Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi loài đậu gà (cicer arietinum)

LỜI C M ĐO N Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong đề tài “Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến tính chống chịu điều

LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2019

LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn:

TS Chu Đức Hà ThS Phạm Phương Thu

ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH BẤT LỢI

LOÀI ĐẬU GÀ (CICER ARIETINUM)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học

TS Chu Đức Hà ThS Phạm Phương Thu

HÀ NỘI - 2019

LỜI C M ĐO N

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong đề tài “Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến

tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi loài đậu gà (Cicer arietinum)” Mọi kết

quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hà My

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em xin bày tỏ sự biết n vô c ng s u sắc tới thầy TS Chu Đức Hà - Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông Nghiệp và cô ThS Phạm Phư ng Thu - Bộ môn Sinh học phân tử - Khoa sinh - Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 về những hướng dẫn tận tình chu đ o ên cạnh những kiến thức xã hội ch kh c

Bên cạnh đ em c ng xin ch n thành c m n sự giúp đỡ quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp là

n i em đã tiến hành kh a luận tốt nghiệp của mình

Cuối c ng em xin c m n sự giúp đỡ của c c thầy cô trong Bộ môn Sinh học phân tử, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2

Hà Nội, ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hà My

D NH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ Tiếng Anh Thuật ngữ Tiếng Việt

ANF Anti-nutritional factor Yếu tố kh ng dinh dưỡng ASWF Available soil water fraction Phần nước có sẵn trong đất

ER Early reproductive stage Giai đoạn sinh sản sớm GEO Gene Expression Omnibus Omnibus biểu hiện gen GRAVY Grand average of hydropathicity Độ ưa nước

LIS Legume information system Hệ thống thông tin họ Đậu

LR Late reproductive stage Giai đoạn sinh sản muộn

SWEET Sugars will eventually be exported

transporter

Chất vận chuyển đường sau cùng

WGS Whole genome shotgun Kỹ thuật x c định trình tự

toàn hệ gen

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đ ch nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 C chế đ p ứng môi trường ở c y tr ng 3

1.2 T ng quan về họ protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực vật 4

1.2.1 Cấu trúc và vai trò của protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực vật 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu protein vận chuyển đường sucrose SWEET ở thực vật 5

1.3 T ng quan về c y đậu gà 6

1.3.1 Ngu n gốc và phân loại của c y đậu gà 6

1.3.2 Đặc điểm của c y đậu gà 7

1.3.2.1 Đặc điểm hình thái của c y đậu gà 7

1.3.2.2 Đặc điểm di truyền của c y đậu gà 8

1.3.3 Vai trò của c y đậu gà 9

1.3.3.1 Vai trò của c y đậu gà làm thực phẩm 9

1.3.3.2 Vai trò của cây đậu gà trong chăn nuôi 10

1.3.3.3 Vai trò của c y đậu gà trong cải tạo đất 11

1.3.3.4 Vai trò của c y đậu gà trong sản xuất nhiên liệu 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Phạm vị nghiên cứu địa điểm và thời gian 14

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 14

2.3 Phư ng ph p nghiên cứu 14

2.3.1 Phư ng ph p ph n t ch đặc t nh protein SWEET trên c y đậu gà 14

2.3.2 Phư ng ph p x y dựng c y ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà 15

2.3.3 Phư ng ph p x c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở đậu gà 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả ph n t ch đặc tính protein SWEET ở đậu gà 20

3.2 Kết quả x y dựng c y ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà 28

3.3 Kết quả x c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở đậu gà 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

1 Kết luận 37

2 Đề nghị 37

DANH MỤC C NG TR NH Đ C NG Ố LIÊN QU N ĐẾN LUẬN V N 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Họ SWEET của một số loài 5

Bảng 1.2 Đặc tính lý hóa của dầu hạt desi 11

Bảng 2.1 Thông tin chú giải về họ SWEET ở đậu gà 13

Bảng 2.2 Những tham số để căn trình tự tư ng đ ng ng MEGA 16

Bảng 2.3 Những ph n t ch ưu tiên 17

Bảng 3.1 K ch thước và trọng lượng protein SWEET ở đậu gà 21

Bảng 3.2 Điểm đẳng điện và vị tr cư trú dưới tế ào được dự đo n của protein SWEET ở đậu gà 24

Bảng 3.3 Chỉ số bất n định của họ protein SWEET ở đậu gà 26

Bảng 3.3 Độ ưa nước của họ protein SWEET ở đậu gà 27

Bảng 3.4 Mức độ đ p ứng của c c gene CaSWEET ở rễ đậu gà trong điều kiện xử l hạn và mặn 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm hình th i loài đậu gà 7

Hình 1.2 Genome của đậu gà 9

Hình 2.1 C sở dữ liệu Expasy - Protparam 15

Hình 2.2 C sở dữ liệu TargetP 15

Hình 2.3 C sở dữ liệu MEGA 16

Hình 2.4 C sở dữ liệu LIS 18

Hình 2.5 C sở dữ liệu GEO 19

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại protein SWEET ở đậu gà 28

Hình 3.2 Biểu hiện các gene CaSWEET trong ba mẫu mô của c y đậu gà trong điều kiện thường 30

Hình 3.3 Mức độ iểu hiện của họ gene mã h a CaSWEET ở 8 mô hoa trong điều kiện thường 32

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện tượng biến đ i khí hậu và thời tiết cực đoan đã và đang t c động rất lớn đến sản xuất nông nghiệp Những yếu tố bất lợi phi sinh học của môi trường như hạn hán, mặn, nhiệt độ đã ảnh hưởng tới qu trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Thực vật đ p ứng các bất lợi môi trường nhờ một loạt gene thuộc hai nhóm là protein chức năng và protein điều hòa

Trong nh m protein chức năng họ protein vận chuyển đường sucrose là SWEET sugars will eventually e exported transporters) được iết đến với rất nhiều vai tr quan trọng liên quan đến trao đ i chất và đ p ứng ất lợi trong tế ào Loại protein này có chức năng vận chuyển uniporter sucrose qua màng tế bào tập hợp trong tế bào nhu mô phloem và có thể bị tấn công bởi các vi khuẩn gây bệnh để

có thể thu được đường cho sự sinh trưởng của chúng Qu trình này giúp cho sucrose được vận chuyển từ c quan t ng hợp l ) đến c c vị tr cần thiết trong c y phục vụ qu trình sinh t ng hợp và trao đ i chất Vì vậy nghiên cứu về họ protein SWEET luôn thu hút được sự quan t m của c c nhà khoa học

Đậu gà (Cicer arietinum L.) là cây họ Đậu (Fabaceae) phát triển hàng năm

được tr ng ph biến ở nhiều n i Đậu gà là một loại thực phẩm tư ng đối rẻ và giàu dinh dưỡng (protein, vitamin, khoáng chất và chất x ) c lợi cho sức khỏe Bên cạnh đ vỏ hạt, thân và lá của đậu gà c n thường được dùng làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc C ng như những cây họ Đậu kh c đậu gà có khả năng cải tạo đất

vì vậy luôn được khuyến kh ch tr ng lu n canh với c c c y tr ng ch nh nh m tăng

năng suất nông sản c ng như trả lại độ phì nhiêu cho đất T m lại C arietinum n i

riêng và c y họ Đậu n i chung là một trong những đối tượng thu hút được rất nhiều

sự quan t m trên thế giới và trong nước

Trên đậu gà người ta đã iết đến các họ gene g m CaNAC, CaTCP và

CaNF-Y thuộc nh m protein điều hòa Sự biểu hiện của những gene thuộc ba họ

gene này là khác nhau trong các mô khác nhau Ba họ gene này đều được phát hiện

là chứa những gene đ p ứng với hạn h n theo con đường phụ thuộc hoặc không phụ thuộc scisic acid) Tuy nhiên chưa c nghiên cứu nào về nh m gene vận chuyển sucrose liên quan đến tính chống chịu ở c y đậu gà

Một c u hỏi được đặt ra là liệu r ng c c protein vận chuyển đường sucrose SWEET c đ ng vai tr trong đ p ứng với điều kiện ngoại cảnh ở c y đậu gà hay

không Để giải quyết vấn đề này đề tài “Tìm hiểu vai trò của họ gene mã hóa

protein vận chuyển đường sucrose liên quan đến tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi loài đậu gà (Cicer arietinum)” đã được thực hiện

2 Mục đích nghiên cứu

Sử dụng phư ng ph p tin sinh học, nh m tìm hiểu về cấu trúc của họ protein

SWEET trên c y đậu gà Đ ng thời nghiên cứu vai trò của họ gene SWEET đối với

tính chống chịu của đậu gà trước điều kiện bất lợi Từ đ đưa ra c sở cho phát

triển nghiên cứu giống cây tr ng chống chịu điều kiện bất lợi

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích c c đặc t nh l h a học của protein SWEET trên cây đậu gà

- Xây dựng c y ph n loại của họ protein SWEET ở đậu gà

- X c định mức độ iểu hiện của c c gene mã h a SWEET ở c c ộ phận của

c y đậu gà trong một số điều kiện

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học của đề tài nh m cung cấp những hiểu iết c ản về đặc tính và chức năng của họ protein SWEET ở đậu gà Bên cạnh đ c n cung cấp

những dữ liệu về sự biểu hiện của các gene CaSWEET trong điều kiện thường và

bất lợi Từ đ c những hiểu biết rõ h n về c y đậu gà, đặc biệt có cái nhìn t ng

qu t h n về tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh ất lợi của thực vật

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nh m cung cấp các thành viên họ gene

CaSWEET đ p ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Từ đ c thể mở ra hướng

nghiên cứu ứng dụng nh m phục vụ công t c chọn tạo giống nh m n ng cao t nh chống chịu

CHƯƠNG 1 TỔNG QU N TÀI LIỆU 1.1 Cơ chế đ p ứng môi trường ở c tr ng

Sự sinh trưởng và phát triển của thực vật chịu ảnh hưởng lớn từ các bất lợi liên quan đến độ ẩm, n ng độ muối và nhiệt độ của môi trường [47-tr.44] Theo Agarwal (2010) năng suất tiềm năng của cây tr ng có thể bị giảm tới 70% trong vụ mùa khi chịu t c động từ các bất lợi môi trường [6-tr.39] Tuy nhiên, thực vật có thể

đ p ứng và thích nghi với những bất lợi đ ng một loạt những thay đ i về mặt sinh lý, sinh hóa Một số yếu tố phiên mã (Transcription factor - TF) quy định biểu hiện của một số gene liên quan tới bất lợi môi trường đã được phát hiện Ví dụ như sản phẩm của một số gene đ p ứng hạn ở mức phiên mã được cho r ng có khả năng

đ p ứng với bất lợi về hạn Nhiều gene đ p ứng hạn c ng đ p ứng bất lợi về mặn và nhiệt độ thấp, cho thấy sự t n tại của c chế đ p ứng bất lợi tư ng tự [48-tr.44]

Thực vật đ p ứng các bất lợi của môi trường nhờ một loạt các gene có chức năng kh c nhau [16-tr.40] Sản phẩm của c c gene này được phân chia thành hai nhóm Nhóm một bao g m những protein chức năng như protein màng protein LEA (Late embryogenesis abundant) [27-tr.41] Nhóm này có thể hoạt động bảo vệ thực vật một cách trực tiếp trong chống chịu các yếu tố bất lợi [48-tr.44] Nhóm hai

là nhóm những protein điều h a như protein kinase TF Nhóm protein này liên quan đến điều chỉnh truyền tín hiệu và biểu hiện gene đ p ứng bất lợi [44-tr.43] Chính hai nhóm protein này đã tham gia vào qu trình trả lời k ch th ch và k ch hoạt biểu hiện ph ng thủ ở cây tr ng trong điều kiện bất lợi của ngoại cảnh Phân tích chức năng của c c gene đ p ứng bất lợi giúp chúng ta hiểu thêm về c chế phân tử chống chịu và đáp ứng bất lợi của thực vật

Nh m protein điều h a được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu trên c c đối tượng thực vật Một số gene thuộc nh m protein điều hòa liên quan tới đ p ứng bất

lợi đã được biết tới như NAC [28-tr.42], TCP [45-tr.43] hay NF-Y [15-tr.40] Tư ng

tự, nhóm protein chức năng c ng được chú ý bởi nhiều thành viên có liên quan tới

đ p ứng bất lợi Điển hình trong số đ là SUT - protein vận chuyển sucrose qua màng đã được nghiên cứu trên nhiều loài thực vật khác nhau [31-tr.42] Bên cạnh

đ một thành viên triển vọng mới thuộc nhóm protein chức năng dành được nhiều

sự quan tâm không kém là SWEET (sugars will eventually be exported transporter) [8-tr.39] Đ y là họ protein vận chuyển đường sucrose trong thực vật [14-tr.40] Để hiểu rõ h n về nh m protein vận chuyển này cấu trúc và vai tr của SWEET ở thực vật được tìm hiểu rõ n t h n ở nội dung tiếp theo

1.2 Tổng quan về họ protein vận chu ển đường sucrose SWEET ở thực vật

1.2.1 Cấu trúc và vai trò của protein vận chu ển đường sucrose SWEET ở thực vật

Thực vật là sinh vật có khả năng quang hợp tạo ra các hợp chất hữu c với đường là sản phẩm chủ yếu và có nhiệm vụ cung cấp năng lượng cho tế bào [4-tr.39] Trong đ sucrose là car ohydrate c ản cho phép vận chuyển đường dài, được tải vào phloem từ tế bào ngu n và xuất vào n i chứa [4-tr.39] Để làm được điều này cần có loại protein có khả năng vận chuyển và đưa sucrose đi qua màng SUT (sugar transporter) hay SUC (sugar carrier) là protein vận chuyển cùng chiều

H+/sucrose sử dụng chuyển động proton trên màng plasma của yếu tố rây và tế bào kèm để tải sucrose chống lại gradient n ng độ vào phloem [12, 13]

Bên cạnh đ một họ protein vận chuyển đường mới được x c định là SWEET [14-tr.40] SWEET thuộc họ MtN3/saliva, chúng vận chuyển đường monosaccharides hoặc disaccharides qua màng nội bào hoặc màng plasma, với

MtN3 được x c định là gene đ ng vai tr trong dinh dưỡng cộng sinh Rhizobium

gây nên sự phát triển nốt sần rễ Medicago truncatula [14-tr.40] Các phân tử

SWEET nhỏ h n so với chất vận chuyển đường khác với 7 TM (Transmembrane domain) Chen et al 2010) đã mô tả cấu trúc của phân tử SWEET có dạng 3+1+3 [14-tr.40] Mô hình đã chỉ ra r ng cấu trúc của SWEET là kết quả từ sự sao chép của một polypeptit được hợp nhất bởi 3 xoắn xuyên màng thông qua một xoắn TM trung tâm; N và C-terminal tư ng ứng n m ở ngoại bào và dịch ào tư ng [14-tr.40]

SWEET là protein vận chuyển uniporter sucrose qua màng tế bào tập hợp trong tế bào nhu mô phloem Các protein này có chức năng tải sucrose ra khỏi lá và

có thể bị tấn công bởi các vi khuẩn gây bệnh để có thể thu được đường cho sự sinh trưởng của chúng [8-tr.39] Những vi khuẩn gây bệnh này tấn công trực tiếp vùng promoter SWEET gây ra sự biểu hiện khác nhau của c c gene SWEET Điều này cho thấy chức năng vận chuyển đường của các SWEET là mục tiêu để các mầm bệnh và vi khuẩn cộng sinh giành dinh dưỡng [14-tr.40] Những phân tích về họ SWEET hoàn chỉnh có thể giúp giải quyết một vài bí ẩn về sản xuất mật hoa, phát triển hạt giống và phấn hoa Điều này có thể giúp giải thích về chuyển hóa dinh dưỡng từ thực vật trong t c động qua lại với vi sinh vật [14-tr.40]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu protein vận chu ển đường sucrose SWEET ở thực vật

Họ protein SWEET có sự phân bố rộng trong sinh giới được x c định có ở thực vật con người động vật nguyên sinh động vật đa ào vi khuẩn và vi khuẩn

c [8-tr.39] Những nghiên cứu về họ protein SWEET ở thực vật đã được tiến hành

trên một số đối tượng như Arabidopsis thaliana [14-tr.40], lúa (Oryza sativa) tr.44] đậu tư ng (Glycine max) dưa chuột ( Cucumis sativus) , bông sợi (Gossypium

[49-hirsutum) Cụ thể các nhà nghiên cứu đã x c định có 17 gene SWEET ở A thaliana

[14-tr.40] và 21 OsSWEET ở lúa (O sativa) [49-tr.49] Năm 2015 trên đối tượng đậu tư ng c c nhà khoa học đã x c định được 52 gene GmSWEET [41-tr.43] Tiếp đến, 68 BnSWEET đã được x c định ở cải dầu [31-tr.42] Năm 2018, 28 thành viên

SWEET trên sắn (Manihot esculenta) c ng đã được x c định [1-tr.39] Gần đ y

nhất, nghiên cứu của Chu Đức Hà và cs 2019) đã x c định có 21 gene CaSWEET ở

đậu gà [2-tr.39]

Bảng 1.1 Họ SWEET của một số loài

4 Manihot esculenta Sắn 28

Thành viên đầu tiên của họ SWEET thực vật được x c định là gene

AtSWEET1 ở A thaliana [14-tr.40] Protein do gene này mã h a c liên quan đến

việc cung cấp chất dinh dưỡng cho thể giao tử hoặc tuyến mật hoa [14-tr.40] Hai

thành viên khác là AtSWEET11 và AtSWEET12 hoạt động chiếm ưu thế ở màng

plasma đ ng vai tr như chất điều chỉnh dòng sucrose, glucose, fructose Đ ng

thời, hai SWEET này còn liên quan đến đ p ứng bất lợi về lạnh và điều kiện thiếu nước [14-tr.40] Thêm vào đ AtSWEET15 được kỳ vọng có cảm ứng trong sự già

của lá và những bất lợi thẩm thấu (độ mặn cao, lạnh và hạn) theo con đường phụ thuộc ABA [30-tr.42]

Ở lúa, OsSWEET1a/2a/3a/4/5/16 có biểu hiện cao ở hoa hoặc bông tại các

giai đoạn phát triển khác nhau Theo một nghiên cứu đã chứng minh r ng đột biến

câm OsSWEET14 khiến c y sinh trưởng chậm, tạo ra hạt có k ch thước nhỏ tr.42] Bên cạnh đ OsSWEET11 và OsSWEET14 bị các vi khuẩn gây bệnh tấn

[36-công trực tiếp b ng cách tiết ra một loại protein đặc trưng liên kết với vùng

promoter SWEET và hoạt hóa gene SWEET [8-tr.39] Do đ c thể thấy, khả năng

vận chuyển của SWEET là mục tiêu tấn công của các mầm bệnh và vi khuẩn cộng sinh Nhờ đ nghiên cứu về họ SWEET ở thực vật giúp nâng cao hiểu biết về sự phát sinh mầm bệnh ở thực vật tìm hướng kháng bệnh thông qua dòng vận chuyển của SWEET [41-tr.43]

Trên một đối tượng khác là cải dầu (Brassica napus), kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biểu hiện BnSWEET12 được cảm ứng tích cực bởi sự xử lí ABA, GA

(Gibberellin) và BR (Brassinosteroid) trong hạt [31-tr.42] Bên cạnh đ , mức độ

biểu hiện của đa số gene SlSWEET ở cà chua (Solanum lycopersicum) được quan

s t để điều chỉnh một vài nếp trong đ p ứng với bất lợi mặn và nhiệt độ [21-tr.41]

Từ đ c thể thấy, các gene SWEET c liên quan đến đa dạng sinh lý, sinh hóa và

đ ng vai trò quan trọng trong chống chịu bất lợi phi sinh học

1.3 Tổng quan về cây đậu gà

1.3.1 Ngu n gốc và ph n loại của cây đậu gà

Đậu gà (Cicer arietinum L.) thuộc chi Cicer, phân họ Đậu (Faboideae), họ Đậu (Fabaceae) C reticulatum Ladz được xem như t tiên hoang dại của đậu gà Dựa theo sự phân bố hiện nay của C reticulatum đậu gà có thể đã được thuần hóa tại

Đông Nam natolia ph a Đông Nam Th Nhĩ Kì gần Syria ngày nay) khoảng 7500 TCN hoặc có thể sớm h n Cuối thời kỳ đ đ mới đậu gà đã ph t triển rộng về phía Tây tới Hy Lạp hiện nay Trong thời kỳ đ đ ng đậu gà tiếp tục phát triển rộng ở phía Tây Crete, phía trên Ai Cập ở phía Nam, hướng Đông qua Iraq ngày nay đến tiểu lục địa Ấn Độ; sau đ lan ra Nam và T y Á vào thời kỳ đ sắt đ ng thời có mặt lần đầu tại Ethiopia [43-tr.43]

1.3.2 Đặc điểm của cây đậu gà

1.3.2.1 Đặc điểm hình th i của cây đậu gà

Đậu gà là c y hàng năm ph t triển nhanh, phân nhánh, thân có lông, chiều cao

từ 20 đến 60 cm hoặc có thể lên tới 1 m Rễ cái sâu, dài (2 m), nhiều rễ phụ (15 - 30 cm) có các nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Lá kép dài 5 cm với 10 - 20 lá chét hình trứng hoặc elip m p l c răng cưa Hoa đậu điển hình, màu trắng, h ng tía hoặc xanh Quả nhỏ hình thuôn ph ng, vỏ có lông, chứa 1 hoặc 2 hạt [50-tr.44]

Hình 1.1 Đặc điểm hình th i loài đậu gà [51-tr.44]

Đậu gà được chia làm hai nhóm chính là desi và kabuli Loại desi có hạt nhỏ, nhăn màu tối Hạt kabuli c k ch thước lớn h n ề mặt hạt mịn, màu trắng hoặc be Trọng lượng hạt desi khoảng 0,1 - 0,3 g và kabuli là 0,2 - 0,6 g Desi chiếm khoảng

80 - 85% t ng diện tích tr ng của cây đậu gà, chủ yếu được tr ng ở Châu Á và

Ch u Phi Trong khi đ ka uli được tr ng rộng rãi ở Tây Á, Bắc Phi, Bắc Mỹ và Châu Âu [32-tr.42]

Giống đậu gà được quan tâm trong nghiên cứu này là 'CDC Frontier' Đ y là một giống ka uli Canada được phát hành lần đầu tiên năm 2003 và được phát triển bởi Trung tâm phát triển cây tr ng Đại học Saskatchewan CDC Frontier có kiểu lá kép, hoa trắng, các lá mầm vàng và vỏ hạt màu sữa Hạt giống c k ch thước trung ình c y sinh trưởng trung bình và tiềm năng năng suất cao trong những v ng đất

n u và n u đen trên thảo nguyên Canada [17, 32]

1.3.2.2 Đặc điểm di tru ền của cây đậu gà

Đậu gà là c y lưỡng bội (2n = 16), tự thụ phấn Năm 2013 nh m t c giả Ấn

Độ đã đưa ra ản phác họa trình tự gene của CDC Frontier b ng phư ng ph p WGS (whole genome shotgun), b sung các ngu n gene có sẵn cho nghiên cứu cây họ Đậu Kết quả đã thu được 153,01 Gb dữ liệu trình tự, với k ch thước genome đậu gà

được ước lượng là 738,09 Mb (với h n 28 000 gene) dựa trên số liệu thống kê

k-mer [46-tr.43] Có thể thấy r ng 73,8% của genome được chiếm trong các scaffold, còn lại 36,3% (genome không lắp r p) được làm giàu cho các chuỗi lặp lại [46-tr.43]

Khoảng một nửa 49 41%) genome đậu gà bao g m các yếu tố chuyển vị và

lặp lại chưa ph n loại, có thể so sánh với trình tự các cây họ đậu kh c như M

truncatula (30,5%), đậu triều (Cajanus cajan 51 6%) và đậu tư ng 59%) C c

nhân tố chuyển vị ngược có trình tự lặp lại dài ở đầu tận cùng là lớp yếu tố vận động d i dào nhất, và chiếm > 45% t ng số genome nhân [46-tr.43]

Parween et al 2015) đã đưa ra báo cáo về genome của ICC 4958 (phiên bản 2.0), loại Desi được tạo ra b ng cách sử dụng dữ liệu trình tự b sung và một bản đ

di truyền cải tiến [40-tr.43] Điều này dẫn đến sự gia tăng gấp 2,7 lần chiều dài của các phân tử giả và giảm đ ng kể khoảng cách trình tự Việc lắp r p genome ước tính bao phủ h n 94% không gian gene và dự đo n sự có mặt của 30.257 gene mã hóa protein bao g m 2230 và 133 gene mã h a tư ng ứng cho các TF tiềm năng và c c gene đề kh ng tư ng đ ng [40-tr.43]

Hình 1.2 Genome của đậu gà [46-tr.43]

1.3.3 Vai trò của cây đậu gà

1.3.3.1 Vai trò của cây đậu gà làm thực phẩm

Đậu gà là một loại thực phẩm tư ng đối rẻ và giàu dinh dưỡng (protein, vitamin, khoáng chất và chất x ) lợi cho sức khỏe [5-tr.39] Ngu n carbohydrate và protein trong đậu gà chiếm khoảng 80% t ng khối lượng hạt khô so với c c đậu hạt

kh c Đậu gà chủ yếu được tiêu thụ dưới dạng thức ăn hạt hoặc dưới những hình thức kh c nhau như ột được dùng làm bánh (Nam Á), chế biến cà ri hoặc d ng để chế biến c c m n ăn nhẹ

Hàm lượng tinh bột chiếm 41 - 50% t ng car ohydrate c trong đậu gà Kabuli chứa nhiều đường h a tan sucrose glucose và fructose) h n Desi So với các loại

ng cốc, đậu gà có hàm lượng tinh bột thấp h n nhưng hàm lượng amylose cao h n (30 - 40% so với 25% trong lúa mì) [11, 17]

Chất x trong đậu gà (10 - 20%) g m chất x h a tan và chất x không h a tan giúp giảm cholesterol, n định đường trong máu, chống lại ung thư Hàm lượng

chất o trong 100 g đậu gà 6 04 g) cao h n so với c c đậu hạt kh c như đậu lăng (1,06 g); cả với ng cốc như lúa mì 1 70 g) và lúa 1 64 g) [32-tr.42] Thực phẩm

từ đậu gà cung cấp một lượng lớn protein (bột đậu gà: 24,4 - 25,4%; bột lúa mì: 9,3

- 14 3%) và năng lượng cho chế độ ăn kiêng Ở c c nước Ch u Á c c đậu hạt thường được sử dụng cùng với ng cốc để b sung đ p ứng nhu cầu amino acid trong chế độ ăn h ng ngày Hàm lượng amino acid thiết yếu (39,89 g/100 g protein)

và amino acid nội sinh (58,64 g/100 g protein) trong bột đậu gà cao h n so với bột

mì (32,20 g/100 g protein) [42-tr.43] Người ta thấy r ng các protein phân lập từ bột đậu gà có cấu trúc lỏng lẻo h n do đ c thể con người có thể tiếp thu chúng một cách dễ dàng [32-tr.42]

Đậu gà không thể coi là một loại hạt dầu do hàm lượng dầu khá thấp (3,8 - 10%) so với đậu tư ng Tuy nhiên, dầu đậu gà chứa các tocopherol, sterol và tocotrienol có giá trị dược liệu và dinh dưỡng quan trọng Hàm lượng α-tocopherol trong 100 g đậu gà tư ng đối cao h n 8 2 mg) so với c c đậu hạt kh c như đậu lăng (4,9 mg) hay đậu xanh (1 mg) Cùng với hàm lượng α-tocopherol, n ng độ của d-tocopherol làm cho dầu đậu gà oxy hóa n định và góp phần tốt h n trong lưu trữ Các giá trị acid thấp h n được quan sát ở đậu gà khiến tinh chế dầu dễ h n Gi trị peroxide (3,97 - 6,37 mequiv/kg) n m trong giới hạn tối đa của khuyến cáo Codex (10 mequiv/kg) cho dầu ăn được [32-tr.42]

Đậu gà c ng cung cấp vitamin và khoáng chất cần thiết Hạt đậu gà thô (100 g) cung cấp trung bình khoảng 5,0 mg Fe; 4,1 mg Zn; 138 mg Mg; 160 mg Ca [32-tr.42] Khi được sử dụng cùng thức ăn kh c đậu gà có thể b sung về nhu cầu vitamin ở người Đậu gà là ngu n acid folic và tocopherol (cả α và γ) tốt, với một số vitamin tan trong nước như 2, B5, B6 ở mức tư ng tự hoặc cao h n trong c c loại đậu hạt khác [32-tr.42]

1.3.3.2 Vai trò của cây đậu gà trong chăn nuôi

Vỏ hạt th n và l tư i hoặc khô) của đậu gà thường được dùng làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc Tuy nhiên chúng lại có một lượng acid oxalic đ ng kể không tốt đối với thức ăn gia súc Đôi khi hạt được xay x t để làm thức ăn cho động vật Hoạt động của yếu tố kh ng dinh dưỡng trong đậu gà đối với động vật nhai lại

ít gặp vấn đề h n nhờ lên men ở dạ cỏ Đậu gà thô c hàm lượng chất ức chế trypsin

và chymotrypsin thấp h n đậu Hà Lan đậu thông thường và đậu tư ng Điều này dẫn đến các giá trị dinh dưỡng cao h n và t vấn đề về tiêu h a h n ở động vật dạ dày đ n [32-tr.42] Khẩu phần ăn của động vật dạ dày đ n c thể được hoàn thành

với 200 g/kg đậu gà thô để thúc đẩy sản xuất trứng và sinh trưởng ở chim và lợn Số lượng có thể cao h n khi đậu gà được xử lý b ng nhiệt

1.3.3.3 Vai trò của cây đậu gà trong cải tạo đất

Một đặc trưng của các cây họ Đậu là có vi khuẩn sống cộng sinh tại các nốt sần trên rễ của chúng Tư ng tự với đậu gà, trong nốt sần chứa vi khuẩn cố định

đạm (Rhizobium) ở rễ có khả năng chuyển đ i Nit kh quyển (N2) thành các dạng chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH4+) Do đã thu được một lượng N cần thiết nên cây ít khi có biểu hiện thiếu N

Heuzé V et al (2015) cho biết khả năng cố định N ở đậu gà có thể lên tới 100

kg N/ha [50-tr.44] Việc tr ng lu n canh đậu gà với các cây tr ng khác có vai trò quan trọng trong cải tạo và duy trì độ màu mỡ của đất tr ng; đ ng thời giúp phá vỡ chu kỳ bệnh và côn trùng gây hại làm tăng năng suất cây tr ng [7, 20]

1.3.3.4 Vai trò của cây đậu gà trong sản xuất nhiên liệu

Thân, lá và rễ c y đậu gà được con người sử dụng làm nhiên liệu đốt Bên cạnh đ c c cây họ Đậu thường chứa nhiều hợp chất có thể được tinh chế để phục

vụ sản xuất nhiên liệu sinh học Hạt c y đậu gà tuy chứa ít dầu h n so với các loại hạt cho dầu khác (lạc đậu tư ng) nhưng dầu đậu gà có các chỉ số tư ng đối cao h n [32-tr.42] Dựa trên số liệu của Zia-Ul-Haq et al 2007 và Shad et al 2009 năm

2012, K Jukanti et al đã t m tắt đặc tính lý hóa của dầu hạt đậu gà loại desi trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc tính lý hóa của dầu hạt desi [32-tr.42]

Ngu n

Giá trị Acid (mg KOH/g) 2,55 - 2,67 2,40 - 2,50

Giá trị Iodine phư ng ph p Wijs) 111,87 - 113,69 112,56 - 113,87 Giá trị xà phòng hóa (mg KOH/g) 183,98 - 185,64 178,90 - 180,64 Chất không xà phòng hóa (%, w/w) 2,99 - 3,71 3,42 - 3,47

Mật độ tư ng đối (g/cm3, tại 408C) 0,96 -

Giá trị năng lượng (kJ/100 g mẫu) - 3,85 - 13,01 1531,71 - 1560,63

MAG: monoacylglycerols; DAG: diacylglycerols; TAG: triacylglycerols.

Trong xu hướng diesel h a động c trên toàn cầu diesel sinh học đang ngày càng được ưa chuộng h n nhiều so với diesel khoáng Điểm n i bật trong khi sử dụng, diesel sinh học không tạo các sản phẩm cháy gây ô nhiễm môi trường như

SO2 [3-tr.39] Dầu thực vật và mỡ động vật là những nguyên liệu chính để sản xuất diesel sinh học Khi TAG phản ứng với alcohol sẽ tạo ra các alkyl ester - thành phần chính của diesel sinh học [3-tr.39] Như quan s t ảng 1.2, dễ dàng nhận thấy hàm lượng TAG trong dầu đậu gà desi cao, do vậy, có thể sử dụng đậu gà để điều chế diesel sinh học Thêm vào đ t ng lượng car ohydrate trong đậu gà (60,7 g/100 g) cao h n c c đậu hạt khác [32-tr.42] Hàm lượng carbohydrate, lipid và protein cao

là nguyên liệu c sở cho sản xuất khí biogas Chính vì vậy, có thể xem xét sử dụng đậu gà để sản xuất nhiên liệu sinh học bảo vệ môi trường

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

˗ Đối tượng nghiên cứu: Giống đậu gà ka uli CDC Frontier [46-tr.43]

˗ Dữ liệu nghiên cứu: Dữ liệu genome và proteome của đậu gà ka uli CDC Frontier' [46-tr.43] trên Phytozome v 12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/) [26-tr.41]

- Trình tự gene và protein của 21 thành viên SWEET trên đậu gà được thu thập từ nghiên cứu trước đ y [2-tr.39]

Bảng 2.1 Thông tin chú giải về họ SWEET ở đậu gà [2-tr.39]

STT Tên gene M định danh gene M định danh protein

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

˗ Phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp

˗ Phòng bộ môn Sinh học phân tử - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 3/2018 đến tháng 5/2019

2.3 Phương ph p nghiên cứu

2.3.1 Phương ph p ph n tích đặc tính protein SWEET trên c đậu gà

Đầu tiên, trình tự amino acid của 21 protein vận chuyển SWEET được thu thập từ nghiên cứu trước của Chu Đức Hà và cs (2019)

Những đặc tính của phân tử protein g m số lượng aa (amino acid) trọng lượng ph n tử mW molecular weight) điểm đẳng điện pI isoelectric point) chỉ

số bất n định II insta ility index) và độ ưa nước (GRAVY, grand average of hydropathicity) được x c định thông qua việc đưa trình tự amino acid của các CaSWEET vào công cụ Expasy (https://www.expasy.org/) [24-tr.41] Hình 2.1) Sau đ dữ liệu được đưa vào ph n t ch trên phần mềm EXCEL

Hình 2.1 Cơ sở dữ liệu Expas - Protparam

Tiếp đến, sự dự đo n vị tr định khu của protein trong tế ào được thực hiện

ng c ch đưa trình tự protein của 21 thành viên thuộc họ CaSWEET vào truy vấn trên chư ng trình TargetP v1.1: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ [18, 19] Hình 2.2)

Hình 2.2 Cơ sở dữ liệu TargetP

2.3.2 Phương ph p x dựng c ph n loại họ protein SWEET ở đậu gà

Cây phân loại được xây dựng bởi phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) [34-tr.42] Hình 2.3) Để xây dựng cây phân loại, tiến hành c c ước sau:

Hình 2.3 Cơ sở dữ liệu MEGA

ước 1: Trình tự protein CaSWEET được đưa vào truy vấn trên MEG để căn trình

tự tư ng đ ng theo mặc định (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Những tham số để căn trình tự tương đ ng ng MEG

1 Bắt cặp hai trình tự Hình phạt khoảng trống đầu tiên 10

Hình phạt khoảng trống kéo dài 0,1

2 Bắt cặp nhiều trình tự Hình phạt khoảng trống đầu tiên 10

Hình phạt khoảng trống kéo dài 0,2

ước 2: C y ph n loại được thiết lập dựa theo thuật to n NJ Neigh or-Joining) trên công cụ MEG (V6.0) với thông số trong ảng 2.3

Sự kiểm tra phát sinh chủng loại

Số lượng bản sao Bootstrap 1000

3

Mô hình thay thế

một

4

Những mô hình và tỷ lệ

Tỷ lệ giữa những vùng Những tỷ lệ đ ng nhất

Tham số Gamma Không áp dụng

Đầu tiên, mã định danh của gene CaSWEET được đưa vào truy vấn trên Hệ

thống thông tin cây họ Đậu (Legume Information System, LIS) [25-tr.41] để tìm kiếm biểu hiện các gene tại các mẫu mô của đậu gà trong điều kiện ình thường [22-tr.41]

ước 1: Truy cập vào LIS (https://legumeinfo.org/) sau đ click vào Search chọn Gene search and basket

ước 2: Trong mục Species chọn cicar.ICC4958 và nhập code của gene CaSWEET ước 3: Xem mức độ biểu hiện của các gene tại các mô

ước 4: Đưa số liệu vào Excel, xây dựng biểu đ để phân tích

Hình 2.4 Cơ sở dữ liệu LIS

Tiếp theo, nghiên cứu này c n quan t m đến biểu hiện của CaSWEET trong

điều kiện bất lợi Dữ liệu biểu hiện của gene mã hóa CaSWEET ở rễ được khai thác trên c sở dữ liệu Gene Expression Omnibus (GEO) [9-tr.39] đã công ố trước đ y trong nghiên cứu của Garg et al (2016) C y đậu gà tr ng trong nhà kính tại nhiệt

Đối với xử lí hạn, mỗi cây đối chứng được duy trì trong chậu ở điều kiện thuận lợi nhất với 90% nước có sẵn trong đất (Available soil water fraction, ASWF)

b ng c ch tưới xem kẽ ngày Trong khi đ những cây chịu hạn được giữ tại 0,9 ASWF cho tới khi áp dụng hạn Khi xử lí hạn, mỗi chậu được tưới nước 4 lần, mỗi

lần 1l cho tới khi giống như đất đ ng ruộng; các chậu được ph p tho t nước qua

đêm và c n để theo dõi sự mất nước C c c y đối chứng được thu cùng thời điểm

với cây xử lí hạn tại 2 giai đoạn phát triển ER (Early reproductive, sinh sản sớm) và

LR (Late reproductive, sinh sản muộn) Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần với mẫu rễ được thu khi SWF đạt 0,2 sau 50 ngày (ER) và 70 ngày (LR) để chiết RNA [23-tr.41]

Trong điều kiện xử lí mặn c y đối chứng được tưới nước thẩm thấu ngược, còn dung dịch NaCl được tưới cho cây chịu mặn Tại giai đoạn sinh dưỡng, cây được tưới 40 mM NaCl trước khi gieo và 40 mM sau 8 ngày gieo Vào giai đoạn

LR, hai liều 40 mM được thực hiện cách 5 ngày từ ngày bắt đầu ra hoa C y đối chứng và cây chịu mặn đều được thu rễ ở c c giai đoạn sau 15 ngày xử lí mặn để chiết RNA Các mẫu rễ được làm sạch và bảo quản trong nit lỏng ở - 80oC cho đến khi tách RNA[23-tr.41]

Hình 2.5 Cơ sở dữ liệu GEO

Để thu thập dữ liệu biểu hiện CaSWEET trong điều kiện hạn và mặn trên

GEO, thực hiện tiến hành c c ước sau:

ước 1: Truy cập vào GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

ước 2: Nhập từ kh a „GSE70274‟ đối với dữ liệu điều kiện xử lí hạn) và

„GSE70377‟ đối với dữ liệu trong điều kiện xử lí mặn) trong ô Keyword, rối ấn enter

ước 3: Tải Supplementary file về dưới dạng custom

ước 4: Đưa vào Excel để xử lí bảng số liệu