Khi dung hợp protoplast giữa s.. rustica chống được các bệith trên.. A) Sơ đõ chut^ cho vecta hiển nạp cùa tẽ bào Eukaryote.. C) Sỉnễi íổng ỉtợp phylohormon ớ phần mô có [r]
Trang 1LAI TỂ BÀO SOMA
5.1 M ỏ ĐẦU
N hư ta đă biết, khác với các tế bào động vật, t ế bào thực vật ctí th àn h tế bào là lớp
bao ngoài cùng Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo và pectin Nếu
như th àn h tế bào bị tách bỏ, thì lúc đđ tế bào thực vật sẽ lộ ra lớp m àng sinh chất ngoài
cùng, m à trạ n g thái ta gọi là tế bào tràn hay protoplast Khi các protoplast tiếp xúc với nhau thỉ chúng cổ th ể hợp n h ất lại làm một, m à ta gọi là 8ự d u n g hợp protoplast Nếu
như các protoplast cđ nguòn gốc từ các tế bào som a thuộc các giống, loài hoặc chi khác
nhau được dung hợp lại thi nó cđ th ể dẫn đến hiện tượng lai té bào soma (somatic
hybrydization),
Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước đây trong một thời gian dài người ta cho ràn g kỷ th u ật dung hợp protoplâst chỉ giới hạn ở các tế bào động vật; m ặc dầu ngay
từ rấ t sớm K uster (1909) đă nêu ra ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma để vượt qua những khó khản nảy sinh trong quá trìn h lai xa ở thực vật Mãi cho đến nảm
1960, sau những nghiên cứu thành cổng của Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp các
e m y m cellulose, pectinase và maceroz3nne để tách bỏ th àn h tế bào thực vật, thi kỹ th u ậ t dung hợp protoplast mdi được áp dụng ở thực vật Tuy nhiên, nổ chi thực sự phát triể n
m ạnh m ế và cố xu hiỉớng được úng dụng tro n g chọn giổng chỉ sau các kết quả n ^ i ê n cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuổc lá từ protopỉast của Ikkebe (1971) và việc tái
sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa hai loài N tabacum với N langsdorffi
của Carlson (1972),
Sự r a đời của kỹ th u ậ t protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo ra nhữ ng tái tổ hợp di truyền giữa các đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) m à bằng phương pháp ỉai hữu tính khò hoặc không đ ạ t được Trong quá trỉn h dung hợp, bên cạnh sự kết hợp giữa các genom trong nhân, còn cố th ể xảy ra sự hợp n h ất tế bào ch ất giữa các protoplast Nhờ vậy, m ột số tín h trạ n g do các gen trong tế bào chất kiểm soát, như tính b ất th ụ đực, cố th ể được chuyển m ột cách không khó khăn từ cây này sang cây khác nhờ kỹ th u ậ t này
Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách được các protoplast m ột cách nguyên vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho các sản phẩm dung hợp phân chia và tái sinh chúng th àn h cây
5.2 TÁCH PROTOPLAST
Về nguyên tác, có hai phương pháp tách bỏ th àn h tế bào thực vật : phương pháp cơ
học và phương pháp dùng enzyin T\xy nhiên, trong thực tế người ta chỉ dùng phương
Trang 2pháp enzym, vì nđ cd^hiệu su ẩt rấ t cao m à lại không gây thương tổn cho tế bào.
Khi thành tế bào được tách ra, protoplast phải được phóng thích ra môi trường cd
áp su ất thắm th áu cao để trá n h nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( ví
dụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M) Tuy nhiên, thời gian lưu lại ở đó không nên quá dài khiến cho trao đổi chất của tế bào và cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại
Dể tách protoplast, ví dụ từ cây thuốc lá được trồng trong nhà kính, được tưới thường xuyên ở 25"C, thỉ lá thứ ba từ trên xuống là ngiiồn thực liệu thích hợp nhất Lá được khử trù n g bằng ethanol 70% trong vài giây, sau đó được nhúng vào dung dịch hypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất Lá được thái nhỏ cho vào đỉa P etri chứa hỗn hợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme và 0,05% driselase, để qua đêm
(khoảng 16 h) Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 làn bàng dung dịch mới
không chứa enzyxn bầng cách ly tâm
Ngoài lá, người ta cd th ể dùng phần trụ dưới lá mầm hay rễ làm nguyên liệu tách protoplast Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast này dễ phân biệt với các protoplast được tách ra từ mô th ịt lá Một nguồn nguyên liệu khác cũng được dùng để tách protoplast là các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù Đôi với các cây hoà thảo, điều cần biết là, chỉ cd các protoplast được tách ra từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù mới có khả nảng phân chia và tái sinh cao (Fujimura,1985 )
53 DUNG HỘP PROTOPLAST
Lần đầu tiên Carlson (1972) đã tái sinh ra những cây thuốc lá từ protoplast bàng cách cho dung hợp protoplast trong môi trường cfòng thẩm tích của dung dịch n itra t
n atri Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lá ở môi trường 50
cho việc dung hợp tế bào chất Sau này, Kao (1974) đả phát hiện ra chát polyethylen glycol (PEG) cd tác dụng làm tân g hiệu quà dung hợp của protoplast; vl nd là chất qd ái lực với nước, làm tăn g tính thẩm thấu và tăng bề m ặt tiếp xúc giữa các protoplast Chỉ
sau vài phút được ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 % (w/v) của PBG (mol Wt 1500 - 1600)
hàu như tấ t cà các protoplast đều được kết dính lại Tuy nhiên, việc dung hợp chỉ thực
10,5) T\iy nhiên, do PEG có độc tín h đối với tế bào thực- vật nên người ta thường dùng
ở nồng độ thấp hơn và thêm vào đó m ột ít DMSO (dimethyl sulíoxid)
Sau này, phương pháp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) do Zim m erm an đề xướng (1982) được nhièu người áp dụng Nguyên tác của phương pháp là ; môi trường chứa protoplast được đặt giữa hai điện cực; sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ra m ột xung điện với điện th ế cao ( 500 - 10000 v/cm) trong khoảnh khác 5-6/1000 giây
Với các cây họ cà, hiệu quả dung hợp của phương pháp này đ ạ t tới > 50% Càn nhớ
là, hiệu su ất dung hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: m ật độ protoplast, nhiệt độ khi thí nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường và nguồn nguyên liệu cho protoplast (tế bào mô th ịt lá thường thích hợp hơn là mô sẹo hoặc rễ cây) Sự cd m ặt của m ột lượng lớn không bào và các h ạ t tinh bột làm giảm khả nảng sống sơt của protoplast trong quá trin h dung hợp Dưối đâv (bảng 5.1) là môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy protoplast được tách ra từ th ịt lá cây thuốc lá
Trang 3100 LAI TẾ BÀO SOMA
Bàng 5.1. MÔI truròrng nuối cấy protoplast thuốc lá (Bourgỉn, 1979 )
5.4 NUÔI CẤY PROTOPLAST VÀ TÁI SINH CÂY
Môi trường nuôi cấy protoplast khác xa so với các môi trường nuôi cấy mô đ ể cho tế báo cổ th ể phfln chia và hinh th ành md sẹo Điều khác trư ãc tiên là, mổi trư dng này cần phảỉ cd áp suăt thẩm thâu cao lúc ban đầu bầng cách aử dụng m annitol hoặc sorbitol ; thứ hai là, môi trường phẩd ctí nông độ chất sinh trưởng tương đổi cao Đối với protoplast
thuổc lá nồng độ các chất đổ là : 3 mg/1 NAA (15 Ịiim.) và 1 mg/ỉ benzylam inopurín (5
/im ) - Xem bảng 5.1 M ật độ protoplast / ml phải điều chỉnh sao cho cd th ể đếm được
bầng bu&ng đốm hồng cầu Vối thuốc lá, nồng độ đó là 60000 protoplast /ml (nốu tế bào
cđ kích thước bé thỉ m ật độ ctí th ể tAng lên) Môi trường dịch th ể của protoplast cần đ ật
trong điều kiộn tổi cho đến khi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhát Sau đổ kho&ng tìỉ
2 -6 ngày thỉ th ành tế bào được tái sinh (tùy theo loài cây) Cấu trú c 2 tế bào cố th ế quan s á t được dưới kính hiển vi soi ngược, nếu chúng được nuôi cấy trê n môi trường
lỏng THỉy nhiên, nếu nuôi cấy trôn môi trường đặc thl ta có th ể theo dõi được sự p h át triể n của từng protoplast và sự hinh th àn h từ n g cụm t ế bào bé cđ nguồn góc từ từ n g
protoplast
Đ ể chọn lọc các đột biến sinh hoá hoậc các con lai soma ngưdi ta cổ th ể nuỗi cẨy tách riêng từng protoplast trên từ ng đĩa P e tri nhỏ trong mối trường cổ n&ng độ auxin
th ấp và m ật độ tế bào thấp (1 tế bào / Iml) Với protoplast của cây cải dầu, bàng phương
pháp nuôi cấy liên tục cđ thay môi trường mới 2-3 lần thì có th ể thu được các nhổm tế
bào cổ kỉ}ả n&ng tái sinh, sau khi chuyển chúng san g mối trường đặc tạo ch&ỉ thân
Cổ hai con đường phát sinh hình thái tro n g quá trin h hình thành cây hoàn chỉnh đối với các t ế bào cd nguồn gốc từ protopiast Đối với các protoplast cđ nguồn gốc tỉl mỏ th ịt
ỉá của cây thuốc lá, thỉ từ trong các tậ p đoàn t ế bào nhỏ xuất hiện những u 16i ( vài tu ầ n sau khi tách protoplast) Các u này phát triể n th àn h rễ trong mổi trường khổng có chát sinh trưởng hoặc có ít auxin Còn trong trư ờ ng hỢp khi protoplast có nguồn gốc từ các
Trang 4tố bào phôi được nuôi cẩy dạng huyền phù ( thưòng đổi với họ hoà thảo ) thi các cụm tố bào v&n giữ nguyẽn được khả n&ng phát sinh phối để hinh thành nên các phổi Nếu đảm bảo được qui trìn h chặt chẽ như trên, thi phồi hoặc mô phân sinh sỗ hỉnh th àn h sau khoảng 3 -5 tu ầ n lễ Tuy nhiên, trong những trường hợp khi mà điều kiện th í n i^iộ m
khống tổi ưu và có những biến đối về mặt di truyền thỉ sẽ xuát hiện sự thay đổi VẾ sổ
lượng nhiễm sác th ể Ví dụ, với các protoplast từ cây khoai tây 2n, tầ n số cây 2n được
tá i sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là các cây 4n
5.5 CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp
Giả sử ta cho dung hợp giữa các protoplast từ 2 cây khác nhau và thu được kiểu tế bào dị nhân (heterokaiyocjrte), trong đó có sự trộ n lẫn cả nhân và tế bào chất (bao gốm
cả ty, lạp th ể trong tế bào chẫt ) Song, sự dung hỢp này cũng có th ể chỉ xảy r a giữa 2 nhãn hoậc giữa các tế bào chất hoặc chi một phần giữa các nhân Điều này phụ thuộc
vào quan hệ giữa các loài Ví dụ, tàn số dung hợp giữa N.tabacum / N.tabacum ỉà 10 ■*, giữa Brassica campetris / B oleracea là 0,5 Dể làm tăng khả năng tái sinh các cáy lai,
người ta đã sử dụng một số phương pháp làm tản g tỷ lệ các tế bào dị nh ân hoậc các phương pháp chọn lọc tế bào lai
Dưới đây, ta xem xét một sổ kỹ thuật tách các sản phẩm dung hợp
1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tách và ũh&n dòng đổi với các sản phẩm dung hạp dưới kính hiển vi, dựa vào sự sai khác về m ặt hinh thái; chẳng hạn sự cổ m ặ t của các chloroplast từ protoplast của mô thịt lá và sự khũng cổ m ặt của chúng tro n g các protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ dưới lá mầm Việc tách các tố bào dị nh án được tiến hành bằng micropipet
2) G albraỉth (1978) và Redenbaugh (1981) đS ra phương pháp nhận diện các sản phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang hoặc với chất rhodam in isothiocyanat đối với các protoplast trước lúc cho dung hợp
3) Các sản phẩm dung hợp cũng có thể được tách ra bàng phương pháp kốt hợp tìí
trường với gen chỉ thị kháng ehẵt khấHg ẫÌRh Nguyên tấc nhu ẫãu; protoplast của dạng
A được gán những phân tử nhỏ cố ái lực tỉí tính mạnh; protoplast của dạng B có gán gen
kháng chất kháng sinh (ví dụ như kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast được cho đi qua cột phàn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A và protoplast lai được gỉữ lại
ở cột, còn proíoplast dạng B thỉ tách khỏi cột Hỗn hợp protoplast lai và dạng A được nuổi căy tro n g mổi trường có kanamycin để tách ra các tế bào lai
4) Các hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trinh dinh dưỡng được dùng r ấ t rộng rãi và cđ hiệu quả để nhận biết các sản phắm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch tạn g hay thiếu h ụ t diệp lục, các đột biến sinh hoá do thiếu enzym n itra t reductase - NR (Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) hoặc các gen đánh dấu (ctí được bằng phương pháp chuyển gen) có liên quan đến tỉnh kháng các chát kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983)
- C hẳng hạn, cđ những trưòng hợp, khi được nuôi cấy tro n g môi trư ờ n g thiếu hoocmon ngoại sinh thi các tế bào lai có khả nãng cho mỏ sẹo và tái sinh cây, còn các tế bào của từ n g dạng bó mẹ lại không có khả năng ấy (Power (1977) và Shenck (1982))
- Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa các dạn g đột
Trang 5biến thuộc hai ioài Petunia hybrida và p parodii, tro n g đổ protoplast từ dạng đột biến albỉno của p hybrida cho md sẹo m àu trá n g trê n mối trư òng m à d đd protopỉast của p
parodii khống cho mữ sẹo, còn tế bào lai thì cho mỗ sẹo màu xanh.
bố m ẹ : m ột dạng được g&Đ gen kháng k an am y d n còn dạng kia được gán gen kháng hygrom ydn; việc chọn lọc các tế bào lai được tifo hàn h trong mữi trường chứa cả hai loại kháng sinh đđ
N ếu m ột trong hai dạng bổ mẹ là kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an
N R nén khống th ể sổng được tr6n mỗi trư ờ ng N O ^d o khống có khả năng khử N O ^ -*■
N 0J" -* NH3, còn dạng kia được chuyển gen kiểm soát m ột tính trạ n g trội - như kiểu kháng chất diệt cỏ hoặc kháng sinh - th i ta cổ th ế chọn lọc trực tiếp các tế bào lai trê n mỗi trường tổi thiểu và cổ bổ sung chãt kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (các tế bào bổ hoặc
mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được) D ạng con lai đ a năng như vậy đa được sử dụng
d cây thuổc ỉá hoặc cải d&u
5.6 CON LAI DO sự DUNG Hộp NHẢN
Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhấib nhân (nuclear hybrid) đa được tạo ra thành cống giữa các ỉoài cây trồng vỗi loài hoang dại d chi cải dầu; ví dụ, giữa loài
B nigra chứa 1 bộ gen (B) vói ỉoài B napua chúa 2 bộ gen (ÁC) Bàng phương pháp dung
hợp protoplast giữa hai loỉd ây, người ta đã tạo ra được dạng con lai chứa 3 bộ gen (ABC)
H oặc khi dung hợp protoplast giữa E n ica sativa vói B napus người ta đã chuyển được gen kháng cỏn trù n g và chịu khô <x5 d Eruca vào con lai.
ỏ khoai t&y (S tuberosum), khả nàn g sử dụng kỹ thuẠt dung hợp protoplast là rđt
củ, người ta đa th u nhẠn được m ột dạng OOIÍ lai khác loài (6n) cho củ, hữu th ụ và lại cd
khả n&ng lai được với 5 tuberosum M ặt khác, dạng con lai này lại nhận được các gen
quí từ loài hoang dại là gen kháng v irut thường gây bệnh xoăn lá d khoai tAy trồng và gen kháng bệnh vi khuẩn ở củ
c&n lưu ý'ỉà, mặc dàu sự dung hợp protoplast giữa các cáy thuộc các ỉoàỉ, thậm chí
ra, hoặc con lai cd sức sổng thãp hoậc b át thụ 'Trong nhỉdu trưdng hợp, g&n như toàn bộ hoặc m ột phần nhiễm sấc th ể của m ột tro n g hai dạng bổ mẹ bị m ất đi .T\iy nhiên, diồu này lại dán đến m ột hiộu ứng lý thú khác-, con lai chỉ n h ận được m ột số nhiễm 8ấc th ế hay m ột đoạn nhiễm sác th ể của m ột tro n g hai dạng bố mẹ, nhưng chứng lại chứa những gen cd ích cliò mục đích chọn giổng Bàng phương pháp xử lý phdng zạ, người ta làm đ ú t các nhiễm sác th ế th ành các đoạn nhô và chúng được chuyển vào genom của th ế nhận sau quá trìn h dung hợp protoplast Ch&ng hạn, hoạt tín h của gen N R d c&y thuốc lá đột biến N R ~ được khdi phục sau khi protoplast của nđ được dung hợp với protoplast của lúa mỉ đã được chiếu xộ Theo cách nhu vậy, người ta- đă chuyển được nhiều gen kháng bệnh từ loài này sang loẳứ khác thuộc chi cải dầu
5.7 CON LAI DO DUNG Hộp TẾ BÀO CHẤT
l y lạp th ể chứa những bộ gen tương đối bé nhỏ 80 vâi hệ gen trong nh&n Chúng chứa lượng ADN m ã hoá cho khoảng 10% poỈ3rpeptit đảm bảo cho chức n an g của các cơ
Trang 6quan tử, phàn 90% còn lại là do các gen n h ãn m ã hoá và được chuyển qua m àng của các
cơ quan tử Các cơ quan tử được phân bố m ột cách n g ỉu nhiỗn vào các tế bào con qua
các th ế hệ tế bào Trong sinh sản hữu tính, các cơ quan tử nổi chung chỉ được chuyển qua giao tử cái Trong khi đổ, nhờ sự dung hợp protoplast mà ta cđ được hiện tượng đổng góp như nhau của các cơ quan tử có tro n g tế bào chất từ hai dạng bố mẹ Sản phẩm của dung hựp có th ể chứa các nh&n, ty th ể và lạp th ể tù cả hai dạng bố mẹ Nhưng, nó cũng
có th ể chi chúa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chát thi lại của cả hai D ạng con
lai như vậy ctí tên gọi là con lai tế bào chất hay cybrid.
ỗ.7.1 Dung hợp protoplast và trao dổi tế bào chát
Trong trường hợp mục đích thí nghiệm là phối hợp nhân của một dạng bố mẹ này với to àn bộ tế bào chất của dạng bố mẹ kia và nếu như, khả năng kết hợp nhân của hai
d ạn g ấy là cao, thì người ta có th ể chiếu xạ dạng bđ mẹ cho tế bào chát (cytoplasmic donor) bằng tia X hay tia gamma Bằng cách xử lý như vậy, tia phổng xạ sẽ khồng g&y
ra hiệu quả đột biến đến các hệ gen ở cơ quan tử, vỉ nđ cổ nhiều bản sao trong tế bào Còn đổi với dạng bố mẹ nhận nh&n (nuclear recipient) thỉ ngưòi ta loại bỏ cơ quan tử tro n g t ế bào ch ất bằng cách sử dụng các chất ức chế trao đổi chât, như iodoacetat hay iodoacetamid
Trong các sản phẩm dung hợp, lạp th ể được phân ly ngẫu nhiẻn vào các th ế hệ tế bào k ế tiếp Cũng cd hiện tượng, tro n g m ột cụm tế bào chi tồn tại các lạp th ể của m ột trong hai dạng bổ mẹ cả trong các con iai nhân hay con lai tế bào chất
Các nghiên cứu ở con lai som a giữa hai ioài thuổc lá và giữa thuốc lá với cây họ cà cho th ấy cd hiện tượng tái tổ hợp giữa các genom của ỉạp th ể (Thanh & Medgyesy,19ỗ9) Thí nghiệm nối trê n đã sử dụng các c&y đột biến về lạp th ể kháng chăt kháng sinh và bạch tạng Theo phân tích của Fẹjes (1990) trẻ n cây thuốc iá thỉ, tái tổ hợp này xuát hiện
là do sự trao đổi chéo
ị Cụm tế bào p h át triể n trong môi trường cđ streptom ycin
i Chọn lọc các cụm xanh
ị
l ầ i sinh các cây m ang lạp th ể tái tổ hợp
Trang 75.7.3 Dung hợp protoplast và các tái tổ hợp hộ gen ty thể
T ính b ấ t thụ đực tế bào chất cổ ở nhiều loài thực vật là một tỉn h trạ n g di truyền do
sự kiểm soát của hệ gen ty th ể (Lonsdale, 1987) N hững phân tích v6 tính đa hinh chiều dài các phân đoạn cát giới hạn (RFLP) đổi vối ty th ể của các con lai soma hay các cybrid
ở Petunia hay Brassica (Rothenberg, 1985; Vedel, 1986) đều cho thấy có hiện tượng tái
tổ hợp giữa các genom trong ty thể
ỏ cfly thuốc lá, khi đem dung hợp protoplast giữa m ột ỉoài hữu thụ với m ột loài băt
th ụ đực thì sự tái tổ hợp xảy ra giữa các ty th ể đâ dẫn đến chỗ làm cho hỉnh thái hoa của cAy ỉai khác so với cả hai dạng bổ mẹ ban đầu (Kofer, 1990) Hiện tương tái tổ hỢp xảy ra ở hệ gen ty th ể đâ được tìm thấy ở nhiều loài thực vật Diều đó mở ra khả năng
cố th ể tạo ra sự trao đổi gen ty th ể giữa các ỉoài
5.7.4 ÍÁp dụng sự dung hợp tế bào soma dể cải tiến các giống cây trồng qua
hệ thống các cơ quan tử
Từ sơ đ& trê n hinh ỗ l ta thấy, về m ặt lý thuyết cố th ể cố 9 sản phẩm sau quá trin h dung hợp protoplast giữa hai dạng bổ mẹ khác nhau vS hộ gen lạp th ể (dạng trõ n )v à ty
th ể (dạng sao), khi ta xem xét đến các khả năng: việc loại trừ đi hệ gen ty lạp th ể của
m ột trong hai dạng bố mẹ hoặc các kiểu tái tổ hợp khác nhau xảy ra giữa hai dạng bố
N hìn chung, tái tổ hợp xảy ra ở các trường hợp 7 và 8 là phổ biến hơn cả
Các hệ gen lạp th ể khác nhau khi tbn tại chung trong m ột tế bào thường ít xảy ra
tá i tổ hợp, nhđt ỉà trong các trường hạp ít hoặc khổng có sự cạnh tra n h giữa chúng Ngược iạỉ, giữa các hệ gen ty th ể thường hay xảy ra tái tổ hợp Hệ gen tái tổ hỢp này
được duy trl trong cây cybrid được tá i sinh hoặc ở hậu thế Vi thế, cấu trú c hay gập ở
các cybrid là sự cố m ặt trong tế b&o của các tái tổ hợp ty th ể và genom lạp th ể của một tro n g hai dạng bố mẹ ( trường hợp số 7 và 8 của sơ d& trẽn)
Chuyển tẽ bào chất bất thụ đực vào căy trầng
B àng phương pháp dung hợp protoplast ta cđ th ể chuyển ngay được tế bào chăt bất
thụ đực vào các giống cáy trSng hữu thụ Uiảc nhau, điều mầ bàng phương phặp lai trở
lại thống thường ta phải tiến hành qua 5 - 6 lần la i.ỏ cfly lúa, ngưòi ta đã tá i sinh được các cây cybrid chúa nhân của giổng hữu th ụ và các ty th ể tái tổ hợp từ hai dạng bố mẹ nhứng vẫn cổ tính băt thụ đực tế bào chất của dạng bất thụ đực (Kyozuka, 1989) Cũng như thố, G upta (1996) đã chuyển được tố bào ch ất b ấ t thụ từ dòng CMS m ang ký hiệu V20A sang các dòng duy trì và phục hồi hữu th ụ RCPL1-2C, V20B và IR36, đều thuộc
nhdm ỉúa Indica Bằng phương pháp tương tự r.hư vậy, người ta cũng đã th àn h cổng tro n g việc chuyển tế bào chất b át th ụ đực vào các giổng cây hữu thụ ở báp CÂÌ, cà rốt và
củ cải đường (Prim ard, 1988; 'Iknno- Suenaga, 1988; Krens, 1990) ở thuổc lá,
K um ashiro (1988) đã tạo ra được m ột kiểu b á t th ụ đực tế bào chất mới nhờ việc dung
hợp giữa protoplast của loài N tabacum với protoplast đă được chiếu xạ của loài N
africana Đối với các c&y cam quít, tính bất th ụ đực d những giống có quả khỗng h ạt có
ý ng^ĩa kinh tế lón Vardi (1989) đã tạo r a được các cybrid bất thụ đực cho quả khống
h ạ t ở nhdm cây này.
Cái tiên hệ thống bđt thụ đực tế bào chất ờ Brassica
Các cây trống thuộc chi Braasica có nhiều loài là cây rau hoặc cây cho dầu, như báp
cải hoặc cải dầu Cải dầu ỉà loại cây cho dầu quan trọ n g thứ ba, sau đậu tương và cọ
Trang 8co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GlốNG THựC VẬT 105
dàu Đế sản x u í t cây ỉai Fj thường ngưòi ta sử dụng tính khổng hợp của chúng N hưng
đidu này khòng cho phép áp dụng ở qui mô lớn Vỉ thế, c&n cổ m ột hộ thống kiểm soát
cổ hiệu quả hơn sự th ụ phân thống qua tín h b á t thụ Tính bất thụ đực tế bào chất của cây củ cải cd th ể được chuyển qua c&y báp cải nhờ phương pháp lai hữu tính khác loài; con lai th u được m ặc dầu cố tín h bất th ụ đực nhưng cỡ quan sinh sản cái lại cố tín h hữu thụ kém Bằng phương pháp dung hợp protoplast ngưòỉ ta đa tạo ra sự tta o đổi lục lạp
và sự tái tổ hợp ở ty th ể giữa củ cải và báp cải TVong quá trin h chọn lọc các cybrid, người ta đă tách được các cây b ấ t th ụ h ạ t phấn nhưng cơ quan sinh sản cái p h á t triể n
binh thường và cổ khả n in g k í t hợp cao.
( + )
ị
6
Hình 5.1 Các sân phẩm dung hợp protoplast ^ ữ a hai dạng bổ mẹ cồ sự khác nhau ve hệ gen ìạp thề
(hình írHn) và ty thề ( hình sao).
Trang 9N hững kết quả nghiên cứu trên báp cải và củ cải cho thấy, chl cđ một phàn nhỏ của genom ỉạ càn được đưa vào cây trồng, khi phàn đtí kiểm soát tính trạng kiểu như bất
th ụ đực t ế bào chát Điều này cũng chứng tỏ rằng, hiện tượng tái tổ hợp ty th ể cho phép loại bỏ đi nhữ ng tính trạn g khững tốt về m ặt chọn giống
5.8 MỘT s ó THÀNH T ự u CỦA KÝ THUẬT LAI TẾ BÀO SOMA
Trong hơn hai thập kỷ qua người ta đă đạt được nhiều tiến bộ trong kỹ th u ật dung hợp pĩX)toplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh cây ở nhiều loài cây trùng
D ung hợp protoplast là con đường có hiệu quả để khác phục được nhiều khó khăn gặp phỉd trong quá trìn h lai hữu tính khác loài hoặc khác chi Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra được những cơ th ể có tái tổ hợp gen ở những loài cây đa bội hoậc có cơ quan sinh sản hữu tín h p h át triể n kém
Sau đây là m ột số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối với việc cải tiến giống cày trồng
- ở chi cải Brassica, nhờ dung họp protopỉast mà người ta đã tái tổng hợp được loài
Brassica napus từ hai loài B oleracea và B campestris.
khi đó, ỉoài N rustica chống được các bệith trên Con lai hữu tính giữa hai loài này bát
thụ N hưng con lai soma giữa chúng lại hữu thụ và cổ khả nâng kháng các bệnh kể trôn
- ỏ các c&y họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast mà người ta đã tạo ra được con
lai som a giữa khoai t&y với các loài khác của chi Solanum, vốn khổng lai được với nhau
bằng phương pháp hữu tính, mà lại cố tính kháng bệnh cao
- ỏ cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protopỉast người ta đã tạo ra được con lai
soma giữa cỏ ba lá {Trifolium repens) với cây Međi (Medicago sativa) và được sử dụng
trong việc sản xuất chđt tanin tit lá Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tuang
trồng với các loài hoang dại - ví như giữa Glycine max với G tom m tella • cũng đã được
tạo ra
- ở cây lOa, tròng một chựợRg trinh hợp tốG nghiên eđy giSa IIQII với TVưbng DH Tổng hợp N o ttỉn ỉ^ a m (Anh), nhờ sử dụng kỹ th u ật dung hợp protopỉast Dgười ta đã tạo được m ột sđ giống lúa cổ tính bát thụ đực tế bào chất nhưng lại cđ khả năng chổng chịu s&u bệnh và nhiệt độ thấp
- Riêng đối với cây lúa mi, mậc dầu người ta đâ bỏ ra rấ t nhiều công sức để nghiên cúu nổ, như ng cho đến nay những kết quả thu được trong lỉnh vực này còn rấ t hạn chế
Trang 10KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG
CHỌN GIỐNG THựC VẬT 6.1 Mỏ ĐẦU
6.1.1 Khái niệm chung
Xét cà ở góc độ kỹ th u ật di truyền thực vật và sinh học thực vật ndi chung, kỹ th u ậ t chuyển gen là m ột công cụ có tiềm năng trong viêc giải quyết m ột số vấn đề hiện đại của sinh lý học, sinh hoá học, sinh học phát triển và di truyền học Rố ràn g kỹ th u ậ t chuyển gen thực vật sỗ tác động mạnh đến sự phát triển của kỹ th u ậ t tách dòng gen, giúp cho việc làm sáng tỏ hơn mối liên hệ giữa kiểu gen với kỉểũ hinb; và do vậy sẽ tạo
ra những thành tựu to lớn mới trong việc xác định các gen có lợi trong các nghiên cứu
lý thuyết và ứng dụng
N hững bước phát triể n của kỹ thuật chuyển gen thực vật đả bát nguồn từ những
th àn h công của các hệ thổng chuyển gen ở động vật cđ vú và nấm men 'I\iy nhiên, khác với ở động vật, kỹ thuẠt chuyển gen thực vật trở nên rất phức tạp do sổ lượng lớn của các loài và tính đa dạng của chúng Mặt khác, bản thân qúa trỉnh này gập nhiều trở ngại lớn, như thành tế bào thực vật là một hàng rào ngàn chặn rá t hiệu quả đối với sự xâm nhập của các phân từ ADN Còn đối vói các tế bào sinh dục hay hợp tử th ỉ ADN khổng
cổ khả năng lọt vào được Phữi non thi rấ t bé và được bao bọc bởi các lớp m àng cứng Các t ế bào của mữ ph&n sinh cũng không cho phép các gen hoạt động cổ th ể đi tới được
Hơn nữa, kỷ th u ậ t thụ tinh in vitro được sử dụng cho các thao tác đổi với noãn, hợp tử
và tiền phôi ỏ thực vật vẫn chưa phải là dễ dàng như ỏ động vật
Biến nạp là quá trin h chuyển ổn định một đoạn ADN vào hệ gen nhãn thực vật Ý nghía thực tiễn của nó ỉà tạo ra những tín h trạ n g mỏi hoặc cải tiốn n h ữ n g tín h trạ n g
đ ã cổ nào đó Về m ột sổ phương diện nào đổ mà ndi, kỹ th u ậ t này cổ ưu đ iểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu tính Nếu ỏ phương pháp lai hữu tín h , để chuyển được m ột gen bay một số gen tứ giổng này qua giổng khác người ta phải tiến
h àn h m ột qui trìn h lai trở lại tốn rấ t nhiều thời gian và công sức Trong khi đd, kỹ
th u ậ t chuyển gen khổng những cho phép ta vượt qua được nhữ ng trở ngại do sự xa cách về qu an hệ họ hàn g giữa thể cho gen và nhận gen, m à còn cho phép cây trô n g
tiếp n h ận m ột cách nhanh chóng những gen mới do con ngưòi thiốt kế Ta có th ể làm
được điêu đđ b ằn g cách sử dụng các hệ thổng vectơ sinh học, như ng khống phải là đều ctí th ể thực hiện được vối bất kỳ cây trồng nào Việc tái sinh các cây được chuyển gen chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có "tính toàn thẽ" (totipotent) - m à khổng phải