Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR đánh giá nguồn bố mẹ phục vụ chọn tạo giống bông lai f1

luận văn, tiến sĩ, thạc sĩ, báo cáo, khóa luận, đề tài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-THÁI THỊ LỆ HẰNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

ðÁNH GIÁ NGUỒN BỐ MẸ PHỤC VỤ CHỌN TẠO

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

MÃ SỐ : 60 62 05

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch

HÀ NỘI - 2008

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các số liệu kết quả trong luận văn này là trung thực

và chưa thông qua bất cứ một công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan rằng các tài liệu trích dẫn ñúng nguồn gốc và những tập thể và cá nhân giúp ñở ñã ñược cảm ơn

Học viên

Thái Thị Lệ Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình th ực hiện ñề tài tốt nghiệp cao học, học viên luôn

nhân ñược sự quan tâm, giúp ñở của Lãnh ñạo Viện Nghiên cứu bông và

Phát tri ển nông nghiệp Nha Hố, Phòng Nghiên cứu Giống và Công nghệ

sinh h ọc và các phòng chức năng cùng toàn thể bạn bè, ñồng nghiệp Với

t ấm lòng chân thành học viên xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến các tập thể

và cá nhân ñó

ðặc biệt học viên xin gửi lời cảm ơn sâu sắc ñến thầy giáo GS.TS

Nguy ễn Quang Thạch, Viện Sinh thái nông nghiệp, Trường ðại học Nông

nghi ệp Hà Nội ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñở học viên tận tình về mọi

m ặt trong suốt quá trình thực hiện ñề tài

H ọc viên xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Bích Thuỷ, CN Phạm

Anh Tu ấn, CN Phạm Thị Hoa và các anh chị Phòng Sinh học phân tử, Viện

Di truy ền nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện, giúp ñở học viên trong quá

trình th ực hiện ñề tài

Lu ận văn ñược hoàn thành còn có sự chia sẽ, ñộng viên và giúp ñở cả

v ật chất lẫn tinh thần của gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp

Nhân ñây học viên xin bày tỏ lòng tri ân tới tất cả các ñơn vị và cá

nhân ñã giúp ñở toàn diện và quý báu trên

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

Phần 1 MỞ ðẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục ñích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của ñề tài 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.4 Phạm vi nghiên cứu của ñề tài 3

1.4.1 Giống nghiên cứu 3

1.4.2 ðịa bàn nghiên cứu 3

1.4.3 Thời gian nghiên cứu 3

Phần 2 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học 4

2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bông vải 4

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bông trên thế giới 4

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuât bông ở Việt Nam 6

2.3 Chọn giống ưu thế lai 9

2.3.1 Lai giống và nguyên tắc chọn cặp bố mẹ 9

2.3.1.1 Nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái ñịa lý 10

2.3.1.2 Nguyên tắc khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất 11

2.3.1.3 Nguyên tắc khác nhau về thời gian các giai ñoạn sinh trưởng 11

2.3.1.4 Nguyên tắc khác nhau về tính chống chịu sâu bệnh 12

2.3.1.5 Nguyên tắc bổ sung các tính trạng cần thiết 12

2.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện ưu thế lai 13

2.4 Một số ựặc ựiểm chắnh của giống bông lai F1 14

2.5 đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 15

2.5.1 đa dạng di truyền và khái niệm về chỉ thị di truyền 15

2.5.1.1 đa dạng di truyền 15

2.5.1.2 Khái niệm về chỉ thị di truyền 15

2.5.2 Một số chỉ thị ứng dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền thực vật 17

2.5.2.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) Ờ đa hình ựộ dài các ựoạn cắt hạn chế 17

2.5.2.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphims) Ờ đa hình ựộ dài các ựoạn nhân chọn lọc 17

2.5.2.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphims) Ờ đa hình các ựoạn ADN nhân ngẫu nhiên 18

2.5.2.4 SSR (Simple Sequence Repeats) Ờ đa hình các lặp lại ựơn giản 18

2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 19

2.5.3.1 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 21

2.5.3.2 Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bông vải 25

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU29 3.1 Vật liệu nghiên cứu 29

3.1.1 Giống bông: gồm 20 bố mẹ có nguồn gốc khác nhau 29

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 30

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 đánh giá bố mẹ bằng các chỉ tiêu hình thái 30

3.3.2 đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị SSR 30

3.3.2.1 Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA 30

3.2.2.2 Phương pháp PCR-SSR 30

3.3.3 đánh giá, so sánh sơ bộ bố mẹ và các tổ hợp lai 31

3.4 Chỉ tiêu theo dõi 31

3.4.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng 31

3.4.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ñồng 31

3.4.2.1 Thời gian sinh trưởng 31

3.4.2.2 ðặc ñiểm thực vật học 31

3.4.2.3 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 32

3.4.2.4 Chất lượng xơ bông 32

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 32

Phần 4 KẾT QỦA NGHIÊN CỨU 33

4.1 Kết quả ñánh giá một số ñặc ñiểm hình thái của các bố mẹ 33

4.1.1 Thời gian sinh trưởng và các ñặc ñiểm thực vật học chính 33

4.1.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 35

4.1.3 Chất lượng xơ bông của các giống bố mẹ 38

4.1.4 Phân nhóm di truyền giữa các giống bố mẹ 41

4.1.5 Phân nhóm di truyền giữa các giống bố mẹ theo tính trạng năng suất 45

4.1.6 Phân nhóm di truyền các giống bố mẹ theo tính trạng chất lượng xơ bông 46

4.2 Kết quả ñánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị phân tử SSR 48

4.2.1 Tách chiết ADN và chọn lọc mồi ñánh giá ña hình vật liệu khởi ñầu 48

4.2.2 Phân nhóm di truyền vật liệu khởi ñầu 50

4.3 Kết quả so sánh một số tổ hợp lai trên một số tính trạng chính 55

4.3.1 Ưu thế lai tính trạng thời gian sinh trưởng và chiều cao cây 56

4.3.2 Ưu thế lai tính trạng số quả/m2 và khối lượng quả 58

4.3.4 Ưu thế lai tính trạng ñộ dài và ñộ bền xơ 64

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70

5.1 Kết luận 70

5.1 ðề nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 82

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng4.1 Thời gian sinh trưởng và các ñặc ñiểm thực vật học chính của các giống thí nghiệm, Ninh Thuận năm 2007 34Bảng 4.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống tham gia thí nghiệm, Ninh Thuận năm 2007 36Bảng 4.3 Một số chỉ tiêu chính về chất lượng xơ bông của các giống thí nghiệm, Ninh Thuận năm 2007 38Bảng 4.4 Tương quan di truyền của các giống bố mẹ (phân tích bằng chỉ thị hình thái) 40Bảng 4.5 Một số ñặc ñiểm thực vật học và sinh trưởng của các nhóm 43Bảng 4.6 Năng suất và các yếu tố cầu thành năng suất của các nhóm 44Bảng 4.7 Chất lượng xơ trung bình của các nhóm 44Bảng 4.8 Trình tự, tổng số phân ñoạn nhân ñược và số ñoạn ña hình của các căp mồi nghiên cứu 49Bảng 4.9 Tương quan di truyền của các giống bố mẹ (phân tích bằng chỉ thị phân tử) 53Bảng 4.10 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng TGST và chiều cao cây 57Bảng 4.11 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng số quả/m2 và khối lượng quả 60Bảng 4.12 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng năng suất lý thuyết và năng suất thực thu 62Bảng 4.13 Khoảng cách di truyền, ưu thế lai trên tính trạng ñộ dài và ñộ bền xơ 65Bảng 4.14 Thời gian sinh trưởng và các ñặc ñiểm thực vật học chính của các tổ hợp lai triển vọng 68Bảng 4.15 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai triển vọng 68Bảng 4.16 Một số chỉ tiêu chất lượng xơ bông của các tổ hợp lai triển vọng 69Bảng 4.17 Một số chỉ tiêu sâu bệnh hại chính của các tổ hợp lai triển vọng 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1 Phân nhóm di truyền các bố mẹ theo chỉ thị hình thái 42

Hình 4.2 Phân nhóm di truyền theo tính trạng năng suất 45

Hình 4.3 Phân nhóm di truyền theo tính trạng chất lượng xơ 46

Hình 4.4 AND tổng số của các giống thí nghiệm 48

Hình 4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm SSR với cặp mồi BNL1317 trên agarose 3% 48

Hình 4.6 Sơ ñồ phân nhóm di truyền theo chỉ thị phân tử của các giống thí nghiệm 51

Hình 4.7 Tương quan giữa sai khác di truyền với ưu thế lai về thời gian sinh trưởng và chiều cao cây 56

Hình 4.8 Tương quan giữa khoảng cách di truyền với ưu thế lai về số quả/m2 và khối lượng quả 59

Hình 4.9 Tương quan giữa khoảng cách di truyền với ưu thế lai về năng suất lý thuyết và năng suất thực thu 63

Hình 4.10 Tương quan giữa khoảng cách di truyền với ưu thế lai về chiều dài xơ và ñộ bền xơ 64

Phần 1 MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Chọn giống là một khâu kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu cây bông Lịch sử chọn tạo giống bông cho ñến nay chủ yếu sử dụng phương pháp chọn lọc và lai tạo truyền thống Bằng phương pháp này các nhà chọn giống

ñã tạo ra ñược hàng loạt giống bông có năng suất cao, chất lượng tốt ñặc biệt

là kháng sâu, kháng bệnh cơ bản ñáp ứng ñược nhu cầu sản xuất như GL03, VN15, VN01-2, VN01-4, VN02-2, VN04-3, VN04-4, VN04-5, VN05-4

Trong những năm gần ñây, sử dụng giống bông lai ñã mang lại nhiều thành tựu to lớn cho ngành bông như năng suất, chất lượng ñược cải thiện rõ rệt, chống chịu với ñiều kiện ngoại cảnh, kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ Theo nghiên cứu của một số nhà khoa học Ấn ðộ cho thấy cải tiến năng suất bông bằng cách sử dụng giống thuần có thể gia tăng 5 - 10% năng suất trong vòng năm năm hoặc dài hơn nữa Trong khi ñó, bằng phát triển các giống bông lai trong một thời gian ngắn Ấn ðộ ñã thành công trong việc tăng năng suất trung bình cả nước lên gấp ñôi (Patel, 1990) [60] Với những ñặc tính

ưu việt của giống bông lai có thể nhanh chóng mở rộng diện tích trồng bông

kể cả những vùng khó khăn Tuy nhiên, ñể tạo ñược các giống bông ñạt ñược những yêu cầu của sản xuất bằng con ñường lai tạo và chọn lọc truyền thống phải ñược tiến hành trên quy mô lớn, tốn rất nhiều thời gian và chi phí lớn Hơn nữa, sử dụng các chỉ thị hình thái ñể ñánh giá nguồn vật liệu bố mẹ ñôi lúc còn mang tính chủ quan và các tính trạng số lượng thường biến ñộng lớn dưới tác ñộng của ñiều kiện ngoại cảnh vì thế hiệu quả ñạt ñược chưa cao

Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học ñã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong nông nghiệp Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng ñã ñược nhiều nhà khoa học quan tâm Nhiều giống cây trồng ñược tạo ra bằng ứng dụng công nghệ sinh học (lúa,

ngô, ựậu tương, bắp cải, khoai tây ) Trong ựó, việc sử dụng các chỉ thị phân

tử khác nhau ựược nghiên cứu và phát triển ựã trở thành công cụ mạnh mẽ ựể phân tắch ựa dạng di truyền và xác ựịnh các mối quan hệ giữa các giống cây

trồng, vật nuôi như RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism ), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Trong

ựó, chỉ thị SSR là một loại chỉ thị ựược sử dụng khá phổ biến, chắnh xác và hữu hiệu trong nghiên cứu ựa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuôi khác nhau trong cùng một loài ựộng vật hay thực vật Ngày nay sử dụng

kỹ thuật SSR ựã ựược nhiều nhà khoa học quan tâm nhằm xây dựng bản ựồ liên kết, phân lập (gen), xác ựịnh quan hệ di truyền giữa các giống cây trồng, vật nuôi và chẩn ựoán cặp lai cho ưu thế lai (Muhanad Walid Akash, 2003) [58] Tuy nhiên, hướng nghiên cứu này còn rất ắt ựược triển khai ở Việt Nam

Vì vậy, ựể nâng cao hiệu quả trong công tác chọn giống bông nói chung và giống bông lai nói riêng, việc sử dụng kết hợp giữa các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử là yêu cầu cấp thiết Trên cơ sở ựó chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài ″″″″Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR ựánh giá nguồn bố mẹ phục vụ chọn tạo giống bông lai F 1 Ợ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

- Xác lập ựược ựa dạng di truyền của vật liệu bố mẹ khởi ựầu

- Tạo các tổ hợp lai cho ưu thế lai cao ựáp ứng ựược nhu cầu sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

- đánh giá các vật liệu khởi ựầu bằng các chỉ tiêu hình thái

- Tách chiết ADN tổng số

- Tiến hành PCR-SSR, phân nhóm di truyền và dự ựoán các tổ hợp lai

- So sánh sơ bộ các con lai

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

ðề tài nghiên cứu sử dụng các chỉ thị hình thái và phân tử trên cơ sở phân tích các tính trạng số lượng và phân tích ADN sẽ xác định được khoảng cách di truyền của các giống bơng thí nghiệm ðồng thời, nghiên cứu mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền và ưu thế lai trên một số tính trạng chính của một số tổ hợp lai Các kết quả đĩ là các dẫn liệu khoa học quan trọng làm

cơ sở cho các nhà chọn tạo giống nghiên cứu và tham khảo

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đề xuất được một số tổ hợp lai dự kiến cĩ triển vọng nhằm gĩp phần tạo giống bơng lai F1 đáp ứng nhu cầu sản xuất của ngành bơng

1.4 Phạm vi nghiên cứu của đề tài

1.4.1 Giống nghiên cứu

Trong khuơn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tơi tiến đánh giá 20

giống bơng Luồi (Gossypium hirsutum L.) trong tập đồn giống bơng của

Viện nghiên cứu bơng và Phát triển nơng nghiệp Nha Hố

1.4.2 ðịa bàn nghiên cứu

ðề tài nghiên cứu của chúng tơi được thực hiện tại Viện Nghiên cứu bơng & PTNN Nha Hố và Viện Di truyền nơng nghiệp - Hà Nội

Một phần số liệu của đề tài nghiên cứu này là kết quả phối hợp nghiên cứu của Viện Nghiên cứu bơng và PTNN Nha Hố và Viện Di truyền nơng

nghiệp trong dự án nghiên cứu "Chọn giống bơng vải kháng bệnh xanh lùn

bằng chỉ thị phân tử" thuộc chương trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp do

Viện Di truyền Nơng nghiệp - Hà Nội chủ trì

1.4.3 Thời gian nghiên cứu

ðề tài được tiến hành từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 8 năm 2008

Phần 2 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học

Hệ gen sinh vật Eukaryote có mặt các trình tự nucleotid lặp lại, có kích thước khác nhau ñặc trưng cho loài SSR (Simple Sequence Repeats) gồm 2-5 nucleotid lặp lại nhiều lần (TG)n hoặc (AAT) Ở lúa, ñã phát hiện ra các nhóm

GA, GT, CAT, CTT (Z Li, 1999) [52] Các ñoạn này ñược gọi là SSR, STRs (Short Tandom Repeats), SSLPs (Single Sequence Length Polymorphims) và gọi chung là microsatellite (vi vệ tinh) Các ñoạn ADN nhắc lại này có trình

tự hai ñầu rất ñặc trưng cho từng loài nên ñược sử dụng ñể thiết kế mồi cho PCR Do có sự sai khác về kích thước của các ñoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu ña hình, lập bản ñồ và phân lập gen cũng như giám ñịnh giống

Cây bông thuộc chi Gossypium, họ Malvaceae Chi bông gồm nhiều loài khác nhau trong ñó có 4 loài bông trồng phổ biến và rộng rãi khắp nơi

trên thế giới (Gossypium arborium L., Gossypium herbaceum L., Gossypium

hirsutum L., Gossypium barbadense L.) Lịch sử phát triển của chi bông của

các loài có sự biến ñổi rất lớn về di truyền, từ nguồn gốc cây lâu năm qua quá trình tiến hoá ñã hình thành nhiều nhóm khác nhau (dạng lâu năm, thường niên) Các dạng thường niên cũng phân thành nhiều nhóm khác nhau từ chín cực sớm ñến chín rất muộn và mang nhiều dạng hình khác nhau (dạng lá, ñộ lông, màu sắc ) là cơ sở cho chọn giống bông ưu thế lai

2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bông vải

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bông trên thế giới

Trong những năm gần ñây, sản lượng bông vải trên thế giới ñã tăng lên một cách ñáng kể, ngoài việc tăng năng suất, diện tích trồng bông không ngừng ñược mở rộng Cho ñến nay, trên thế giới có khoảng 50 quốc gia sản

xuất bông vải với diện tích hàng năm khoảng 30-34 triệu ha và tập trung chủ yếu ở các nước có ñiều kiện khí hậu nhiệt ñới và á nhiệt ñới Trong ñó, các nước có diện tích trồng bông lớn nhất trên thế giới là Ấn ðộ (8.730 nghìn ha),

Mỹ (5.596 nghìn ha), Trung Quốc (4.824 nghìn ha), Pakistan (3.125 nghìn ha), Uzbekistan (1.453 nghìn ha), Brazil (750 nghìn ha) và Thổ Nhĩ Kỳ (654 nghìn ha) (Clive James, 2001/02) [34] Tổng giá trị sản xuất bông hàng năm trên hế giới ñạt 20 tỷ USD, trong ñó các nước ñang phát triển chiếm 70% giá trị Sản xuất bông ở Châu Á chiếm khoảng 60% sản lượng toàn cầu, Châu Phi chiếm 15% và Châu Mỹ Latinh chiếm khoảng < 5% Tính ñến niên vụ 2004/05, Trung Quốc là nước ñứng ñầu thế giới về sản lượng bông xơ (hơn 6 triệu tấn), tiếp ñến là Mỹ (5 triệu tấn), Ấn ðộ (3 triệu tấn), Pakistan (2 triệu tấn), Brazil (1,5 triệu tấn) (Clive James, 2004) [35]

Trong các nước sản xuất bông chủ yếu, Ấn ðộ là quốc gia ñầu tiên trên thế giới khai thác và sử dụng các giống ưu thế lai với mục ñích thương mại Giống bông lai ñầu tiên của thế giới Hybrid 4 (H4) ñã ñược ñưa vào sản xuất tại Ấn ðộ từ năm 1970, kể từ ñó nhiều giống bông lai mới lần lượt ra ñời và việc sử dụng các giống bông lai trong sản xuất gia tăng một cách nhanh chóng Nghiên cứu khai thác ưu thế lai trên cây bông rất thành công ở

Ấn ðộ, nhiều giống bông lai cùng loài hay khác loài ñã ra ñời và chứng tỏ

ưu thế lai về khả năng cho năng suất, khả năng thích nghi với ñiều kiện ngoại cảnh, chống chịu ñược với sâu bệnh, ñặc biệt là ưu thế lai về chất lượng xơ bông Hiện tại, Ấn ðộ là một trong những quốc gia ñứng ñầu thế giới về sản xuất bông vải, trong ñó hơn 40% diện tích trồng bông của Ấn ðộ

sử dụng giống bông lai kinh tế Diện tích sản xuất hàng năm chiếm 21% diên tích bông toàn thế giới, sản lượng chiếm khoảng 12% Mặc dù giá thành hạt giống bông lai còn cao hơn hạt giống bông thuần nhưng các giống bông lai cho năng suất cao hơn nhiều (năng suất bông xơ bình quân khoảng

0,8 tấn/ha) và mang ñược nhiều ñặc tính mong muốn nên vẫn ñược sử dụng rộng rãi trong sản xuất và xu thế ngày càng phát triển mạnh (Bhagirath Choudhary and Gaurav Laroia, 2001) [31]

Trung Quốc hiện là một trong những quốc gia ñứng ñầu thế giới về sản xuất và tiêu thụ bông vải với ña phần diện tích sử dụng là các giống bông lai (khoảng 50% diện tích) (Hsu và Gale, 2001 và ICAC, 2005) [43] Việc sản xuất hạt giống bông lai ở Trung Quốc ñược tiến hành chủ yếu bằng phương pháp lai thủ công với chi phí sản xuất và chế biến cho 1 ha giống lai F1 khoảng từ 11.000-12.000 USD (tương ñương 180-200 triệu VND) với giá bán 1 kg hạt giống bông lai thương mại trong nước của Trung Quốc khoảng 9,8 USD (tương ñương 156.8 VND), (Hezhong Dong

và cộng sự, 2005) [41]

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuât bông ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng ưu thế lai trên cây bông mới chỉ bắt ñầu vào những năm 1980, trước ñó sản xuất bông của nước ta chủ yếu sử dụng các giống bông Luồi thuần hoặc các giống bông ñịa phương có năng suất và chất lượng xơ bông thấp ðến năm 1986, một số con lai khác loài (Luồi x Hải ñảo) ñã ñược lai tạo và thử nghiệm, trong ñó nổi bật nhất là tổ hợp lai MCU9 x Menoufi Giống này có ưu thế lai cao về năng suất và chất lượng xơ nhưng không thích nghi với ñiều kiện ẩm ñộ cao trong sản xuất bông vụ mưa ở Việt Nam nên tỷ lệ quả lép cao, nhiễm bệnh giác ban nặng

do ñó giống này không phổ biến ñược cho sản xuất

Từ những năm 1990 trở ñi, Việt Nam kết hợp nhập nội và thử nghiệm một số giống bông lai từ Ấn ðộ, Trung Quốc, Úc, Mỹ ñồng thời ñẩy mạnh nghiên cứu sử dụng ưu thế lai, chủ yếu tập trung vào các giống lai cùng loài

bông Luồi (intra-hirsutum) Kết quả sử dụng giống bông lai nhập nội như

Bioseed 7 và các giống lai nội ñịa ñầu tiên như L18, VN20 và VN35 thành công trong sản xuất ñã góp phần mở rộng diện tích ñáng kể và tăng năng suất

từ 1,5 - 2,0 lần (0,6 - 0,7 tấn/ha lên 1,0 - 1,2 tấn/ha) Mặt khác, sử dụng hệ thống sản xuất hạt giống lai theo phương pháp thủ công hiện tại ñã cơ bản ñáp ứng ñược nhu cầu hạt giống với chất lượng ñảm bảo cho sản xuất trong nước, giảm ñáng kể chi phí khi phải nhập khẩu hạt giống bông lai từ nước ngoài

Mặc dù các giống bông lai L18, VN20 và VN35 có ưu thế lai về năng

suất, chất lượng, có khả năng kháng rầy xanh chích hút (Amrasca devastans)

từ trung bình ñến khá nhưng các giống này không có khả năng kháng sâu

xanh ñục quả (Helicoverpa armirega) nên năng suất thường bấp bênh Do

ñó, sản xuất bông trong giai ñoạn này mặc dù có tăng nhưng còn chậm, tổng diện tích sản xuất bông trong cả nước trong những năm 1996-1997 khoảng hơn 10.000 ha, sản lượng chỉ ñáp ứng khoảng 7 - 10% nhu cầu nguyên liệu cho ngành Dệt trong nước

Trong những năm gần ñây, việc nhập nội nhiều vật liệu có nguồn gen quý như kháng sâu, kháng rầy, chất lượng xơ tốt ñã giúp cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống bông ở trong nước có nhiều bước ñột phá mới Nhiều giống bông lai mới (cùng loài bông Luồi) lần lượt ra ñời và ñược ứng dụng vào sản xuất, ñáp ứng cơ bản và kịp thời nhu cầu ña dạng hoá bộ giống sản xuất trên nhiều vùng sinh thái trồng bông của Việt Nam, Trong những giống tạo ñược nổi bật nhất là 3 giống bông lai VN15, VN01-2 và VN02-2 Các giống bông lai này bên cạnh có khả năng cho năng suất với ưu thế lai khá cao (20 - 30%) chúng còn có khả năng kháng sâu xanh tốt Trong ñó, giống VN01-2 bên cạnh có khả năng kháng sâu xanh tốt còn kết hợp ñược khả năng kháng rầy xanh chích hút; giống VN02-2 kết hợp ñược khả năng kháng sâu xanh và kháng thuốc trừ cỏ Chính nhờ việc áp dụng nhanh những tiến bộ về giống, kỹ thuật canh tác, bảo vệ thực vật ñã góp phần rất quan

trọng giúp cho sản xuất bông hàng hoá trong nước có những bước ñột phá Hiện tại, diện tích sản xuất bông của Việt Nam hàng năm dao ñộng từ 25 -

30 nghìn ha, tăng gần 2 lần so với thời ñiểm 1997 Các giống mới ñã có vai trò quan trọng trong việc ổn ñịnh sản xuất, tăng năng suất và sản lượng bông ñồng thời cải thiện ñáng kể về mặt chất lượng xơ sợi (Viện nghiên cứu và Phát triển cây bông năm 2004, 2005) [28], [29]

Kết quả nghiên cứu và chọn tạo giống bông trong những năm gần ñây ñã xác ñịnh ñược nhiều giống bông lai có triển vọng, kết hợp ñược nhiều ñặc tính quan trọng như có khả năng cho năng suất cao, kháng ñược một số loài sâu bệnh ñồng thời cho chất lượng xơ bông tốt Trong ñó nổi

bật nhất là các giống bông lai mới VN04-3, VN04-4 và VN04-5 (ñang tiến

hành so sánh và s ản xuất thử nghiệm tại các vùng bông chính từ năm

2003) Kết quả khảo nghiệm và sản xuất thử trong năm 2003 ñã ñược ñánh

giá cao tại Hội ñồng Khoa học Công ty bông Việt Nam (tại thành phố Hồ

Chí Minh, 8/2004), do ñó các giống bông lai mới này ñược kiến nghị nhân nhanh giống ñưa vào sản xuất thử nghiệm trên diện rộng làm cơ sở cho việc phóng thích giống mới ñưa vào phục vụ sản xuất (Viện nghiên cứu và Phát triển cây bông năm 2004) [28]

Hiện nay, việc sản xuất hạt giống bông lai ở nước ta cũng giống như Trung Quốc nhưng giá thành thấp hơn, giá 1kg hạt giống bông lai thương mại trong nước hiện nay khoảng 8,2 USD rẻ hơn Trung Quốc 1,6 USD Mặt khác, chi phí hạt giống cho sản xuất bông ở Việt Nam hiện nay khoảng 40,9 USD/ha (thấp hơn Trung Quốc từ 10-20 USD/ha) Bên cạnh ñó, việc

sử dụng các giống bông lai trong sản xuất ở Việt Nam trong những năm qua ñã chứng tỏ những ñặc ñiểm ưu việt của nó so với các giống bông thuần như ưu thế lai về năng suất cao hơn 20-30 %; khả năng kháng sâu bệnh cải thiện ñáng kể, qua ñó giảm chi phí phòng trừ sâu bệnh giảm 1/3

lần; các ñặc tính về chất lượng xơ ñược cải thiện rất nhiều ñáp ứng yêu cầu

về phẩm chất xơ sợi cho công nghiệp Dệt trong nước Do ñó, việc sản xuất

và sử dụng hạt giống bông lai trong nước là một yêu cầu không thể thiếu, hợp lý và có cơ sở

Tuy nhiên, chọn tạo giống bông lai ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp lai truyền thống mất nhiều thời gian, công lao ñộng và hiệu quả chưa cao Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và việc chọn giống bằng marker phân tử nói riêng ñã mang lại hiệu quả lớn trong công tác chọn giống cây trồng Chính vì thế, với ñiều kiện hiện nay việc nghiên cứu sử dụng kết hợp phương pháp chọn giống theo phương pháp truyền thống và chỉ thị phân tử là yêu cầu cấp thiết của các nhà chọn giống

2.3 Chọn giống ưu thế lai

2.3.1 Lai giống và nguyên tắc chọn cặp bố mẹ

Lai giống là sự giao phối giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có tính di truyền khác nhau ñể tạo ra biến dị tổ hợp Các dạng thực vật do sự giao phối

tự nhiên hoặc nhân tạo ñã kết hợp ñược những tính trạng di truyền của bố mẹ

và tạo ra các cây (con) lai

Lai giống là phương pháp cơ bản ñể tạo ra biến dị tổ hợp phục vụ cho chọn lọc Thông qua quá trình lai giống mà có thể phối hợp ñược các ñặc tính và tính trạng có lợi của các dạng bố mẹ vào con lai Tuy nhiên, bố

mẹ truyền cho con cái bộ gen của chúng và kết quả của quá trình tái tổ hợp

mà nhiều kiểu gen mới ñã ñược tạo ra, sau khi tương tác với môi trường ñã tạo ra các kiểu hình mới rất có ích cho chọn giống (Nguyễn Văn Hiển, 2000) [9]

Thành tựu của chọn giống là chọn lọc ựược kiểu gen mong muốn vì thế kết quả của phương pháp lai là ựiều quyết ựịnh Chọn ựược bố mẹ ựể thoả mãn các yêu cầu ựặt ra là cơ sở ựể tạo ra các biến dị tổ hợp mong muốn Dựa vào kinh nghiệm và thành tựu của các nhà chọn giống thế giới, trên cơ sở di truyền học người ta ựã ựưa ra các nguyên tắc cơ bản ựể chọn cặp bố mẹ khi lai như nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái ựịa lý, các yếu tố cấu thành năng suất, thời gian các giai ựoạn sinh trưởng, tắnh chống chịu và các tắnh trạng bổ sung ựặc biệt

2.3.1.1 Nguyên t ắc khác nhau về kiểu sinh thái ựịa lý

Kiểu hình của một dạng thực vật là kết quả tương tác giữa kiểu gen và môi trường Các giống và dạng thực vật trong quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo ựược hình thành thắch nghi với một ựiều kiện ựất ựai, khắ hậu nhất ựịnh

Thực chất của nguyên tắc chọn cặp bố mẹ theo loại hình sinh thái ựịa

lý là liên kết các tắnh trạng và ựặc tắnh của các dạng hoặc giống xa về ựịa

lý, sinh thái vào một giống mới Các dạng lai xa nhau về ựịa lý là sự tổ hợp các gen khác nhau của bố mẹ Sự khác biệt về mặt di truyền ựược biểu hiện

ra bên ngoài bằng các tắnh trạng và ựặc tắnh như chịu hạn, chịu úng, chịu chua, chịu rét, thời gian sinh trưởng ngắn, dài Việc chọn bố mẹ xa nhau

về ựịa lý nhằm tổ hợp ựược các gen kiểm tra tắnh trạng khác nhau Do ựó kết quả của lai giống sẽ chắc chắn hơn và vật liệu cung cấp cho quá trình chọn lọc sẽ phong phú hơn, xác suất chọn ựược giống tốt phù hợp với ựiều kiện sinh thái ựịa phương cao hơn

Ở Việt Nam, bằng nguyên tắc này các nhà chọn giống ựã tạo ra ựược nhiều giống có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao như giống lúa NN1 do Bác

sĩ Lương đình Của tạo ra bằng lai giữa giống Ba Thắc của Nam Bộ và Bunco

của Nhật Bản, Giống VN10 do Trần Như Nguyện lai tạo giữa hai dạng xa nhau về ựịa lý (A5 là dòng ựột biến có nguồn gốc đông Nam Á và Rumani 45

có nguồn gốc Châu Âu ôn ựới) có khả năng chịu rét tốt, trồng vụ xuân cho năng suất cao và ổn ựịnh (Nguyễn Văn Hiển, 2000) [9]

2.3.1.2 Nguyên t ắc khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất

Khi chọn bố mẹ nhằm nâng cao năng suất ở các thế hệ lai thì bố và mẹ phải có sự khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất Sự khác nhau này cần

có khả năng bổ sung lẫn nhau, phối hợp với nhau ựể tạo ra một giống mới hoàn chỉnh hơn

Các yếu tố cấu thành năng suất là các tắnh trạng số lượng Các tắnh trạng này hầu hết do hệ thống ựa gen quyết ựịnh Cụ thể, khi xét năng suất của một cây trồng thì năng suất trên một ựơn vị diện tắch do năng suất từng

cá thể và số cá thể trên ựơn vị diện tắch ựó quyết ựịnh Năng suất cá thể cao

và trồng ựược nhiều cá thể trên ựơn vị diện tắch là mục tiêu phấn ựấu của nhà chọn giống Năng suất cá thể ựược tạo nên bởi các yếu tố cấu thành năng suất Vắ dụ, ở nhóm cây ngủ cốc là số lượng bông, số hạt trên bông, khối lượng 1000 hạt

2.3.1.3 Nguyên t ắc khác nhau về thời gian các giai ựoạn sinh trưởng

Tùy thuộc vào mục ựắch của nhà chọn giống và nhu cầu của sản xuất

mà phải tạo ra các giống có thời gian sinh trưởng khác nhau từ ngắn, trung bình ựến dài đặc biệt ựể tăng vụ tránh các ựiều kiện thời tiết bất lợi gây thiệt hại cho sản xuất cần có các giống có thời gian sinh trưởng từ ngắn ựến cực ngắn, song năng suất và chất lượng phải ựảm bảo yêu cầu

để phát huy tối ựa tự do tổ hợp của các kiểu gen quyết ựịnh các pha sinh trưởng của cây trồng nhằm tạo ra giống mới có thời gian sinh trưởng như

ý muốn thì bố và mẹ dùng trong các phép lai cần có cấu trúc thời gian các giai

ñoạn sinh trưởng khác nhau Vì vậy, khi nghiên cứu nguồn vật liệu khởi ñầu của nguồn gen cần có các quan sát tỉ mỉ về thời gian hoàn thành các giai ñoạn sinh trưởng

2.3.1.4 Nguyên t ắc khác nhau về tính chống chịu sâu bệnh

Cây trồng vốn có tính chống chịu sâu bệnh nhờ thừa hưởng tính di truyền của tổ tiên chúng Tính chống chịu này dần yếu ñi do có sự bảo vệ của con người trong quá trình canh tác Việc chọn tạo ra các giống vừa có năng suất cao vừa chống chịu tốt với các loài sâu bệnh gây hại là mục tiêu của bất

kỳ chương trình chọn giống nào

Mặt khác ở mỗi vùng sinh thái ñặc thù có các nòi sâu bệnh khác nhau Vì thế một giống hoàn toàn kháng bệnh ở vùng này nhưng khi chuyển sang vùng khác lại bị nhiễm bệnh Một giống cây trồng có khả năng thích ứng rộng cần có phổ kháng sâu bệnh rộng, cùng lúc có thể chống ñược nhiều nòi sinh lý khác nhau Vì vậy, khi chọn các dạng bố mẹ cần chú

ý sự khác nhau về tính kháng bệnh ngang ñể tổ hợp ñược một phổ kháng sâu bệnh rộng vào giống lai

Ví dụ CR203 là giống chống rầy với cả 3 biotyp nên ñược trồng ở rất nhiều vùng khác nhau từ vĩ tuyến 17 trở ra, giống IRI 352 kháng ñạo ôn tổng hợp Các giống lúa này ñều ñược tạo ra nhờ phép lai các dạng bố mẹ có tính kháng rầy và kháng ñạo ôn khác nhau (Nguyễn Văn Hiển, 2000) [9]

2.3.1.5 Nguyên t ắc bổ sung các tính trạng cần thiết

Giống cây trồng là sản phẩm của toàn thể loài người Một giống cây trồng tốt sẽ ñược con người nhân rộng ra nhiều vùng ñịa lý khác nhau Nhập nội giống cây trông có các tính trạng tốt là phương pháp nhanh ñể ñưa giống vào sản xuất Tuy nhiên, các giống cây trồng mới tạo ra khi di chuyển từ vùng sinh thái này sang vùng sinh thái khác tỏ ra còn khiếm khuyết hoặc thiếu một

số tính trạng quan trọng nào ñó như kém chịu rét, chống ñổ không tốt, chất lượng không cao Do vậy, các giống mới ñược tạo ra bằng các phương pháp hiện ñại ñều là các kiểu gen tốt, chúng chỉ còn thiếu một số tính trạng mà nếu ñược bổ sung sẽ thành một giống hoàn chỉnh

2.3.2 Xác ñịnh mức ñộ biểu hiện ưu thế lai

- Ưu thế lai giả ñịnh (heterosis): con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính

trạng nghiên cứu so với số ño trung bình của bố mẹ trên cùng tính trạng

F1 - 0,5 * (P1 + P2)

Hm (%) =

0,5 * (P1 + P2)

* 100

Trong ñó: Hm: Ưu thế lai giả ñịnh hay ưu thế lai trung bình

F1: Số ño trung bình của tính trạng ở con lai F1

P1: Số ño trung bình của tính trạng ở P1

P2: Số ño trung bình của tính trạng ở P2

- Ưu thế lai thực (heterobeltiosis): Con lai biểu hiện sự hơn hẳn tính trạng nghiên cứu so với bố mẹ có số ño cao nhất

F1 - Pb

Hb (%) =

Pb

* 100

Trong ñó: Hb: Ưu thế lai thực

F1: Số ño của tính trạng ở con lai F1

Pb: Số ño tính trạng ở bố hoặc mẹ cao nhất

- Ưu thế lai chuẩn (standard heterosis): Con lai biểu hiện sự hơn hẳn trên tính trạng nghiên cứu so với một giống ñang phổ biến rộng trong vùng

F1 - S

Hs =

S

* 100

Trong ñó: Hs: Ưu thế lai chuẩn

F1: Số ño của tính trạng ở con lai F1

S: Số ño tính trạng ở giống chuẩn

2.4 Một số ñặc ñiểm chính của giống bông lai F 1

Giống lai F1 là giống ñược tạo ra do giao phối giữa hai giống bố mẹ, mang ñược nhiều ñặc tính tốt của bố mẹ Ở ñời thứ nhất, con lai ñược tạo

ra có ưu thế về sinh trưởng, phát dục, tính chống chịu và kết quả giống F1

có năng suất cao hơn bố (mẹ) cho năng suất cao nhất, phẩm chất tương ñương hoặc cao hơn bố mẹ

Thông thường các con lai cùng loài H x H có thể cho năng suất tăng từ

30 - 60%, thậm chí tăng gấp 2 - 3 lần bông thường Ở Ấn ðộ, bình quân năng suất bông lai trên toàn quốc gấp 1,5 - 1,6 lần bông thường

Nhìn chung các giống ưu thế lai F1 có xu hướng làm tăng chiều dài xơ (khoảng 9%), tăng ñộ bền xơ (6 - 7%), chống chịu tốt, sinh trưởng mạnh, các tính trạng khác giữ nguyên hoặc có phần cải tiến

Trong giai ñoạn ñầu cây mọc nhanh, ñều, khỏe Giai ñoạn trước khi nở hoa cây to khỏe, nhiều cành lá, lá dày Với mật ñộ thưa 20 - 25 ngàn cây/ha cây phát triển cân ñối, bón nhiều phân nhưng không bị lốp, duy trì bộ lá lâu

Ưu ñiểm này ñã làm cho giống F1 có năng suất rất cao, có cơ hội ñể thâm canh tăng hiệu quả trồng trọt (Phan Thanh Kiếm, 1998) [11]

2.5 đa dạng di truyền và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

2.5.1 đa dạng di truyền và khái niệm về chỉ thị di truyền

2.5.1.1 đa dạng di truyền

đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức ựộ gen Các gen ựa hình là nguyên nhân dẫn ựến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thắch nghi hơn quần thể khác khi chịu những thay ựổi của môi trường

đa dạng di truyền là cơ sở ựể tạo nên ưu thế lai Trong một chừng mực nhất ựịnh, nếu tắnh ựa dạng di truyền giữa các bố mẹ càng lớn thì ưu thế lai càng cao

Nghiên cứu ựa dạng di truyền có ý nghĩa rất lớn trong chọn giống đó

là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì ựược nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thắch nghi với những thay ựổi của ựiều kiện ngoại cảnh (La Tuấn Nghĩa, 2004) [13]

Các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống luôn quan tâm ựến chỉ thị

di truyền vì tắnh ưu việt của nó trong việc nghiên cứu sự kế thừa dấu hiệu di truyền và những biến ựổi của chúng trong quần thể, ựặc biệt là các tắnh trạng nông sinh học có lợi cho con người Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự

sai khác về mặt thông tin di truyền giữa hai hay nhiều cá thể Sự sai khác này

có thể ñược phát hiện bằng các chỉ thị như: chỉ thị sinh hóa, chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử… Những chỉ thị này từ lâu ñã là những công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống

Chỉ thị sinh hóa là loại chỉ thị có bản chất là ña hình protein gồm isozyme và các loại protein dự trữ Những chỉ thị sinh hóa chỉ thể hiện ở những giai ñoạn nhất ñịnh của quá trình phát triển cá thể tùy vào cơ chế phức tạp của sự ñóng mở gen Cơ chế này ñược ñiều chỉnh bởi vật chất di truyền là ADN Một protein có mặt trong cơ thể sinh vật dù ở giai ñoạn nào của phát triển cá thể thì cũng chỉ là sản phẩm của gen thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN – ARN – Protein Tuy nhiên, do có số lượng không nhiều và phụ thuộc vào các giai ñoạn phát triển của cá thể nên chỉ thị sinh hóa hạn chế

Chỉ thị phân tử AND là những chỉ thị có bản chất ña hình AND, nó có thể là một ñoạn gen hoặc một ñoạn ADN có vị trí xác ñịnh trên nhiễm sắc thể (NST) di truyền theo quy luật Menden

Trong những năm gần ñây, các chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu hệ gen của nhiều loại cây trồng Các nhà khoa học ñã thiết lập ñược bản ñồ chi tiết về các chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng

Trên cơ sở ñó tiến hành chọn lọc gián tiếp trên các chỉ thị này, ñây ñược gọi

là phương pháp chọn lọc dựa vào chỉ thị AND – Marker Assisted Selection

(MAS) (Phan Hữu Tôn, 2004) [18]

2.5.2 Một số chỉ thị ứng dụng trong nghiên cứu ña dạng di truyền thực vật

2.5.2.1 Ch ỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) – ða

hình ñộ dài các ñoạn cắt hạn chế

RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai acid nucleic dựa trên

sự phân cắt ADN bằng các enzyme giới hạn (Restriction enzymes) và kỹ thuật

lai ADN với mẫu dò Kỹ thuật này tạo nên các ñoạn cắt khác nhau ñược phân biệt bằng ñiện di ñồ, các ñoạn cắt ñược gọi là “dấu vân tay” ñặc trưng cho từng phân tử ADN Ở thực vật, chỉ thị này lần ñầu tiên ñược áp dụng trong nghiên cứu gen tổng hợp ARN ribosome trong vùng cấu trúc nhân của lúa

mỳ Từ ñó chỉ thị này ñược ứng dụng ñể lập bản ñồ di truyền trên một số ñối tượng khác như cà chua, ngô, lúa (Leister và cs, 1999) [51]

Chỉ thị RFLP là chỉ thị ñồng trội, có khả năng biểu hiện trong tất cả các alen của cùng một locus gen Vì thế, có thể phân biệt các cá thể ñồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa), ñây là ñặc ñiểm ưu việt của chỉ thị RFLP Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP vẫn còn nhiều hạn chế do lượng mẫu lớn, kỹ thuật phức tạp, thời gian kéo dài và ñầu tư trang thiết bị

kỹ thuật lớn

2.5.2.2 Ch ỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphims) – ða hình

ñộ dài các ñoạn nhân chọn lọc

Chỉ thị AFLP là sự khuếch ñại có chọn lọc các ñoạn ADN ñược cắt bởi enzyme giới hạn AFLP phát hiện ña hình thong qua sự khác nhau về ñộ dài

của các ñoạn ADN ñược nhân lên Kỹ thuật này linh hoạt, có thể phát hiện ñược sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào

Kỹ thuật này có nhiều ưu ñiểm như cho ñộ ña hình cao, lượng ADN tổng số tiêu tốn rất ít, dễ dàng lặp lại và có thể phân tích ADN ở bất kỳ nguồn gốc hay mức ñộ phức tạp nào Tuy nhiên chỉ thị này không có khả năng phân biệt giữa thể ñồng hợp tử và dị hợp tử, kỹ thuật phức tạp và ñòi hỏi ñầu tư trang thiết bị lớn

2.5.2.3 Ch ỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphims) – ða hình các ñoạn ADN nhân ngẫu nhiên

Chỉ thị RAPD là kỹ thuật ñược dựa trên cơ sở PCR với các ñoạn mồi ñơn có trình tự ngẫu nhiên (10 nucleotid) Sự nhân ADN chỉ xảy ra khi vị trí mồi ở hai ñiểm có sự ñịnh hướng ngược nhau trong khoảng tối ña 2000 base dọc theo nhiễm sắc thể Do mồi ngắn nên phản ứng RAPD sẽ tạo ra nhiều ñoạn ADN có kích thước và trình tự khác nhau

Kỹ thuật RAPD có nhiều ưu ñiểm như phát hiện ña hình ñáng tin cậy, phương pháp tiến hành ñơn giản, dễ sử dụng, thời gian ngắn, giá thành thấp,

sử dụng lượng ADN khuôn ít, không cần trang thiết bị phức tạp Nhưng chỉ thị này không phân biệt ñược thể dị hợp tử, ñộ nhạy của RAPD phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện của phản ứng (thành phần phản ứng, nhiệt ñộ gắn mồi ), không chắc chắn các ñoạn có cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen và ñôi khi không lặp lại ñược, ñặc biệt là những cơ thể có bộ gen lớn như lúa mỳ (Devos K M và

cs, 1992) [37]

2.5.2.4 SSR (Simple Sequence Repeats) – ða hình các lặp lại ñơn giản

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thụât khuếch ñại các ñoạn lặp lại ñơn giản còn ñược gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsattellite)

Các đoạn lặp lại gồm từ 2 đến 6 cặp nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen ðoạn SSR điển hình là đoạn trình tự gồm 2 - 3 cặp nucleotit, lặp lại từ 9 - 30 lần Các đoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT Các đoạn lặp lại cĩ kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng lồi, từng giống cây trồng và vật nuơi

Ngay trong một genome cũng cĩ mức độ lặp lại ở các nhiễm sắc thể khác nhau Ở các động vật cĩ vú, một đoạn trình tự lặp lại một vài lần chiếm

>50%, cịn đoạn lặp lại hàng trăm nghìn lần chỉ chiếm khoảng 20 - 25% Các đoạn SSR thường ở vùng gần tâm động hoặc đầu mút của NST và cĩ vai trị điều hồ hoạt động của gen

Kỹ thuật SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuơi khác nhau trong cùng một lồi động vật hay thực vật Ngày nay sử dụng kỹ thuật SSR để xây dựng bản đồ liên kết, phân lập (gen), xác định quan hệ di truyền giữa các dịng, giống cây trồng, vật nuơi và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (C J Bell,

1994 và D Tautz, 1984) [30], [70]

2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

Trước đây, việc ứng dụng các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nơng học quan trọng đã được nhiều nhà chọn giống quan tâm và sử dụng, nĩ được xem như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Tuy nhiên, việc ứng dụng cịn gặp nhiều hạn chế Vì thế chỉ thị phân tử ra đời đã trở thành cơng cụ đắc lực hổ trợ phương pháp truyền thống, giải phĩng cho các nhà chọn giống một lượng lớn cơng việc khi phải tiến hành chọn lọc Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:

1 Chỉ thị phân tử có thể xác ñịnh kiểu gen của các locus tại bất kỳ giai ñoạn nào và bất cứ mức ñộ nào (tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể)

2 Số lượng các chỉ thị AND là rất lớn, trong khi ñó số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

3 Các alen khác nhau thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc ñánh giá các chỉ thị hình thái thường hay ñi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

4 Các alen của các chỉ thị phần lớn là ñồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào Các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội – lặn, do ñó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

5 ðối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc ñánh giá các cá thể trong quần thể phân ly Trong khi ñó, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp

Ngày nay, phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử là một phương pháp hữu hiệu trợ giúp ñắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà chọn giống truyền thống không hoặc rất khó giải quyết Ngoài ra, phương pháp này còn giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra

Gần ñây, các nhà khoa học ñã phân tích cặn kẽ một số mô hinh MAS Theo ñó, chỉ cần trải qua 3 - 4 thế hệ chứ không phải 6 – 8 thế hệ (ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế) là có thể ñạt ñược mục tiêu của mình (Frey và cs, 2004) [38]

2.5.3.1 M ột số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Những nghiên cứu gần ñây sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu ña dạng di truyền của nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, lúa mỳ, cà chua, khoai tây, ñậu tương ñã mang lại nhiều thành công lớn cho các nhà chọn giống Các nhà khoa học Trung Quốc ñã sử dụng 28 cặp mồi SSR phân tích 90 giống ñậu ñũa, kết quả ñã nhân ñược 128 allen với mức tương ñồng di truyền trung bình

là 44%

Zhao yong, 2002 [76] phân tích ña dạng di truyền của 23 giống lúa từ

5 quốc gia khác nhau trên thế giới với 16 cặp mồi SSR Kết quả thu ñược số alen trên locus dao ñộng từ 2 ñến 10 (trung bình 5,2) Tương ñồng di truyền của 23 giống lúa dao ñộng từ 0,13 ñến 0,64 Phân tích sơ ñồ hình cây cho thấy 23 giống nghiên cứu ñược phân thành 2 nhóm chính Qua ñó một lần nữa tác giả khẳng ñịnh rằng có thể sử dụng chỉ thị SSR ñể ñánh giá ña dạng

di truyền của các giống lúa ở các ñiều kiện sinh thái, ñịa lý khác nhau và mối quan hệ trong phả hệ

Theo Li Z C và cs, 2004 [53] nghiên cứu ña hình của 113 dòng/giống lúa vùng Yunnan ñã ñưa ra kết luận rằng, sự ña dạng của loài phụ Japonica cao hơn Indica Trước ñó, Song Z P và cs, 2003 [68] ñã sử dụng 23 cặp mồi SSR phân tích ña hình của 232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (03 quần thể từ

Jiangxi và 03 quần thể từ Hunan – Trung Quốc) Kết quả thu được tổng số

115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi cĩ mức độ đa hình cao hơn ở Hunan

Yang Xiaquan và cs, 2005 [73] sử dụng 2 chỉ thị genomic-SSR và EST-SSR phân tích 3 lồi lúa mỳ lục bội gồm 28 common wheat (Triticum aestivum L.), 13 spelt (Triticum spelta L.) và 11 compactum (Triticum compactum Host.) Kết quả cho thấy đa hình di truyền của các giống common wheat cao nhất tiếp đến là spelt và compactum Khoảng cách di truyền giữa các quần thể cao hơn trong cùng quần thể và xu thế tương tự được khám phá cho các genome A, B và D Chính vì thế, spelt và compactum cĩ thể sử dụng làm tập đồn giống cho chọn giống lúa mỳ đặc biệt là tăng cường gen D Qua kết quả này một lần nữa nhĩm tác giả khẳng định rằng chỉ thị EST-SSR là chỉ thị lý tưởng để đánh giá đa dạng di truyền cũng như nghiên cứu nguồn gốc và

sự tiến hố cây lúa mỳ

ðối với cây ăn quả, sử dụng kết hợp kỹ thuật SSR và AFLP phân tích

đa dạng di truyền của tập đồn giống bưởi chùm cho thấy gần 99,1% của 335 SSR loci, 72% của 343 AFLP loci là đa hình và 9,85 alen/SSR locus được phát hiện Giá trị đa dạng di truyền thay đổi từ 0,19 đến 0,91 Tỷ lệ dị hợp tử dao động từ 0,13 đến 0,28 Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy tập đồn giống bưởi chùm phân thành 8 nhĩm, gồm một số nhĩm chính như nhĩm bưởi Shatain, Wendan và các giống lai Kết quả phân loại cho phép mở rộng các giống bưởi này làm genotyp nền để sử dụng cho mục tiêu chọn giống (Liu Yong và cs, 2005) [56]

* Ở Việt Nam

Trong nghiên cứu chọn giống cây trồng, việc xác định cấu trúc di truyền, đánh giá đa hình và phân nhĩm di truyền của quần thể bố mẹ là việc

làm cần thiết và cĩ ý nghĩa Ứng dụng chỉ thị phân tử vào cơng tác chọn tạo giống cây trồng là một hướng đi mới tại Việt Nam Song song với các phương pháp chọn tạo giống truyền thống thì đây được coi là một cơng cụ hữu ích làm tăng hiệu quả và gĩp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống Tuy nhiên, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học nĩi chung và chỉ thị phân tử nĩi riêng trong chọn giống cây trồng ở Việt Nam cịn nhiều hạn chế, phần lớn các kết quả đạt được chỉ ở mức độ phịng thí nghiệm

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 dịng/giống lúa bố mẹ và con lai F1 trong sản xuất lúa lai hai dịng bằng chỉ thị phân tử, Nguyễn Văn ðồng và cs, 1999 [7] đã dùng 15 cặp mồi SSR nghiên cứu đa hình Kết quả thu được cho thấy, mức độ đa hình giữa chúng rất lớn, dao động từ 0,06 – 1,00 Trên cơ sở đĩ tác giả đã lựa chọn và đưa ra tổ hợp lai và TGMS-VN1 x D24 dự đốn cho ưu thế lai cao với khoảng cách di truyền 0,67 – 0,90

Bùi Mạnh Cường và cs, 2003 [23] đã sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá

29 dịng ngơ thuần với 60 mồi ngẫu nhiên Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền biến động từ 0,47 - 0,77 chứng tỏ giữa các vật liệu nghiên cứu cĩ sự đa hình rất lớn Phân nhĩm ưu thế lai (ƯTL) theo phương pháp PCO (Principal coodinate analysis - Gower, 1966) xác định hai nhĩm chính, tồn tại tương quan tuyến tính dương với r = 0,61 - 0,67 giữa năng suất và GD bố mẹ, xác định được 03 tổ hợp lai cĩ năng suất cao hơn bố mẹ từ 9 - 14% Tương tự, Bùi Văn Thắng và cs, 2003 [23] sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 33 giống lạc chống chịu bệnh

gỉ sắt, thu được 109 phân đoạn ADN, trong đĩ cĩ 66 phân đoạn đa hình (chiếm 60,6%) cho thấy cĩ sự khác biệt di truyền từ 4 - 18% Phân nhĩm theo

GD cho thấy các giống cĩ cùng vùng địa lý, sinh thái ở cùng nhĩm; cĩ thể chọn làm các bố mẹ phụ vụ cho cơng tác lai tạo giống

Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 35 giống lạc cĩ phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn Lê Thị Muội và cs,

2005 [12] đã sử dụng 20 cặp mồi SSR để đánh giá Kết quả cho thấy, cĩ 19 cặp mồi cho đa hình, hệ số sai khác di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12 – 49% Kết quả đã ghi nhận các giống lạc cĩ cùng nguồn gốc hoặc cùng mức độ kháng bệnh đều được xếp vào một nhĩm nhỏ

Ngồi ra, sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 dịng/giống lúa cĩ nguồn gốc khác nhau đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49 - 0,96 Qua kết quả nghiên cứu đã phân loại các giống lúa thành các nhĩm cĩ khoảng cách di truyền khác nhau, đĩ là cơ sở để chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai (Võ Thị Minh Tuyền, 2007) [21]

Trong những năm gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tính trạng kháng sâu bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trường, các tính trạng chất lượng…

Lưu Ngọc Huyền, 2005 [8] sử dụng 50 cặp mồi SSR xác định tính kháng rầy nâu ở một số dịng/giống lúa Kết quả đã xác định được 15 chỉ thị SSR nằm ở NST số 4 của hệ gen lúa và sử dụng làm chỉ thị trợ giúp để chọn lọc các cá thể mang gen kháng rầy nâu Trong khi đĩ, Trương Bá Thảo và cs,

2005 [17] phân tích đa dạng di truyền về tính trạng protein của 50 giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau Các SSR marker cĩ mức độ đa hình tốt là RM335, RM272, RM180, RM183 Marker RM234 liên kết với gen điều khiển tính trạng hàm lượng protein (GPC) trong gạo được xác định trên NST số 7 Sự liên kết marker RM234 với gen điều khiển GPC cao biểu hiện độ chính xác 93,3% QTL điều khiển tính trạng này

2.5.3.2 M ột số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bông vải

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bông ñã ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu

Theo Liu và cs, 2000 [54] sử dụng 65 cặp mồi ñể khuếch ñại 70 locus trong genome (nhiễm sắc thể) của các loài bông Kết quả nghiên cứu chỉ thị SSR ñược xác ñịnh trong nghiên cứu này ñã cung cấp những số liệu có mức

ñộ tin cậy cao là cơ sở cho các nghiên cứu khác Hơn nữa, có thể sử dụng kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị khác ñể lập bản ñồ liên kết của genome bông Thật vậy, gần ñây bản ñồ liên kết ñã ñược tạo ra với sự kết hợp sản phẩm của

199 RAPD và SSR trong chọn lọc giống bông (Ulloa và cs, 2000) [72]

Một số nghiên cứu gần ñây khi sử dụng các chỉ thị như RAPD, AFLP

và SSR cho thấy mức ñộ ña hình của các loài bông trồng tương ñối thấp, có thể

từ 1 - 3% (Wendel và cs, 1992; Tatineni và cs, 1996; Pilley và Myers, 1999; Lu

và Myers, 2002) [75], [69], [63], [57] và 1 - 8% (Multani và Lyon, 1995) [59] Một số kết quả ở Úc, Trung Quốc và Pakistan cũng có kết quả tương tự (Zuo

và cs, 2000; Rahman và cs, 2002) [77], [64] Tuy nhiên, một số kết quả khác cho thấy mức ñộ ña hình của các giống bông khá cao M K Rana và K V Bhat, 2005 [66] nghiên cứu 59 giống bông thuộc 4 loài bông trồng cho thấy, ña hình giữa 59 giống bông ñạt 36% Trong ñó, mức ñộ tương ñồng di truyền

trung bình của 41 giống bông luồi (Gossypium hirsutum L.) ñạt 74%, ñồng thời

qua nghiên cứu các tác giả ñã khẳng ñịnh rằng ña hình giữa các loài bông nhị bội cao hơn các loài bông tứ bội

Trước ñó, Rahman và cs, 2002 [64] nghiên cứu ña hình của 27 giống bông cho mức tương ñồng di truyền là 66,2% Sử dụng ñồng thời chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Tatineni và cs, 1996 [69] ñã ñánh giá quan hệ di truyền

của 16 giống bông nhập nội, khẳng ñịnh tương quan tuyến tính dương

(r=0,63) giữa khoảng cách di truyền theo chỉ thị RAPD và khoảng cách phân

loại theo chỉ thị hình thái Trong khi ñó, Ivan Schuster và cs, 2006 [48] sử dụng microsatellites nghiên cứu quan hệ di truyền của 53 giống bông, cho kết quả tương quan tuyến tính trung bình ñạt 0,40 ± 0,01 Một số nghiên cứu khác, Iqbal và cs, 1997 [47] xác ñịnh tỷ lệ ña hình 89,1% trong 22 giống bông luồi; trong ñó, 17 giống phân vào cùng nhóm có tỷ lệ ñồng dạng di truyền 81,5 - 93,4%; chỉ có riêng giống nhị bội mức tương ñồng thấp (55,7%) so với

các giống tứ bội ðối với hai loài bông cỏ châu Phi (G herbaceum) và bông

cỏ châu Á (G arboreum), mức ñộ tương ñồng ñạt 72% ñược ghi nhận trong

một nghiên cứu khác (Rana và cs., 2002) [65]

Trong những năm gần ñây, chỉ thị SSR ñược sử dụng khá phổ biến ñể ñánh giá ña hình và lập bản ñồ gen Jinfa Zhang và cs, 2005 [50] ñã sử dụng

88 cặp mồi SSR nghiên cứu ña hình của 24 giống có nguồn gốc khác nhau

ñã thu ñược 177 allen với tương ñồng di truyền dao ñộng từ 0,69 ñến 0,94 (trung bình 0,77)

Ngày nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã sử dụng kết hợp nhiều chỉ thị phân tử ñể nghiên cứu, ñánh giá ña hình bông Nhóm tác giả Ebtissam

H A Hussein và cs, 2007) [46] ñã sử dụng chỉ thị RAPD, SSR, EST, AFLP ñồng thời kết hợp giữa các chỉ thị hình thái ñể ñánh giá 11 giống bông (Luồi

và Hải ñảo) Kết quả cho thấy, mức ñộ tương ñồng di truyền tương ñối cao và dao ñộng tương ứng là 63,8 - 95,9%, 13,8 - 98,1%, 70,4 - 98,5%, 13,7 - 99,3% và 78,2 - 98,0%; 11 giống bông ñược phân thành 2 nhóm chính (1 nhóm có 8 giống gồm cả bông Luồi và Hải ñảo, nhóm còn lại gồm 3 giống bông Luồi) Tương tự, Hussein và cs, 2002 [44] sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, SSR, ISSR, AFLP phân tích 13 giống bông ñã chứng minh rằng giống bông Luồi (Hindi) ñược tách ra từ các giống bông Hải ñảo ở Ai Cập Trong

khi ñó, Samina N Qureshi và cs, 2004 [67] sử dụng chỉ thị EST-SSR nghiên cứu ña hình giữa các loài bông cho thấy ña hình giữa các giống cùng loài

bông luồi (Gossypium hirsutum L.) là 26%, giữa loài bông Luồi và bông Hải

ñảo (Gossypium barbadense L.) là 52%

Kế thừa những kết quả trên, Wang và cộng sự, 2004 [74] ñánh giá ña hình của 50 giống bông trồng dựa vào chỉ thị EST-SSR, tương quan tuyến tính giữa các giống từ 0,11 ñến 0,83 (trung bình 0,47); các giống ñược phân thành hai nhóm chính và hầu hết ñều phù hợp với phả hệ của các giống bông (nguồn gốc các giống bông) ðiều ñó ñã chứng minh rằng, chỉ thị EST-SSR là công cụ hữu hiệu ñể phân tích, ñánh giá ña hình bông

Sử dụng ñồng thời các chỉ thị RAPD, ISSR, SSR Hussein và cs, 2006 [45] ñã ñánh giá 21 giống bông Luồi cho kết quả về tương ñồng di truyền tương ứng là 72,1 - 95,7%; 79,1 - 95,0% và 72,1 - 96,6% Trước ñó, các nhà khoa học Trung Quốc ñã nghiên cứu tương quan di truyền của 36 giống bông sử dụng các chỉ thị SSR, ISSR và RAPD thu ñược mức tương ñồng di truyền của các giống nghiên cứu dao ñộng từ 57,5 - 92,9% Tác giả ñã phân tích sơ ñồ hình cây cho thấy, sử dụng chỉ thị RAPD cho kết quả thành hai nhóm chính, nhóm 1 gồm tất cả các giống thuộc loài bông Hải ñảo ngoại trừ

giống PEA (Pima Early American) Tuy nhiên, chỉ thị ISSR và SSR cho kết

quả là hai nhóm chính nhưng nhóm 1 gồm các giống bông Hải ñảo và nhóm

2 gồm các giống bông Luồi và giống PEA Mặc dù kết quả phân tích hình cây có những khác nhau giữa các chỉ thị nhưng phần lớn vẫn tương ñồng với nhau Nhóm tác giả cho rằng, những khác nhau ñó có thể là do ảnh hưởng của môi trường ñến các loài bông nghiên cứu hoặc do sự tiến hoá cơ học (Hussein và cs, 2002) [44]

Tóm l ại, sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ñang ñược

nghiên c ứu và ứng dụng rộng rãi Nhiều giống cây trồng mới với các tính

tr ạng khác nhau ñã ñược tạo ra, cơ bản ñáp ứng ñược phần nào nhu cầu của

s ản xuất ðối với cây bông, việc ứng dụng chỉ thị phân tử ñánh giá ña hình ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu trong những năm

g ần ñây và ñạt ñược một số kết quả ñáng tin cậy Các kết quả nghiên cứu ñều

cho th ấy có sự khác nhau về di truyền cây bông Nhưng phần lớn các nhà tác

gi ả ñều cho rằng tương ñồng di truyền giữa các giống bông Luồi tương ñối

cao, dao ñộng trong khoảng 0,70 ñến 0,93 và ña hình của loài bông nhị bội

cao h ơn loài bông tứ bội

Ở Việt Nam, việc chọn tạo giống bông ñã ñược nghiên cứu từ rất lâu nhưng chủ yếu dựa vào các ñặc ñiểm hình thái (di truyền số lượng) Việc ứng dụng công nghệ sinh học mới ñược quan tâm và bắt ñầu nghiên cứu trong những năm gần ñây theo các hướng như chuyển gen kháng sâu, kháng hạn cho bông, sử dụng các chỉ thị phân tử ñể kiểm tra, ñánh giá sự biểu hiện của gen Tuy nhiên, kết quả chỉ ở mức ñộ trong phòng thí nghiệm

Xuất phát từ thực tế ñó, ñể giải quyết những ñòi hỏi cấp bách về công tác chọn tạo giống bông, ngoài việc sử dụng các phương pháp chọn lọc truyền thống cần tăng cường kết hợp với việc ứng dụng các chỉ thị phân tử ñể nhanh chóng tạo ra các giống mới phù hợp với nhu cầu sản xuất

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Giống bông: gồm 20 bố mẹ có nguồn gốc khác nhau

TT MSTð Ký hiệu Tên giống Nguồn gốc Ghi chú

3.1.2 Mồi (primers) và các vật tư khác

- Sử dụng 15 cặp mồi ñược chọn lọc từ tổ hợp 50 cặp mồi SSR sử dụng ñể ñánh giá tính ña hình ADN (phụ lục 1)

- Các vật tư và dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm

3.2 Nội dung nghiên cứu

- đánh giá nguồn vật liệu khởi ựầu bằng chỉ thị hình thái

- đánh giá nguồn vật liệu khởi ựầu bằng chỉ thị phân tử

- Tạo các tổ hợp lai

- đánh giá, so sánh sơ bộ bố mẹ và con lai F1

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 đánh giá bố mẹ bằng các chỉ tiêu hình thái

Các bố mẹ ựược gieo trồng và theo dõi các chỉ tiêu theo quy trình chung của ngành bông

- Diện tắch ô thắ nghiệm: 6 m2/giống

- Diện tắch bảo vệ: 100 m2

- Tổng diện tắch thắ nghiệm: 500 m2

3.3.2 đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ bằng chỉ thị SSR

3.3.2.1 Chu ẩn bị mẫu, tách chiết DNA

- Chuẩn bị mẫu lá bông: mẫu lá của các dòng giống bông ựược thu từ những cây ựược treo biển ựánh dấu cho vào ống eppendorf 2 ml, sau ựó nhanh chóng cho vào nitơ lỏng Mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh

số và 0,5-1U Taq DNA polymerase

- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR-SSR (1) 950C trong 7 phút, (2)

940C trong 30 giây, (3) 50-600C trong 01 phút, (4) 720C trong 01 phút, (5) các bước từ 2 ựến 4 ựược lặp lại là 35 chu kỳ, (6) 720C trong 5 phút, (7) giữ lạnh ở 40C

- điện di sản phẩm PCR trên agarose 3% ở 100V trong 03 giờ Nhuộm gel trong Ethidium Bromide 0,5ộg/ml 15 phút và soi dưới ựèn UV, chụp ảnh

- Sử dụng chương trình NTSYS version 2.1 ựể phân tắch ựa dạng di truyền, dự ựoán các tổ hợp lai

3.3.3 đánh giá, so sánh sơ bộ bố mẹ và các tổ hợp lai

Bố trắ thắ nghiệm theo khối ựầy ựủ ngẫu nhiên (RCBD), 3 lần nhắc lại

- Kho ảng cách cây: 1,00 m x 0,25 m x 1 cây Mật ựộ: 4,0 vạn cây/ha

- K ỹ thuật canh tác và bảo vệ thực vật (theo quy trình chung của giống

bông lai)

+ Lượng phân bón (kg/ha): 120 N + 60 P2O5 + 60 K2O

+ Các biện pháp chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh theo quy trình trồng giống bông lai

+ Hạt giống ựược xử lý Gaucho trước khi gieo (5g/kg hạt)

3.4 Chỉ tiêu theo dõi

3.4.1 Theo dõi chỉ tiêu trong phòng

- Chất lượng và nồng ựộ ADN tổng số

- Số phân ựoạn ADN trên mỗi mồi và tổng số phân ựoạn

- Các hình ảnh của kết quả thắ nghiệm

3.4.2 Theo dõi chỉ tiêu ngoài ựồng (theo quy trình chung của ngành bông)

3.4.2.1 Th ời gian sinh trưởng (ngày): Theo dõi trên toàn bộ số cây/công

thức/lần nhắc

3.4.2.2 đặc ựiểm thực vật học

- Chiều cao cây (cm)

- Số cành ựực/cây, số cành quả/cây

- Vị trắ cành quả 1

Theo dõi trên 10 cây ựại diện/công thức/lần nhắc (trừ những cây ở ựầu hàng) đánh giá tại giai ựoạn có 50% số cây có quả ựầu tiên nở

3.4.2.3 N ăng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

- Khối lượng quả, khối lượng 100 hạt và tỷ lệ xơ

- Năng suất lý thuyết, năng suất thực thu

Theo dõi toàn bộ số cây/công thức/lần nhắc ựối với chỉ tiêu năng suất thực thu

3.4.2.4 Ch ất lượng xơ bông

Cách thu mẫu bông hạt ựể phân tắch: thu 30 quả/công thức/lần nhắc (thu quả ở vị trắ thứ 1-2 trên cành quả thứ 4-6; chọn quả nở ựều, xơ trắng, không bị dắnh mưa và bị sâu bệnh hại) và phân tắch trên máy HVI

3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Các chỉ tiêu về hình thái: xử lý bằng phần mềm Exel và MTASTC

- Phân tắch ADN tổng số trên gel agarose 1,0% và kết quả PCR trên gel agarose 3,0% Nhuộm gel bằng EtBr 0,5ộg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên ựèn UV, chụp ảnh và phân tắch kết quả

- Số liệu về sự xuất hiện của các băng ựiện di theo quy ước có xuất hiện băng (1) và không xuất hiện (0) sau ựó ựược xử lý trên phần mềm Exel và NTSYS pc version 2.1