NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BỨC XẠ GAMMA LÊN CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.)

NỘI DUNG Chương 1: GIỚI THIỆU Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 4: DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BỨC XẠ GAMMA LÊN CÂY BẠC

HÀ (Mentha arvensis L.)

IN VITRO

Học viên: Trần Lệ Trúc Hà GVHD: TS Trần Thị Lệ Minh

TS Lê Quang Luân

NỘI DUNG

Chương 1: GIỚI THIỆU

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 4: DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

Đặt Vấn Đề

• Tinh dầu được xem là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp

• Con người cần sử dụng các chất có nguồn gốc

tự nhiên nhằm bảo vệ sức khoẻ và môi trường

• Phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp

hữu hiệu để nhân nhanh các giống cây trồng

• Bức xạ gamma là một tác nhân hiệu quả trong việc cải tiến các đặc tính tốt

Chương 1: GIỚI THIỆU

1 Mục tiêu

- Xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro cây Bạc hà

- Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Bạc hà in

vitro

2 Mục đích

-Tạo cây Bạc hà có khả năng sản sinh tinh dầu bằng kỹ

thuật nuôi cấy in vitro

- Đánh giá khả năng chọn tạo giống cây Bạc hà bằng

phương pháp chiếu xạ gamma kết hợp kĩ thuật nuôi cấy in

vitro

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Bạc hà

Châu Á (Bạc hà Á)

- Vị trí phân loại

+ Giới: Plantae + Ngành: Magnoliophyta + Lớp: Magnoliopsida + Bộ: Lamioles

+ Họ: Lamiaceae + Chi: Mentha

+ Tên khoa học: Mentha

arvensis L.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Giống Bạc hà Á phổ biến ở Việt Nam

+ Bạc hà bản địa

+ Bạc hà di thực

2.2 Giới thiệu chung về tinh dầu

Menthone

C10H18O Menthol

C10H20O

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Các phương pháp khai thác tinh dầu

 Chưng cất

+ Chưng cất với nước+ Chưng cất bằng nước và hơi nước+ Chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng

Trích ly bằng dung môi bay hơi

Trích ly bằng dung môi không bay hơi

+ Ngâm+ Hấp phụ+ Động học

2.3 Phương pháp nhân giống in vitro

+ Có thể đáp ứng số lượng lớn trong thời gian ngắn

+ Dễ dàng bảo quản giống

+ Tiết kiệm chi phí vận chuyển

+ Vật liệu để nhân giống dồi dào

+ Góp phần tích cực cho công tác giống cây trồng

+ Dễ dàng trao đổi kết quả với các nước

+ Hiệu quả kinh tế cao

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.3 Phương pháp nhân giống in vitro

- Các phương pháp nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy tế bào đơn và thu nhận các chất có hoạt

tính sinh học

Nuôi cấy protoplast - chuyển gen

Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

- Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro

Mẫu cấy

Môi trường nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ)

- Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro

Khoáng (đa lượng và vi lượng)

Amino acid

Nguồn carbon

Vitamin

Các chất điều hòa sinh trưởng

Một số các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

12

2.4 Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng đối với cây trồng

- Khái niệm bức xạ

Bức xạ là sự phát năng lượng vào môi trường dưới dạng tia Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đường đi đều coi là tia ion hóa

Tia ion hóa được chia làm 2 loại:

+ Sóng điện từ: Tia Roentgen, tia gamma + Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron

 Bức xạ gamma là bức xạ điện từ có độ xuyên mạnh

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa

+ Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tượng đột

biến nhiễm sắc thể

+ Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA

+ Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi

+ Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân

đôi

+ Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA

+ Ảnh hưởng phối hợp

2.4.5 Những thành tựu nghiên cứu về đột biến bằng

phương pháp chiếu xạ

a Trên thế giới

- Nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn

và đã tìm ra được những sinh vật biến dị nổi bật (Muller, 1925).

- "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trưởng, phát dục,

hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng" (Humphrey, 1951; Rauling, 1958; William, 1960)

- 1019 giống đột biến ở những cây có hạt được đưa vào sản xuất và

523 giống đột biến ở những cây lương thực và hoa kiểng (tổ chức phối hợp FAO/IAEA, 1964).

- Khử các thành tố axit oligosacharide dưới vỏ đậu Hà Lan (Jammala

Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha,

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

b Trong nước

- Đột biến hom Mía (Nguyễn Văn Vinh, 2002)

- Kích thích hạt Sắn (Hoàng Hưng Tiến, 2003)

- Nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu Khoai tây giống và hoa Cúc (Nguyễn Tiến Thịnh, 2004)

- Nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma (Viện Khoa học Miền Nam, 2004)

-Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa cạn (Lê Xuân Thám, 2004)

- Kích thích hạt giống hoa Kiết Tường, củ Lyli (Trần Thanh Hân, 2005)

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Giống cây: Bạc hà (Mentha arvensis L.)

- Mẫu thí nghiệm: Mẫu nuôi cấy in vitro, mẫu

chiếu xạ, mẫu trồng ở vườn ươm, mẫu chiết xuất tinh dầu

-Thiết bị và dụng cụ: tủ cấy, nồi hấp, nguồn gamma 60Co

- Hóa chất: MS, menthol, menthone chuẩn

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh

- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ

gamma lên cây Bạc hà in vitro

- Nội dung 3: Lựa chọn và đánh giá tính ổn định

của các dòng biến dị phát hiện được

- Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) in vitro hoàn chỉnh

+ Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mẫu cấy

Các thao tác ngoài phòng thí nghiệm

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiệm thức Nồng độ Javel :

nước

Thời gian khử trùng (phút)

+ Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA

đến sự hình thành callus từ lá

 Mục đích: Tìm ra nồng

độ của NAA và BA tối ưu

cho việc tạo callus

 Chỉ tiêu theo dõi :

- Phần trăm mẫu tạo callus

- Màu sắc và đặc điểm của callus

 Thời gian theo dõi: 3- 5

tuần

Nghiệm thức NAA (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

+ Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tái

sinh chồi từ callus của cây Bạc hà in vitro

Mục đích: Xác định nồng độ BA

thích hợp đến sự tái sinh chồi cây

Bạc hà

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỉ lệ mẫu tạo chồi

- Số chồi trên mẫu: Số chồi trung

bình trên 1 mẫu cấy

- Chiều cao chồi (cm): Đo từ mặt

thạch đến đỉnh sinh trưởng cao nhất

sát nồng độ BA lên khả năng tái

sinh chồi cây Bạc hà in vitro

+ Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng

hình thành rễ của cây Bạc hà in vitro

Mục đích: Xác định nồng

độ NAA thích hợp lên khả

năng ra rễ cây Bạc hà

Chỉ tiêu theo dõi:

- Phần trăm chồi tạo rễ

- Số rễ trung bình trên 1 chồi

- Chiều dài rễ (cm): Đo từ gốc

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Bạc

Độ tăng sinh khối và khả năng

biệt hoá chồi

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm liều xạ

Nghiệm thức Liều xạ (Gy) Mẫu

b Chiếu xạ gây biến dị

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu callus

Mẫu callus sau khi chiếu xạ tiếp tục nuôi cấy và theo dõi

độ tăng sinh khối, tỷ lệ sống và khả năng biệt hóa chồi

 Mục đích

- Xác định sự ảnh hưởng của bức xạ gamma lên mẫu callus, chồi cây Bạc hà, qua đó xác định liều chiếu xạ gây gây kích thích và biến dị hiệu quả nhất

- Tạo các dòng Bạc hà biến dị có đặc tính mới so với

giống gốc

- Nội dung 3: Lựa chọn và đánh giá các dòng biến dị phát hiện được

+ Chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi sinh trưởng và phát triển của cây từ khi trồng

đến khi ra hoa rộ: Chiều cao cây, kích thước lá, hình dạng

lá, khả năng đẻ nhánh, năng suất

Phân tích hàm lượng tinh dầu

 Định tính và bán định lượng bằng sắc ký bản mỏng

 Định lượng bằng sắc ký khí

27

Chương 4

DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC

- Quy trình nuôi cấy in vitro cây Bạc hà

- Giá trị LD50 của mẫu callus và chồi khi chiếu xạ tia gamma

- Các dòng Bạc hà biến dị

- Phương pháp định tính và bán định lượng Menthone và Menthol bằng sắc ký bản mỏng, định lượng bằng sắc ký khí