi trường nuôi cấy phải thường xuyên ñược kiểm tra sự nhiễm khuẩn dưới kính hiển vi

Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ cần cho sự phát triển của tế bào ñộng vật là từ 35 – 380C, nhiệt ñộ này là thân nhiệt của ñộng vật máu nóng Ở 40C một số tế bào có thể sống trong một thời gian và có thể bảo quản những tế bào này ngắn hạn ở

40C Ở 20 – 250C tế bào sống ñược nhưng phát triển chậm Trên 400C tế bào chỉ sống ñược vài giờ, ở 450C tế bào sẽ chết sau 30 phút, dưới 00C tế bào bị chết Dưới -400C ñến -1960C, trong ñiều kiện bảo quản ñặc biệt tế bào có thể sống ñược vài tháng ñến hàng chục năm (Phan Thị Phi Phi, 1990), (Willmer

ở khoảng 10C/ 5 phút

CO2 và bicacbonat

CO2 xuất hiện trong môi trường nuôi cấy dưới dạng hoà tan, ở trạng thái cân bằn với HCO3 - Áp lực CO2 không khí, cũng giống như nhiệt ñộ, sẽ ñiều hoà nồng ñộ CO2 hoà tan Do vậy, khi nuôi cấy tế bào trong tủ ấm 370C

ta phải nạp khí CO2 (Bulter M và cs, 1994) Thực tế cho thấy hàm lượng CO2

trong không khí môi trường nuôi là 5%, nồng ñộ này thích hợp với nhiều dòng tế bào

Môi trường nuôi cấy

Năm 1991, H Lewis chế thử môi trường lỏng ñầu tiên, bao gồm một số thành phần quen thuộc như: muối khoáng, pepton, huyết thanh, chất chiết xuất phôi

Cùng với việc nhân giống các dòng tế bào thì nhu cầu về lượng môi trường nuôi cấy lớn hơn, chất lượng ổn ñịnh hơn ñã dẫn ñến sự ra ñời của các môi trường nuôi cấy mới dựa trên cơ sở những phân tích về dịch cơ thể và hoá sinh dinh dưỡng (Skehan và cs,1990), (Willmer E N,1965)

Cho ñến nay, ñã có rất nhiều loại môi trường khác nhau thích hợp cho từng loại tế bào ñộng vật Các môi trường ñó ñều có thành phần chính gồm acid amin, khoáng, vitamin,… như môi trường RPMI (Roswell Park Memorial Instutite), MEM (Minimal Essential Midium) của Eagle, DMEM (Dulbecco Minimal Essential Midium) của Dulbecco cải tiến trên môi trường của Eagle, … (Hee – Byung Chai và cs, 2000)

2.1.7 Khả năng phòng và chữa trị bệnh ung thư

2.1.7.1 Liệu pháp sinh học ( Biological therapy)

Liệu pháp sinh học hay còn ñược gọi là liệu pháp miễn dịch là phương pháp sử dụng hệ miễn dịch của cơ thể một cách trực tiếp hoặc gián tiếp ñể chống lại bệnh ung thư hoặc thông qua việc làm giảm thiểu các tác dụng phụ của các liệu pháp chữa trị ung thư khác Liệu pháp này bao gồm

việc sử dụng các interferon, interleukin, kháng thể ựơn dòng, vaccine, can thiệp vào hệ gen (gene therapy) và các chất tăng cường miễn dịch không ựặc trưng ựể chống lại tế bào ung thư (Darnell J và cs, 1990), (National Cancer Institute, 2005)

2.1.7.2 Liệu pháp hoá trị

Là liệu pháp sử dụng dược liệu hoá chất có khả năng tiêu diệt hoặc ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư Các hoạt chất ựược sử dụng tuỳ theo các loại ung thư khác nhau và theo liều lượng khác nhau Cho ựến nay, liệu pháp hoá trị ựược xem là hiệu quả tuy nhiên liệu pháp này thường ựi kèm với nhiều tác dụng phụ không mong muốn như nôn mửa, rụng tóc v.vẦ(đỗ Trung đàm, 1995)

2.1.7.3 Liệu pháp xạ trị

Là liệu pháp sử dụng nguồn năng lượng cao từ tia X, tia gamma, neutron và các nguồn phóng xạ khác ựể tiêu diệt tế bào ung thư và các khối u khu trú tại chỗ Liệu pháp này sử dụng máy chiếu phóng xạ từ ngoài cơ thể hoặc thông qua một số nguồn vật liệu phóng xạ ựược chuyển vào cơ thể ở vị trắ gần khối u ung thư Ngoài ra, liệu pháp này còn sử dụng các cơ chất phóng

xạ như các kháng thể ựơn dòng gắn ựồng vị phóng xạ ựể tăng cường tắnh hiệu quả và ựặc hiệu, tránh làm tổn thương các tế bào lành khác trong quá trình ựiều trị bệnh (Nguyễn Thanh đạm và cs, 2002)

2.1.7.4 Liệu pháp phẫu thuật

Là phương pháp sử dụng phẫu thuật ựể cắt bỏ khối tế bào bệnh Liệu pháp này thực sự ựem lại hiệu quả chữa trị nếu ựây là giai ựoạn ựầu của bệnh ung thư, khối u vẫn còn khu trú tại chỗ Trong trường hợp căn bệnh ựã di căn tới các khu vực khác nhau trong cơ thể thì liệu pháp phẫu thuật sẽ chỉ là giải pháp tình thế và cần kết hợp với các liệu pháp khác ựể ựiều trị tắch cực và triệt

ựể (đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân,1995)

2.1.7.5 Liệu pháp phòng chống ung thư (cancer chemoprevention)

Khác với mục ñích của liệu pháp chữa trị ung thư (cancer chemotherapy) nhằm tiêu diệt tế bào ung thư ñể ngăn ngừa sự tiến triển của căn bệnh, thì liệu pháp phòng chống ung thư lại nhằm ngăn chặn bệnh ngay từ ñầu, là giai ñoạn xuất hiện sự chuyển dạng của những tế bào bình thường thành những tế bào ung thư (National Cancer Institute, 2005)

Các nhóm hoạt chất phòng chống ung thư hoạt ñộng theo 2 phương cách:

1 Phòng chống hoặc ngăn chặn những ñột biến gen có khả năng dẫn tới bệnh ung thư (National Cancer Institute, 2005)

2 Phòng chống hoặc ngăn chặn quá trình tăng sinh liên tục của các tế bào bệnh dẫn tới hình thành khối u (National Cancer Institute, 2005)

Hiện tại, Viện nghiên cứu ung thư của Mỹ- NCI ñã ñưa liệu pháp phòng chống ung thư lên thành một trong những vấn ñề ñược ưu tiên hàng ñầu với hơn 400 hoạt chất có tiềm năng ñang ñược tích cực nghiên cứu Cho ñến nay, một số hoạt chất ñã chính thức ñược sử dụng rộng rãi và ñược chứng minh là có khả năng phòng chống sự hình thành và phát triển của tế bào ung thư ở những giai ñoạn sớm như các vitamin A, C, D, E, các hoạt chất như β- caroten, tamoxifen.v.v.(Cragg G M và cs, 1994) và hoạt chất paenol trong cây xích thược

ðể ñối phó ñược với căn bệnh hiểm nghèo nêu trên, việc tìm kiếm nguyên liệu thuốc từ thực vật, ñộng vật và vi sinh vật trên ñất liền cũng như dưới biển ñã trở thành một trong những hướng nghiên cứu quan trọng của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như các quốc gia Các thành phần hóa học của chúng, thể hiện hoạt tính sinh học lên các tế bào của ñộng vật và con người ñược chia làm 2 nhóm phụ thuộc vào nồng ñộ cũng như chức năng

cơ bản của nó: các chất trao ñổi sơ cấp (ñược tích tụ ñể ñảm bảo nhu cầu về dinh dưỡng và cấu trúc) và các chất trao ñổi thứ cấp (hoạt ñộng như các

hoocmôn, dược liệu và ñộc tố) Một số chất trao ñổi thứ cấp ñược xem như sản phẩm thải của quá trình trao ñổi chất, chẳng hạn như, các alcaloit có thể giữ chức năng như là các chất thải chứa nitơ Tuy nhiên, một phần quan trọng của các sản phẩm bắt nguồn từ con ñường trao ñổi thứ cấp có vai trò như là các tác nhân bảo vệ chống lại các con ñường gây bệnh (như côn trùng, nấm hay vi khuẩn) hay các phân tử ñiều tiết sự phát triển (các hợp chất dạng hoocmôn kích thích hay kìm hãm sự phân chia tế bào và sự phát triển hình thái) Từ các chức năng sinh lý này, các sản phẩm trao ñổi thứ cấp là các thuốc ñiều trị ung thư tiềm tàng, bởi vì tính ñộc tế bào của chúng ảnh hưởng ñến các tế bào ung thư hay quá trình phát triển của khối u bị ñiều chỉnh, và thậm trí ức chế sự phát triển của khối u Liệu pháp sử dụng các hợp chất này ở nồng ñộ thấp có thể gây tử vong cho các vi sinh vật và ñộng vật nhỏ bé, nhưng ở các ñộng vật lớn hơn (gồm cả con người) chúng có thể ảnh hưởng ñặc hiệu lên các mô phát triển nhanh nhất như các khối u Việc nghiên cứu sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc ñiều trị các bệnh hiểm nghèo (trong

ñó có bệnh ung thư) ñã ñược con nguời biết ñến và nghiên cứu từ lâu Quá trình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật nhằm tạo

ra các chế phẩm thuốc ñiều trị ung thư ñã trải qua lịch sử hàng ngàn năm và

ñã ñạt ñược nhiều thành tựu quan trọng ðến những năm cuối của thập kỷ 60, các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên biển theo hướng chống ung thư mới thự sự diễn ra mạnh mẽ

2.1.8 Tình hình gây u thực nghiệm trên chuột phục vụ cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc phòng chữa ung thư

Aristotle từng làm thí nghiệm trên ñộng vật ñể tìm hiểu cơ chế bệnh tật Nhưng thí nghiệm y khoa trên ñộng vật chỉ ñược hợp thức hoá vào thập niên 1960s Sau thảm nạn thalidomide vào 1956 ñến ñầu thập niên 1960s, mà theo ñó hàng vạn trẻ em ở Châu Âu sinh ra với dị tật nghiêm trọng do các bà

mẹ sử dụng thuốc chống thai thalidomide trong khi có thai, việc thí nghiệm y

khoa trên chuột ñược hợp pháp hoá ở Anh Năm 1961, chính phủ Anh ban hành ñạo luật cho phép các nhà nghiên cứu thử nghiệm các thuốc trên chuột

và ñộng vật trước khi sử dụng cho con người Ở Châu Âu, Robert Hook ñược coi là người ñầu tiên sử dụng chuột ñể nghiên cứu thực nghiệm về oxy trong

cơ thể vào năm 1614 Năm 1902, các dòng chuột nuôi trở thành những con vật ñầu tiên ñược giáo sư Ernest Castle ñưa vào phòng thí nghiệm của ðại học Harvard và sau ñó là ðại học Pennsylvania, khi chúng ñược phát hiện thấy có mọc các khối u Theo tính toán cho tới nay trên thế giới ñã sử dụng tới

25 triệu con chuột cho hoạt ñộng nghiên cứu khoa học (http://vietnamnet.com)

Với sự tương ñồng hệ gen giữa người và chuột lên ñến 99% mà hầu như bất cứ kiên thức nào về bệnh tật và thuốc ñặc trị cũng ñều ñược tiếp cận hay thu nhập qua nghiên cứu trên chuột

Ung thư là căn bệnh nan y và gây ra tỉ lệ tử vong cao cho người bệnh Việc chữa trị ung thư thực sự gặp rất nhiều khó khăn mặc dù hiện nay ñã sử dụng nhiều liệu pháp chữa trị như liệu pháp gen, liệu pháp miễn dịch, xạ trị, phẫu thuật hoặc kết hợp các liệu pháp này Các nhà khoa học cũng ñã ñưa ra liệu pháp phòng chống ung thư (cancer chemoprevention) sử dụng các hoạt chất có tác dụng ngăn chặn bệnh hình thành (initiation), tiến triển (promotion), phát bệnh (progression) và di căn (metastasis) (Boone và cs, 1990) Tuy nhiên,

dù là liệu pháp nào thì khả năng phòng chữa bệnh của chúng sau khi ñược

chứng minh ở mức ñộ invitro cũng phải tiếp tục ñược chứng minh ở mức ñộ

các thí nghiệm invivo, việc gây ung thư thành công trên chuột là một trong

những bước quan trọng ñể tạo cơ sở cho việc thực hiện các bước thử nghiệm trong quy trình phát triển biệt dược dùng cho người Hiện nay trên thế giới có khá nhiều các công trình các công trình nghiên cứu ñể tìm ra ñược phương pháp gây ung thư thực nghiệm cho chuột một cách hiệu quả nhât Tại Việt Nam

việc gây ung thư thực nghiệm trên chuột cũng ựã ựược thực hiện trong thời gian qua như gây u thực nghiệm tại Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam (đỗ Thị Thảo và cs, 2008), công trình gây ung thư bằng dưa khú và mắm tôm của GS.TSKH đái Duy Ban Ngoài ra một số nơi cũng ựã thành công trong việc gây ung thư, gây u báng trên chuột với những mục ựắch khác nhau như Viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương, đại học Quốc gia Hà Nội v.vẦMặc dù việc gây ung thư thực nghiệm trên chuột tại Việt Nam ựã ựược biết ựến và có một số kết quả nhất ựịnh nhưng vẫn chưa có nhiều những công trình nghiên cứu về vấn ựề này

2.2 Cây Xắch thược và dược tắnh chống ung thư

Cây Xắch thược (Paeonia veitchii Lynch var beresowskii Shiff.) thuộc

họ Mẫu ựơn (Paeoniaceae) đây là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao từ 50-80 cm, rễ củ mập, vỏ ngoài màu nâu ựỏ Thân hình trụ nhẵn, lá mọc so le,

có cuống dài, chia nhiều thuỳ rất hẹp, mép nguyên, hai mặt nhẵn Hoa to mọc riêng ở kẽ lá và ngọn thân, màu ựỏ, nhị vàng Cũng như một số loài khác thuộc cùng chi với Xắch thược có nguồn gốc ở vùng đông á như Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên Xắch thược là một cây thuốc quắ ựược trồng lâu ựời ở Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Triều tiên, sau ựược di thực sang châu Âu làm cảnh Tại các nước này hoa nở vào tháng 5 Ờ 7, kết quả vào tháng 7 Ờ 8 Vào ựầu những năm 1970, cây ựã ựược di thực trồng ở Việt Nam, nhiều nhất là ở tỉnh Lào Cai (SaPa) Cây trồng sinh trưởng phát triển khá tốt và ra hoa quả Trước ựây vào gần ngày tết, nước ta có nhập từ Trung Quốc cả cây về ựể làm cảnh, nhưng giá thành rất ựắt Gần ựây ắt nhập cây mà chỉ nhập vỏ cây dùng làm thuốc (Lã đình Mỡi, 2005 và đỗ Tất Lợi, 1999) Những nghiên cứu về thành phần hoá học cho thấy rễ cây chủ yếu là paeoniflorin với hàm lượng khoảng 2% rễ khô, ngoài ra còn có paeonol và một monotecpen glycosid thu ựược bằng cách xử lý paeoniflorin với kali cacbonat trong metanol

Hình 2.1 Ảnh cây Xích thược (Paeonia veitchii Lynch.)

Hoạt chất paeonol (2-hydroxy-4-methoxyacetophenone), một hợp chất ñược coi là thành phần chính trong các loài thực vật thuộc chi Paeonia (tài

liệu y học trung quốc còn gọi là Botan-pi (Nagai N và cs, 1887) Vào ñầu

những năm 1981 các nghiên cứu cho thấy hoạt chất paeonol có khả năng hạ sốt (antipyretic), có tác dụng giảm ñau và an thần, có khả năng kháng viêm

(Harada M and Yamashita A và cs, 1972) và kháng khuẩn (T Ohta và cs,

1969) Kunio Mimura và cộng sự ñã sử dụng phương pháp ñồng vị bền ñể tiến hành nghiên cứu sự chuyển hóa của hoạt chất paeonol trong cơ thể bệnh nhân tự nguyện Kết quả nghiên cứu vào thời ñiểm này cho thấy trong cơ thể bệnh nhân tự nguyện hoạt chất paeonol không bị biến ñổi (Kunio Mimura and

Shigeo Baba, 1981) Nghiên cứu tác dụng lợi tiểu của hoạt chất paeonol ñược

sử dụng với các mức liều 62,5-250 mg/kg thể trọng, ñối tượng ñược sử dụng

là chuột nhắt với trọng lượng cơ thể là 196 g Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol có tác dụng lợi tiểu với cơ chế khác rất nhiều so với lợi tiểu thiazide

(Koichiro Kawashima và cs, 1985) Nghiên cứu những biến ñổi của hoạt chất dưới các tác ñộng của các yếu tố nội tại ñúng vai trò rất quan trọng trong ñịnh hướng nghiên cứu hoạt chất này Nhằm thực hiện ý tưởng trên, Tung Hu Tsai

và cộng sự ñã thực hiện các nghiên cứu về ñộng dược học của hoạt chất paeonol trên chuột sau khi cho chuột uống paeonol Trong nghiên cứu này các tác giả ñã sử dụng hệ thiết bị HPLC với ñầu dò Photodio array ñể nghiên cứu nồng ñộ của hoạt chất paeonol trong huyết tương chuột Huyết tương ñược lấy

ở các thời ñiểm khác nhau sau khi cho chuột uống paoenol ở các mức liều 2,5;

5 và 10 mg/kg thể trọng Kết quả nghiên cứu trên có thể xác ñịnh khả năng hấp thụ và bài tiết hoạt chất paeonol trong cơ thể chuột ở mức liều 2,5-

10mg/kg thể trọng (Tung Hu Tsai và cs, 1994) Trong lâm sàng, các kết quả

nghiên cứu ñộng dược học ñược áp dụng cho các loại dược phẩm nhưng nguyên lý của nó có thể ñược áp dụng cho bất cứ một chất nào ñược ñưa từ bên ngoài vào như các chất dinh dưỡng, các hormone, ñộc tố Tuy nhiên, các nghiên cứu về ñộng dược học của paeonol nêu trên chưa ñưa ra ñược một bức tranh trọn vẹn về cơ chế ñộng dược học của hoạt chất này Thêm vào ñó các kết quả nghiên cứu trên chưa nêu ñược sự tương tác giữa hoạt chất này và hoạt chất khác trong khi sử dụng hoạt chất này với sự có mặt của một vài hợp chất khác Kết quả nghiên cứu chính xác quá trình kết hợp hoặc không kết hợp của hoạt chất trong quá trình nghiên cứu ñộng dược học của hoạt chất paeonol ñã ñược Takaaki Yasuda và cộng sự thực hiện trên thiết bị HPCL kết hợp với ñầu dò Photodio array Trong nghiên cứu này các tác giả ñã ñề xuất con ñường chuyển hóa của hoạt chất paeonol trong cơ thể chuột sau khi cho uống paeonol (hình 2.2) (Takaaki Yasuda và cs, 1999)

Hình 2.2 ðề xuất cơ chế chuyển hóa của paeonol trong cơ thể chuột

Theo các tác giả ñề xuất, hoạt chất paeonol sau khi ñi vào cơ thể ñã chuyển hóa thành 2,4-dihydroxyacetophenone-5-O-sulfate (P1), resacetophenone-2-O-sulfate (P2), 2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O-sulfate(P3) và paeonol-2-O-sulfate(P4), resacetophenone (P5) và một lượng rất nhỏ paeonol Kết quả này ñược khẳng ñịnh thông qua các bước phân tích mẫu nước tiểu, mẫu huyết tương và mật của chuột ñược uống paeonol Như vậy có thể nhận thấy hoạt chât paeonol khi ñi vào cơ thể chuột ñã bị hydroxy hóa và sau ñó bị sulfate hóa ở vị trí C-5 ñể có thể bài tiết ra theo nước tiểu (Takaaki Yasuda và cs, 1999)

Năm 2005, Mukesh Doble và cộng sự ñã tổng hợp một vài dẫn xuất ñi

từ chất ñầu là paeonol, các dẫn xuất tổng hợp ñều dựa trên cơ sở quá trình chuyển hóa của paeonol khi vào cơ thể chuột Các dẫn xuất này ñã ñược ñánh giá hoạt tính ức chế quá trình chống ñông máu ðiều ñặc biệt là các tác giả trên ñã sử dụng mô hình cấu trúc và hoạt tính ñể nghiên cứu tác ñộng của các thông số vật lý như ñiện tích, liên kết hydro, HOMO và ñộ phân cực v.v lên hoạt tính chống ñông của các dẫn xuất Kết quả nghiên cứu ñã chi ra ñược 5 yếu tố vật lý có ảnh hưởng nhiều ñến hoạt tính của các dẫn xuất Kết quả

nghiên cứu mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính giúp cho việc hiểu ñược

sự ảnh hưởng của các thông số trên cấu trúc ñến hoạt tính, từ ñó giúp cho việc ñịnh hướng lựa chọn hoạt chất có hoạt tính cao (Mukesh Doble và cs, 2005) Nghiên cứu của Yu Ling Ma và cộng sự còn cho thấy paeonol có tác dụng lên lực co bóp cơ tim và trợ tim (Yu-ling Ma và cs, 2006) Các nghiên cứu nêu trên có ñề cập ñến khả năng kháng viêm của hoạt chất paeonol Tuy nhiên, khả năng ñiều trị chứng viêm ruột kết và cơ chế kháng viêm theo cơ chế ức chế sự hoạt hóa của yếu tố nhân NF-κB của hoạt chất paeonol hiện mới ñược

thông báo (Kazuhiro Ishiguro và cs, 2006)

Năm 2007, Inrina Tsoy Nizamutdinova và cộng sự ñã nghiên cứu ảnh hưởng của paeonol ñến quá trình phát triển khối u theo cơ chế ức chế sự hoạt hóa của các yếu tố nhân Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol có khả năng ức chế sự hoạt hóa của NF-kB (Inrina Tsoy Nizamutdinova và cs, 2007) Nhóm nghiên cứu Shu Ping Xu và cộng sự ñã tiến hành nghiên cứu tác dụng ngăn chặn sự xuất hiện của một vài loại ung thư của paeonol trên một số dòng tế bào ung thư như: dòng tế bào ung thư bạch cầu (K562), dòng ung thư vú (T6-17), dòng ung thư gan (Bel-7404), dòng ung thư cổ tử cung (Hela) [32] Bình thường, tế bào ung thư bị ức chế bởi 2 chức năng ngừa ung thư chính của tế bào là: tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và tế bào già cỗi (senescence) Hai chức năng này ngăn ngừa sự tăng trưởng của tế bào ung thư Dựa trên nguyên lý trên, Shu Ping Xu và cộng sự ñã thiết kế mô hình nghiên cứu tác dụng của paeonol ñối với khả năng chống sự tăng sinh, gây chết theo chương trình và chu kỳ sống của tế bào ung thư gan người Trong

mô hình này, các tác giả ñã sử dụng paeonol tinh khiết và paeonol có kết hợp với các tác nhân chống ung thư ñang ñược dùng ñể ñiều trị bệnh ung thư như Cisplatin (CDDP), doxorubicin (DOX) và 5-fluorouracil (5-FU) ñể so sánh Trong mô hình nghiên cứu này, paeonol thể khả năng ức chế sự tăng sinh của

sử dụng paeonol với các tác nhân chống ung thư thì sự có mặt của paeonol làm tăng khả năng của các tác nhân này Các nghiên cứu này còn chỉ ra rằng

sự kết hợp của paeonol với tác nhân Cisplatin với liều lượng phù hợp sẽ góp phần làm giảm buồn nôn, bị mửa và một số triệu trứng gây ñộc thận khi dùng người bệnh dùng Cisplatin (Shu Ping Xu và cs, 2007) Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào ung thư thực quản của paeonol với hai dòng tế bào ung thư thực quản ñược sử dụng là: dòng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần dưới của thực quản (Human oesphageal adenocarcinoma cell line SEG-1) và dòng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần phía trên của thực quản (Human squamous cell carcinoma cell line Eca-109) (X.A Wan và cs, 2008) Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol có tác dụng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương trình ñối với hai dòng tế bào ung thư thực quản (hình 2.3a, b)

Hình 2.3a Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương

trình của paeonol ñối với dòng tế bào ung thư thực quản

Hình 2.3b Khả năng gây chết tế bào theo chương trình của paeonol ñối

với dòng tế bào ung thư thực quản SEG-1, Eca-109

Trong hóa trị liệu ñiều trị bệnh ung thư việc dùng riêng biệt một biệt dược có thể gây ra các hiệu ứng phụ, cisplatin là một ví dụ Khi sử dụng riêng cisplatin trong ñiều trị bệnh ung thư thực quản thường gây ra các hiệu ứng gây ñộc thận cho người bệnh Những hạn chế khi sử dụng biệt dược riêng biệt

ñã ñược các nhà khoa học khắc phục bằng cách sử dụng biệt dược với một số chất phụ thêm Sự cộng hợp của các chất sẽ làm giảm các hiệu ứng phụ không mong muốn ñối với người bệnh Hoạt chất paeonol cũng ñã ñược nghiên cứu

và sử dụng cùng với cisplatin trong hóa trị liệu ñiều trị bệnh ung thư thực quản (X.A Wan và cs, 2008) Trong mô hình nghiên cứu này các tác giả ñã

sử dụng paeonol riêng, cisplatin riêng và kết hợp giữa cisplatin và peonol với nồng ñộ phù hợp ñể nghiên cứu tác dụng ñiều trị bệnh ung thư thực quản Hai dòng tế bào ung thư thực quản ñược sử dụng ñó là : dòng ung thư thực quản

người với biểu hiện xuất hiện tại phần dưới của thực quản (Human

người với biểu hiện xuất hiện tại phần phía trên của thực quản (Human

sử dung chỉ riêng paeonol tác dụng của paeonol lên hai dòng tế bào ung thư

có sự khác biệt ñáng kể, dòng SEG-1 khá nhạy ñối với tác dụng của paeonol

Eca-109 có giá trị IC50 = 124,77 mg/L Khi sử dụng kết hợp paeonol (7,81; 15,63 và 31,25 mg/L) với cisplatin ở tỉ lệ 1/1, kết quả cho thấy sự kết hợp của paeonol với cisplatin làm tăng khả năng gây ñộc dòng tế bào SEG-1 (hình 2.4a) và Eca-109 (hình 2.4b)

Hình 2.4a Tác dụng của cisplatin

và tác dụng của cisplatin và

paeonol ñến dòng SEG-1

Hình 2.4b Tác dụng của cisplatin

và tác dụng của cisplatin và paeonol ñến dòng Eca-109

Kết quả tính toán hệ số tương tác giữa các thuốc cho thấy paeonol và ciplastin cùng cộng hợp tác dụng ñến dòng SEG-1 (hình 2.5a), tác dụng mạnh khi nồng

ñộ ciplastin thấp (khoảng 0,0078 mg/L) Tương tự ñối với dòng Eca-109 (hình 2.5b) hệ số tương tác giữa hai thuốc bằng 1 cho thấy cả paeonol và cisplatin cùng có tác dụng ñến dòng Eca-109

Hình 2.5a hệ số tương tác của

cisplatin và paeonol ñến dòng

SEG-1

Hình 2.5b hệ số tương tác của cisplatin và paeonol ñến dòng Eca-

109

Kết quả nghiên cứu khả năng gây chết tế bào theo chương trình cũng cho thấy sự kết hợp của paeonol và cisplantin làm gia tăng khả năng gây chết hai dòng SEG-1 và Eca-109 theo chương trình (hình 2.6)

Hình 2.6 Sự kết hợp của paeonol và cisplantin gia tăng khả năng gây

chết dòng SEG-1 và Eca-109 theo chương trình

Như vậy, kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả (X.A Wan và cs, 2008) cho thấy sự kết hợp của paoenol và cisplatin làm tăng khả năng ức chế và gây chết tế bào ung thư thực quản so với khi sử dụng ñơn paeonol và cisplatin Hiệu quả của sự kết hợp giữa các hoạt chất không chỉ dừng lại trong việc ñiều trị các bệnh ung thư thực quản, trong nghiên cứu ñiều trị ung thư gan các nhà khoa học cũng chứng minh ñược rằng sự kết hợp giữa các hoạt chất với liều lượng phù hợp sẽ góp phần gia tăng liệu pháp ñiều trị Với các nghiên cứu nêu trên, hoạt chất paeonol ñã ñược sự quan tâm ñặc biệt của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực ñiều trị ung thư gan Qua phân tích các tác dụng của paeonol như tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư, tác dụng giảm ñau, tác dụng an thần, kháng sinh, chống ô xy hóa, kháng viêm, ñiều hòa miễn dịch và chống khôi u (G.P Sun và cs, 2008) nhận thấy nghiên cứu làm rõ cơ chế chống khối u của paeonol sẽ góp phần ứng dụng thực tiễn hoạt chất này trong ñiều trị ung thư Các tác giả ñã xây dựng mô hình nghiên cứu chống khối u của paeonol trên mô hình gây u chuột mang tế bào ung thư gan HepA Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HepA trên chuột mang u gây ra bởi tế bào ung thư HepA Trên

mô hình nghiên cứu in vivo cũng cho thấy paeonol có tác dụng gây chết tế bào

ung thư theo chương trình Như vậy, thông qua mô hình nghiên cứu các tác

trình ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào HepA trên chuột, sự ức chế này thông qua quá trình gây chết tế bào HepA theo chương trình và ñiều biển sự sản sinh IL-2 và TNF-α Kết quả nghiên cứu này ñã cung cấp cho các nhà khoa học một bằng chứng khoa học trong việc ứng dụng hoạt chất có nguồn gốc từ thảo dược trong các liệu pháp ñiều trị bệnh ung thư gan Bên cạnh lĩnh vực nghiên cứu chống ung thư, hiện nay loãng xương cũng là một vấn ñề hiện ñang ñược các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm, vì quy mô lớn và hệ quả nghiêm trọng của căn bệnh này trong cộng ñồng Loãng xương ñược biết ñến như là một bệnh nội tiết với hai ñặc ñiểm chính: lực của xương

bi suy yếu và cấu trúc của xương bị thay ñổi (Anonymous, 1993) Các nhà khoa học ñã tìm kiếm ñược rất nhiều hoạt chất chống loãng xương từ tự nhiên, trong xu hướng tìm kiếm các hoạt chất chống loãng xương có nguồn gốc từ thiên nhiên, hoạt chất paeonol cũng ñã ñược các nhà khoa học nghiên cứu hoạt lực của hoạt chất ñối với tác dụng chống loãng xương Dựa trên các nghiên cứu về vai trò của những sinh hóa tố liên quan ñến quá trình loãng xương, các tác giả này ñã thử nghiệm ảnh hưởng của paeonol ñến quá trình hình thành tế bào tủy xương Kết quả thử nghiệm cho thấy paeonol ức chế sự phát triển của tế bào tủy xương và có khả năng kéo dài sự bền vững của xương trong quá trình ñiều trị chứng loãng xương (Huei-Yann Tsai và cs,

2008)

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

• Dòng tế bào ung thư LLC (Lewis lung carcinoma) do trường ðại học Universit degli Studi di Milano (Italia) cung cấp

• Chuột nhắt trắng dòng BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh ñược nuôi với mật ñộ 5 con/lồng tại chuồng nuôi ñộng vật của Viện Công nghệ sinh học Chuột ñược cung cấp thức ăn tiêu chuẩn, nước uống tự do

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm và thiết bị thí nghiệm

 Vật liệu thí nghiệm

Hoạt chất paeonol (Tên khoa học: 2'-Hydroxy-4'-methoxyacetophenone với công thức phân tử: C9H10O3, Khối lượng phân tử: 166 và chế phẩm PAN từ hợp chất này với hàm lượng paenol ñạt 95%

 Hoá chất và thiết bị thí nghiệm

- Dung môi PBS pha PAN

- Thiết bị làm sinh hoá máu

- Xi lanh, kim tiêm, dao mổ, kéo

- Tủ nuôi tế bào (Sanyo, Nhật) có ñiều hoà nhiệt ñộ và CO2 tự ñộng

- Tủ cấy vô trùng sử dụng ñèn cực tím và màng lọc 0,25µm

- Chai lọ nuôi cấy, pipet các loại của Costar và Corning Incorparated

- Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật) với ñộ phóng ñại 5-20×20

- Buồng ñếm tế bào (Newbauer, ðức)

- Môi trường nuôi cấy

- Trypsin EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid)

- Huyết thanh

- Kháng sinh

- Nước cất

3.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ 01/10/2009 – 30/06/2010

3.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu

Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Gây u thực nghiệm trên chuột nhắt trắng dòng BALB/c bằng tế bào ung thư có khả năng di căn mạnh Lewis Lung Carcinoma (LLC)

- Xác ñịnh liều ñộc cấp tính LD50 gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm của paenol

- Nghiên cứu tìm hiểu hoạt tính của Paenol khi sử dụng làm chất bảo vệ

ñể phòng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột ñã ñược gây u thực nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

• Lô 4: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng

• Lô 5: Lô ñối chứng, chuột ñược tiêm 0,1ml dung dịch sinh lý/con

3.3.1.2 Xác ñịnh liều ñộc cấp tính LD 50 gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm của hoạt chất Paeonol bằng ñường uống

50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi ñộng vật của Viện Công nghệ sinh học, ñược chia làm 5 lô (10 chuột/lô), chuột bị bỏ ñói hoàn toàn 16 giờ trước khi cho uống chế phẩm PAN

• Lô 6: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ

3.3.1.3 Nghiên cứu ñộc bán trường diễn của hoạt chất paeonol khi cho chuột thí nghiệm uống liều thấp trong thời gian dài

Nghiên cứu ñộc tính bán trường diễn ñược tiến hành theo phương pháp của Abraham (1978): 50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi ñộng vật của Viện Công nghệ sinh học, ñược chia làm 3 lô (10 chuột/lô), hàng ngày cho uống chế phẩm PAN liều thấp và theo dõi trong 4 tuần

• Lô 11: Chuột thí nghiệm ñược cho uống PAN với liều 1000 mg/kgP/ngày

• Lô 12: Chuột thí nghiệm ñược cho uống PAN với liều 500 mg/kgP/ngày

• Lô 13: Chuột thí nghiệm chỉ cho uống nước sinh lý

3.3.1.4 Nghiên cứu tìm hiểu hoạt tính của Paeonol khi sử dụng làm chất bảo

vệ ñể phòng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột ñã ñược gây u thực nghiệm

• Lô 14: uống PAN liều 100mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau ñó tiêm tế bào LLC ñể gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa

• Lô 15: uống PAN liều 200mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau ñó tiêm tế bào LLC ñể gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa

• Lô 16: tiêm tế bào LLC ñể gây u, ñồng thời uống chế phẩm PAN liều 100 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 17: tiêm tế bào LLC ñể gây u, ñồng thời uống chế phẩm PAN

200 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 18: tiêm tế bào LLC ñể gây u, sau khi có u sơ cấp thì cho uống PAN liều 250 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 19: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 20: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 1000 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 21: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 1500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa

• Lô 22 (ñối chứng): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống PBS là dung môi ñược sử dụng ñể pha PAN trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm

• Lô 23 (ñối chứng âm): không tiêm tế bào LLC và chỉ cho uống nước

muối sinh lý trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm

Với bố trí thí nghiệm như trên, chúng tôi sẽ kiểm tra ñược khả năng bảo

vệ cơ thể của PAN trước khi gây u bằng tế bào ung thư LLC ở các liều lượng khác nhau (lô 14, 15, 16, 17) ðồng thời, sau khi chuột ñã xuất hiện u do bị tiêm tế bào ung thư LLC, chuột ñược sử dụng PAN như chất chữa trị ở các liều lượng khác nhau (lô 18, 19, 20, 21) Lô số 22 ñược sử dụng như là ñối chứng của thí nghiệm

Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và ño kích thước khối u sơ cấp hàng tuần trên chuột thí nghiệm theo phương pháp của Abrham (1978)

và của Iigo et al (1991) ñể xác ñịnh khả năng ức chế khối u của PAN Thể

tích khối u ñược tính theo công thức của Iigo (1991)

V = chiều dài (khối u) × chiều rộng2(khối u)/2 Trong ñó: V: thể tích khối u

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư invitro

Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư ñược tiến hành theo phương pháp ñang lưu hành tại Viện ung thư Quốc Gia Mỹ NCI (National Cancer Institute)

và ñược WHO công nhận

Dòng tế bào ung thư LLC (Lewis lung carcinoma) do trường ðại học Universit degli Studi di Milano Italia cung cấp ở dạng ñược bảo quản trong Nitơ lỏng (-196oC) vì vậy tế bào này sẽ phải ñánh thức trước khi nhân nuôi ở các môi trường khác nhau

* Phương pháp ñánh thức tế bào (Thawing)

Lấy tế bào ra khỏi Nitơ lỏng, ñưa vào cốc nước 37oC cho ñến khi dung dịch trong ống tan ñá hoàn toàn, lau phía ngoài ống cất bằng cồn 70o ñể khử trùng Chuyển tế bào sang một ống li tâm quay với tốc ñộ 300 vòng/phút trong 5 phút Sau ñó hút bỏ dịch nổi ñể loại DMSO (Dimethyl Sulphoixide)

Chuyển tế bào sang chai nuôi, nhỏ từ từ từng giọt môi trường nuôi cấy

nếu ñưa môi trường mới vào quá nhanh

Tiếp theo, ñể chai nuôi vào tủ ấm 37oC, 5%CO2

* Phương pháp nhân nuôi tế bào ung thư

Tế bào sau khi ñược ñánh thức từ N2 lỏng sẽ ñược nuôi cấy trong môi trường ñủ phù hợp trong 3-5 ngày

Khi tế bào ñã mọc dàn ñều thành ñơn lớp ở ñáy chai nuôi cấy thì cần chuyển sang chai nuôi cấy mới Tỉ lệ cấy chuyển là 1: 3 hoặc 1: 5 (tuỳ theo loại tế bào và tuỳ vào mục ñích sử dụng) Trung bình sau 2- 3 ngày, môi trường nuôi phải ñược thay mới Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển của tế bào ñã thay ñổi Nếu môi trường không ñược thay mới ñúng lúc, tế bào sẽ chết

Quy trình cấy chuyển:

- Loại môi trường cũ: dùng pipetman hút môi trường cũ ra khỏi chai nuôi

- Rửa tế bào bằng PBS vô trùng

- Làm rời tế bào bằng Trypsin- EDTA: cho vào khoảng 0,5 - 0,6ml trypsin/1chai nuôi diện tích bệ mặt nuôi 25 cm2, ủ ở 37oC từ 3 – 5 phút ñể tế bào tách khỏi bề mặt chai nuôi, khi tế bào ñã tách khỏi bề mặt chai nuôi sẽ ñược làm rời nhờ bơm hút ñẩy hay vỗ nhẹ

- Li tâm loại bỏ Trypsin- EDTA ở tốc ñộ 1000vòng/phút trong 5 phút

- Pha loãng tế bào với tỉ lệ 1: 3

- ðưa vào chai nuôi cấy mới với 5 – 7 ml môi trường nuôi cấy mới phù hợp

- ðể vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi

3.3.3 Phương pháp ñếm tế bào

Tế bào trước khi ñược tiêm cho chuột ñể gây u sẽ ñược ñếm và ñiều chỉnh tới nồng ñộ tế bào thích hợp Tế bào ñược ñếm theo phương pháp của Neubauer

Trước khi ñếm, tế bào phải ñược xử lý bằng Trypsin (ñối với các dòng