Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc và hoạt tính chống loãng xương của một số hợp chất tách được từ cây vót vàng nhạt (viburnum lutescens blume)

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆLê Đức Thiện NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG LOÃNG XƯƠNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TÁCH ĐƯỢC TỪ CÂY VÓT VÀNG NHẠT Viburnum lutescens B

Trang 1

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Đức Thiện

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG LOÃNG XƯƠNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT

TÁCH ĐƯỢC TỪ CÂY VÓT VÀNG NHẠT

(Viburnum lutescens Blume)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Hà Nội - 2021

Trang 2

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

(Viburnum lutescens Blume)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Phượng Minh

Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Hải Đăng

Hà Nội - 2021

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luậnvăn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nàokhác

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận văn

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi

rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Hà Nội, 3/2021

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bêncạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp

đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Phượng Minh - ViệnHóa học Môi trường quân sự, BTL Hóa học, BQP; TS Nguyễn Hải Đăng -Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội và các Cán bộ thuộc PhòngNghiên cứu cấu trúc, Viện Hoá sinh biển đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, Phòng Đào tạo cùng các thầy,

cô giáo trong Học viện Khoa học và Công nghệ đã đào tạo và giúp đỡ tôitrong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi trân trọng và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã động viên vàgiúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt thời gian qua

Cuối cùng Tôi xin cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất

có hoạt tính chống loãng xương từ nguồn tài nguyên thực vật tại một số tỉnhphía Bắc Việt Nam”, mã số: KHCBHH.02/19-21 đã hỗ trợ kinh phí để giúp

đỡ Tôi hoàn thiện luận văn này

Hà Nội, 3/2021

Trang 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT

HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết HPLC High-performance liquidchromatography Sắc ký lỏng áp suất cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang 6

Bảng 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất VL1 và tài liệu tham khảo 38

Bảng 4 Số liệu phổ NMR của hợp chất VL4 và hợp chất tham khảo 47

Bảng 9 Số liệu phổ NMR của hợp chất VL9 và hợp chất tham khảo 62

Bảng 10 Kết quả đánh giá hoạt tính chống loãng xương của các hợp chất VL1-VL9 65

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh cây Vót vàng nhạt 6

Hình 2: Quá trình tái mô hình xương (bone remodeling) 26

Hình 3: Mẫu Vót vàng nhạt chụp tại nơi thu hái - Mê Linh, Vĩnh Phúc 30

Hình 4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Vót vàng nhạt 35

Hình 5: Cấu trúc hóa học của hợp chất VL1 37

Hình 6: Phổ 1H-NMR của hợp chất VL1 39

Hình 7: Phổ 13C-NMR của hợp chất VL1 40

Hình 8: Phổ DEPT của hợp chất VL1 40

Hình 9: Phổ ESI-MS của hợp chất VL1 41

Trang 8

Hình 25: Phổ HSQC của hợp chất VL6 55

Hình 32: Phổ HSQC của hợp chất VL8 61

Hình 36: Cấu trúc hóa học của các hợp chất VL1- VL9 66

Trang 9

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

Danh mục chữ viết tắt iii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

Mục lục 1

Mở Đầu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI VIBURNUM 5

1.1.1 Giới thiệu chung chi Viburnum 5

1.1.2 Giới thiệu chung cây Vót vàng nhạt (Viburnum lutescens Blume.) 6

1.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Viburnum 6

1.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Viburnum 24

1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ 24

1.2.1 Các đặc tính cơ bản của bệnh loãng xương 25

1.2.2 Các phương pháp điều trị bệnh loãng xương 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 30

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 31

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính loãng xương (chống hủy xương) trên tế bào RAW264.7 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 XỬ LÝ MẪU VÀ QUY TRÌNH PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 34

3.1.1 Xử lý mẫu nghiên cứu 34

3.1.2 Quy trình phân lập các hợp chất 34

3.2 THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 35

3.2.1 Hợp chất VL1: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside 35

3.2.2 Hợp chất VL2: Kaempferol 3-O-rutinoside 36

3.2.3 Hợp chất VL3: Kaempferol 3-O-α-L- rhamnopyranosyl (1→6)-β-D-galactopyranoside 36

3.2.4 Hợp chất VL4: Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside 36

3.2.5 Hợp chất VL5: Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside 36

3.2.6 Hợp chất VL6: (7S,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-β-D-glucopyranoside 36

3.2.7 Hợp chất VL7: (7S,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9՛-O-β-D-glucopyranoside 36

3.2.8 Hợp chất VL8: (7S, 8R)-5-methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside 37

Trang 10

3.3.9 Hợp chất VL9:

(7S,8R)-4,9,9՛-trihydroxy-3,3՛,5-trimethoxy-4′,7-epoxy-8,5՛-neolignan 9՛-O-β-D-glucopyranoside 37

3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG LOÃNG XƯƠNG IN VITRO CỦA CÁC HỢP CHẤT 37

3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 37

3.4.1 Hợp chất VL1: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside 37

3.4.2 Hợp chất VL2: Kaempferol 3-O-rutinoside 41

3.4.3 Hợp chất VL3: Kaempferol 3-O-α-L- rhamnopyranosyl (1→6)-β-D-galactopyranoside 44

3.4.4 Hợp chất VL4: Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranoside 47

3.4.5 Hợp chất VL5: Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside 50

3.4.6 Hợp chất VL6: (7S,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-β-D-glucopyranoside 52

3.4.7 Hợp chất VL7: (7S,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9 -O-β-D- ՛ glucopyranoside 56

3.4.8 Hợp chất VL8: (7S, 8R)-5 methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside 58

3.4.9 Hợp chất VL9: (7S,8R)-4,9,9 -trihydroxy-3,3 ,5-trimethoxy-4′,7-epoxy- ՛ ՛ 8,5 -neolignan 9 -O-β-D-glucopyranoside ՛ ՛ 62

3.5 HOẠT TÍNH CHỐNG LOÃNG XƯƠNG CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 65 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ 66

4.1 CÁC HỢP CHẤT ĐÃ ĐƯỢC XÁC ĐỊNH TỪ CÂY VÓT VÀNG NHẠT .66 4.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT ĐÃ XÁC ĐỊNH ĐƯỢC 67

Tài liệu tham khảo 68

Phụ lục 70

1 Phụ lục phổ của hợp chất VL1 70

9 Phụ lục phổ của hợp chất VL9 88

Trang 11

MỞ ĐẦU

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá vềnhững hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Không chỉ các nướcphương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dượcliệu Theo thống kê, ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư sốthuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc.Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào

sử dụng với mục đích chữa bệnh Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếmcác hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dượcphẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoahọc bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong

cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có

hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo ước tính, nước ta có khoảng 13000loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 5000 loài được sử dụng làmthuốc Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng caosức khoẻ cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngàycàng trở nên quan trọng

Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Namcòn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng đểchữa nhiều loại bệnh khác nhau Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thứcđộc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá Ngoài ra, hàngtrăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữabệnh của chúng

Vót vàng nhạt thuộc chi Viburnum bao gồm khoảng 200 loài Một số loài

đã được dân gian sử dụng làm thuốc để điều trị các bệnh khác nhau như, ho,tiêu chảy, viêm khớp dạng thấp Lá của chúng có thể chữa bệnh sởi, cành và

lá sắc uống chữa viêm tắc buồng trứng, cũng dùng nấu nước tắm cho phụ nữmới sinh mau lại sức… Bên cạnh đó, đã có nghiên cứu cho thấy cao chiếtMeOH của cây Vót vàng nhạt thể hiện đáng kể khả năng chống loãng xương

Trang 12

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của chi Viburnum cho thấy tiềm năng lớn trong phát triển các dược

chất thiên nhiên có hoạt tính kháng viêm, chống lão hóa… Tuy nhiên, cácnghiên cứu ở nước ta mới chỉ tập chung vào phân loại và định danh các loàimang tính điều tra, khảo sát Các nghiên cứu về các nhóm hợp chất của chúnggần như là chưa có Do vậy, nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Vót vàng nhạt (V lutescens Blume) sẽ cung cấp thêm thông tin

về các nhóm hợp chất của loài này, tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu vềsau

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, Tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc và hoạt tính chống loãng xương của một số hợp chất tách được từ cây Vót vàng nhạt” với các nội dung sau:

- Phân lập được một số hợp chất từ cây Vót vàng nhạt (Viburnum lutescens Blume)

- Xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất

- Đánh giá sơ bộ hoạt tính chống loãng xương của các chất đã phân lập

và xác định được

Trang 13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI VIBURNUM

1.1.1 Giới thiệu chung chi Viburnum

Viburnum hay còn gọi là Kim ngân hoa là một chi gồm khoảng 200

loài, cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ trong họ Adoxaceae Sự phân loại hiện nay dựatrên phát sinh loài phân tử Trước đây, nó thuộc họ Caprifoliaceae, các loàithuộc họ bản địa phân bố ở khắp bán cầu Bắc, với một số loài phân bố mởrộng đến các vùng núi nhiệt đới của Nam Mỹ, Ukraine, Nga và Đông Nam Á

Ở Châu Phi, chi này được giới hạn trong dãy núi Atlas Ở Ukraine, Viburnum

(kalyna) được xem như một biểu tượng quốc gia, một biểu tượng cho lễ kỷniệm Koliada và quan niệm về tình yêu thể hiện sự dịu dàng của các cô gáitrẻ Đây là yếu tố chính của vòng hoa truyền thống của Ukraine Tên chungbắt nguồn từ tiếng Latinh Lá mọc đối, đơn, nguyên, có răng cưa hoặc cong

Ở vùng khí hậu mát thường rụng lá, ở các vùng khí hậu ấm áp lá thường cómàu xanh Một số loài có lông dày ở chồi và lá, lông hình sao Hoa được tạothành hình nón 5-15cm, mỗi bông màu trắng kem hoặc hồng, có năm cánh, ởmột số loài có mùi rất thơm Quả có hình dạng tròn, bầu dục, có màu từ đỏđến tím, xanh lam hoặc đen, chứa một hạt đơn Một số loại có thể ăn được,nhưng nhiều loại khác hơi độc

Viburnum là loại dược liệu có khả năng ức chế chất Histamin và

Prostaglandin E2 (đây là 2 hoạt chất thường xuất hiệu nếu cơ thể đang gặptình trạng viêm nhiễm) Nhờ vậy, chúng được ứng dụng để điều trị các chứngbệnh như viêm họng, viêm da do mụn nhọt, lở ngứa, trị viêm ruột thừa cấp…

Theo nhiều nghiên cứu chuyên ngành, dược liệu này có khả năng khángkhuẩn rộng và mạnh hơn rất nhiều các loại thảo dược khác Đặc biệt, Kim

ngân hoa kháng khuẩn được với chủng E coli (vi khuẩn đường ruột) và S aureus (vi khuẩn đường hô hấp) Ngoài ra, chúng còn có tác dụng kháng

khuẩn từ các loại nấm khác,…Ngoài khả năng chống khuẩn, kim ngân hoacòn phát huy tác dụng trong việc ức chế các loại virus chữa bệnh khác Nhiềunghiên cứu đã chỉ ra rằng, vị thuốc này là loại dược liệu quý giá làm nền tảng

Trang 14

chống mầm bệnh Điều này có được là do chúng chứa chiết xuất như axitchlorogenic, acid caffeoylquinic, flavonoid… Đây là những hoạt chất ức chếkháng virus trong giác mạc, phổi, hệ hô hấp

1.1.2 Giới thiệu chung cây Vót vàng nhạt (Viburnum lutescens Blume.)

Vót vàng nhạt là loại cây thân bụi sống lâu năm, cao 3-6 m Thân gỗmọc thành bụi Lá mọc đối xứng thành hai dãy, hình bầu dục có răng cưa.Hoa màu trắng và ra hoa có quả vào khoảng tháng 11,12 hàng năm Chúngmọc tự nhiên trong rừng thưa, ven rừng phân bố rộng rãi ở Nam Mỹ (Peru),phương Tây, Châu Á (Philippines và Malaysia) và Trung Quốc Ở Việt Nam,Vót vàng nhạt phân bố tại các tỉnh Bắc Kạn, Thái Nguyên, Nghệ An, KonTum (Kon Plông, Mang Cành), Lâm Đồng (Bảo Lộc)…

Vót vàng nhạt đã được dân gian sử dụng làm thuốc để điều trị các bệnhkhác nhau, chẳng hạn như, ho, tiêu chảy, viêm khớp dạng thấp Lá của chúng

có thể chữa bệnh sởi, cành và lá sắc uống chữa viêm tắc buồng trứng, cũngdùng nấu nước tắm cho phụ nữ mới sinh mau lại sức…

Dưới đây là hình ảnh của cây Vót vàng nhạt:

1.1.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Viburnum

Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Viburnum Hiện nay các nhà khoa học đã

Trang 15

phát hiện được trên 200 hợp chất thuộc chi Viburnum Thành phần chủ yếu

của chi này là các nhóm chất thuộc nhóm diterpene, triterpene, iridoid,monoterpene, sesquiterpene, flavonoid, lignan, phenol, coumarin, lactone,alkaloid và một số các hợp chất khác có cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, theokết quả tìm kiếm của, hiện chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học

cũng như hoạt tính sinh học của cây vót vàng nhạt ở Việt Nam.

1.1.3.1 Các hợp chất Diterpene.

O

OH O

1

O O

OH

O OH

5

OH O

O

O HO

11

O O

OH

OH O

O

HO

12

Trang 16

OH O

O O

16

Diterpene là thành phần chủ yếu của chi này, có 86 diterpene được phân lập

từ chi này Các diterpene loại vibsanin có thể được coi là sản phẩm tự nhiên khá

hiếm, chúng chỉ có trong chi Viburnum Từ ba loài (V odoratissimum, V awabuki,

V suspensum) đã phân lập được vibsanin A-F (1-6), vibsanin I (9), vibsanin L-M

(11,12), aldovibsanins A-C (22-24), vibsanols A-B (84, 85) cùng sáu diterpenes

khác(61, 79-83) Từ loài V odoratissimum đã phân lập được vibsanins G, H, K và

O-W (7, 8, 10, 13-21), furanovibsanins A-G (25-31), neovibsanins A-D, G-I

(32-35, 37-39), spirovibsanin A (40) cùng với 21 diterpene là (58-60, 62-78, 86) Từ

loài V.awabuki đã thu được neovibsanin F (36) và gomojosides A-Q (41-57)

OH O

O O

OH

18

OH O O

HO

20

O OH

HO

OH

O O O

21

OH O

OHC HO

H OHC

OH

24

O

O HO

O O

25

Trang 17

26

O

O O

O

OH OMe

31

O O

H O

H OMe

O

OH O

36

O O

O

H O

37

O O

O GIcO

OGIc

41

Trang 18

H

OGIc OH

46

H

OGIc O

OGIc

49

H H

OGIc GIcO

OGIc

OH HO

52

H H

OGIc

HO HO

OGIc

O O

O

OOH

OMe H

58

O

O OMe

O O

59

Trang 19

OH

O H HO

OHC H

61

OMe O

O O

OMe

68

O O

OMe

69

O O

73

O

OH O

O

O O

HO

80

OH O

HO

81

Trang 20

OH O

OH

OH O

84

O OH O

1.1.3.2 Các hợp chất Triterpene

Ba bảy hợp chất triterpene đã được phân lập từ chi Viburnum bao gồm damarnane, ursane và oleanane Từ V dilatatum đã phân lập được các hợp

chất Viburnols A-K (87-97), viburnudienone B1 methyl ester (101), viburnudienone B 2methyl ester (102), viburnudienone H1 và H2 (105,106),

viburnenone B1 methyl ester (103), viburnenone B2 methyl ester (104) Từ V.

urceolatum thu được α -amyrin palmitate, lupeol palmitate, β-amyrin axetate

và axit ursolic (108-111) Viburolide (113) được phân lập từ V arboricolum Năm triterpene (98-100, 107, 112) được phân lập từ V awabuki Ba triterpene (114-116) phân lập từ V suspensum Ba triterpene (121-123) phân lập từ V tinus Hai triterpene (117, 118) phân lập từ V odoratissimum El-Gamal cũng

đã thu được hai triterpene (119,120) từ loài V awabuki

O HHO

90

Trang 21

H

H O HO

H

HO

MeO2C HO HO

92

H

H O HO

H

HO

O MeO 2 C OH

93

H

H O HO

O

MeO2C O HO

HO H O O

96

H

H O

O O

101 R=

O O O O HO HO

O

108

H

O H

H Me(H2C)14

O

109

Trang 22

O

O HO HO HOOC

O OH HO

OH OH

O OH HO

OH HO

HO

HOOC

O OH HO

123

1.1.3.3 Các hợp chất Iridoid.

Năm mươi ba Iridoid đã được phân lập từ chi này Viburtinosides A-B

(124,125), Viburtinosides I-V (141-145), suspensolides A-F (146,147) phân

lập được từ V tinus Năm 2004-2005, Fukuyama và cộng sự đã phân lập được

các luzonials A-B (126,127), luzonidials A-B (128,129), luzonosides A-D

Trang 23

(130-133), luzonoid A-G (134-140) từ V luzonicum Furcatoside A-C 150) phân lập từ V furcatum Urceolatoside A-D (151-154) được phân lập từ

(148-V urceolatum Isoviburtinoside II-III (166,167), isosuspensolide E-F (168,169) và năm loại iridoid (161-165) phân lập từ V ayavacense Ba iridoid

2 ′-Acetyldihydropenstemide, 2′-Acetylpatrinoside, 3′-Acetylpatrinoside 157), cùng các hợp chất lantanoside (175), dihydropenstemid (176) đã được

(155-phân lập từ V lantana Ba iridoid (170-172) thu được từ V rhytidophyllum Hai iridoid Viburnalloside, Decapetaloside (173,174) được phân lập từ V betulifolium Hợp chất(158,159,160) thu được từ V prunifolium

O O

OH CHO

126 R = (E) - p - coumaroyl

127 R = (Z) - p - coumaroyl

O O

RO

O

OH HO HO

132 R = (E) - p - coumaroyl

133 R = (Z) - p - coumaroyl

O

OH H

R 1 O

H O

R 1 O

H O

OR 1

HO HO HO

R 2 O

O OH

Trang 24

O O OH HO HO

O O

HO

OAc

O O

147

O

O O

OH HO HO

O O

HO

OAc

O O

H

H HO

OH

O

OH

OH HO

OH CHO

O HO

O

OAc

149

Trang 25

OAc HO

AcO OH AcO

R 1 O HO

OAc

R 2 O

AcO OH AcO

HO

OAc HO

HO HO

175

O

OGIc H

H O HO

O

176

1.1.3.4 Monoterpenes

Mười monoterpenes đã được phân lập từ chi này Betulalbuside A (177)

được phân lập từ V orientale Urceolid (178), phlebotricoside (179) được phân

Trang 26

lập từ V phlebotrichum Betulalbuside B (180); anatolioside E (181); anatolioside (182), anatolioside A - D (183–186) phân lập từ V orientale

OH HO HO O OH

179

O

O HO

HO O

O O HO OH O

O O

O HO HO

O

O O OH HO

HO

OH

O OH

O O

HO

O O OH HO

O HO HO

OH

O HO

HO HO

182

O O O HO HO

OH

O O

HO

O O

O HO HO OH

O O

HO

O O

O HO

OH

O HOHO

HO

186

Trang 27

1.1.3.5 Sesquiterpenes.

Năm 1996, Fukuyama đã phân lập được 3 sesquiterpenes: awabukinol,

4-hydroperoxyawabukinol, 3-hydroperoxy yawabukinol (187–189) từ V.awabuki

OH HOO

188

H

OH HOO

189

1.1.3.6 Flavonoids.

Mười lăm flavonoids đã được phân lập từ chi này Trong số đó, hai

flavonoids (190,191) phân lập từ V furcatum Hai flavonoid Cyanidin sambubioside, kuromanin (192, 193) được phân lập từ chi V dilatatum Luteolin 3’-O-b-dxylopyranosyl-(1-2)-O-β-D-glucopyranoside (194) được phân lập từ V.

3-O-grandifolium Ba flavonoids là astragalin, kaempferol 3-O-rutinoside,

apigenin 7-O-b-d-glucoside (195,197,202) phân lập từ V wrightii Flavonoids kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (196) được phân lập từ V wrightii và

V tinus Quercetine (198) được phân lập từ chi V odoratissimum Ba flavonoids nobiletin, rutin, afzelin (199-201) được phân lập từ V tinus Quercetine (198) phân lập từ V tinus Hai flavonoids, epicatechin (203) và catechin (204) phân lập từ V awabuki (204) được tìm thấy ở V.

rhytidophyllum

O

O O

OH HO

OH

HO

OH OH

190

O

OH

O O

O

OH HO

HO HO

O OH

O HO

HO OH

191

Trang 28

O +

HO

O O

O HO

HO

O

OH HO

HO HO

O O

HO

O OH

194

OH O O O OH HO HO HO HO

195

OH O O O

OH HO

HO

O O

OH OH

OH

OH HO

HO HO

O O OH

MeO

OMe MeO

OMe

199

O

OH O O

O

OH

OH HO

OH

O O OH HO

Trang 29

4-O-β-vibsanol, 9’-O-Methyl4-O-β-vibsanol, dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (205-209) được

phân lập từ V awabuki

Hai hai phenols đã được phân lập từ chi này trong đó 2,3,4-Trihydroxybutyl

6-O-(E)-caffeoyl-β-D-glucopyranoside (210), cùng với bảy phenol khác từ (211; 219-224) đã được phân lập từ V dilatatum Phlebotrichin, p-hydroquinone và arbutin (212-214) được phân lập từ chi V phlebotrichum Axit methyl este 3-O- caffeoylquinic (216); Hợp chất 4-O-caffeoylquinic (215) phân lập từ chi V dilatatum Axit methyl estes (217); Methyl estes 5-O-caffeoylquinic; Axit (218) được phân lập từ V cylindricum Hợp chất (225, 223) được phân lập từ V opulus Hợp chất chavicol (227) phân lập từ chi V furcatum Henryoside (228, 229) được phân lập từ V rhytidophyllum (226, 230, 231) phân lập được từ V wrightii

OH O

OH

OH O

O O

OH

212

Trang 30

213 R = H

214 R = Gic

O O

OH HO

HO

O O

OH OH

OH HO

HO

O O

OH OH

220

O O

OH HO

OH

O

OH

OH O

21

OH OH O

O HOOC

2 24

OH O

O

OH

OH HO

225

OH O

OH HO

OH

O

OH HO

OH OH

228

O O

OH HO

HO

OH O

Năm furcatin được phân lập từ chi này gồm: 2′,6′-O-diacetylscopolin

(232) được tìm thấy trong V suspensum, các hợp chất 3′,6′-O-diacetylscopolin

Trang 31

(233); 2′-O-acetylscopolin (234); 6′-O-acetylscopolin (235) phân lập được từ được từ V awabuki Hợp chất scopoletin 7-O-sophoroside (236) được phân lập

từ chi V tinus

O

OAc HO

OAc

O O MeO

233

O

OAc HO

OH

O O MeO

234

O

OH HO

O

O HO

240

Trang 32

Năm 2005, Mohamed đã phân lập được 2,6-Di-C-methylnicotinic acid

3,5-diethyl ester (241) từ V tinus Năm 1995, Abdallah và Ibraheim đã phân lập được Viburnine (242) từ chi V rhytidophyllum

N O

O

O O

241

N

N N

O Ph

O

Ph O

242

1.1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Viburnum.

Chiết xuất MeOH từ lá và cành của V awabuki cho thấy khả năng

chống lại ba dòng tế bào, bao gồm ung thư biểu mô tuyến phổi ở người A549,ung thư biểu mô tuyến ruột kết HT-29, bệnh bạch cầu lymphocytic chuột P-

388 Các hợp chất phân lập từ V awabuki đã được xác định là vibsanin P (14)

và vibsanin W (21) thể hiện độc tính tế bào P-388 với giá trị ED50 tương ứng

là 2,25 và 2,18 μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồm

vibsanin Q-V (15-20) gây độc tế bào với giá trị (ED50 <10,0 μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml) Vibsanin

P (14) và vibsanin W(21) gây độc tế bào trên dòng A549 (ED50 4,62 và 5,60

μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml) và HT-29 (ED50 9,97 và 8,15 μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml) Nghiên cứu cho thấy Luzonial A

(126) và luzonial B (127) thể hiện các hoạt động ức chế dòng tế bào HeLa

(ung thư biểu mô ở người) với giá trị IC50 là 3,5 và 1,9 μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml Luzonoside A

(130), luzonoside B (131); A-E (134-138) cũng gây ức chế các dòng tế bào

HeLa với giá trị IC50 trong khoảng 3-7 μg/ml Ngoài ra, các hợp chất phân lập từ loài này gồmg/ml

1.2 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ

Loãng xương là hiện tượng xương mất dần canxi, khiến xương bị xốp,yếu và trở nên dòn và dễ gãy hơn Loãng xương là một tình trạng rối loạnchuyển hóa của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương, mất chất khoángtrong xương dẫn đến làm tăng nguy cơ gãy xương Sức mạnh của xương đượcphản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng xương và chất lượng xương

Trang 33

1.2.1 Các đặc tính cơ bản của bệnh loãng xương

Xương có chức năng quan trọng trong cơ thể Xương cung cấp sự vậnđộng và giúp nâng đỡ trọng lượng cơ thể, bảo vệ các bộ phận quan trọngtrong cơ thể như tủy xương và não Xương còn là một “kho” lưu trữ chấtkhoáng như calci và phospho, các yếu tố tăng trưởng và chất béo 90% canxi

và 85% phốt pho được lưu trữ trong xương Nguồn canxi và phốt pho này cóthể được huy động để duy trì sự cân bằng lượng khoáng chất nội mô Một vàiyếu tố điều hòa sự chuyển hóa xương quan trọng được biết đến gồm hoócmôn tuyến cận giáp, calcitonin, vitamin D, protein liên quan đến tuyến giáp,insulin-like growth factor-1 Mô xương chứa phần lớn collagen loại 1, chiếm90% lượng protein trong xương Phần còn lại là các chất hữu cơ như yếu tốsinh trưởng (growth factors), osteonectin và osteocalcin Phần vô cơ củaxương bao gồm phần lớn chất khoáng hydroxyappatite (Ca10(PO4)6(OH)2) Do

đó, xương vừa có sự mềm dẻo vừa có sự bền bỉ

Dựa vào đặc điểm sinh lý, xương có thể chia làm hai loại: xương xốp(trabecular hay cancellous bones) và xương đặc (cortical bones) Tính chung,xương xốp chiếm khoảng 20% tổng khối lượng xương, và phần 80% còn lại

là xương đặc Xương xốp được cấu tạo bởi một mạng tế bào rất phức tạp vàtinh vi Do đó, xương xốp có độ chuyển hóa cao, có diện tích rộng hơn, và dễ

bị gãy hơn xương đặc

Ở bậc phân tử, xương được cấu thành từ 4 loại tế bào chính: tế bào tạoxương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast), cốt bào (osteocyte), và tếbào liên kết (lining cells) Những tế bào này tương tác với một số chấtkhoáng, protein, hóc môn và các phân tử khác để nuôi dưỡng xương và liêntục đục bỏ xương cũ và thay bằng xương mới qua quá trình tái mô hình (boneremodeling) Tế bào tạo xương (và cả cốt bào) có nguồn gốc từ các tế bào gốc

có tên là tế bào mầm trung mô (mesenchymal stem cell - MSC), tạo ra nhữnglớp xương và góp phần tạo lực của xương Tế bào hủy xương xuất phát từ tếbào tạo máu (hematopoietic cell) đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại quamột quá trình phân hủy chất khoáng gọi là hủy xương Một số tế bào tạoxương được “chôn” trong các lớp xương, và sau này sẽ trở thành cốt bào Cốt

Trang 34

bào rất phổ biến, chiếm đến 95% số tế bào có mặt trong xương Những tế bàotạo xương còn lại nằm trên bề mặt của xương, và chúng được gọi là tế bàoliên kết Các cốt bào liên kết với nhau, và liên kết với các tế bào tạo xương,hình thành một mạng tế bào có chức năng chuyển giao tín hiệu và chuyểngiao các chất dinh dưỡng trong xương

Để đảm bảo độ bền và sự nguyên vẹn, xương trải qua quá trình tái môhình (bone remodeling), khoảng 10% lượng xương được thay mới hàng năm Tái mô hình xương (bone remodeling) là một quá trình sinh lí mà các xương

bị tổn thương được loại bỏ bằng tế bào hủy xương (osteoclasts) rồi thay thếbằng các xương mới được tạo bởi các tế bào tạo xương (osteoblasts)

Hình 2: Quá trình tái mô hình xương (bone remodeling)

Quá trình tái mô hình xương xảy ra theo trình tự: khởi động(activation), phân hủy (resorption), tạm ngưng (reversal) và tạo xương(formation) Bước khởi động tùy thuộc vào các tế bào tạo xương gửi tín hiệuđến các tế bào tạo máu để sản sinh ra các tế bào hủy xương Ở giai đoạn phânhủy (có thể xảy ra phía dưới các lớp tế bào liên kết) các tế bào hủy xương đục

bỏ những xương bị tổn hại hay xương cũ bằng cách phân hủy các chất khoáng

và để lại những lỗ hổng trên bề mặt xương Sau đó là một giai đoạn trung gian

Trang 35

ngắn được gọi là giai đoạn tạm ngưng (reversal phase) để các tế bào đơn nhângiống đại thực bào thu dọn các mảnh vụn được thải ra trong quá trình phânhủy xương, các tế bào tạo xương xuất hiện và bắt đầu sửa chữa những xương

bị tổn hại bằng xương mới Trong quá trình này, một số tế bào tạo xương cònlưu lại trong mô xương và được chuyển hóa thành các tế bào xương thật sự(osteocyte) Một khi xương mới được khoáng hóa, quá trình tái mô hình coinhư hoàn tất trong một vùng xương nào đó, quá trình tạo xương chấm dứt,tiếp theo đó là khoảng bất động (quietscence) cho tới khi bắt đầu một quátrình tái mô hình mới

Thời gian phân hủy xương ngắn hơn thời gian tạo xương Giai đoạnphân hủy kéo dài vài tuần, nhưng giai đoạn tạo xương thì cần đến vài tháng đểhoàn tất Các tế bào tạo xương sản sinh ra nhiều protein, và các protein này cóchức năng kiểm soát quá trình tạo xương Một protein có tên là macrophagecolony stimulating factor (M-CSF), qua tương tác với thụ thể MCSF làm tăngcác tế bào tạo xương Các tế bào hủy xương cũng sản sinh ra một protein cótên là receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) vàRANKL liên kết với một thụ thể trên tế bào hủy xương (RANK) và kích thíchchúng chuyển hóa thành những tế bào hủy xương hoàn chỉnh Mối tương tácgiữa RANK/RANKL còn làm tăng mức độ hủy xương Tế bào hủy xương cònsản sinh ra một protein khác có tên là osteoprotegerin (OPG), là protein đượctiết ra và liên kết với RANKL làm ngăn chặn tế bào hủy xương không chotương tác với RANK, do đó có chức năng làm giảm số tế bào hủy xương Cáchormon và yếu tố nội tại như hormon cận giáp (PTH), calcitriol hay 1,25-dihydroxy D (1,25D), prostaglandin F2 (PGF2) và interleukin-1 (IL-1) tươngtác với các tế bào tạo xương để gia tăng sản sinh RANKL và giảm sản sinhOPG Sự cân đối giữa RANKL và OPG quyết định lượng xương bị mất baonhiêu

Việc mất cân bằng giữa việc tạo xương và hủy xương có thể dẫn đếnquá trình tái mô hình bất thường và sự phát triển của các bệnh lí về xươngnhư chứng teo xương, chứng loãng xương Báo cáo của tổ chức y tế thế giớicho thấy tỉ lệ gãy xương tăng nhanh cùng với tuổi tác và nguy cơ gãy xương ở

Trang 36

phụ nữ 50 tuổi là 40% Vào năm 1990, trên toàn thế giới có 1.7 triệu ca gãyxương hông, con số này dự kiến sẽ tăng lên đến 6 triệu vào năm 2050

Các nghiên cứu trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng các tế bào hủyxương (osteoclast) thực ra có nguồn gốc từ các đại thực bào (macrophage) vàđơn bào lớn (monocyte) của tủy xương Nếu các đại thực bào tách từ tủyxương được nuôi trong môi trường đặc biệt có tăng cường phối tử RANKL thìchúng sẽ bị kích thích biệt hóa thành tế bào hủy xương Điều này mở ra khảnăng vô cùng lớn trong việc phát triển nghiên cứu đánh giá hoạt tính chốngloãng xương thông qua khả năng tác động lên quá trình hình thành tế bào hủy

xương của các chất thử trong môi trường in vitro

1.2.2 Các phương pháp điều trị bệnh loãng xương

Loãng xương (Osteoporosis) là một bệnh tưởng chừng như đơn giản đểchữa trị nhưng nếu điều trị không đúng cách sẽ làm bệnh ngày càng trầmtrọng đưa đến tăng nguy cơ gãy xương Sự toàn vẹn của xương về cả chấtlượng và khối lượng thể hiện sức mạnh của xương Có rất nhiều cách để chữaloãng xương hiệu quả, tuy nhiên người bệnh có thể tham khảo theo phác đồđiều trị loãng xương bộ y tế như sau:

1.2.2.1 Phương pháp điều trị không dùng thuốc

Không có một loại thuốc hay một phương pháp duy nhất để điều trịloãng xương Loãng xương cần điều trị trong thời gian dài (thường 3-5 năm)

và cần phối hợp nhiều loại thuốc với các phương pháp khác nhau để tăngcường hiệu quả, và giảm tác dụng phụ của nhau

Phương pháp điều trị loãng xương này chủ yếu dựa vào việc điều chỉnhthói quen sinh hoạt, tập luyện thể dục thể thao của người bệnh - nguyên nhânchính gây ra loãng xương Các bác sĩ khuyến cáo người bệnh loãng xương vàngười chưa bị loãng xương cần tích cực làm theo phương pháp này để phỏng

và giảm nguy cơ mắc bệnh loãng xương ở người trẻ tuổi

1.2.2.2 Chế độ dinh dưỡng hàng ngày

Mỗi ngày nhu cầu trung bình của cơ thể con người cần từ 1000-1500

mg chất dinh dưỡng hàng ngày Canxi là chất nên bổ sung nhiều nhất cho cơ

Trang 37

thể, người bệnh dễ dàng tìm được các thực phẩm giàu canxi trong các thựcphẩm như sữa, sữa hạt và một số loại dược phẩm Cần tránh sử dụng các chấtkích thích như rượu, bia, thuốc lá; tránh thừa cân hoặc thiếu cân đột ngột ảnhhưởng tới quá trình điều trị.

1.2.2.3 Chế độ sinh hoạt

Người bệnh nên thiết lập chế độ sinh hoạt khoa học, ngủ đủ giấc, đúngthời gian, tránh thức khuya học làm việc quá sức dẫn đến tình trạng bệnhnặng hơn Tăng cường vận động nhẹ, tránh ngồi sai tư thế Ngoài ra, ngườibệnh có thể chuẩn bị các thiết bị nẹp chỉnh hình cho cột sống hoặc khớp háng

để giảm sự tỳ đè lên cột sống, đầu xương và xương vùng hông

1.2.2.4 Bổ sung vitamin D tự nhiên

Tập thể dục ngoài trời vào buổi sáng là phương pháp tăng cường hấpthu vitamin D tốt nhất, tăng độ đàn hồi và dẻo dai khớp xương Một số bài tậphiệu quả như đi bộ, tập aerobic, chạy bộ, tập dưỡng sinh… Lưu ý, nên tập nhẹnhàng, tránh gắng sức tránh nguy cơ tổn thương xương

Trang 38

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu: Cây Vót vàng nhạt được thu thập tại Trạm đa dạng sinhhọc Mê Linh, Vĩnh Phúc vào tháng 5 năm 2019

Hình 3: Mẫu Vót vàng nhạt chụp tại nơi thu hái - Mê Linh, Vĩnh Phúc

Mẫu được nhận dạng bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái vàTài nguyên sinh vật Tiêu bản được lưu giữ tại Trường Đại học Khoa học vàCông nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tửngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

Trang 39

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếpđiện đến khi hiện màu.

 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bướcsóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dungdịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ đểxác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chếlại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường vàchất hấp phụ pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm(240-430 mesh) Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC(30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20(Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: AGILEN 1100.

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sựkết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đạibao gồm:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR

Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC

 Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD hoặc CDCl3

Trang 40

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính loãng xương (chống hủy xương) trên tế bào RAW264.7

 Thiết bị/dụng cụ

- Đĩa nuôi cấy 100 x 20 mm (Corning, Mỹ)

- Phiến 96 giếng có xử lí bề mặt (Corning, Mỹ)

- Kính hiển vi soi ngược có chụp ảnh

 Hóa chất

- DMEM (Hyclone, Mỹ)

- FBS (Gibco, Mỹ)

- Penicillin/Streptomycin (Gibco, Mỹ)

- Recombinant mouse RANKL (R&D systems, Mỹ)

- TRAP detection kit (Sigma Aldrich, Mỹ)

- Acetone (Scharlau, Tây Ban Nha)

- Formaldehyde 37% (Scharlau, Tây Ban Nha)

 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm

Mẫu các hợp chất được pha thành dung dịch gốc với nồng độ 50 mMtrong DMSO, sau đó pha loãng ở các nồng độ thích hợp

Tế bào RAW264.7 đã được biệt hóa thành tế bào hủy xương được nuôicấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS,penicillin và streptomycin Sau đó chúng được nuôi cấy trong phiến 96 giếngvới mật độ 5 x 104 tế bào/giếng Sau 24 giờ, tế bào được xử lí với hợp chấtthử nghiệm và bổ sung 1µL RANKL (100ng/mL) vào tất cả các giếng Sau 48giờ, tế bào được xử lí một lần nữa với hợp chất thử nghiệm và RANKL(100ng/mL) Sau 24 giờ, loại bỏ dịch nổi tế bào ở các giếng và rửa bằng nướccất Các tế bào hủy xương (osteoclasts) được cố định trong Fixation solution(chứa citrate solution, acetone và 37% formaldehyde, tỉ lệ 25:65:8) trong 30giây, sau đó rửa lại 3 lần bằng nước cất Các tế bào được nhuộm màu TRAPbằng bộ kit acid phosphatase leukocyte bọc giấy bạc, ủ phiến 96 trong tủ ấm

Định dạng
Số trang	98
Dung lượng	18 MB