nghiên cứu phân tích đồng phân quang học lansoprazol sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất lansoprazol và R-lansoprazol dexlansoprazol Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THẢO HẠNH NGÂN

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL

SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất

Mã số: 8720210

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THẢO HẠNH NGÂN

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL

SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luậnvăn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Nguyễn Thảo Hạnh Ngân

Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2017 – 2019Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL

SỬ DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Nguyễn Thảo Hạnh NgânHướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Thanh Dũng, TS Lê Thị Thu Cúc

Từ khóa: HPLC, lansoprazol, phân tách đồng phân, đồng phân quang học

Mở đầu

Lansoprazol được chỉ định điều trị nhiều bệnh dạ dày bao gồm cả loét dạ dày tá tràng và

điều trị nhiễm Helicobacter pylori Lansoprazol có hai đồng phân đối quang là

(R)-lansoprazol (dex(R)-lansoprazol) và (S)-(R)-lansoprazol Tuy nhiên, chỉ có dạng (R) là có hoạt tính sinh học, còn dạng (S) có nhiều tác dụng phụ Phần lớn chế phẩm trên thị trường ở dạng

racemic Tuy nhiên, để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, lansoprazol được sản xuất dưới

dạng đồng phân (R)-lansoprazol và được đưa ra thị trường vài năm trước Trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân quang học (R)-lansoprazol bằng kỹ

thuật HPLC

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất lansoprazol và (R)-lansoprazol (dexlansoprazol)

Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá trìnhtách nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các thông số: hai pic đồng phân phải táchnhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; hệ số bất đối As nằm trong khoảng 0,8 - 1,5 Saukhi tìm được điều kiện thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảosát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và

độ đúng Quy trình phân tích sau khi được thẩm định đã được áp dụng để định lượng hoạt

chất dexlansoprazol và xác định tạp (S)-lansoprazol trong chế phẩm chứa hoạt chất

dexlansoprazol trên thị trường

Kết quả

Xây dựng được quy trình để phân tích đồng phân quang học của lansoprazol khi sử dụngpha động chứa tác nhân đối quang như sau: sử dụng cột sắc ký Gemini NX C18 (150 x 4,6mm; 5 µm) với pha động acetonitril – dung dịch đệm NaH2PO4 10 mM có chứa 10,0 mM

SBE-β-CD, pH 2,5 (20:80, tt/tt) Tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ 30oC, thể tích tiêm mẫu

10 µl và bước sóng phát hiện 285 nm

Xây dựng được quy trình để phân tích đồng phân quang học của lansoprazol khi sử dụngcột bất đối Lux cellulose như sau: sử dụng cột sắc ký Lux Cellulose-1 (250 x 4,6 mm; 5µm) với pha động là n-hexan: IPA: acid formic (80:20:0,1, tt/tt/tt) Tốc độ dòng: 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, nhiệt độ cột: 30oC và bước sóng phát hiện: 285 nm

Độ phân giải của các đồng phân lớn hơn 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) dưới 2% (n =

6), độ phục hồi là 98 - 102%, phương pháp này phù hợp trong kiểm tra chất lượng

Kết luận

Đã xây dựng được hai quy trình phân tách đồng phân quang học lansoprazol bằng kỹ thuật

HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang và sử dụng cột bất đối Lux cellulose

Cả hai quy trình đều có tính chọn lọc, giới hạn phát hiện thấp, cho kết quả chính xác và độlặp cao Quy trình này đã được áp dụng để định lượng dexlansoprazol, xác định tạp đồng

phân (S)-lansoprazol trong chế phẩm chứa dexlansoprazol.

Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210

CHIRAL SEPARATION OF LANSOPRAZOL ENANTIONMER BY USING

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Nguyen Thao Hanh NganSupervisor: Assoc Dr Phan Thanh Dung, Dr Le Thi Thu Cuc

Keywords: HPLC, lansoprazol, chiral separation, enantiomers.

Introduction

Lansoprazole, a proton pump inhibitor that is indicated for the treatment of many stomach

diseases including peptic ulcer and Helicobacter pylori infection Lansoprazole has two enantiomers: (R)-lansoprazole (dexlansoprazole) and (S)-lansoprazole However, only (R) form is bioactive, while (S) form has many side effects Therefore, to improve safety and efficacy, lansoprazole is produced as an isomer (R)-lansoprazole In this study, we present the analysis results of optical isomers (R)-lansoprazole by HPLC technique.

Material and methods

The subject of this study was lansoprazole and (R)-lansoprazole (dexlansoprazole) A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the chiral separation

of lansoprazole in two different approaches using chiral stationary phase in normal phase and using chiral mobile phase additive in reversed phase In normal phase, the enantiomer separation of lansoprazole is studied on different chiral stationary phases Another HPLC method using chiral mobile phase additive on a Gemini C18 column (150 mm × 4.6 mm, 5 µm) was developed by studying the influences of type and concentration of cyclodextrins and buffer pH of mobile phase The det ection wavelength was set at 285 nm at 20°C.

Results

The two enantiomers were separated on a Lux Cellulose-1 column in chiral stationary phase

study The mobile phase was n-hexane-isopropanol-acid formic (80:20:0.1) (v/v/v) A

baseline resolution of lanso prazole enanti omers was achieved using ACN and 10 mM phosphate buffer (pH 2.5) containing 10 mM SBE ‐β‐CD (20:80) (v/v) as mobi le phase with a flow rate of 1.0 mL/min The resolution of the enantiomers in two methods were more than 1.5 The methods were extensively validated following the International Conference on Harmonisation (ICH) guidelines The range of quantification for both enantiomers was 150-

1500 µg/mL with r2 > 0.999 for dex lansoprazole Relative standard deviation of the method was below 2% (n=6), the percentage recovery ranged from 98% to 102%.

Conclusion

The methods are suitable in quality control and capable of determine impurity limit of

(S)-enantiomer in dexlansoprazole.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ x

DANH MỤC CÁC BẢNG xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LANSOPRAZOL 3

1.1.1 Tính chất vật lý 4

1.1.2 Tính chất hóa học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Chỉ định 5

1.1.5 Tương tác thuốc 5

1.1.6 Định tính và định lượng 5

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 6

1.2.1 Khái niệm về đồng phân đối quang 6

1.2.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích đồng phân đối quang 7

1.2.3 Điện di mao quản trong phân tích đồng phân đối quang 8

1.2.4 Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác 8

1.3 PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG TRONG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (CHIRAL ADDITIVE MOBILE PHASE) 10

1.3.1 Khái niệm 10

1.3.2 Các tác nhân quang hoạt 11

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DEXLANSOPRAZOL 12

1.4.1 Nghiên cứu trong nước 15

1.4.2 Nghiên cứu nước ngoài 15

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Đối tượng 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 20

2.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng cột bất đối Lux cellulose 26

2.2.3 Ứng dụng quy trình để định lượng chế phẩm chứa dexlansoprazol trên thị trường 28

2.2.3.1 Định lượng dexlansoprazol 28

2.2.3.2 Xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol 28

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL BẰNG HPLC SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG 29

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 29

3.1.2 Thẩm định quy trình phân tích dexlansoprazol bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 39

3.1.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng

phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang 50

3.2 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC LANSOPRAZOL BẰNG HPLC SỬ DỤNG CỘT BẤT ĐỐI LUX CELLULOSE 52

3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng cột bất đối Lux cellulose 52

3.2.2 Thẩm định quy trình phân tích lansoprazol bằng HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 55

3.2.3 Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng phương pháp HPLC sử dụng cột bất đối Lux Cellulose-1 66

3.3 ỨNG DỤNG HAI QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CHẾ PHẨM CHỨA DEXLANSOPRAZOL TRÊN THỊ TRƯỜNG 68

3.3.1 Ứng dụng hai quy trình đã xây dựng để định lượng chế phẩm chứa dexlansoprazol trên thị trường 68

3.3.2 Xác định tạp đồng phân (S)-lansoprazol 69

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 71

CHƯƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

5.1 KẾT LUẬN 77

5.2 KIẾN NGHỊ 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

CE Capillary electrophoresis

CM-β-CD Carboxymethyl-beta-cyclodextrin

CSPs Chiral stationary phases Pha tĩnh bất đối

EMEA European Medicines Evaluation Agency Cơ quan Dược phẩm châu Âu

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

IPA Isopropyl alcohol

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

M-β-CD Methyl-beta-cyclodextrin

MeOH Methanol

SBE-β-CD Sulfo butylether- beta-cyclodextrin

(S)-LAN Đồng phân (S)-lansoprazol Đồng phân (S)-lansoprazol

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo lansoprazol 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo dexlansoprazol 3

Hình 1.3 Sơ đồ tách đồng phân quang học bằng phương pháp hóa học 9

Hình 3.1 SKĐ khảo sát khi thay đổi các loại cột sắc ký khác nhau 30

Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng của cột sắc ký HPLC lên sự phân tách đồng phân lansoprazol 31

Hình 3.3 SKĐ khảo sát khi thay đổi các tác nhân đối quang khác nhau 32

Hinh 3.4 SKĐ khảo sát khi thay đổi nồng độ tác nhân đối quang 33

Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ tác nhân đối quang SBE-β-CD lên sự phân tách đồng phân lansoprazol 33

Hình 3.6 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân khi thay đổi pH của pha động 35

Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng của pH pha động lên sự phân tách đồng phân lansoprazol 35

Hình 3.8 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân khi thay đổi nồng độ đệm NaH2PO4 36

Hình 3.9 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ đệm NaH2PO4 lên sự phân tách đồng phân lansoprazol 37

Hình 3.10 SKĐ khảo sát sự tách đồng phân khi thay đổi tỷ lệ pha động 38

Hình 3.11 Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ pha động lên sự phân tách đồng phân lansoprazol 39

Hình 3.11 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol 41

Hình 3.12 SKĐ mẫu chuẩn dexlansoprazol 41

Hình 3.13 SKĐ mẫu dung môi 41

Hình 3.14 SKĐ mẫu trắng 41

Hình 3.15 SKĐ mẫu thử lansoprazol 41

Hình 3.16 SKĐ mẫu thử dexlansoprazol 41

Hình 3.18 Độ tinh khiết của pic dexlansoprazol trong mẫu thử 41

Hình 3.19 Phổ UV tại thời gian lưu của pic dexlansoprazol trong mẫu chuẩn 42

Hình 3.20 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-lansoprazol trong mẫu chuẩn 42

Hình 3.21 Phổ UV tại thời gian lưu của pic dexlansoprazol trong mẫu thử 42

Hình 3.23 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh dexlansoprazol trong

mẫu chuẩn lansoprazol 43

Hình 3.24 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-lansoprazol trong mẫu chuẩn lansoprazol 43

Hình 3.25 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của dexlansoprazol trong mẫu chuẩn dexlansoprazol 44

Hình 3.26 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 1,00 µg/ml 49

Hình 3.27 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,50 µg/ml 49

Hình 3.28 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,20 µg/ml 50

Hình 3.29 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,10 µg/ml 50

Hình 3.30 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,05 µg/ml 50

Hình 3.31 SKĐ khảo sát khi thay đổi các cột Lux cellulose khác nhau 54

Hình 3.32 SKĐ khảo sát khi thay đổi các tỷ lệ pha động khác nhau 55

Hình 3.33 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol 56

Hình 3.34 SKĐ mẫu chuẩn dexlansoprazol 56

Hình 3.35 SKĐ mẫu dung môi 57

Hình 3.36 SKĐ mẫu trắng 57

Hình 3.37 SKĐ mẫu thử lansoprazol 57

Hình 3.38 SKĐ mẫu thử dexlansoprazol 57

Hình 3.39 Độ tinh khiết của pic dexlansoprazol trong mẫu thử 57

Hình 3.40 Phổ UV tại thời gian lưu của pic dexlansoprazol trong mẫu chuẩn 57

Hình 3.41 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-lansoprazol trong mẫu chuẩn 57

Hình 3.42 Phổ UV tại thời gian lưu của pic dexlansoprazol trong mẫu thử 58

Hình 3.43 Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-lansoprazol trong mẫu thử 58

Hình 3.44 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh dexlansoprazol trong mẫu chuẩn lansoprazol 59

Hình 3.45 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh dexlansoprazol trong mẫu chuẩn dexlansoprazol 59

Hình 3.46 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của dexlansoprazol 60

Hình 3.47 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,50 µg/ml 65

Hình 3.48 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,20 µg/ml 65

Hình 3.50 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,05 µg/ml 66Hình 3.51 SKĐ mẫu chuẩn lansoprazol nồng độ 0,025 µg/ml 66Hình 4.1 Cấu tạo hạt pha tĩnh cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) và cộtGemini C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) 72

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các chất đối chiếu 18

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất thuốc thử 18

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị 19

Bảng 3.1 KQ khảo sát các cột sắc ký khác nhau 30

Bảng 3.2 KQ khảo sát các tác nhân đối quang khác nhau 31

Bảng 3.3 KQ khảo sát các nồng độ tác nhân đối quang khác nhau 32

Bảng 3.4 KQ khảo sát các nồng độ pH dung pha động khác nhau 34

Bảng 3.5 KQ khảo sát các nồng độ NaH2PO4 khác nhau 36

Bảng 3.6 KQ khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau 37

Bảng 3.7 KQ khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu chuẩn lansoprazol (n=6) 40

Bảng 3.8 KQ khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu chuẩn dexlansoprazol (n=6) 40

Bảng 3.9 KQ khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn lansoprazol 42

Bảng 3.10 KQ khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn dexlansoprazol 44

Bảng 3.11 KQ khảo sát độ đúng của viên nén lansoprazol (n=9) (đồng phân dexlansoprazol) 45

Bảng 3.12 KQ khảo sát độ đúng của viên nén lansoprazol (n=9) (đồng phân (S)-lansoprazol) 45

Bảng 3.13 KQ khảo sát độ đúng của viên nén dexlansoprazol (n=9) 46

Bảng 3.14 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phân dexlansoprazol) 46

Bảng 3.15 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phân (S)-lansoprazol) 47

Bảng 3.16 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén dexlansoprazol 47

Bảng 3.17 KQ khảo sát độ chính xác trung gian của viên nén lansoprazol (đồng phân dexlansoprazol) 48

Bảng 3.18 KQ khảo sát độ chính xác trung gian của viên nén lansoprazol (đồng phân (S)-lansoprazol) 48

Bảng 3.19 KQ khảo sát độ chính xác trung gian của viên nén dexlansoprazol 49

Bảng 3.21 KQ khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau 54Bảng 3.22 KQ khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu chuẩn lansoprazol (n=6) 55Bảng 3.23 KQ khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu chuẩn dexlansoprazol(n=6) 56Bảng 3.24 KQ khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn lansoprazol 58Bảng 3.25 KQ khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn dexlansoprazol 60Bảng 3.26 KQ khảo sát độ đúng của viên nén lansoprazol (n=9) (đồng phândexlansoprazol) 61

Bảng 3.27 KQ khảo sát độ đúng của viên nén lansoprazol (n=9) (đồng phân

(S)-lansoprazol) 61Bảng 3.28 KQ khảo sát độ đúng của viên nén dexlansoprazol (n=9) 62Bảng 3.29 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phândexlansoprazol) 62

Bảng 3.30 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phân

(S)-lansoprazol) 63Bảng 3.31 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén dexlansoprazol 63Bảng 3.32 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phândexlansoprazol) 64

Bảng 3.33 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén lansoprazol (đồng phân

(S)-lansoprazol) 64Bảng 3.34 KQ khảo sát độ lặp lại của viên nén dexlansoprazol 65Bảng 3.35 KQ định lượng dexlansoprazol trong các chế phẩm bằng quy trình phântích đồng phân quang học lansoprazol bằng phương pháp HPLC sử dụng cột bất đốiLux Cellulose-1 69Bảng 3.36 KQ định lượng dexlansoprazol trong các chế phẩm bằng quy trình phântích đồng phân quang học lansoprazol bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động

có chứa tác nhân đối quang 69

Bảng 3.37 KQ khảo sát tạp đồng phân (S)-lansoprazol trong các chế phẩm 69

Bảng 4.1 So sánh thông số sắc ký khi sử dụng pha động có chứa tác nhân đối

quang SBE-β-CD và quy trình sử dụng cột sắc ký Lux cellulose-1 75

MỞ ĐẦU

Ngày nay, trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc, bên cạnh việc tìm và tổnghợp các hợp chất mới thì việc phân tách các hợp chất đối quang từ hỗn hợp racemiccũng đang dành được nhiều sự quan tâm [19], [20], [29], [34] Các hợp chất đối quangtuy không khác nhau về tính chất vật lý và hóa học nhưng khác nhau về cấu trúc khônggian dẫn đến sự khác biệt về tác dụng sinh học [27] Do đó, Cơ quan quản lý thuốc vàthực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã khuyến khích việc sản xuất các chế phẩm thuốc ở dạng

đồng phân riêng lẻ [23], [24], [24], [44] Tuy nhiên, sự phát triển của các phương pháp

phân tích đồng phân quang học cũng như sự xuất hiện không ngừng của các chế phẩmthuốc với dạng đồng phân riêng lẻ trên thị trường đòi hỏi phải có quy trình kiểm tra độtinh khiết đồng phân của thuốc thành phẩm [13]

Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPI) gần đây được sử dụng nhiều trong điều trị loét

dạ dày- tá tràng vì đem lại hiệu quả trị liệu cao và được chỉ định riêng lẻ hoặc phối hợpvới các nhóm thuốc kháng acid, thuốc bao phủ niêm mạc dạ dày, thuốc kháng thụ thể

histamin H2 và kháng sinh diệt vi khuẩn Helicobacter pylori Nhóm thuốc PPI này có

các hoạt chất đã được biết đến nhiều như: omeprazol, pantoprazol, lansoprazol,rabeprazol,… Ngoài chỉ định cho bệnh loét dạ dày- tá tràng, nhóm thuốc này còn sửdụng được cho bệnh nhân mắc bệnh trào ngược dạ dày thực quản (GERD), hội chứngZollinger-Ellison Bên cạnh việc thiết kế các hoạt chất mới trong nhóm, các nhànghiên cứu cũng tập trung vào tổng hợp các dạng đối quang của các hoạt chất đang lưuhành trên thị trường như esomeprazol, dexlansoprazol, dexrabeprazol,… vì những ưu

điểm như liều dùng giảm, tác dụng chuyên biệt trên receptor, độc tính giảm… khi so

với dạng thuốc racemic [23], [24], [28]

Hiện nay, chế phẩm thuốc đối quang của nhóm PPI (esomeprazol, dexlansoprazol,dexrabeprazol) chưa được sản xuất nhiều ở Việt Nam, trong khi đó thành phẩm nhậpkhẩu lại có giá thành đắt Với nhu cầu của thị trường ngày càng lớn, các công ty dượcViệt Nam đã và đang nghiên cứu để sản xuất chế phẩm thuốc đối quang kể trên Vìvậy, cần phải xây dựng quy trình phân tích đồng phân quang học của các hoạt chất này

để từ đó có thể kiểm độ tinh khiết đồng phân

Trong nhóm thuốc PPI, lansoprazol và dạng đồng phân đối quang của nó(dexlansoprazol) được phát minh ra gần đây nhất nên các tạp chí trong và ngoài nước

có số lượng nghiên cứu về chúng còn hạn chế Hai phương pháp phân tích đồng phânquang học thường được sử dụng nhất là phương pháp điện di mao quản (CE) vàphương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với những điểm thuận lợi và khó khănkhác nhau

Vì lẽ đó, với mong muốn có thể xây dựng quy trình phân tích đồng phân quang họclansoprazol với nhiều khả năng ứng dụng vào thực tiễn, đề tài “Nghiên cứu phân tích

đồng phân quang học lansoprazol sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao” được

thực hiện với những mục tiêu như sau:

─ Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng pha động chứa tác nhân đối quang

─ Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột bất đối

─ Ứng dụng các quy trình đã thẩm định để định lượng và kiểm tra độ tinh khiết đồng

phân trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường và so sánh, đối chiếu kết quảgiữa kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với pha động chứa tác nhân đối quang và kỹthuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột bất đối

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ LANSOPRAZOL

Lansoprazol có tên khoa học: pyridinyl]methylthio-1H-benzimidazole (C16H14F3N3OS) với khối lượng phân tử là353,363 g/mol Số đăng ký CAS (Chemical Abstract Service- Dịch vụ tóm tắt hóachất) là 103577-45-3 Công thức cấu tạo của lansoprazol được thể hiện trong hình 1.1[1], [45]

2-[3-Methyl-4-(2,2,2-trifluoroethoxy)-2-Hình 1.1 Công thức cấu tạo lansoprazol

Về cấu trúc: Vị trí của nguyên tử lưu huỳnh (S) trung tâm tạo nên nhóm sulfoxid là vị trí xác định nên hai đồng phân lập thể (R) và (S) [7] Chúng tuy có công thức phân tử

và công thức cấu tạo hoàn toàn giống nhau nhưng sự phân bố trên mặt phẳng khônggian lại khác nhau, dẫn đến sự khác biệt trong tác dụng dược lý

Dexlansoprazol là đồng phân (R) của lansoprazol, có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo dexlansoprazol

1.1.1 Tính chất vật lý

- Bột kết tinh màu trắng hay nâu nhạt, không mùi

- Dễ tan trong ethyl acetat, ethanol tuyệt đối, rất ít tan trong ether, acetonitril và không

tan trong n-hexan và nước.

Bước 1: PPI được proton hóa lần đầu trên vòng pyridin và được tích lũy ở cáctiểu quản chế tiết Tình trạng này là một yếu tố quan trọng quyết định đến khả năng tácdụng của thuốc và nó phụ thuộc vào nồng độ PPI trong máu

Bước 2: Các PPI được proton hóa lần 2 trên vòng benzymidazol tạo thành dẫnxuất sulfonamid hoặc acid sulfenic Các phức hợp ưa lưu huỳnh này có tính phản ứngcao nên đã kết hợp với nhóm SH của acid amin cystein trong enzym để tạo nên các cầu

nối dísulfid tương đối ổn định Ở trạng thái này bơm H+, K+/ATPase bị bất hoạt khôngcòn khả năng vận chuyển ion H+ nữa.

Dexlansoprazol là đồng phân quang học dạng dexlansoprazol, đã được nghiên cứu

rằng có tác dụng dược lý hơn hẳn so với đồng phân (S)-lansoprazol trên tác dụng làm

lành vết loét và cũng có ảnh hưởng quan trọng hơn lên cytocrom CYP2C19

Dexlansoprazol bị chuyển hóa chậm hơn so với đồng phân (S)-lansoprazol, do đó thời

gian tác dụng của thuốc được kéo dài hơn [1]

1.1.4 Chỉ định

Lansoprazol được chỉ định điều trị nhiều bệnh dạ dày bao gồm cả loét dạ dày tá tràng,

điều trị nhiễm Helicobacter pylori, điều trị và phòng ngừa khả năng gây loét dạ dày tá

tràng của nhóm NSAID, hội chứng Zollinger-Ellison và trào ngược thực quản (GERD– gastroesophageal reflux disease) Thuốc cần được uống vào trước bữa ăn 30 phút, tốtnhất là vào buổi sáng [1]

1.1.5 Tương tác thuốc

- Lansoprazol được chuyển hóa nhờ hệ enzym cytochrom P450, nên tương tác với cácthuốc khác được chuyển hóa bởi cùng hệ enzym này Do vậy, không nên dùnglansoprazol cùng với các thuốc khác cũng được chuyển hóa bởi cytochrom P450

- Sucrafat: làm giảm hấp thu lansoprazol

- Ketoconazol, itraconazol: bị giảm tác dụng do lansoprazol làm giảm tính acid củamôi trường nên giảm sự hấp thu các thuốc này [1]

1.1.6 Định tính và định lượng

1.1.6.1 Phương pháp định tính

Phổ hấp thụ hồng ngoại

Lansoprazol có phổ hấp thu hồng ngoại với các đỉnh hấp thu tại 3231, 2984 và 2930,

1580, 1282, 1118 nm So sánh phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấpthụ hồng ngoại của lansprazol chuẩn [1]

Phổ hấp thu tử ngoại

Lansoprazol có khả năng hấp thu tử ngoại, cực đại hấp thu của lansoprazol trong dungmôi acetonitril là 285 nm [1].

1.1.6.2 Phương pháp định lượng

Phương pháp chuẩn độ điện thế

Hòa tan 0,300 g chế phẩm trong 40 ml ethanol 96% (TT), và pha loãng thành 50 mlvới nước Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) Xác định điểm kếtthúc bằng phương pháp chuẩn độ điện thế 1 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ)tương ứng với 36,94 mg C16H14F3N3OS [1]

1.1.6.3 Các chế phẩm hiện có trên thị trường

Thuốc chứa hoạt chất lansoprazol sản xuất ở Việt Nam đã phân phối trên thị trường cóLansoprazol Stada (STADA), TV.Lansoprazol (TV Pharm), Lansoprazol(Khapharco),…Hiện chưa có thuốc chứa hoạt chất dexlansoprazol sản xuất ở ViệtNam, chỉ có thuốc nhập khẩu có biệt dược Dexilant (Takeda, Nhật Bản)

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

1.2.1 Khái niệm về đồng phân đối quang

Đồng phân đối quang (enantiomers) là hai đồng phân không gian dạng “ảnh” và “vật”

qua gương Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống nhau, chỉ khác về cách bố tríkhông gian của các nhóm thế quanh nguyên tử bất đối ở vị trí trung tâm Đồng phânquang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay củamặt phẳng ánh sáng phân cực Điều kiện cho tính quang hoạt chính là: cấu trúc hìnhhọc của phân tử phải không chồng khít hoàn toàn với hình ảnh phản chiếu qua gươngcủa chính phân tử đó, tương tự như hình ảnh của bàn tay phải và bàn tay trái(chirality) Ngoài sự khác biệt về khả năng quay mặt phẳng phân cực và sự khác biệt

về cấu trúc không gian ra thì tất cả các tính chất hóa lý thông thường của đồng phân

đều giống nhau Chất mà có khả năng làm quay mặt phẳng phân cực một góc α nào đó

gọi là chất quang hoạt [3], [7], [32]

Chính sự khác biệt về cấu trúc không gian đã làm cho các dạng đồng phân có ái lựckhác nhau với các thụ thể sinh học, cũng như chất mang, receptor, enzym,… Vì thế

đặc tính dược động học, cũng như đặc tính dược lý của hai dạng đồng phân của cùng

một thuốc có thể rất khác nhau Có tới 64% các dược chất đang sử dụng hiện nay có

đồng phân đối quang, mà khoảng 30% trong số đó có các đồng phân đối quang mangđặc tính dược lý và dược động học khác nhau [3], [7]

1.2.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích đồng phân đối quang

Để tách riêng biến thể (±)-X thành đối quang, (±)-X được cho qua cột nhồi chất hấp

phụ bất đối xứng (viết tắt là (-)-Chp) Khi cho X chảy qua cột, các đối quang tạo phức

hợp có độ lớn yếu với chất nhồi bất đối xứng qua liên kết hydro và tạo thành các phức

dia (đồng phân quang học không đối quang): (-)-Chp.(+)-X và (-)-Chp.(-)-X Những

phức này có tính chất vật lý, năng lượng liên kết, hằng số tạo phức khác nhau và do đó

có độ bền khác nhau Vì vậy, đối quang nào tạo phức ít bền vững hơn sẽ đi qua cộtnhồi chất hấp phụ bất đối xứng nhanh hơn đối quang còn lại Dựa vào sự khác biệt đó,hai đối quang được tách riêng [3], [7]

Hiện nay, phương pháp sắc ký có vai trò quan trọng trong điều chế cũng như phân tích

đồng phân quang học, bao gồm sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng

cao Đây là phương pháp cho kết quả phân tích cao, ổn định, chính xác Tuy nhiên,thời gian phân tích thường kéo dài, pha tĩnh bất đối thường rất đắt và không phải phatĩnh nào cũng áp dụng được cho các chất [3], [7]

Có hai cách để phân tách các đồng phân đối quang bằng phương pháp sắc ký:

Trực tiếp: thông qua sự tạo thành các đồng phân không đối quang nhất thời (transientdiastereisomer) trong quá trình sắc ký, bằng cách thêm vào pha động các tác nhân đốiquang thích hợp hoặc sử dụng pha tĩnh bất đối [3], [7]

Gián tiếp: thực hiện phản ứng tổng hợp tạo thành các đồng phân không đối quang bềnvững (stable diastereisomer) trước khi tiến hành sắc ký [3], [7]

1.2.3 Điện di mao quản trong phân tích đồng phân đối quang

Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tử tích điện hòa tan hay phân tán trong

dung dịch chất điện giải khi có dòng điện đi qua Điện di mao quản (CE) là phươngpháp sử dụng mao quản làm kênh di chuyển để thực hiện quá trình tách điện di Từnhững năm 1990, CE đã được đưa vào các chuyên luận trong Dược điển các nước nhưDược điển Anh (BP), Dược điển Châu Âu (EP), Dược điển Mỹ (USP),… CE cho thấyhiệu quả trong phân tích đồng phân quang học [3], [4], [14], [16], [18]

Có hai cách tách đồng phân quang học bằng CE là trực tiếp hoặc gián tiếp Phươngpháp trực tiếp được sử dụng phổ biến hơn trong CE Với phương pháp này, các tácnhân quang hoạt được thêm vào dung dịch điện ly nền Các tác nhân sẽ tạo phức hợpvới cả hai đối quang để hình thành các đồng phân đối quang không nhất thời (transientdiastereisomer) Do hằng số liên kết (binding constants) của tác nhân đối quang vớimỗi đối quang khác nhau mà hai đối quang được tách ra Khi so sánh với phương phápsắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), vẫn có những khác biệt rõ ràng về cách vận hành,những điểm thuận lợi và không thuận lợi giữa hai phương pháp này Điểm mạnh của

CE là nguyên lý vận hành đơn giản, lượng mẫu phân tích không nhiều, dung môi sửdụng hạn chế Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều hạn chế như độ lặp lại không cao,cột mao quản đường kính khá hẹp nên dễ bị tắc nghẽn, dễ bị hấp phụ mẫu phân tíchtrên bề mặt [14], [34]

1.2.4 Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác

1.2.4.1 Phương pháp cơ học

Hỗn hợp racemic thường tồn tại ở dạng tinh thể riêng biệt của dạng (+) và dạng (-).Tùy vào kích thước của các tinh thể, nếu đủ lớn có thể dùng phương pháp thủ công đểnhặt riêng các phân tử có cấu hình khác nhau Tuy nhiên phương pháp này hiện naychỉ mang tính lịch sử và ít được sử dụng [3], [4], [7]

1.2.5.2 Phương pháp đặt mầm

Năm 1866, Gerer đã đưa thêm một đối quang tinh khiết vào dung dịch racemic nồng

độ bão hòa để dung dịch trên đạt trạng thái bão hòa với đối quang thêm vào Dạng đối

quang này kết tinh và có thể tách ra Phương pháp này chỉ áp dụng được với dung dịchbão hòa của hỗn hợp racemic nhưng không áp dụng được với hợp chất racemic [3],[4], [7].

1.2.5.3 Phương pháp sinh hóa

Enzym là những chất xúc tác có tính chọn lọc về cấu trúc và đặc thù lập thể rất cao Sựtương thích giữa enzym và cơ chất giống như hình ảnh “ổ khóa-chìa khóa” Do đó,enzym thường được ứng dụng để điều chế các chất quang hoạt bằng cách cố địnhenzym trên các chất mang Các đối quang phản ứng với enzym bằng các vận tốc khácnhau, từ đó có thể tổng hợp bất đối xứng hoặc phân hủy bất đối xứng để có được một

đối quang tinh khiết Phương pháp này tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết quang học cao,ứng dụng nhiều trong thực tiễn, đặc biệt là trong điều chế các acid amin có tính quang

hoạt [3], [4], [7]

1.2.5.4 Phương pháp hóa học dựa trên sự tạo thành các đồng phân quang học không có tính đối quang

Đây là phương pháp quan trọng nhất để tách riêng các chất quang hoạt, bản chất của

phương pháp có thể được biểu diễn bằng sơ đồ sau:

(S*): Tác nhân quang hoạt

(R,S*) và (S,S*): Đồng phân quang học không đối quang (đồng phân dia)

(R), (S): Các đối quang tinh khiết

Khi cho biến thể racemic phản ứng với một tác nhân quang hoạt (S*) thì thu được hai

chất (R,S*) và (S,S*) là một cặp đồng phân quang học không đối quang Hai đồng

phân này khác nhau về tính tan, áp suất hơi, hệ số hấp phụ và nhiều tính chất khác, nên

Kết tinh phân đoạn (R,S*)

(S,S*)

(R) (S)

có thể tách riêng hai đồng phân dia ra khỏi hỗn hợp của chúng bằng các phương phápkết tinh phân đoạn hay phương pháp sắc ký.

Sự tách riêng biến thể racemic qua sự tạo thành các đồng phân quang học không đốiquang gồm 3 giai đoạn:

- Tạo thành đôi đồng phân quang học không đối quang

- Dựa vào sự khác nhau về tính chất để tách riêng cặp đôi đồng phân quang học không

đối quang

- Phá vỡ phân tử đồng phân quang học không đối quang tinh khiết để tách ra đối quang

và tác nhân đối quang tương ứng

Tác nhân đối quang cần được lựa chọn dựa trên bản chất hóa học của chất cần phântích Hiện nay, phương pháp tạo đồng phân dia được sử dụng hữu hiệu nhất để tổnghợp và tách các chất đối quang

1.3 PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG TRONG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (CHIRAL ADDITIVE MOBILE PHASE)

1.3.1 Khái niệm

Sự phân tách trực tiếp hai đồng phân đối quang có thể tối ưu hóa bằng cách thêm vàopha động tác nhân đối quang, được gọi là pha động đối quang Cơ chế nhận biết các

đồng phân đối quang đã được đề cập trước đó Nguyên tắc là chất chọn lọc đối quang

sẽ tạo dẫn chất với hai đồng phân đối quang để hình thành hai sản phẩm không phải là

đối quang (diastereodisomers), như vậy chúng sẽ có tính chất vật lý và hóa lý khác

nhau nhiều hơn, do đó có thể tách chúng ra khỏi nhau trong điều kiện sắc ký lỏng bìnhthường Sự phân tách các đồng phân đối quang được tối ưu hóa bởi các chất chọn lọc

đối quang sẽ dẫn tới sự tạo thành các phức chất đối quang trong pha động, các phức

chất là đồng phân quang học nhưng không đối quang hoặc các chất chọn lọc đối quang

sẽ bao bọc pha động tạo thành pha tĩnh quang hoạt có khả năng phân biệt và tách cácchất đối quang Kỹ thuật phân tích bằng sắc ký lỏng sẽ được chú trọng và mở rộngtheo hướng sử dụng chất đối quang thêm vào pha động để tách và định lượng các đồngphân đối quang Bên cạnh đó cũng góp phần giới hạn việc lựa chọn các hệ thống phát

hiện và các phức chất không bền giữa chất chọn lọc đối quang và đồng phân đối quang

sẽ dễ dàng được phát hiện bởi các đầu dò khác nhau, mở rộng hơn về khả năng táchcác chất và ít bị giới hạn hơn so với sử dụng cột sắc ký [21]

1.3.2 Các tác nhân quang hoạt

Các tác nhân quang hoạt thích hợp với cấu trúc của chất phân tích Để đạt hiệu suấttách tốt, yêu cầu tác nhân phải là chất quang hoạt có tác động chọn lọc đến thành phầnquang hoạt của mẫu phân tích và tạo cho các thành phần này ái lực khác nhau với dungmôi hoặc dung dịch đệm Các tác nhân quang hoạt không được hấp thu UV ở vùngphát hiện của mẫu phân tích Trong các tác nhân quang hoạt được sử dụng để tách

đồng phân thì cyclodextrin và các dẫn chất của chúng là những tác nhân được sử dụng

phổ biến do có nhiều ưu điểm kể trên [6], [22], [26], [43]

1.3.2.1 Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) thuộc nhóm hợp chất được tạo thành từ các phân tử đường liên kết

với nhau tạo thành vòng (vòng oligosaccharides), có từ 5 tiểu đơn vị glucopyranoside theo liên kết 1,4 Trong tự nhiên, CD tồn tại dưới dạng α-, β-, γ-

α-D-cyclodextrin với 6-8 tiểu đơn vị

Hình 1.3 Cấu tạo của các dạng tồn tại của cyclodextrin.

Hiện nay, CD và các dẫn xuất được ứng dụng rất phổ biến được phân loại thành 3

nhóm sau Nhóm CD không tích điện gồm β–CD, methyl-β–CD, dimethyl-β–CD và hydroxy-β-CD Nhóm CD tích điện dương gồm methylamino-β-CD và hepta-methyl- amino-β-CD Nhóm CD tích điện âm gồm carboxymethyl-β-CD, muối natri phosphat

β-CD, muối natri sulfobutylether (SBE) β-CD, carboxymethyl γ –CD và muối natri

phosphat γ –CD [22].

1.3.2.2 Beta-cyclodextrin

Beta-cyclodextrin (β-CD) là loại CD chứa 7 đơn vị D-glucopyranose, độ tan trong nước thấp hơn so với α-CD và γ-CD β-CD là dạng CD được sử dụng nhiều nhất vì giá

thành thấp, tính phổ biến cao, có giá trị về thương mại mặc dù độ tan không cao

Dạng β-CD là dạng tự nhiên có độ chọn lọc cao nhất đối với các đồng phân so với các

dạng CD khác, nên trong các công trình nghiên cứu về tách đồng phân quang học bằng

các phương pháp GC, HPLC và CE, phần lớn ứng dụng CD và các dẫn chất của

β-CD làm chất quang hoạt

1.3.2.3 Các dẫn chất của β-cyclodextrin

Sự thay thế nhóm hydroxyl ở vị trí của C2, C3 và nhóm chính C6 bằng các nhóm khácnhau như: alkyl-, hydroxy alkyl-, carboxy alkyl-, amino-,… sẽ tạo thành các dẫn xuất

khác nhau của β-CD Các loại dẫn chất của β-CD như: dẫn xuất ester, ether,

sulfonat,… Tùy theo điều kiện phản ứng có thể tạo ra các dẫn chất thế ở cả ba vị tríC2, C3 và C6, hoặc thế một hoặc hai vị trí trong ba vị trí trên

Một số dẫn xuất thương mại thông dụng của β-CD: hydroxy propyl-β-CD; hydroxy etyl-β-CD; metyl-β-CD; heptakis (2,6-di-O-metyl)-β-CD; heptakis (2,3,6-tri- O-metyl)-β-CD; heptakis (2,3-diacetyl-6-sulfo)-β-CD; heptakis (2,3-dimetyl-6-sulfo)-

2-β-CD; heptakis-6-sulfo-2-β-CD; dimetyl amino-2-β-CD; carboxy metyl-2-β-CD; carboxy

etyl-β-CD; carboxy metyl etyl-β-CD… [43]

1.4 CỘT SẮC KÝ LỎNG CÓ PHA TĨNH BẤT ĐỐI (CHIRAL STATIONARY PHASE)

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký cột bất đối xứng là một biến thể của sắc ký cột được sử dụng để tách các đồngphân quang học Pha tĩnh loại này chứa một đồng phân đối quang duy nhất của hợpchất bất đối

Pha tĩnh bất đối có thể được tạo thành bằng cách gắn hợp chất bất đối xứng lên bề mặtcủa chất hỗ trợ như silica gel Các pha tĩnh bất đối phổ biến dựa trên các

oligosaccharid như cellulose hoặc cyclodextrin (đặc biệt là với β-cyclodextrin, một

phân tử vòng bảy đường) Việc tách các chất đối quang bằng cách sử dụng cột HPLCbất đối có thể sử dụng cột HPLC có pha tĩnh bất đối xứng (CSP) Các chất đối quang

được phân tách dựa trên số lượng và loại của mỗi tương tác xảy ra trong quá trình

chúng tiếp xúc với pha tĩnh bất đối

1.4.2 Một số loại pha tĩnh bất đối

1.4.2.1 Pha tĩnh bất đối bản chất protein

Pha tĩnh bất đối bản chất protein gồm các enzym, protein huyết tương và các receptor.Protein là cấu trúc phức tạp với diện tích bề mặt lớn bao gồm nhiều trung tâm tạo lậpthể và các vị trí liên kết khác nhau, cho phép nhiều khả năng tương tác giữa các phân

tử với các phân tử nhỏ [55] Ứng dụng đầu tiên của protein dưới dạng CSP đã đượcbáo cáo vào năm 1973, mô tả việc tách các chất đối quang tryptophan, bản chất là 1loại acid amin bằng cách sử dụng một albumin huyết thanh bovin (BSA) -sepharoseCSP Sau báo cáo đầu tiên này, nhiều CSP dựa trên protein đã được phát triển, vớialbumin huyết thanh proteinsthehuman được sử dụng nhiều nhất (HSA), α1-acidglycoprotein (AGP), ovomtio thô (OVM) và cellobiohydrolase I (CBH I) các proteinnày như các bộ chọn lọc bất đối đã được ghi nhận rõ ràng về sự cân bằng sắc ký đốivới một loạt các hợp chất bất đối và để nghiên cứu ái lực liên kết Protein dưới dạngCSP được áp dụng trên các nghiên cứu về ái lực và dược động học vì chúng có thể bắtchước các hệ thống in vivo, đặc điểm này rất quan trọng trong việc thiết kế thuốc [43].Khả năng sử dụng chất hữu cơ đục hoặc nước làm pha động được chỉ ra là liên quancủa CSP dựa trên protein xem xét khả năng tương thích của nó bằng cách sử dụng khốiphổ để phát hiện Nhược điểm của loại CSP này là công suất và hiệu quả thấp Hơnnữa, khả năng biến tính của protein giới hạn phạm vi pH, cường độ ion, nhiệt độ vàthành phần chất hữu cơ của pha động, là kết quả của việc giảm tính ổn định hóa học vàsinh hóa của nó

HSA là CSP dựa trên protein được áp dụng nhiều nhất và nó được sử dụng chủ yếutrong các nghiên cứu về liên kết thuốc với protein [43] Trong kỹ thuật tách, nó được

áp dụng để phân tích các hợp chất có tính axit yếu và trung tính cũng như các phân tử

lưỡng cực (zwitterionic) Để chuẩn bị loại CSP này, protein có thể được hấp thụ vật lýhoặc được liên kết cộng hóa trị vào silicagel pha tĩnh.

1.4.2.2 Pha tĩnh bất đối bản chất cyclodextrin

Cyclodextrins bao gồm các oligosaccharid mạch vòng; loại macrocycles này có thể

nón cắt ngắn với phần bên trong không phải là khoang cực và các nhóm hydroxyl tự

do nằm trên các cạnh lớn hơn và nhỏ hơn Các nhóm hydroxyl có thể được tạo dẫnxuất bằng các nhóm thế phân cực hoặc bất cực khác nhau [55], có thể ảnh hưởng đếntính linh hoạt tuân thủ của một cyclodextrin nhất định, sửa đổi kích thước của khoangcủa nó và tạo các vị trí ràng buộc bổ sung [43]

Cơ chế nhận dạng đối quang thường dựa trên sự hình thành của một phức hợp baogồm giữa các chất phân tích và khoang bên trong của cyclodextrin [43] Ngoài ra, cácchất phân tích có thể thiết lập các loại tương tác khác nhau với mặt bên ngoài, baogồm tương tác lưỡng cực, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết π-π, Liên kết cộng hóatrị của các dẫn xuất cyclodextrin được ứng dụng nhiều nhất vì nó cung cấp một liênkết mạnh mẽ và bền vững với hỗ trợ sắc ký Các chất liên kết phổ biến nhất là ete,amino và urê Gần đây, một trình liên kết triazole cũng được mô tả tính ổn định caocủa loại CSP này cho phép sử dụng nhiều loại dung môi như các thành phần của pha

động phân cực nhiều, mang lại hiệu quả phân tách đồng phân cho các chất phân tích

khác nhau [55] Có thể phối hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân hoặc phương phápdocking hoặc mô hình phân tử để có thể nhận biết được dạng đối quang trên cột phatĩnh loại này

1.4.2.3 Pha tĩnh bất đối bản chất polysaccarid

Ứng dụng đầu tiên của polysaccharid làm chất chọn lọc sắc ký đồng phân đối quangđược mô tả bởi Hessen và Hagel, năm 1976 Kể từ đó, nhiều dẫn xuất polysaccharid

khác nhau đã được sử dụng rộng rãi làm CSP do đặc tính đối quang cao của chúng saukhi tạo dẫn xuất Tuy nhiên, amylose và cellulose là polysaccharid chính của nhómnày ứng dụng trong pha tĩnh bất đối, tiếp theo là chitosan và chitin [51] Khả năngnhận biết bất đối xứng của các dẫn xuất polysaccharid phụ thuộc vào cấu trúc nhóm đa

dạng, bao gồm các đơn vị đường, các trung tâm tạo liên kết của các đơn vịglucopyranose, loại liên kết và vị trí của nó, cũng như các chuỗi polyme liền kề [49].

Sự cuộn xoắn của xương sống polyme cũng cần thiết cho tính đối quang [43] Các dẫnxuất polysaccharid làm bộ chọn lọc bất đối hiệu quả có thể bao gồm phenyl, alkyl hoặcbenzylcarbamat, este, benzoat, hoặc nhóm aryl hoặc cycloalkyl [52] Benzoat hoặcphenylcarbamat các chất có thể bao gồm metyl, metoxy, trong số các nhóm khác, và /hoặc các nhóm thế clo trong vòng thơm, cho biết khả năng hòa tan và nhận dạng bất

đối khác nhau [52] Hơn nữa, vị trí của các nhóm thế trong vòng thơm ảnh hưởng đến

hiệu suất cân bằng đối quang [49] Các dẫn xuất polysaccharid có thể được phủ lênchất hỗ trợ sắc ký, như silica hoặc dẫn xuất, bằng quá trình hấp phụ cho phép diện tích

bề mặt lớn hơn và hiệu quả cao [43] CSP bao gồm các dẫn xuất polysaccharid đượcphủ có thể hoạt động ở pha bình thường, hữu cơ phân cực và chế độ rửa giải pha đảongược; tuy nhiên, chúng có những hạn chế do không tương thích với dung môi “khôngchuẩn”, chẳng hạn như diclometan, cloroform, toluen, hoặc aceton [43] Việc sử dụngnhững dung môi đó trong pha động có thể làm tan polysaccarid hấp phụ của pha tĩnh.Trong số các CSP dựa trên polysaccharid được phát triển, 3,5-đimetylphenyl tris-phenylcarbamat của amylose và cellulose được chứng minh là có hiệu suất nhận biết

đối quang cao nhất Hiện nay, xu hướng nghiên cứu đặc điểm cấu trúc liên quan đếnđối quang, cơ chế nhận dạng và hành vi sắc ký của chúng ở cấp độ phân tử để phát

triển các polysaccarid trong tương lai

1.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DEXLANSOPRAZOL

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Không tìm thấy nghiên cứu trong nước về phương pháp định lượng dexlansoprazol

1.5.2 Nghiên cứu nước ngoài

- Nghiên cứu của tác giả Lajos Attila Papp phương pháp phân tích đồng phân đốiquang của lansoprazol bằng phương pháp điện di mao quản (CE) [37]

Điều kiện điện di:

Cột điện di Cột mao quản silica nung chảy

Dung dịch điện ly nền Dung dịch đệm phosphat 25 mM, pH = 7,0, chứa 10 mM

sulfobutyl-ether-β-CD và 20 mM γ-CD

Áp suất tiêm mẫu 50 mbar

Thời gian tiêm mẫu 3 s

Detector UV Bước sóng phát hiện 210 nm

- Tác giả Juon Jose và cộng sự sử dụng phương pháp điện di mao quản để phân tích

đồng phân quang học của lansoprazol trong chế phẩm thuốc [35]

Điều kiện điện di:

Cột điện di Cột mao quản silica nung chảy

Dung dịch điện ly nền Dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH = 2,2, chứa 12 mM

β-CD và 5 mM natri sulphit

Áp suất tiêm mẫu 50 mbar

Thời gian tiêm mẫu 3 s

Detector UV Bước sóng phát hiện 285 nm

- Tác giả P Balamurugan và cộng sự đã đề ra phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệunăng cao để phân tích dexlansoprazol [42]

- Tác giả Miura M sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp chiết pha rắn để nghiêncứu phân tích đồng phân đối quang lansoprazol trong mẫu huyết thanh [40]

Detector UV Bước sóng phát hiện 285 nm

Nhận xét: Hiện nay chỉ có các công bố nước ngoài về nghiên cứu tách đồng phânquang học lansoprazol Còn đối với phạm vi trong nước chưa có đề tài thực hiện phântích đồng phân quang học hoạt chất lansoprazol, đặc biệt là sử dụng kỹ thuật sắc kýlỏng hiệu năng cao với pha động chứa tác nhân đối quang và kỹ thuật sắc ký lỏng hiệunăng cao sử dụng cột pha tĩnh bất đối Tuy nhiên, nhu cầu phát triển các thuốc đốiquang trong nước đang ngày càng tăng Do đó cần có nghiên cứu xây dựng quy trìnhphân tích đồng phân quang học của các hoạt chất này để từ đó kiểm tra độ tinh khiết

đồng phân Đó là lý do thực hiện đề tài này

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

Hoạt chất lansoprazol và đối quang dexlansoprazol

2.1.2 Hóa chất

- Nguyên liệu thử nghiệm gồm:

Viên nén Lansoprazol STADA 30 mg (Lansoprazol 30 mg)- Việt Nam, SĐK: 1171-03, Lô: 180819 , Hạn dùng: 24/02/2022

VNB-Viên nén Dexilant 60 mg (Takeda) (Dexlansoprazol 60 mg)- Nhật Bản, SĐK: 655-17, Lô: 240619 , Hạn dùng: 05/04/2022

VN2 Danh mục chất chuẩn đối chiếu được thể hiện trong bảng 2.1:

Bảng 2.1 Danh mục các chất đối chiếu

Chất đối chiếu Hàm lượng (%) tính trên

chế phẩm nguyên trạng Số lô Nguồn gốc

080718 VKN thuốc TP.HCM

- Dung môi, hóa chất, thuốc thử được thể hiện trong bảng 2.2:

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất thuốc thử

1 Sulfobutyl ether β-cyclodextrin

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ

- Trang thiết bị được thể hiện trong bảng 2.3:

Bảng 2.3 Danh mục trang thiết bị

1 Máy sắc ký lỏng hiệu

năng cao

HPLC Shimadzu UFLC20A, đầu dò DDA SPD-M20A

Nhật

5 Cân phân tích Sartorius, độ chính xác

Cột Lux Cellulose-3 (cellulose tris (5-cloro-2-methylphenyl carbamat)) (250 x 4,6mM; 5 µm).

Bình định mức, pipet chính xác, pipet pasteur và các dụng cụ thủy tinh khác dùngtrong phân tích

Màng lọc PTFE 0,45 µm

Cối chày và nhiều dụng cụ khác

Các thiết bị và dụng cụ phân tích đã được hiệu chuẩn đạt quy định GLP và ISO/IEC17025

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang

Quy trình định lượng được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học và đặc tính lý hóa củadexlansoprazol Thông qua tài liệu tham khảo, kỹ thuật sắc ký lỏng HPLC với tác nhân

đối quang β-CD và các dẫn xuất, quy trình khảo sát đã được lựa chọn.

2.2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Để xây dựng các phương pháp xác định hai đồng phân đối quang của lansoprazol

trong chế phẩm thuốc, các khảo sát thực nghiệm về khả năng tách hai đồng phân này

đã được tiến hành trên phương pháp HPLC:

- Cột sắc ký: các loại cột C8, C18

- Tác nhân đối quang: sulfobutyl ether cyclodextrin (SBE-CD), methyl cyclodextrin (M-β-CD), hydroxypropyl β-cyclodextrin (HP-β-CD), β-cyclodextrin,…

β Nồng độ tác nhân đối quang

- pH pha động: khảo sát pH vào khoảng 2,5-6,5

- Pha động: nồng độ đệm, tỷ lệ pha động,…

- Bước sóng phát hiện

Điều kiện lựa chọn: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá trình

tách hai đồng phân nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các thông số: hai pic

- Dung dịch mẫu chuẩn lansoprazol (1200 µg/ml): Cân chính xác khoảng 30 mg

lansoprazol chuẩn, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu

âm 10 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọcPTFE 0,45 µm, siêu âm đuổi khí

- Dung dịch mẫu chuẩn dexlansoprazol (600 µg/ml): Cân chính xác khoảng 30 mg

dexlansoprazol chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 ml methanol,siêu âm 10 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọcPTFE 0,45 µm, siêu âm đuổi khí

- Dung dịch mẫu thử lansoprazol: Cân 20 viên nang lansoprazol, xác định khối lượng

trung bình thuốc trong nang Cân lượng thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 30

mg lansoprazol, cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm

10 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọcPTFE 0,45 µm, siêu âm đuổi khí

- Dung dịch mẫu thử dexlansoprazol: Cân 20 viên nang dexlansoprazol, xác định khối

lượng trung bình thuốc trong nang Cân lượng thuốc đã nghiền mịn tương ứng vớikhoảng 30 mg dexlansoprazol, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 35 mlmethanol, siêu âm 10 phút, lắc đều, để nguội, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều,lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm, siêu âm đuổi khí

- Dung dịch mẫu placebo: chuẩn bị như dung dịch mẫu thử nhưng thay lượng bột

thuốc bằng lượng tá dược tương ứng trong mẫu thử

- Dung dịch mẫu trắng: Dung môi hòa tan mẫu là methanol.

2.2.1.3 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Thẩm định quy trình phân tích định lượng bằng kỹ thuật HPLC trên mẫu được thẩm

định theo hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích (2005) Thẩm định

phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

- Tính tương thích hệ thống (System Suitability)

- Giới hạn phát hiện (Detection Limit - LOD)

- Giới hạn định lượng (Quantitation Limit - LOQ) [10], [11], [17]

a) Tính tương thích hệ thống

Kiểm tra tính tương thích hệ thống là một phần không thể tách rời trong nhiều quytrình phân tích Đánh giá tính tương thích hệ thống là những phép thử nhằm đánh giátính thích hợp của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy mócthiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử Các thông số của phép thửtính tương thích của hệ thống được thiết lập cho từng quy trình riêng biệt phụ thuộcvào loại quy trình được thẩm định

Chuẩn bị mẫu: Pha mẫu chuẩn theo mục 2.2.1.2

Tiến hành: Tiêm 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn có cùng nồng độ, cùng điều kiện Ghi nhậncác thông số: thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), hệ số bất đối (AS), độ phân giải(RS), hệ số dung lượng (k’), số đĩa lý thuyết (N)

Yêu cầu: RSD (tR, S, N) ≤ 2%; RS ≥ 1,5; 0,8 ≤ AS ≤ 1,5 [30], [31]

b) Tính đặc hiệu

Việc xác định tính đặc hiệu cần thiết được tiến hành trong khi thẩm định cácphép thử định tính, xác định tạp chất và định lượng Quy trình dùng để xác định tính

đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định của quy trình phân tích Tính đặc hiệu là khả

năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể cótrong mẫu thử Thông thường các thành phần này gồm các tạp chất, sản phẩm phânhuỷ, chất nền Một quy trình phân tích kém đặc hiệu có thể được bổ trợ bằng mộthoặc nhiều quy trình phân tích khác Định nghĩa này có liên quan đến các phép thửsau:

+ Định tính là để khẳng định sự có mặt của chất phân tích

+ Thử tinh khiết là để khẳng định tất cả các quy trình phân tích cho phép xác

định chính xác hàm lượng tạp chất trong chất phân tích ví dụ như phép thử tạp chất

liên quan, kim loại nặng, hàm lượng của dung môi tồn dư

+ Định lượng (hàm lượng hoặc hoạt lực) là đưa ra kết quả chính xác về hàmlượng hoặc hoạt lực của chất phân tích trong mẫu thử

Chuẩn bị mẫu: Pha mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu chuẩn, mẫu thử theo mục 2.2.1.2.Tiến hành: Thực hiện quy trình sắc ký để phân tích các mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn,mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn

Yêu cầu:

- Mẫu trắng, mẫu placebo không cho pic ở khoảng thời gian lưu tương ứng với thờigian lưu của mẫu chuẩn

- Mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của mẫu chuẩn

- Phổ UV tại thời gian lưu của các pic trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải giống nhau

- Đạt độ tinh khiết khi kiểm tra độ tinh khiết pic (Peak purity index) [30], [31]

c) Tính tuyến tính

Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ vớinồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử

Chuẩn bị mẫu: Pha dãy dung dịch chuẩn có chứa nồng độ chất chuẩn tăng dần từ nồng

độ 25%, 50%, 100%, 150% đến 200% so với dung dịch chuẩn pha theo mục 2.2.1.2

Tiến hành: Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn đã được chuẩn bị theo điều kiện đã chọn.Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độchất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương phápbình phương tối thiểu Sử dụng phép phân tích hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tínhthích hợp của phương trình hồi quy và trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của hệ sốtrong phương trình hồi quy

Yêu cầu: R2 ≥ 0,995 [30], [31]

d) Độ đúng

Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với

giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận Đôi khi khái niệm này còn gọi là độxác thực (trueness) Độ đúng cần được thiết lập trong khoảng phân tích xác định củaquy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử được chuẩn bị theo mục 2.2.1.2 Thêm chính xác một lượngchất chuẩn cần phân tích vào mẫu thử tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100%,120% so với mức nồng độ ghi trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính củaphương pháp

Tiến hành: Tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ thực hiện trên 3 mẫu

ượ ạ ấ ê à × 100%

Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98-102% và RSD ≤ 2% [30], [31]

e) Độ chính xác

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân

tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồngnhất dưới những điều kiện mô tả Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độchính xác trung gian và độ tái lặp Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực

và đồng nhất Tuy nhiên, nếu không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc

một dung dịch mẫu thử Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ dao động, độlệch chuẩn hoặc hệ số độ dao động của một loạt phép đo.

- Độ lặp lại (Repeatability)

Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết quả của:

a) Tối thiểu 9 lần định lượng trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy trình(ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) hoặc

b) Tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%

Chuẩn bị mẫu: 6 mẫu thử được chuẩn bị theo mục 2.2.1.2

Tiến hành: Tiến hành định lượng 6 mẫu thử ở nồng độ 100%

Yêu cầu: RSD ≤ 2%

- Độ chính xác trung gian (Intermediate Precision)

Việc xác định độ chính xác trung gian được thực hiện thông qua việc xem xét thay đổi

điển hình bao gồm: ngày phân tích, kiểm nghiệm viên, thiết bị, v.v

Độ chính xác của mỗi một quy trình cần phải đưa ra các dữ liệu sau: Độ lệch chuẩn

(standard deviation), độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation hay hệ sốbiến thiên = coefficient of variation) và khoảng tin cậy [12]

Chuẩn bị mẫu: 6 mẫu thử khác được chuẩn bị theo mục 2.2.1.2

Tiến hành: Thay đổi kiểm nghiệm viên Thực hiện tương tự chỉ tiêu độ lặp lại

Yêu cầu: Kết quả 2 kiểm nghiệm viên có RSD ≤ 2%

f) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng nhỏ nhất của chất cần phântích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết để có thể định lượng

được

Tiến hành: Dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu, thông qua cách so sánh đáp ứng đo

được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng

và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được Tỷ lệ

đáp ứng trên nhiễu nằm giữa 3:1 hoặc 2:1 thường được chấp nhận để thiết lập giới hạn

phát hiện

Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng nhỏ nhất của chất phân tíchtrong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp Giớihạn định lượng là một thông số của phép định lượng các chất có nồng độ thấp trongmẫu thử, đặc biệt thường được dùng để xác định tạp chất và/hoặc sản phẩm phân huỷ.Tiến hành: Dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu, thông qua cách so sánh đáp ứng đo

được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết so với đáp ứng của mẫu

trắng và xác định nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể định lượng được Tỷ lệ

đáp ứng trên nhiễu thông thường là 10:1 [12]

2.2.2 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng phân quang học lansoprazol bằng HPLC sử dụng cột bất đối Lux cellulose

Quy trình định lượng được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học và đặc tính lý hóa củadexlansoprazol Thông qua nguồn tài liệu tham khảo, kỹ thuật sắc ký lỏng HPLC đã

được lựa chọn để khảo sát trên các cột bất đối Lux cellulose với pha tĩnh có bản chất là

dẫn xuất của hợp chất cellulose

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Để xây dựng các phương pháp xác định hai đồng phân đối quang của lansoprazol

trong chế phẩm thuốc, các khảo sát thực nghiệm về khả năng tách hai đồng phân này

đã được tiến hành trên phương pháp HPLC:

- Cột sắc ký: các loại cột Lux cellulose

- Pha động: thành phần và tỷ lệ pha động

Điều kiện lựa chọn: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá trình

tách hai đồng phân nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các thông số: hai pic

đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs > 1,5; hệ số bất đối As nằm

trong khoảng 0,8 - 1,5