Nghiên cứu một số thành phần hóa học và vi thể của hạt tophi gút trong mối liên quan với các chỉ số hóa sinh của bệnh nhân gút là người việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BÙI NGỌC QUANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ VI THỂ CỦA HẠT TOPHI-GÚT TRONG MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC CHỈ SỐ HÓA SINH CỦA BỆNH NHÂN GÚT LÀ NGƯỜI VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BÙI NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

VI THỂ CỦA HẠT TOPHI-GÚT TRONG MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC CHỈ SỐ HÓA SINH CỦA BỆNH NHÂN GÚT LÀ

NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

BÙI NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

VI THỂ CỦA HẠT TOPHI-GÚT TRONG MỐI LIÊN QUAN VỚI CÁC CHỈ SỐ HÓA SINH CỦA BỆNH NHÂN GÚT LÀ

NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LƯƠNG THỊ HỒNG VÂN

Thái Nguyên - 2013

Vì một lý do nào đó, hàm lượng purin trong cơ thể tăng và quá trình chuyển hóa chúng thành axit uric cũng tăng Khi cơ thể có lượng axit uric vượt quá mức bình thường hoặc sự thải axit này ra nước tiểu quá ít thì nồng độ axit uric trong máu tăng lên Sự chuyển hóa axit uric thành muối urat cũng tăng theo dẫn tới sự lắng đọng những tinh thể muối urat sắc nhọn hình kim tại các khớp, sụn, xương, tổ chức dưới da, gây ra viêm sưng khớp và tình trạng viêm nếu kéo dài sẽ làm lắng đọng ngày càng nhiều các tinh thể urat, kết quả tạo thành các hạt tophi [21].

Theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số thành phần hóa học trong hạt tophi có liên quan mật thiết đến cơ chế gây bệnh và mức độ biểu hiện của bệnh Gút Các thành phần hóa học này là một trong những căn cứ quan trọng giúp các nhà chuyên môn định hướng các biện pháp phòng bệnh và đưa ra phác

đồ điều trị hiệu quả Nghiên cứu thành phần của hạt tophi Gút đang là một hướng nghiên cứu mới tiềm năng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào phòng và điều trị bệnh Gút nâng cao sức khỏe cộng đồng [10]

Từ các lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số thành

phần hóa học và vi thể của hạt tophi-Gút trong mối liên quan với các chỉ số

hóa sinh của bệnh nhân Gút là người Việt Nam.”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Xác định được một số thành phần hoá học của hạt tophi-Gút

- Mô tả được cấu trúc vi thể của hạt tophi-Gút

- Tìm ra mối liên quan giữa thành phần hoá học của hạt tophi với các chỉ số hoá sinh của bệnh nhân Gút là người Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu hồ sơ bệnh án để lựa chọn các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn về lâm sàng, xét nghiệm… làm đối tượng nghiên cứu trong đề tài

- Xác định đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân Gút có các hạt tophi được chỉ định phẫu thuật cắt bỏ trong cùng một thời gian

- Thu thập đủ, đúng các mẫu nghiên cứu là các hạt tophi-Gút đã được phẫu thuật cắt bỏ từ các bệnh nhân Gút được chọn

- Thực hiện nghiên cứu thành phần vi thể của hạt tophi Gút bằng phương pháp lát cắt cho hiển vi quang học

- Thực hiện nghiên cứu thành phần hoá học của các hạt tophi-Gút bằng phương pháp phân tích hoá học - sinh học trong phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Sử dụng đặc điểm về thành phần hóa sinh học, mô học của hạt tophi làm

căn cứ khoa học tìm ra các phương pháp phòng, chẩn đoán và điều trị bệnh Gút hiệu quả

Chương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về bệnh Gút

1.1.1 Khái niệm về bệnh Gút

Gút là một trong những bệnh lý được phát hiện rất sớm Đến những năm

60 của thế kỷ XX, các nhà khoa học đã nghiên cứu sâu hơn về sinh học tế bào,

cơ chế sinh lý bệnh của tình trạng tăng axit uric máu và khẳng định Gút là một bệnh lý do rối loạn chuyển hóa gây ra bởi tình trạng lắng đọng các tinh thể urat

ở các mô của cơ thể do tăng axit uric trong máu [10], [22]

1.1.2 Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh

* Nguyên nhân gây bệnh:

Ở người bình thường, lượng axit uric trong máu được duy trì ở mức ổn định khoảng từ 180 - 420 µmol/l theo tiêu chuẩn của Bennet - Wood năm 1968 tại Mỹ Vì một lý do nào đó, hàm lượng purin trong cơ thể tăng, quá trình chuyển hóa chúng thành axit uric tăng Khi cơ thể tạo ra quá nhiều axit uric hoặc thải axit này ra nước tiểu quá ít thì nồng độ axit uric trong máu tăng lên, sự chuyển hóa axit uric thành muối urat tăng theo dẫn tới sự lắng đọng những tinh thể muối urat tại các khớp, sụn, xương, tổ chức dưới da, gây ra viêm sưng khớp

và biểu hiện triệu chứng viêm tại những vị trí lắng đọng.Tăng bẩm sinh do thiếu men hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase (HGPT) nên lượng axit uric tăng cao Như vậy, có thể nói nguyên nhân trực tiếp gây bệnh Gút là axit uric [5], [10]

* Nguyên nhân gây tăng lượng axit uric:

Bệnh Gút nguyên phát là bệnh gắn liền với các yếu tố di truyền và cơ địa, những bệnh nhân này có quá trình tổng hợp purin nội sinh tăng nhiều gây tăng axit uric Đây cũng là nguyên nhân chủ yếu của bệnh

Axit uric trong máu có thể tăng thứ phát do những nguyên nhân sau: Tiêu thụ những loại thức ăn có chứa nhiều purin (gan, lòng, thịt, cá, nấm, tôm, cua), uống nhiều rượu, bia, nước ngọt Cơ thể tăng cường thoái giáng purin nội sinh (phá hủy nhiều tế bào, tổ chức) liên quan đến các bệnh lý huyết học như bệnh đa hồng cầu, leucemie kinh thể tủy, hodgkin, sarcome hạch, đau tủy xương, hoặc

do sử dụng những thuốc diệt tế bào để điều trị các bệnh ác tính Cơ thể giảm thải axit uric qua thận: viêm thận mạn tính, suy thận làm cho quá trình đào thải axit uric giảm dẫn tới sự tích lũy các tinh thể urat trong cơ thể [5], [10], [15]

* Cơ chế gây bệnh:

Tinh thể urat monosodic lắng đọng ở màng hoạt dịch sẽ gây hoạt hoá yếu

tố hageman tại chỗ từ đó kích thích các tiền chất gây viêm kininogen và kallicreinogen trở thành kinin và kallicrein gây phản ứng viêm ở màng hoạt dịch Từ phản ứng viêm, các bạch cầu sẽ tập trung tới, bạch cầu sẽ thực bào các

vi tinh thể urat rồi giải phóng các enzyme tiêu thể của bạch cầu Các men này cũng là một tác nhân gây viêm rất mạnh Phản ứng viêm của màng hoạt dịch sẽ làm tăng chuyển hóa, sinh nhiều axit lactic tại chỗ và làm giảm độ pH Môi trường cường toan thì urat càng lắng đọng nhiều và phản ứng viêm ở đây trở thành một vòng khép kín liên tục, viêm sẽ kéo dài Do đó, trên thực tế thấy hai thể bệnh Gút Thể bệnh Gút cấp tính, quá trình viêm diễn biến trong một thời gian ngắn rồi chấm dứt, hay tái phát Thể bệnh Gút mạn tính quá trình lắng đọng urat nhiều và kéo dài, biểu hiện viêm sẽ liên tục không ngừng [7], [10], [15]

1.1.3 Một số triệu chứng lâm sàng của bệnh

cảm động, quá căng thẳng, lo lắng…; nhiễm khuẩn cấp; sau khi dùng một số thuốc như lợi tiểu nhóm chlorothiazid, tinh chất gan, vitamin B12, steroid [7], [10], [22]

* Triệu chứng lâm sàng cơn Gút cấp tính:

- Khoảng 60-70% cơn Gút cấp biểu hiện ở khớp bàn ngón chân cái

- Đang đêm bệnh nhân thức dậy vì đau ở khớp bàn chân cái (một bên), đau

dữ dội ngày càng tăng, đau không thể chịu nổi, chỉ một va chạm nhẹ cũng gây đau tăng

- Ngón chân sưng to, phù nề, căng bóng, nóng đỏ, xung huyết, trong khi các khớp khác bình thường

- Toàn thân: sốt nhẹ, mệt mỏi, lo lắng, mắt nổi tia đỏ, khát nước nhiều, táo bón, tiểu tiện ít và đỏ

- Đợt viêm kéo dài từ vài ngày đến hai tuần (trung bình là 5 ngày), đêm đau nhiều hơn ngày, viêm nhẹ dần, đau giảm, phù bớt, da tím dần, hơi ướt; ngứa nhẹ rồi bong vẩy và khỏi hẳn, không để lại dấu vết gì ở chân Bệnh có thể tái phát vài lần trong một năm, thường hay gặp vào mùa xuân hoặc mùa thu [7], [10], [22].

* Xét nghiệm và X quang:

- Chụp X quang không có gì thay đổi so với bình thường

- Xét nghiệm: axit uric máu tăng trên 7 mg% (trên 416,5 micromol/l), bạch cầu tăng, tốc độ máu lắng tăng, chọc dịch ở nơi viêm có thể thấy tinh thể urat nằm trong bạch cầu, nhưng cũng có khi axit uric trong máu không tăng [7],

* Thể lâm sàng:

- Thể lâm sàng theo vị trí:

+ Ngoài vị trí khớp bàn ngón chân cái chiếm 60 - 70%, các vị trí khác

ở bàn chân đứng hàng thứ hai như cổ chân, các ngón chân, sau đó là khớp gối, rất ít khi thấy ở chi trên

+ Thể đa khớp (từ 5 - 10%): bệnh nhân sốt, sưng đau lần lượt từ khớp này sang khớp khác, rất dễ nhầm với thấp khớp cấp, viêm đa khớp dạng thấp [7], [10], [22]

- Thể theo triệu chứng và tiến triển:

+ Thể tối cấp: sưng tấy dữ dội, đau nhiều, sốt cao dễ nhầm với viêm khớp do vi khuẩn

+ Thể nhẹ kín đáo: chỉ mệt mỏi, không sốt, đau ít, thường bị bỏ qua + Thể kéo dài: thời gian kéo dài, diễn biến từ khớp này sang khớp khác [7], [10], [22]

1.1.3.2 Triệu chứng của bệnh Gút mãn tính

Gút mạn tính biểu hiện bằng dấu hiệu nổi các cục u (tophi) và viêm đa khớp mạn tính, do đó còn được gọi là “Gút lắng đọng” Gút mạn tính có thể tiếp theo Gút cấp tính nhưng phần lớn là bắt đầu từ từ tăng dần không qua các đợt cấp

+ Tính chất: kích thước to nhỏ không đồng đều, từ vài milimet đến nhiều centimet đường kính, lồi lõm, hơi chắc hoặc mềm, không di động do dính vào nền ở dưới, không đối xứng 2 bên và không cân đối, ấn vào không đau, được bọc bởi một lớp da mỏng, phía dưới thấy cặn trắng như phấn, đôi khi da bị loét và dễ chảy nước vàng và chất trắng như phấn

- Viêm đa khớp: Các khớp nhỏ và nhỡ bị viêm là bàn ngón chân và tay, đốt ngón gần, cổ tay, gối, khuỷu, viêm có tính chất đối xứng, biểu hiện viêm thường nhẹ, không đau nhiều, diễn biến khá chậm Các khớp háng, vai và cột sống không bị tổn thương [2]

- Biểu hiện ngoài khớp:

+ Urat có thể lắng đọng ở thận dưới hai hình thức:

 Lắng đọng rải rác ở nhu mô thận: hoặc không thể hiện triệu chứng gì, chỉ phát hiện qua giải phẫu bệnh, hoặc gây viêm thận, bể thận

 Gây sỏi đường tiết niệu: sỏi axit uric ít cản quang, chụp thường khó thấy, phát hiện bằng siêu âm, chụp UIV Sỏi thận dễ dẫn tới viêm nhiễm, suy thận Đây là một trong những yếu tố quan trọng quyết định tiên lượng của bệnh

+ Urat có thể lắng đọng ở một số cơ quan ngoài khớp như:

 Lắng đọng ở gân, túi thanh dịch, có thể gây đứt hoặc chèn ép thần kinh (hội chứng đường hầm)

 Lắng đọng ở ngoài da, móng tay, móng chân thành từng vùng và mảng, thường dễ nhầm với những bệnh ngoài da khác như vẩy nến, nấm…

 Lắng đọng ở tim: urat có thể lắng đọng ở màng ngoài tim, cơ tim, có khi

cả van tim nhưng rất hiếm

* Xét nghiệm và X quang:

+ Tốc độ lắng máu tăng trong đợt tiến triển của bệnh Các xét nghiệm huyết học khác không có gì thay đổi

+ Axit uric máu tăng trên 7 mg% (trên 416 micromol/l)

+ Axit uric niệu/24h: bình thường từ 400 - 450 mg, tăng nhiều trong Gút nguyên phát; giảm rõ với Gút thứ phát sau bệnh thận

+ Dịch khớp có biểu hiện viêm rõ rệt (lượng muxin giảm, bạch cầu tăng nhiều) Đặc biệt thấy những tinh thể urat monosodic nằm trong hoặc ngoài tế bào

+ X quang: Dấu hiệu quan trọng nhất của bệnh là khuyết xương hình hốc ở các đầu xương, hay gặp ở xương đốt ngón chân, tay, xương bàn tay, chân, đôi khi ở

cổ tay, chân, khuỷu và gối Khuyết lúc đầu ở dưới sụn khớp và vỏ xương, như phần vỏ được thổi vào, bung ra (hình lưỡi liềm), khe khớp hẹp rõ rệt Sau cùng hình khuyết lớn dần và tạo nên hình hủy xương rộng xung quanh có những vết vôi hoá Nếu bệnh tiến triển lâu có thể thấy những hình ảnh thoái hóa thứ phát (hình gai xương) [2], [10], [22]

Hình 1.1 Hình ảnh X quang của các khớp tổn thương mạn tính do Gút [10]

1.1.3.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Gút

Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Gút là tìm thấy tinh thể của axit uric trong dịch khớp hay trong các hạt tophi Hoặc có từ tối thiểu từ 2 tiêu chuẩn sau đây trở lên:

- Trong tiền sử hoặc trong hiện tại có tối thiểu hai đợt sưng đau của một khớp với tính chất ban đầu đột ngột, đau dữ dội và khỏi hoàn toàn trong vòng 2 tuần

- Trong tiền sử hoặc hiện tại có sưng đau khớp ngón bàn chân cái với các tính chất như tiêu chuẩn trên

- Tìm thấy các hạt tophi Đáp ứng điều trị nhanh chóng với Colchicin (trong vòng 48h) trong tiền sử hay hiện tại [7], [10], [22]

1.1.3.4 Bệnh Gút thứ phát

Bệnh Gút xuất hiện do tăng axit uric máu sau một số bệnh khác được gọi là bệnh Gút thứ phát Khi tìm thấy nguyên nhân gây tăng axit uric máu và loại trừ được nguyên nhân thì bệnh khỏi Tuy nhiên, Gút thứ phát rất hiếm gặp

Gút thứ phát gặp ở nam giới tuổi trung niên, hay gặp thể viêm khớp cấp di chuyển hơn là thể ngón chân cái và hầu như không thấy thể đa khớp có u cục, thường có kèm theo sỏi thận, hoặc lắng đọng urat ở nhu mô thận

Nguyên nhân của Gút thứ phát thường gặp sau các bệnh về máu như: bệnh

đa hồng cầu, một số bệnh thiếu máu do tan máu, lơxêmi cấp và kinh thể tủy, bệnh hodgkin, sarcom hạch; sau khi mắc một số bệnh thận: viêm cầu thận mạn tính, suy thận mạn do nhiều nguyên nhân Gút thứ phát cũng có thể gặp sau khi dùng nhiều và kéo dài một số thuốc như steroid, pyrazinnamid, lactat natri, thuốc lợi tiểu nhóm chlorothiazid hoặc dùng các phương pháp diệt nhiều tế bào (hoá chất, phóng xạ,…) để điều trị các bệnh ác tính

Một số nguyên nhân hiếm gặp khác cũng có thể gây nên bệnh Gút thứ phát: bệnh thận do thai nghén, suy tuyến giáp, gan nhiễm glycogen, cường cận giáp [10], [22]

1.2 Một số điều cần biết về axit uric

C [18] Ở nồng độ cao hơn các tinh thể urate sẽ

bị kết tủa Tuy nhiên, trong một số trường hợp các tinh thể urate không bị kết tủa, phải chăng do ảnh hưởng của một số chất hòa tan trong huyết thanh.Phần lớn acid uric trong máu ở dạng tự do, chỉ khoảng < 4% gắn với protein huyết thanh

Hình 2.1.Công thức hóa học của axit uric [18]

Nồng độ axit uric máu trung bình ở nam: 5,1 ± 1,0 mg/dl (420 μmol/lít)

nữ 4,0 ± 1mg/dl (360 μmol/lít) [18], [19] Khi nồng độ axit uric máu vượt qua giới hạn trên được coi là có tăng axit uric Bình thường quá trình tổng hợp và bài tiết axit uric ở trạng thái cân bằng Tổng lượng axit uric trong cơ thể có khoảng

1200 mg (ở nam) 600 mg (ở nữ)[19] Khoảng 2/3 tổng lượng axit uric được tổng

hợp mới và cũng với số lượng tương tự đào thải chủ yếu qua thận

Trong nước tiểu, axit uric hòa tan dễ dàng hơn trong nước, pH nước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan axit uric, bình thường lượng axit uric thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày Do vậy, pH càng kiềm càng thuận lợi cho việc thải acid uric và ngươc lại nước tiểu càng toan thì khó khăn cho việc đào thải axit uric

- pH 5,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L

- pH 7,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L [19]

1.2.2 Cơ chế lắng đọng axit uric và sự tạo thành tophi

Cơ chế chủ yếu là do tăng axit uric máu kéo dài, cơ thể có hàng loạt phản ứng thích nghi nhằm giảm axit uric trong máu bằng cách: tăng bài tiết qua thận, lắng đọng muối urat trong các tổ chức như: màng hoạt dịch, da, kẽ thận, gân Dẫn đến sự biến đổi về hình thái học các tổ chức này Tăng axit uric trong dịch khớp dẫn đến kết tủa thành các tinh thể hình kim gây tổn thương sụn, màng hoạt dịch, bao khớp Qua chỗ sụn bị tổn thương các tinh thể xâm nhập xuống tận lớp xương dưới sụn, hình thành các hạt tophi, gây phá huỷ xương dưới dạng ổ khuyết xương hình cầu Viêm màng hoạt dịch, tăng sinh màng hoạt dịch, thâm nhiễm các tế bào lympho là tổn thương thứ phát Sự lắng đọng các tinh thể ở tổ chức tạo thành các hạt tophi kích thước to nhỏ khác nhau Lắng đọng tinh thể urat ở kẽ thận dẫn đến tổn thương thận như sỏi thận, viêm thận kẽ, xơ hóa cầu thận Tổn thương lan rộng dẫn đến suy thận, tăng huyết áp Đây là yếu tố tiên lượng quan trọng [18], [19]

1.3 Những nghiên cứu về bệnh Gút ở Việt Nam và trên thế giới

Tuy bệnh Gút đã xuất hiện từ lâu nhưng các nghiên cứu hầu như đều nhằm

vào mục đích điều trị và cơ chế gây bệnh cùng với các bệnh lý cũng như triệu chứng liên quan đến bệnh Gút của các nhà chuyên môn Có rất ít các nghiên cứu

về thành phần của hạt tophi Gút được công bố Trên đây là một số nghiên cứu

cơ bản về bệnh Gút đã được công bố trên thế giới và Việt Nam

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Bệnh gút là bệnh viêm khớp phổ biến nhất ở người cao tuổi Tuy nhiên nói chung bệnh xuất hiện là do cách quản lí kém và một phần do thiếu chiến lược điều trị và hướng dẫn đối với người dân đầy đủ [27], [28] Do mức sống ngày càng được nâng cao lên tuổi thọ trung bình của con người cũng được nâng cao, tuy nhiên kèm theo việc nâng cao tuổi thọ là việc gia tăng các bệnh có liên quan đến tuổi tác và các hiệu ứng tác dụng phụ của các thuốc điều trị (ví dụ như thuốc lợi tiểu và scalicylates liều thấp) có thể làm tăng nguy cơ bệnh gút [28], [30]

Từ khi nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh của gút được phát hiện, có rất nhiều các tác giả trên thế giới đi sâu vào nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá tình hình diễn biến của bệnh, xác định các yếu tố nguy cơ và mối liên quan với các nhóm bệnh lý rối loạn chuyển hoá khác Một số nghiên cứu ở các nước phát triển cho thấy tỷ lệ mắc bệnh gút chiếm 1 - 2% dân số, còn tỷ lệ tăng acid uric máu khoảng 13 - 25% tùy từng vùng, từng đối tượng và lứa tuổi Nghiên cứu của Wallace và cộng sự (cs) đã cho thấy trong thập kỷ 90 của thế kỷ 20, bệnh gút đã tăng lên gấp đôi ở người trên 75 tuổi [30]

Để phòng ngừa ngay từ ban đầu đối với bệnh gút thì các chuyên gia hay các bác sĩ khuyên chúng ta nên chú ý đến lối sống cụ thể hơn là việc ăn uống và không nên uống nhiều rượu bia, khi triệu chứng của bệnh gút xuất hiện Tuy nhiên có ít hơn 20% số bệnh nhân bị bệnh gút tìm kiếm sự tư vấn của các chuyên gia hay các bác sĩ về việc thay đổi lối sống của mình để phòng ngừa bệnh và giúp cho quá trình điều trị bệnh được tốt hơn [25] Gần đây ảnh hưởng của hải sản, thịt, rượu, bia, sữa đối với sự phát triển của bệnh Gút đã được chứng mình qua nghiên cứu của nhóm tác giả Choi và cs (2004) [26]

Tăng acid uric máu được phát hiện ở 22 – 38 % bệnh nhân tăng huyết áp

không được điều trị Tỉ lệ bệnh Gút trong dân số tăng huyết áp là 2 –12 % Mặc

dù tỉ lệ tăng acid uric máu tăng ở đối tượng tăng huyết áp nhưng không có sự liên quan giữa acid uric máu và trị số huyết áp Có 25 – 50 % bệnh nhân Gút có kèm tăng huyết áp, chủ yếu ở các bệnh nhân béo phì Nguyên nhân gây nên mối liên hệ giữa bệnh gout và tăng huyết áp hiện nay chưa được biết rõ [34]

Theo như nghiên cứu của Zang và cs thì tổn thương xương khớp trên X- quang chỉ thấy được sau đợt gút cấp đầu tiên từ 6 - 12 năm [33] Cơ chế gây hủy xương trong gút mạn tính: quá trình viêm mạn tính trong bệnh gút giải phóng các cytokines, proteases và các gốc oxy hoá tự do…từ các tế bào màng họat dịch, các tế bào sụn và tạo cốt bào gây viêm mạn tính màng họat dịch dẫn đến mất sụn và hủy xương Tinh thể monosodium urate hoạt hóa các tế bào sụn giải phóng interleukin 1 kích thích nitric oxide synthetase và metalloproteinase làm tiêu hủy sụn Đồng thời tinh thể monosodium urate hoạt hóa osteoblast giải phóng cytokine làm giảm chức năng tạo cốt bào dẫn đến hủy xương cạnh khớp [33]

1.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Trong thời gian qua, nền kinh tế của Việt Nam nói chung đã có những bước phát triển nhanh chóng Cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, cộng với chế độ dinh dưỡng thiếu hợp lý nên bệnh Gút cùng các bệnh rối loạn chuyển hóa khác như tiểu đường, rối loạn lipid máu, tăng huyết áp, thừa cân, béo phì, cũng đang ngày càng phổ biến Tuổi trung bình của các bệnh nhân mắc bệnh Gút theo như nghiên cứu của Lưu Văn Ái và cs năm 2010 tại bệnh viện Chợ Rẫy là 72 7 tuổi và trong đó bệnh nhân ít tuổi nhất là 60 tuổi và nhiều tuổi nhất là 92 tuổi [1] Vào năm 2012 theo nghiên cứu bổ sung của Lê Thị Anh Thư và cs thì tuổi trung bình của các bệnh nhân mắc bệnh Gút là 49 tuổi [25] Điều này chứng tỏ bệnh nhân bị bệnh Gút ngày càng được trẻ hóa có thể một phần do lối sống cà cách ăn uống

Theo như nghiên cứu của Lê Thị Viên (2006) thì số bệnh nhân sống ở thành thị chiếm tỷ lệ nhiều hơn (70 - 74%) Sự khác biệt này có thể là do ngày nay đời sống người dân được nâng lên đáng kể Điều kiện sống và mức sống của người dân ở nông thôn và thành thị ngày nay không cách biệt nhiều Do đó tỷ lệ mắc bệnh ở thành thị và nông thôn không khác nhau nhiều [21]

Trong cơn Gút cấp đầu tiên hầu hết bệnh nhân có tổn thương khớp ở cả chi trên lẫn chi dưới và xuất hiện ở cả 2 bên: Khớp bàn ngón chân cái (77,9%), khớp cổ chân (69,4%), khớp khác ở bàn chân (56,7%), khớp gối (54,2%), Khớp khuỷu (33,9%), khớp cổ tay (30,7%), khớp bàn ngón tay (20,3%) Theo như nghiên cứu của Đoàn Văn Đệ (2003) [7], Lê Thị Viên (2006) [21] Chính vì vậy

mà ở giai đoạn này Gút rất dễ chẩn đoán nhầm với viêm khớp dạng thấp

Nghiên cứu của tác giả Doãn Thị Tường Vi (2008) và cộng sự trên 711 người lứa tuổi 30 - 60 tại bệnh viện 19/8 Hà Nội cho thấy tỉ lệ tăng axit uric máu

và bệnh Gút là 4,9% Các yếu tố liên quan đến tình trạng tăng axit uric máu trong nghiên cứu này đã được xác định là tần xuất tiêu thụ thực phẩm giàu đạm

và rượu bia nhiều, cân nặng và BMI cao Những người tăng axit uric máu có nguy cơ bị tăng huyết áp,có cholesterol, triglycerid huyết thanh cao hơn so với những người bình thường [20]

Cũng trong nghiên cứu của Lưu Văn Ái và cs (2010) thì axit uric niệu 24h

ở bệnh nhân Gút lớn tuổi tập trung ở mức 100-700 mg/ 24 giờ, trung bình là 430,2 ± 235,6 mg, tương đương với 2560,7 µmol/l [1] Không khác nhiều so với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Diễn (2004) (343,5 mg) [5] và trị số của các nước phương tây (425 ± 80 mg) [25]

Khảo sát nồng độ axit uric huyết thanh ở bệnh nhân tăng huyết áp và người bình thường trên 40 tuổi tại Bệnh viện nhân dân Gia Định và bệnh viện Đại học Y thành phố Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy tỉ lệ tăng axit uric ở người không tăng huyết áp là 18% và ở người tăng huyết áp là 63% [8]

Một đặc điểm khác biệt của bệnh Gút so với các bệnh khác là bệnh nhân thường diễn biến âm thầm Trừ những trường hợp đã có biến chứng, các đối tượng còn lại thường chỉ có biểu hiện bệnh vào những đợt cấp Do đó, tâm lý bệnh nhân thường chủ quan, ít tuân thủ nghiêm túc chế độ điều trị và ăn uống

Vì vậy, thời gian xuất hiện biến chứng có thể đến rất sớm gây khó khăn cho điều trị, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của người bệnh Nghiên cứu của Phạm Quang Cử (2009) cho thấy có tới 30% bệnh nhân có sỏi thận ngay ở năm đầu tiên Các yếu tố dinh dưỡng và chuyển hóa có liên quan mật thiết với các biến chứng của bệnh Gút Ngoài các biến chứng tại khớp thì các biến ngoài khớp cũng khá phổ biến Biến chứng ngoài khớp thường gặp nhất của Gút là sỏi thận chiếm 44,8% do lắng đọng tinh thể axit uric trong bể thận và đường tiết niệu Các biến chứng như viêm thực quản, viêm kết mạc, viêm mạch ngoại vi, viêm rễ thần kinh chiếm tỉ lệ từ 5- 20% Một số biến chứng như viêm màng ngoài tim, viêm màng não, viêm tinh hoàn, hội chứng thần kinh ngoại biên do tophi chèn ép gặp với tỉ lệt thấp nhưng đây lại là các biến chứng rất nặng của bệnh [4]

1.4 Một số phương pháp phân tích sinh hóa thường dùng trong nghiên cứu

cơ thể sống

1.4.1 Một số phương pháp thường dùng trong phân tích định lượng

1.4.1.1 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu định lượng protein

- Định lượng protein theo phương pháp Lowry

Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử folin Phương pháp này

sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thủ folin tác dụng lên gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn protein để từ đó dịnh lượng hàm lượng protein Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 - 2,000

µg protein Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa axit amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả [3], [9]

- Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280 nm của protein Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280 nm do các axitamin tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin Sự hấp thu ở bước sóng 280

nm của chúng cũng thay đổi tùy loại protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch (hệ số tắc là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường truyền sóng qua 1cm)

Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp (dưới 0,05 - 0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ: đệm, axit nucleic và một số chất béo) hoặc khi protein ở trong dung dịch huyền phù So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thường ổn định hóa phần lớn protein [9]

- Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl

Theo nguyên tắc protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số và kết quả nhân với 6,25, như thế nghĩa là coi protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong phân tử protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 15 - 17%) Trong thực tế bên cạnh protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như alcaloic, amin, amoniac, axit nitric… Các chất này gọi là nitơ phi protein Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein sau đó xác định nitơ protein [3], [9], [12], [17]

1.4.1.2 Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu định lượng lipit

Trong tế bào, lipit ở dạng tự do và liên kết Lipit tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan dự trữ như mô mỡ Trong thực tế, sự xác định lipit dựa vào hàm lượng lipit được rút ra khỏi nguyên liệu bằng các dung môi hữu cơ Có hai phương pháp để xác định: Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu

Các dung môi chiết xuất lipit thường dùng là ete etylic (ete dầu hỏa, ete petrol, benzen, xăng, cloroform, tetraclorua cacbon…) Trong các thí nghiệm thường dùng ete etylic, vì nó có độ bay hơi cao và nhiệt độ sôi thấp Tốc độ của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu Ngoài lipit ra còn có một số hợp chất hòa tan khác như: vitamin hòa tan trong lipit, phosphatit, steroit, các sắc tố…cũng được chiết ra Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hàm lượng các chất này rất ít nên phương pháp này vẫn được chấp nhận trong các thí nghiệm thông thường Vì vậy, các lipit xác định bằng 1 trong

2 phương pháp trên được gọi là lipit thô Quá trình chiết xuất lipit được thực hiện trên máy Soxhlet [12]

1.4.1.3 Xác định hàm lượng một số thành phần khác bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) Cơ sở lí thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử

tự do ở trong trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ Vì thế muốn thực hiện được phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần thực hiện các quá trình sau đây:

- Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự

do Đó là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu Những trang bị để thực hiện quá trình này được gọi là hệ thống nguyên tử hóa mẫu (dụng cụ để nguyên tử hóa mẫu) Nhờ đó chúng ta có được đám hơi của các nguyên tử tự do của các nguyên tố trong mẫu phân tích Đám hơi chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử

- Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó Ở đây, phần cường độ của chùm tia sáng đã bị một loại nguyên tử hấp thụlà phụ thuộc vào nồng độ của nó ở môi trường hấp thụ Nguồn cung cấp chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu gọi là nguồn phát bức xạ đơn sắc hay bức xạ cộng hưởng

- Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân li và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ nguyên tử Ba quá trình trên chính là nguyên tắc của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử [6] ,[11]

Các dung dịch mẫu đã được vô cơ hoá đuổi khí ôxy hoà tan trong dung

dịch phân tích bằng khí nitơ trong 10 phút, sau đó ghi đường von-ampe hoà tan,

đo thế đỉnh (Ep), dòng đỉnh (Ip) được hiện trên thiết bị cực phổ Định lượng các nguyên tố bằng phương pháp đường chuẩn [11]

1.4.2 Một số phương pháp nghiên cứu quan sát mô và tế bào

1.4.2.1 Phương pháp hiển vi

Tế bào chính là đối tượng của khoa học tế bào, chúng có kích thước rất bé,

do đó để nghiên cứu thì trước hết phải sử dụng kính hiển vi

Các dụng cụ phóng đại được xây dựng dựa trên cơ sở sử dụng các bức xạ điện từ: Bức xạ tia Ronghen, sóng cực ngắn, tia tử ngoại, các tia sáng thấy, tia

hồng ngoại Các bức xạ này đều có tính chất truyền theo dạng sóng hoặc hạt nhưng có độ dài bước sóng khác nhau Mức độ quan sát của kính hiển vi phụ thuộc vào độ phân giải, tức là khả năng quan sát được khoảng cách giữa hai điểm gần nhau Như vậy, khả năng nhìn rõ vật tỷ lệ nghịch với độ dài bước sóng, do đó sự hoàn thiện kính hiển vi gắn liền với việc sự dụng các bức xạ điện

từ ngày càng có bước sóng ngắn [24]

1.4.2.2 Phương pháp nhuộm màu hóa tế bào

Người ta dựa vào đặc tính các cấu thành khác nhau trong tế bào sẽ bị nhuộm màu khác nhau khi dùng những chất màu đặc trưng để làm xuất hiện các cấu thành khác nhau của tế bào ở đúng vị trí của chúng Để xác định được các chất hoặc các nhóm chất khác nhau, người ta sử dụng phương pháp đặc trưng cho từng chất

Ngày nay, người ta đã dùng các phương pháp khác nhau để làm xuất hiện các hydratcarbon, các lipid, các protide, các enzyme, axit nucleic trong tế bào và các cấu thành của tế bào đúng vị trí thật của chúng Phương pháp này chỉ cho kết quả định tính [24]

1.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu tế bào sống

Có nhiều phương pháp nghiên cứu tế bào sống như phương pháp vi phẫu thuật và phương pháp nuôi cấy tế bào - mô italic

Ngày nay, nhờ vào sự hoàn thiện của phương pháp nuôi cấy mô tế bào, người ta không những nuôi cấy thành công các tế bào riêng biệt mà còn có thể nuôi cấy ivitro các bào quan và thậm chí cả các phần tử sống nữa Và đã đóng góp đáng kể trong việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế phân hóa tế bào, cơ chế hoạt động của gen [24]

1.4.2.4 Phương pháp quang phổ

Ta biết rằng các cấu thành khác nhau trong tế bào hấp thu chọn lọc các tia hồng ngoại, các tia tử ngoại và các tia sáng thường Nhờ vậy, người ta có thể dùng quang phổ kế để đo lường sự hấp thụ ánh sáng của các cấu thành tế bào Cường độ hấp thụ ánh sáng của các chất phụ thuộc vào nồng độ của chất đó Như vậy, ta có thể dựa vào các dẫn liệu quang học để tính toán và đưa ra thành phần hóa học của tế bào và định hướng các chất đó

Ngày nay, với phương pháp này, người ta xác định được các chất trong

tế bào với lượng 10-12

- 10-14 g trong diện tích 1 μm2 Kết hợp với các phương pháp khác như kính hiển vi huỳnh quang đã cho phép ta nghiên cứu sự phân bố trong tế bào các chất protide các lipid, các micropolysaccharide cũng như axit nucleic [24]

1.4.2.5 Phương pháp nghiên cứu tự đánh dấu và tự chụp hình

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng các chất đồng vị phóng xạ phóng ra các tia α, β và các tia này tự nhũ tương giấy ảnh Người ta đưa ra các đống vị phóng xạ (C13

, P32 và tritium H3 ) vào tế bào, tiêu bản tế bào tự nhũ tương giấy ảnh (tự chụp hình), sau đó, đem rửa ảnh bằng cách thông thường Dựa vào ảnh chụp, người ta xác định chính xác vị trí, mật độ các phần có chất phóng xạ Phương pháp này không những cho phép chúng ta biết được sự phân bốcác chất trong tế bào mà còn cho phép chúng ta theo dõi được số phận và tính chất động học của các chất trong tế bào Ví dụ: nhờ H3

timidin cho phép ta theo dõi được cơ chế tự tái bản của ADN, nghiên cứu sự tổng hợp protein trên các thể ribosome [24]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các bệnh nhân Gút và các hạt tophi Gút của các bệnh nhân Gút đã được phẫu thuật cắt bỏ tại các cơ sở điều trị bệnh Gút hay tại các bệnh viện (Viện Gút Hải Dương, Viện Gút Hà Nội, Viện Gút Tp.HCM)

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Hóa sinh - Phòng phân tích hóa học - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên

Bộ môn Mô phôi - Trường Đại học Y-Dược - Đại học Thái Nguyên

Khoa xét nghiệm Sinh hóa - Viện Gút Hải Dương

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 5/2012 đến tháng 5/2013

2.3 Thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

- Hệ thống chưng cất đạm (Kjeldahl System for determining Nitrogen)

hãng sản xuất: Velp - Italy

- Bộ chiết Soxhlet hãng sản xuất: Behr - Đức

- Máy đo quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS Hãng sản xuất: Shimazdu – Nhật Bản

- Tủ sấy hãng sản xuất Drying - Italia

- Cân điện tử AB-204 sản xuất tại Nhật Bản

dụng đúng theo những hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng sau:

Bảng 2.1 Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Scharlau

Axit Sunfuric (H2SO4), NaOH, KOH, Amoniac (NH3), Ether etylic, Chuẩn P, Chuẩn K, Axit Clohydric (HCl), H3BO3, petrol ether, KMnO4

Merk

Axit percloric (HClO4), Pb(CH3COO)2, Methyl đỏ, (NH4)6Mo7O2.4H2O (amoni molipdat)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Định lượng Protein trong hạt tophi Gút theot phương pháp Kjeldahl

- Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô được gọi là nito tổng số

Nito có trong thành phần amino axit của protein là nito protein Nito không có trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, axit nitric, các amino axit tự

do, các peptid, ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin… là nito phi protein

Nito tổng số = nito protein + nito phi protein

- Trước tiên, mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Phản ứng xảy ra như sau:

H2SO4 2H2O + 2SO2 + O2

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác Các phân

tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 lại tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành amino axit, C và H của amino axit tạo thành CO2 và H2O, còn

N được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 Tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

- Các nguyên tố P, K, Ca, Mg… chuyển thành dạng oxid: P2O5, K2O, CaO, MgO,…

- Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4+ 2NaOH Na2SO4 + H2O + 2NH3

- NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3

2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + H2O

* Tiến hành:

Vô cơ hóa mẫu:

Bước 1 Cân 0,1g mẫu đã được nghiền nhỏ Dùng một giấy cân cuộn tròn cho cẩn thận mẫu vào tận đáy bình Kjeldahl dung tích 50ml

Bước 2 Cho thêm 5 - 10ml H2SO4 đặc (d = 1,84) Trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nước cất không có nito để thấm ướt bột Khi cho vào bình, không được để mẫu dính bám vào cổ bình

Bước 3 Đậy nút lỏng thủy tinh Lắc nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau đó nhấc bình ra để nguội

Bước 4 Cho vài giọt xúc tác axit percloric ( HClO4), chỉ cho ở giai đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm Tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa Dung dịch sẽ chuyển từ màu đen sang màu cánh dán Nhấc bình ra khỏi bếp, để nguội Bước 5 Cho thêm chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric) Tiếp tục đốt đến khi dịch trong bình không màu Để nguội

Bước 6 Chuyển dịch sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất không có nito và dẫn đến thể tích định mức bằng nước cất không

Định lượng Nitơ phi Protein

Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nito phi Protein Tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein Vì vậy ta dùng các chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng, axit, thẩm tích đối nước

* Tiến hành:

Chúng tôi đã dùng cách thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau: TCA 10 – 20% (axit tricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 – 20% trong hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1

Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch có chứa Nito phi Protein Vô cơ hóa dung dịch rồi tiến hành chưng cất đạm bằng phương pháp Kjendahl tương tự như định lượng nito tổng số [12]

2.4.2 Định lượng Lipit trong hạt tophi Gút theo phương pháp Soxhlet

Trong tế bào, lipit ở dạng tự do và liên kết Lipit tự do tập trung chủ yếu

ở các cơ quan dự trữ như hạt, quả (thực vật) và mô mỡ ( động vật) Chính vì vậy

để xác định hàm lượng lipit, ta chiết rút lipit ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ Ở đây ta dùng petrol ether để trích lipit ra khỏi một lượng mẫu biết trước (mẫu đã được sấy khô) trên máy Soxhlet

* Tiến hành:

Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu Túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ (kiểu gói thuốc) có đường kính bé hơn trụ chiết Túi được sấy khô đến trọng lượng không đổi và được cân phân tích

Nguyên liệu được nghiền nhỏ, sấy khô đến trọng lượng không đổi Cân chính xác 2 – 5 g rồi cho mẫu vào túi giấy Gấp kín mép túi, đặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết

Tiến hành phản ứng:

Bước 1.Trước khi chiết, bình cầu phải được sấy khô đến trọng lượng không đổi Bước 2 Đặt bình cầu trên nồi cách thủy và cho ete vào ½ thể tích bình

Bước 3 Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết

Bước 4 Lắp trụ chiết vào bình cầu

Bước 5 Cho dung môi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu, mức dung môi đến phần trên ống xi phông trụ chiết

Bước 6 Lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi vài giờ

Bước 7 Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy (đối với ete không quá 50o

C) sao cho số lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10 – 15 lần trong 1 giờ (4 – 6 phút/ lần)

Bước 8 Thử lipit đã chiết rút hết hay chưa bằng cách lấy vài giọt ete từ dầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch Cho bay hơi hết ete Nếu không có lipit trên đĩa kính, xem như lipit đã được chiết hoàn toàn

Bước 9 Khi chiết xong, lấy bình cầu ra lắp ống làm lạnh vào và cất lấy ete Bước 10 Lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô cho đến khi trọng lượng không đổi

Trong đó :

m1 : khối lượng bao giấy và mẫu ban đầu (g)

m2 : khối lượng bao giấy và mẫu khi trích lipit và sấy khô (g)

m : khối lượng mẫu ban đầu [12]

2.4.3 Định lượng khoáng tổng số trong hạt tophi Gút

Khoáng tổng số là phần còn lại sau khi các chất hữu cơ đã bị đốt cháy ở nhiệt độ 550 - 600o

C

* Tiến hành:

- Xác định khối lượng chén nung: Nung cốc ở nhiệt độ 550 - 600oC trong 2 -

3 giờ, làm nguội ở bình hút ẩm 45 phút và cân Lặp lại đến khi có trọng lượng không đổi

- Khoáng hóa: Cân 1 - 2 g mẫu vào chén đã biết khối lượng, nung ở nhiệt độ

100oC đến khi hết khói đen bay ra thì tăng nhiệt độ đến 550o

C kéo dài trong 3 -

4 giờ

- Xác định khối lượng khoáng: Mẫu sau khi đã khoáng hóa xong (mẫu trắng đều, nếu còn vết đen xen kẽ thì thêm 10 ml nước cất nóng và nung tiếp) đem để nguội ở bình hút ẩm 45 phút và cân Lặp lại việc nung (khoảng 1 giờ) và cân đến

khối lượng không đổi

2.4.4 Xác định hàm lượng một số nguyên tố liên quan đến bệnh Gút: Na, K

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

Phương pháp AAS dựa trên nguyên tắc tất cả các nguyên tố khi ở trạng

thái nguyên tử đều được hấp thụ bởi một bước sóng nhất định, cường độ hấp thụ

thể hiện nồng độ của các nguyên tố đó có trong mẫu

Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ Phổ sinh

ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử

Nguyên lý của phương pháp này như sau: Nguồn sáng đơn sắc được phát

từ đèn Cathod rỗng (HCl) hoặc đèn phóng điện phi cực (EDL) hay đèn phổ liên tục có biến điện qua vùng nguyên tử hoá đến bộ cảm biến (detector) để đo cường độ bức xạ hay hấp thụ Mỗi kim loại có bước sóng hấp thụ đặc trưng riêng

Đèn cathod rỗng (HCL) hay đèn phi cực (EDL) được cấu tạo do chính nguyên tố đó được làm nguồn phát bức xạ đặc trưng Điều này làm cho phương pháp ổn định và ít bị nhiễu.Cường độ bức xạ bị hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ nguyên tố có trong mẫu ( trong một giới hạn nồng độ) Đây chính là cơ sở để phân tích định lượng [6]

* Tiến hành định lượng:

Lấy 5g mẫu vào chén thạch anh, thêm 15ml H2SO4 75% và 3ml Mg(NO3)225% trộn đều, để xử lý ướt sơ bộ, sau sấy hay đun trên bếp điện cho mau sôi nhẹ và đun từ từ cho đến khô và thành than đen Sau đó đem nung 3 giờ đầu ở nhiệt độ 400 - 4500C, sau đó nung ở nhiệt độ 5300C mẫu tro hóa đến được

bã không cặn đen Sau đó hòa tan tro thu được trong 15ml HCl 1/1, đun cho mẫu tan hết, làm bay hơi hết axit dư đến còn muối ẩm định mức thành 25ml bằng HCl 2% Đây là dung dịch mẫu để xác các kim loại nói trên bằng phương pháp AAS [6]

Các dung dịch mẫu đã được vô cơ hoá đuổi khí ôxy hoà tan trong dung dịch phân tích bằng khí nitơ trong 10 phút, sau đó ghi đường von-ampe hoà tan,

đo thế đỉnh (Ep), dòng đỉnh (Ip) được hiện trên thiết bị cực phổ Định lượng các nguyên tố bằng phương pháp đường chuẩn [6], [11], [14]

2.4.5 Định lượng Canxi trong hạt tophi Gút theo phương pháp Retinxki

Dựa trên cơ sở kết tủa canxi dưới dạng muối canxi của axit oxalic bằng muối amoni của axit oxalic Sau đó canxi axalat tác dụng với axit sulfuric để giải phóng axit oxalic

Bước 3 Lấy 2 ống ly tâm thể tích 15ml Cho vào mỗi ống 4ml dịch lọc, 3ml dung dịch muối amoni của axit oxalic bão hòa và 1 - 2 giọt metyl đỏ Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch amoniac Để yên các ống ly tâm khoảng 10 - 12 giờ để muối canxi của axit oxalic kết tủa và lắng hoàn toàn

Bước 4 Ly tâm và gạn bỏ lớp nước, rửa kết tủa bằng 4ml nước, ly tâm tiếp để loại bỏ lớp nước

Bước 5 Cho thêm 2ml H2SO4 0,5% và đun nóng trên nồi cách thủy trong 5 phút, trong quá trình đó axit oxalic được giải phóng Làm nguội dung dịch Bước 6 Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt 1ml KMnO4 tương ứng với 0,2mg canxi

* Tính kết quả:

Hàm lượng canxi được tính như sau:

Ca2+(mg%) =

4 , 0

100 2 , 0

V

Trong đó: V - thể tích KMnO4 0.1N dùng để chuẩn độ

0,2 - số mg canxi tương ứng với 1ml KMnO4

0,4 - trọng lượng mẫu lấy phân tích (1g mẫu pha trong 10 ml

để xác định nồng độ phospho trong dung dịch

* Tiến hành:

Bước 1 Vô cơ hóa mẫu: Cân 5g mẫu cho vào chén sứ Đốt mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 500 - 6000C từ 1 - 2 giờ, mẫu biến thành tro màu trắng (không có than đen) Lấy chén ra khỏi lò, để nguội Hòa tan tro với 20ml HCl 10% Định mức trong bình định mức đến 100ml bằng nước cất Lắc đều, để lắng qua đêm Lọc dịch trong

Bước 2 Lấy 1ml dung dịch vô cơ hóa cho vào ống nghiệm (làm 2 ống song song) Thêm vào mỗi ống 1,25ml dung dịch amoni molipdap trong H2SO4 và 0,5ml dung dịch ejkonogen, rồi thêm nước đến thể tích 5ml

Bước 3 Đặt các ống nghiệm lên nồi cách thủy đun trong 10 phút Sau đó lấy ra

để nguội và đem đi đo màu trên máy spectrophotometer tại bức sóng 882 nm