xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có kháng nguyên ns1 của virus dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm về test nhanh ns1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH PHƯƠNG THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU CÓ KHÁNG NGUYÊN NS1 CỦA VIRUS DENGUE SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU

CÓ KHÁNG NGUYÊN NS1 CỦA VIRUS DENGUE

SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU

CÓ KHÁNG NGUYÊN NS1 CỦA VIRUS DENGUE

SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảtrong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Tác giả

Huỳnh Phương Thảo

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2018 – 2020

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc & Độc chất – Mã số: 8720210

XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU CÓ KHÁNG NGUYÊN NS1 CỦA VIRUS DENGUE SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

PHÒNG XÉT NGHIỆM VỀ TEST NHANH NS1

Huỳnh Phương ThảoThầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn, TS Nguyễn Vũ Thượng

Từ khóa: Bộ mẫu NS1, ngoại kiểm, test nhanh NS1, virus Dengue.

Mở đầu: Kết quả test nhanh phát hiện kháng nguyên NS1 của virus Dengue được sử

dụng rộng rãi trong chẩn đoán cũng như công tác phòng chống dịch sốt xuất huyết

Dengue Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị trong nước cung cấp bộ mẫu chuẩn NS1

để đánh giá chất lượng các phòng xét nghiệm về test nhanh NS1 Từ nhu cầu thực tếtrên, đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có

kháng nguyên NS1 của virus Dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét

nghiệm về test nhanh NS1

Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Huyết tương bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue của 20 tỉnh/thành

phố khu vực phía Nam được thu thập từ mẫu giám sát của Chương trình Phòng chốngSốt xuất huyết Quốc gia và mẫu NS1 âm tính được thu thập từ viện Truyền máu và

huyết học TP.HCM Phương pháp nghiên cứu: Sau khi sàng lọc với các tác nhân HIV, viêm gan B, viêm gan C, sởi, Rubella, Leptospira, Zika, Chikungunya, mẫu NS1 dương

tính được phối trộn cho đủ thể tích và mẫu âm tính được sử dụng để sản xuất 3 lô và

được xác định các đặc tính bằng realtime RT-PCR Dengue, ELISA phát hiện NS1 của

công ty SD và test nhanh NS1 của một số công ty sản xuất khác nhau Bộ mẫu đượcbảo quản ở dạng đông lạnh và đông khô Độ đồng nhất của bộ mẫu được thực hiện trên

5 mẫu ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại và độ ổn định được xác định ở 2 điều kiện bảo quản

là 2-8 oC và -20 oC trong 3 tháng bằng test nhanh SD

Kết quả: Đã sản xuất được bộ mẫu ngoại kiểm bao gồm 3 mẫu dương tính và 2 mẫu

âm tính ở dạng đông lạnh và đông khô đạt yêu cầu về độ đồng nhất và độ ổn định trong

3 tháng ở -20 oC Bộ mẫu đông khô của lô đầu tiên đã được sử dụng để triển khai ngoạikiểm, được gửi dưới dạng bưu phẩm tới 23 phòng xét nghiệm đánh giá chất lượng xétnghiệm NS1 và đều cho kết quả tương đồng với Viện Pasteur TP.HCM

Kết luận: Bộ mẫu ngoại kiểm cho test nhanh NS1 Dengue dạng đông khô và đông lạnh

đã được sản xuất thành công, đảm bảo độ đồng nhất và độ ổn định ở -20 oC trong 3tháng, đáp ứng tiêu chí của mẫu dùng trong chương trình kiểm tra chất lượng các phòngxét nghiệm

Master’s Thesis – Academic course: 2018 – 2020

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210

DEVELOPMENT OF PRODUCTION PROCESS OF DENGUE NS1 ANTIGEN

PANEL FOR EXTERNAL QUALITY ASSESSMENT

OF DENGUE NS1 RAPID TEST

Huynh Phuong ThaoSupervisor: Assoc Prof Dr Nguyen Duc Tuan, Dr Nguyen Vu Thuong

Keywords: NS1 panel, external quality assessment, NS1 rapid test, Dengue virus Introduction: Dengue NS1 antigen testing is a popular method to diagnose Dengue

fever in the early stages of the disease It uses the Dengue NS1 test result not only in diagnosis but also in Dengue prevention and control program So far, there have been

no local Dengue NS1 standard panel for external quality assessment of Dengue NS1

rapid test in Vietnam For that reason, this study was conducted to develop production

process of Dengue NS1 antigen panel for external quality assessment of Dengue NS1

rapid test

Methods: Object of study: Dengue patient plasma were collected from 20 southern

Vietnam provinces in the National Dengue Control Program and the NS1 negative

samples were collected from Hematology and Blood Transfusion hospital at Ho Chi

Minh city Methods: After screening for HIV, hepatitis B, hepatitis C, measles, Rubella,

Leptospira, Zika, Chikungunya, the NS1 pooled positive samples and the negative

samples were used to produce three batches and characterized by Dengue virus time RT-PCR, SD Dengue NS1 Ag ELISA and some different brands of NS1 rapid

real-tests The panels were stored in freeze-drying condition, and freezing at -20 oC Byusing SD rapid tests, the frozen and freeze-dried panels were evaluated homogeneity

by performing on 5 random samples with two replicates, and stability at two storageconditions at 2-8 °C and -20 °C for three months

Results: The sample panels including three positive samples and two negative samples

in frozen and lyophilized form were produced and conformed homogeneity andstability for three months at -20 oC The lyophilized samples of the first batch were

shipped to 23 laboratories for external quality assessment of Dengue NS1 test and the

results of testing showed similarity with the result from Pasteur Institute HCMC

Conclusion: The freeze-dried and frozen Dengue NS1 panels have been successfully

produced, ensuring uniformity and stability at -20 °C for three months, and can be usedfor external quality assessment scheme

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ iv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue 3

1.2 Các phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue 8

1.3 Kiểm tra chất lượng xét nghiệm 13

1.4 Bộ mẫu NS1 và các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng mẫu chuẩn 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Thiết kế nghiên cứu 20

2.3 Dân số mục tiêu 20

2.4 Dụng cụ - Trang thiết bị - Sinh phẩm – Hóa chất 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Thu thập mẫu từ mẫu giám sát 23

2.5.2 Xác định đặc tính mẫu thu thập 24

2.5.3 Sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue 34

2.5.5 Triển khai thí điểm ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue tại các tỉnh phía Nam 35

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Thu thập mẫu từ mẫu chương trình giám sát SXH quốc gia 37

3.2 Xác định đặc tính mẫu thu thập 38

3.2.1 Kết quả xét nghiệm sàng lọc HIV Ab, VGB Ag, VGC Ab, sởi, Rubella, Leptospira, Zika, chikungunya .38

3.2.2 Kết quả sàng lọc kháng nguyên NS1 trong mẫu huyết tương .41

3.3 Sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue 43

3.3.1 Phối trộn mẫu huyết tương 43

3.3.2 Bất hoạt mẫu 43

3.3.3 Xác định đặc tính mẫu 45

3.3.4 Sản xuất mẫu ngoại kiểm 51

3.4 Kết quả đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm 53

3.4.1 Đánh giá độ đồng nhất 53

3.4.2 Đánh giá độ ổn định mẫu 54

3.5 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue 56

3.6 Kết quả triển khai ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue tại các tỉnh phía Nam 57

3.6.1 Độ ổn đinh của bộ mẫu ngoại kiểm 58

3.6.2 Kết quả triển khai của các đơn vị tham gia 59

Chương 4: BÀN LUẬN 63

4.1 Mẫu thu thập 63

4.2 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue 65

4.3 Chất lượng mẫu ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của virus Dengue 66

4.4 Kết quả triển khai mẫu ngoại kiểm tại các tỉnh phía Nam 67

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt

CHIKV Virus Chikungunya

CRM Certified refence material Mẫu chuẩn được chứng nhận

ELISA Enzyme linked immunosorbent

assay

Phản ứng hấp phụ miễn dịchgắn men

EQA External Quality Assessment Đánh giá chất lượng bên

ngoài

ENIVD

The European Network forDiagnostics of Imported ViralDiseases

Mạng lưới PXN Châu Âu vềbệnh do virus du nhập

HCSD Hội chứng sốc Dengue

HRPO Horseradish Peroxidase

Phản ứng hấp phụ miễn dịchgắn enzym thu bắt kháng thểIgM

KVPN Khu vực phía NamNS1 Nonstructural protein 1 Protein không cấu trúc 1

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

RCPA Royal College of Pathologists of

Australasia

Hội nghiên cứu bệnh họcHoàng gia Úc

RT-PCR Reverse transcriptase

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại chuỗigen sau khi sao chép ngược

SCF Soluble complement-fixing Kháng nguyên cố định bổ thể

hòa tan

SXHD Bệnh sốt xuất huyết Dengue

TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Biểu mẫu dùng chọn mẫu sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm 24

Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu thập từ chương trình giám sát SXH năm 2019 37

Bảng 3.2 Phân bố mẫu huyết tương theo thời gian thu thập 37

Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc HBsAg của 20 mẫu G10 của 4 nhóm G200 39

Bảng 3.4 Kết quả sàng lọc HIV Ab, VGC Ab, sởi, Rubella, Leptospira 40

Bảng 3.5 Kết quả sàng lọc mẫu bằng realtime RT-PCR 41

Bảng 3.6 Kết quả xét nghiệm ELISA 42

Bảng 3.7 Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng realtime RT-PCR 46

Bảng 3.8 Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 47

Bảng 3.9 Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng test nhanh NS1 50

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết tương đông lạnh 53

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của mẫu huyết tương đông khô .54

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ ổn định bộ mẫu ngoại kiểm ở điều kiện vận chuyển của bộ mẫu đông lạnh 54

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá độ ổn định bộ mẫu ngoại kiểm ở điều kiện bảo quản 55

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ mẫu huyết tương đông khô gửi đến các đơn vị tham gia 58

Bảng 3.15 Các test nhanh được sử dụng ở các đơn vị tham gia ngoại kiểm 61

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc bộ gen của DENV .6

Hình 1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm sốt xuất huyết .9

Hình 1.3 Các dấu ấn trong chẩn đoán .9

Hình 2.1: Sơ đồ thực hiện quá trình sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm NS1 23

Hình 3.1 Sơ đồ phối hợp mẫu từ hai trăm mẫu riêng rẽ .38

Hình 3.2 Kết quả sàng lọc HBsAg của 4 mẫu G200 .39

Hình 3.3 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime RT-PCR phát hiện virus Chikungunya, Zika và Dengue 40

Hình 3.4 Chai mẫu khuấy từ qua đêm và khuấy đều 1 giờ sau khi bổ sung chất bảo quản (dung dịch Proclin 300 0,05%) ở nhiệt độ 2-8 oC 44

Hình 3.5 Tế bào C6/36 dưới kính hiển vị huỳnh quang (vật kính x 40) sau khi nhuộm DFA mẫu PI-1 của lô 1 (hình A) và chứng dương Dengue-2 (hình B) 44

Hình 3.6 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng realtime RT-PCR phát hiện DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 của 5 mẫu ngoại kiểm lô 1 45

Hình 3.7 Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISAphát hiện NS1 của mẫu PI-1 48

Hình 3.8 Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISAphát hiện NS1 của mẫu PI-3 48

Hình 3.9 Biểu đồ xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISAphát hiện NS1 của mẫu PI-4 49

Hình 3.10 Xác định đặc tính bộ mẫu bằng kỹ thuật ELISA phát hiện NS1 49

Hình 3.11 Kết quả xác định đặc tính bằng test nhanh NS1 ở lô 1, mẫu 1 51

Hình 3.12 Mẫu đông khô trên máy Modulyo D-230 và ống mẫu sau đông khô 52

Hình 3.13 Nhãn dán bộ mẫu ngoại kiểm 57

Hình 3.14 Bộ mẫu ngoại kiểm được đóng gói và gửi cho các đơn vị 57

Hình 3.15 Thời gian bộ mẫu vận chuyển tại nhiệt độ thường đến các đơn vị và quay

trở lại Viện Pasteur TP.HCM 58

Hình 3.16 Tỷ lệ phần trăm các đơn vị tham gia chương trình 59 Hình 3.17 Thời gian các đơn vị gửi kết quả bộ mẫu chuẩn 60 Hình 3.18 Các test nhanh NS1 được các đơn vị sử dụng xét nghiệm bộ mẫu ngoại

kiểm 60

MỞ ĐẦU

Chẩn đoán phòng xét nghiệm (PXN) là một thành phần quan trọng của giám sát và

kiểm soát sốt xuất huyết Dengue (SXHD) Trong giai đoạn nhiễm trùng cấp tính, việc

phát hiện dựa vào RNA và/hoặc protein không cấu trúc NS1, trong khi kháng thể khángIgM và/hoặc IgG là mục tiêu nhắm đến trong giai đoạn hồi phục Một số xét nghiệmchẩn đoán thương mại cho bệnh sốt xuất huyết hiện được sử dụng để phát hiện RNAhoặc định danh serotype của virus như phản ứng RT-PCR, hoặc phát hiện kháng thểNS1, hoặc IgG và IgM kháng lại virus Một hình thức phổ biến được sử dụng bởi cácPXN để duy trì độ chính xác và chất lượng chẩn đoán là đánh giá chất lượng bên ngoài(EQA) hoặc thử nghiệm thành thạo Theo đó, một cơ quan bên ngoài phân phối cácmẫu mù cho phòng thí nghiệm để phân tích và sau đó xác nhận và báo cáo kết quả.EQA có thể được sử dụng để so sánh hiệu suất phòng xét nghiệm, phát hiện các vấn đềtiềm ẩn liên quan đến sinh phẩm chẩn đoán hoặc quy trình, chỉ ra các khu vực trongphòng xét nghiệm cần cải thiện và xác định nhu cầu đào tạo Ngoài việc đảm bảo chẩnđoán chính xác bệnh sốt xuất huyết, chương trình EQA còn liên kết các PXN tham giavới các PXN tham chiếu quốc tế có thể hỗ trợ chẩn đoán chuyên sâu hơn hoặc các chứcnăng phân tích theo yêu cầu [13]

Trong khuôn khổ của Chương trình mục tiêu quốc qua phòng chống SXHD, cácphòng xét nghiệm chẩn đoán DENV ở bốn viện (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương,Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Viện Pasteur TP HCM)phụ trách công tác giám sát virus – huyết thanh học bệnh SD/SXHD ở từng khu vựctrên những quy trình kỹ thuật chẩn đoán DENV khác nhau Các PXN trong các bệnhviện, trung tâm y tế dự phòng và trung tâm chẩn đoán tư nhân cũng đã và đang sử dụngnhững bộ sinh phẩm chẩn đoán thương mại từ nhiều nguồn khác nhau để chẩn đoánsinh học bệnh SD/SXHD Do xét nghiệm NS1 có thể sử dụng để chẩn đoán xác định ởgiai đoạn sớm của bệnh và có thể thực hiện ở tuyến y tế cơ sở, cho kết quả nhanh (sau2-4 giờ) nên xét nghiệm NS1 tại tuyến quận/huyện trở nên phổ biến Từ đó, rất khó đốichiếu hoặc thu thập các kết quả đạt được bởi các viện khác nhau cũng như đánh giáchất lượng thật sự của các xét nghiệm

Theo quyết định 3711/QĐ-BYT ban hành ngày 19/09/2014 về “Hướng dẫn giám

sát và phòng chống bệnh sốt xuất huyết Dengue”, kết quả NS1 được đề cập trong định

nghĩa ca bệnh xác định để đưa vào hệ thống giám sát, báo cáo và xử lý ổ dịch Số lượng

ổ dịch phát hiện bằng NS1 tăng dần qua các năm Năm 2015, số lượng ổ dịch NS1(+)chiếm 25,5% với số ổ dịch được phát hiện là 2.614 Số lượng ổ dịch NS1(+) năm 2016chiếm 30,6% tổng số ổ dịch phát hiện (3.036 ổ dịch NS1(+)/9.924 ổ dịch) Năm 2018,ghi nhận sự gia tăng mạnh số ổ dịch có kết quả NS1(+) so với các năm trước Số lượng

ổ dịch NS1(+) chiếm 46,6% tổng số ổ dịch phát hiện (6.497 ổ dịch NS1(+)/13.932 ổdịch) Tỷ lệ ổ dịch NS1(+) tăng 10% so với năm 2017 (đạt tỷ lệ 37%) [7],[8],[9] Nhờxét nghiệm NS1 này, các ổ dịch được phát hiện và xử lý kịp thời góp phần cho côngtác phòng chống dịch hiệu quả Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị trong nước cungcấp bộ mẫu chuẩn NS1 để đánh giá chất lượng các phòng xét nghiệm Xuất phát từ

thực tiển trên, đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu có kháng nguyên NS1 của virus Dengue sử dụng trong kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm về test nhanh NS1” được thực hiện nhằm đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng xét nghiệm NS1

Dengue tại 20 tỉnh phía Nam Mục tiêu của đề tài là:

- Xây dựng ngân hàng mẫu xác định kháng nguyên NS1 của DENV

- Đánh giá chất lượng mẫu sau khi sản xuất

- Triển khai thí điểm ngoại kiểm kháng nguyên NS1 của DENV tại các tỉnh khuvực phía Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue

Bệnh sốt Dengue (SD) và bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh do virus truyền qua muỗi Aedes aegypti đã lan nhanh ở tất cả các khu vực của WHO trong những năm gần đây Muỗi Aedes aegypti cũng truyền bệnh Chikungunya và Zika Sốt xuất

huyết lan rộng khắp vùng nhiệt đới và bị ảnh hưởng bởi lượng mưa, nhiệt độ và quátrình đô thị hóa [36]

1.1.1 Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue trên thế giới và Việt Nam

1.1.1.1 Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue trên thế giới

Trước năm 1970, chỉ có 9 quốc gia trải qua dịch bệnh sốt xuất huyết nặng Bệnhhiện đang lưu hành ở hơn 100 quốc gia thuộc khu vực WHO ở Châu Phi, Châu Mỹ,Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Các khu vực Mỹ, ĐôngNam Á và Tây Thái Bình Dương bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất [36]

Các ca bệnh xảy ra trên khắp Châu Mỹ, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dươngvượt quá 1,2 triệu trong năm 2008 và hơn 3,34 triệu vào năm 2016 (dựa trên dữ liệuchính thức do các quốc gia thành viên đệ trình) Gần đây số lượng các trường hợp báocáo đã tiếp tục tăng Trong năm 2015; 2,35 triệu trường hợp mắc sốt xuất huyết đã đượcbáo cáo chỉ riêng ở Châu Mỹ, trong đó 10.200 trường hợp được chẩn đoán là sốt xuấthuyết nặng khiến 1181 người tử vong [36]

Không chỉ số lượng ca bệnh gia tăng khi bệnh lây sang các khu vực mới, mà cònbùng phát thành dịch Mối đe dọa của dịch sốt xuất huyết có thể xảy ra ở Châu Âu khilần đầu tiên ở Pháp và Croatia xảy ra đợt dịch ở địa phương vào năm 2010 và cáctrường hợp du nhập đã được phát hiện ở 3 quốc gia Châu Âu khác Năm 2012, dịch sốtxuất huyết trên quần đảo Madeira của Bồ Đào Nha đã gây ra hơn 2.000 trường hợp vàcác trường hợp du nhập đã được phát hiện ở lục địa Bồ Đào Nha và 10 quốc gia khác

ở Châu Âu Trong số các du khách trở về từ các quốc gia thu nhập thấp và trung bình,sốt xuất huyết là nguyên nhân được chẩn đoán sốt thứ hai sau sốt rét [36]

Năm 2015, tại Delhi, Ấn Độ, đã ghi nhận đợt bùng phát tồi tệ nhất kể từ năm 2006với hơn 15.000 trường hợp Đảo Hawaii, Hoa Kỳ, đã bị ảnh hưởng bởi một vụ dịch với

181 trường hợp được báo cáo vào năm 2015 và lây truyền đang diễn ra vào năm 2016.Các quốc đảo Thái Bình Dương của Fiji, Tonga và Polynesia thuộc Pháp đã tiếp tụcghi nhận các trường hợp bệnh [36]

Năm 2016 được đặc trưng bởi sự bùng phát sốt xuất huyết lớn trên toàn thế giới.Khu vực Châu Mỹ đã báo cáo hơn 2,38 triệu trường hợp trong năm 2016, trong đóriêng Brazil đã đóng góp ít nhất 1,5 triệu trường hợp, cao gấp khoảng 3 lần so với năm

2014 và 1.032 trường hợp tử vong do sốt xuất huyết cũng được báo cáo trong khu vực.Khu vực Tây Thái Bình Dương đã báo cáo hơn 375.000 trường hợp nghi mắc sốt xuấthuyết trong năm 2016, trong đó Philippine báo cáo 176.411 và Malaysia 100.028trường hợp, thể hiện gánh nặng tương tự năm trước đối với cả hai nước Quần đảoSolomon tuyên bố có một ổ dịch với hơn 7000 trường hợp nghi ngờ Tại khu vực ChâuPhi, Burkina Faso đã báo cáo một đợt bùng phát sốt xuất huyết cục bộ với 1.061 trườnghợp có thể xảy ra [36]

Trong năm 2017, số lượng ca mắc sốt xuất huyết đã giảm đáng kể ở mức 73% ởchâu Mỹ - từ 2.177.171 trường hợp trong năm 2016 xuống còn 584.263 trường hợptrong năm 2017 Panama, Peru và Aruba là những quốc gia duy nhất tăng số ca mắc

bệnh trong năm 2017 Thời kỳ bùng phát Zika (sau năm 2016) đã chứng kiến sự suy

giảm của các ca sốt xuất huyết và các yếu tố chính xác dẫn đến sự sụt giảm này vẫnchưa được biết Khu vực Tây Thái Bình Dương của WHO đã báo cáo dịch sốt xuấthuyết ở một số quốc gia ở Thái Bình Dương cũng như sự lưu hành của các type huyếtthanh DENV-1 và DENV-2 [36]

Sau khi giảm số lượng các trường hợp trong năm 2017-2018, các trường hợp tăngmạnh đang được quan sát vào năm 2019 Ở khu vực Tây Thái Bình Dương, sự gia tăngcác trường hợp đã được ghi nhận ở Úc, Campuchia, Trung Quốc, Lào, Malaysia,

Philippines, Singapore và Việt Nam trong khi Dengue-2 được báo cáo ở New Caledonia và Dengue-1 ở Polynesia thuộc Pháp Dịch sốt xuất huyết cũng đã được báo

cáo ở Congo, Côte d’Ivoire, Tanzania ở khu vực châu Phi Một số quốc gia trong khuvực Mỹ cũng đã chứng kiến sự gia tăng số ca mắc bệnh Ước tính 500.000 người mắcsốt xuất huyết nặng phải nhập viện mỗi năm và tỷ lệ tử vong ước tính 2,5% mỗi năm.Tuy nhiên, nhiều quốc gia đã giảm tỷ lệ tử vong xuống dưới 1% và trên toàn cầu, tỷ lệ

tử vong giảm 28% đã được ghi nhận từ năm 2010 đến 2016 với sự cải thiện đáng kểthông qua chương trình nâng cao năng lực ở cấp quốc gia [36]

1.1.1.2 Tình hình bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bệnh SD/SXHD lưu hành quanh năm Sốt Dengue được phát hiện ở miền Bắc lần đầu vào năm 1958 Đến 1969, dịch sốt xuất huyết Dengue lớn đầu tiên

đã xảy ra ở 19 tỉnh miền Bắc Chỉ tính tại Hà Nội từ tháng 7 đến tháng 10 năm 1969 sốbệnh nhân nhập viện chiếm 0,74% dân số thành phố với tỷ lệ tử vong là 0,77% [2]

Ở miền Nam, sốt xuất huyết Dengue được mô tả đàu tiên vào năm 1960 với 60 em

tử vong, đến tháng 8 năm 1963 dịch sốt xuất huyết Dengue đã xảy ra ở Cái Bè, Châu

Đốc, Hồng Ngự, Tân Châu và Cao Lãnh và đã có 331 em nhập viện và tử vong 116 em

[2] Trong năm 2018, số mắc/100.000 dân của toàn khu vực là 248 ca, tăng so với năm

2017 (tăng 31%) và trung bình từ 2011 đến 2015 (tăng 81%) Nhóm tỉnh có sốmắc/100.000 dân cao thuộc khu vực TP HCM, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu, ĐồngNai [2]

1.1.2 Virus Dengue

1.1.2.1 Phân loại

Virus Dengue (DENV) thuộc nhóm Flavivirus, họ Flaviviridae Họ Flaviviridae

có khoảng 70 loài virus gây nhiều bệnh khác nhau ở người và động vật như DENV gây

bệnh sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue, virus viêm não Nhật Bản, virus viêm não St.

Louis và virus West Nile gây ra bệnh viêm não-viêm màng não ở người

Dựa vào hình thái học của virion, tổ chức của bộ gen virus và quy trình nhân lên

của RNA, họ Flaviviridae bao gồm ba giống khác nhau, đó là Flavivirus, Pestivirus và

Hepacivirus Cả ba giống này có các tính chất sinh học khác nhau và không có phản

ứng huyết thanh chéo DENV gồm 4 type huyết thanh (từ DENV-1 đến DENV-4),

thuộc giống Flavivirus Bốn type huyết thanh này khác nhau về tính chất kháng nguyên, gây bệnh SXHD và nặng hơn là hội chứng sốc Dengue (HCSD) với tỷ lệ tử vong cao, nhất là ở trẻ em Virus này truyền bệnh thông qua trung gian là muỗi Aedes aegypti [4]

1.1.2.2 Cấu trúc phân tử

DENV có hình cầu, đường kính khoảng 40 đến 60 nm, chứa một lõi nucleotid đồngkích thước (đường kính khoảng 30 nm) bao quanh bởi một lớp lipid kép Bộ genDENVgồm một RNA cực dương, sợi đơn, dài khoảng 11 kb (Hình 1.1), mã hóa chocho 3 protein cấu trúc: protein lõi (C), protein tiền màng/màng (prM/M), protein vỏ(E), 7 protein không cấu trúc NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 và hai vùngkhông mã hóa ở cả 2 đầu 5’ và 3’ [2],[31]

Protein lõi C là một protein nhỏ (9-12 kDa), tích điện dương mạnh vì chứa nhiềulysin và arginin [2] Vai trò chính của protein này trong tế bào chất là đóng gói virusthông qua tương tác với bộ gen virus và mạng lưới nội chất Vai trò của protein lõitrong nhân chưa được hiểu rõ, nhưng nó có tương tác với một số protein trong nhân(như histon, helicase, importin-/) và nó có thể gây ra sự chết theo chương trình của

tế bào [18]

Protein màng M có 2 dạng: protein tiền màng prM (19-20 kDa) mới được tổng hợp,

có ở bề mặt virus chưa trưởng thành và protein màng M (7-8 kDa) có trong virus trưởngthành, có khả năng lây nhiễm Chức năng chính của protein là tạo mũ chụp lên vònglặp của protein E, ngăn virus mới được tổng hợp quay trở lại tế bào khi di chuyển qua

hệ thống Golgi [18]

Phần lõi được bao quanh bởi protein E (51-60 kDa) là thành phần chính của bề mặtvirus Có nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng protein E đóng rất nhiều vai tròtrong gắn kết vào thụ thể, ngưng kết hồng cầu, sản sinh các kháng thể trung hòa chủ

yếu trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ, trung gian cho sự hòa màng đặc hiệu của virustrong các hạt nội bào pH acid và lắp ráp các thành phần của virus [2],[4],[18]

Trong 7 protein không cấu trúc NS1, NS2 (NS2a, NS2b), NS3, NS4 (NS4a, NS4b)

và NS5, protein NS1 là một glycoprotein (42-50 kDa), có vai trò quan trọng trong sựhình thành và phóng thích virus ra ngoài tế bào động vật có vú Đặc biệt có nhiều nghiêncứu cho rằng NS1 liên quan trong quá trình nhân đôi RNA Các protein NS2A, NS2Blà protein tương đối nhỏ, kết hợp với màng NS2A có vai trò trong đóng gói và saochép của virus NS2A còn có thể ức chế tín hiệu INF NS3 là protein đa chức năng, cóhoạt tính enzym protease, helicase và RNA triphosphatase NS4A, NS4B có thể lànhững protein kết hợp với màng, có vai trò trong việc sao chép của virus thông quatương tác với protein NS3, hai protein này khóa tín hiệu IFN1 NS5 có hoạt tính tổnghợp RNA từ mạch RNA (RdRp – RNA dependent RNA polymerase), protein này cóvai trò trong biến đổi vùng 5’ và khởi đầu tổng hợp RNA [2],[18]

1.1.2.3 Protein NS1 của DENV

Trong số các protein không cấu trúc, NS1 được bảo tồn cao, có trọng lượng khoảng

47 kDa, được tạo ra trong quá trình sao chép của virus và đã được xem là một kháng

nguyên quan trọng trong nhiễm trùng Dengue NS1 tồn tại dưới dạng monomer, dimer

(protein gắn màng, mNS1) và hexamer (protein được tiết ra, sNS1) NS1 được biết làkích hoạt TLR và ức chế hệ thống bổ thể NS1 nội bào đóng vai trò then chốt trong sựnhân lên của virus, trong khi NS1 bài tiết và gắn màng liên quan đến phản ứng miễndịch [26],[27]

Protein NS1 được sản xuất bởi tất cả các Flavivirus và được tiết ra từ các tế bào bị

nhiễm bệnh trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng Protein được tìm thấy trong vòng mộtngày sau khi xuất hiện các triệu chứng ở cả nhiễm sốt xuất huyết nguyên phát và thứphát, trong khi kháng thể xuất hiện khoảng một tuần sau các triệu chứng đầu tiên củanhiễm trùng tiên phát Sự hiện diện của kháng nguyên NS1 ở nồng độ cao trong huyếtthanh bệnh nhân làm cho nó trở thành một dấu ấn sinh học của nhiễm DENV Nhiềuloại xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đã được phát triển

để phát hiện NS1 và một số xét nghiệm miễn dịch này có sẵn trên thị trường dưới dạng

bộ xét nghiệm ELISA hoặc xét nghiệm nhanh [27]

8Ban đầu, NS1 được thể hiện dưới dạng monomer trong các tế bào bị nhiễm bệnh.Sau khi sửa đổi sau dịch mã trong ống thông ER, nó tạo thành các chất đồng nhất liênkết với màng sinh chất và màng tế bào Mặc dù thiếu vùng xuyên màng, NS1 neo vàomàng tế bào thông qua một số con đường Ngoài ra, NS1 là protein duy nhất được tiết

ra liên tục ở dạng hexamer bởi các tế bào chủ bị nhiễm bệnh, có thành phần tương tựnhư một lipoprotein mật độ cao Cấu trúc giàu lipid này có thể giúp NS1 tiết ra gắn vàomàng tế bào bằng cách liên kết với glycosamino glycan (GAG) Do sự giống nhau giữaNS1 và lipoprotein ở mật độ cao, NS1 tiết ra làm phá vỡ tầng đông máu bằng cách canthiệp vào sự tương tác của các hạt lipoprotein nội sinh NS1 tích lũy được tiết ra tronghuyết thanh bệnh nhân SXHD/HCSD đã được quan sát trong giai đoạn cấp [2],[12].Nồng độ NS1 trong huyết thanh ở bệnh nhân SXHD/HCSD có thể đạt tới 50 μg/ml

và nồng độ này có tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh Trong giai đoạnphục hồi, NS1 bị mất đi bởi hiệu ứng qua trung gian kháng thể Do NS1 được tiết ra cóthể tương tác với protein bổ thể, nên lần đầu tiên nó được mô tả là một kháng nguyên

cố định bổ thể hòa tan (SCF) có thể thúc đẩy sự thoái hóa C4 và do đó có thể bảo vệDENV khỏi sự kháng nguyên cố định bổ thể hòa tan ly giải phụ thuộc bổ thể Gần đây,vai trò gây bệnh do NS1 bài tiết trong SXHD/HCSD đã được chứng minh do có liênquan đến hệ thống miễn dịch và kích hoạt tế bào nội mô [12]

Các công cụ chẩn đoán sốt xuất huyết dựa vào đặc điểm, sự nhân lên của virus vàđáp ứng miễn dịch ở thể dịch đối với các protein sốt xuất huyết Chẩn đoán rất quantrọng đối với lâm sàng, hỗ trợ giám sát, nghiên cứu bệnh, phát triển vaccin, thuốc vàthử nghiệm lâm sàng [18],[24] Các phương pháp trực tiếp (phân lập virus, phát hiệnRNA và kháng nguyên) và gián tiếp (điều tra huyết thanh học) tạo thành các công cụchẩn đoán bệnh sốt xuất huyết (Hình 1.2) Phương pháp trực tiếp cho độ tin cậy caonhất trong khi phương pháp gián tiếp thể hiện khả năng phát hiện cao nhất, được ápdụng rộng rãi trong xét nghiệm thường quy [2],[18],[24]

Các dấu ấn chẩn đoán được nghiên cứu trong trường hợp nhiễm sốt xuất huyết phụthuộc vào thời gian nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch và các kỹ thuật sử dụng Tronggiai đoạn sớm của bệnh, phân lập virus, kháng nguyên và phát hiện acid nucleic có thể

Kháng thể IgM chống sốt xuấthuyết được phát hiện trong hầu hết các

trường hợp 5-6 ngày sau khi bị sốt và

thường trong 60-90 ngày, nhưng đôi

khi lên đến 6 tháng Ở lần nhiễm trùng

đầu tiên, kháng thể IgG bắt đầu xuất

hiện vài ngày sau kháng thể IgM,

thường là vào những ngày 7-9 của sốt

Hiệu giá kháng thể tiếp tục tăng chậm

trong một vài tuần và có thể được phát

hiện trong suốt cuộc đời Trong nhiễm

trùng thứ hai, kháng thể IgG tăng

nhanh gần như ngay lập tức sau khi

khởi phát sốt, với mức độ cao ở hầu hết

bệnh nhân (Hình 1.3) [18],[24]

1.2.1 Phân lập virus

Phân lập virus là phương pháp chẩn đoán truyền thống để phát hiện nhiễm DENV.Mặc dù việc phát hiện DENV bằng cách phân lập virus được xem là tiêu chuẩn vàng,nhưng nó không thực tế, vì thời gian phân lập có thể mất vài ngày đến vài tuần

polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) và gần đây hơn là bằng các xét nghiệm hấp thụmiễn dịch liên kết với kháng nguyên NS1 (ELISA) để chẩn đoán nhanh hơn Tuy nhiên,phân lập virus vẫn quan trọng trong việc phân lập chủng, giữ chủng và không thể thaythế bằng PCR hay ELISA Để phân lập virus, các mẫu lâm sàng lấy từ bệnh nhân đượcnuôi cấy trong nhiều dòng tế bào của muỗi (AP-61, Tra-284, AP64, C6/36 và CLA-1)hoặc động vật có vú (LLCMK2, Vero và BHK -21) Mẫu máu của bệnh nhân khởi sốtđến 5 ngày cho kết quả cao

1.2.2 PCR

Hiện tại, một số xét nghiệm PCR được sử dụng để phát hiện bộ gen virus tronghuyết thanh Kỹ thuật Real time RT-PCR cũng dần thay thế các kỹ thuật RT-PCRtruyền thống mặc dù giá thành vẫn còn đắt Các xét nghiệm hiện tại có độ nhạy từ 80-90% và độ đặc hiệu hơn 95% Kết quả PCR dương tính là bằng chứng khẳng định bệnhnhân đang bị nhiễm trùng Tuy nhiên, kết quả âm tính được hiểu là không xác định.Bệnh nhân có kết quả âm tính trước 5 ngày của bệnh thường được yêu cầu gửi mẫuhuyết thanh thứ hai để xác nhận huyết thanh học sau ngày thứ 5 của bệnh [35]

1.2.3 MAC-ELISA

Phương pháp Elisa bắt kháng thể IgM kháng DENV (MAC-ELISA) được sử dụngphổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán Một trong những hạn chế của thử

nghiệm này là khả năng phản ứng chéo giữa các Flavivirus lưu hành khác Do đó, phát

hiện IgM không dùng trong việc xác định kiểu huyết thanh sốt xuất huyết IgM ban đầu

có thể được phát hiện trong khoảng từ 3 đến 5 ngày sau khi phát sốt ở khoảng 50%bệnh nhân nhập viện và có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 90% và 98% khi cácxét nghiệm được thực hiện từ 5 ngày trở lên sau khi khởi sốt Gần như tất cả các bệnhnhân có thể phát hiện IgM từ 6 đến 10 ngày (93%) sau khi khởi sốt và 99% bệnh nhân

có phát hiện IgM được xét nghiệm từ 10 đến 20 ngày sau khi khởi sốt [24]

1.2.4 ELISA-IgG

Xét nghiệm ELISA-IgG thông thường nhằm phát hiện bệnh nhân đã từng mắc SD/SXHD trong quá khứ hoặc hiện tại Xét nghiệm được tiến hành trên mẫu máu cặp (máugiai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục) từ đó tính được sự gia tăng của kháng thể trongsuốt quá trình nhiễm bệnh Xét nghiệm này tương đương với xét nghiệm ngăn ngưngkết hồng cầu Nhìn chung, xét nghiệm ELISA-IgG thiếu độ đặc hiệu trong nhóm huyết

thanh bệnh nhân mắc Flavivirus Mặc dù việc phát hiện kháng thể IgG kháng DENV

đã bị loại bỏ trong chẩn đoán bệnh SD và SXHD cấp tính nhưng xét nghiệm này vẫn

là xét nghiệm được sử dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học huyết thanh bệnh SD vàSXHD Ngoài ra, các xét nghiệm ELISA ái lực kháng thể IgG kháng DENV có thể giúpxác định tình trạng sơ nhiễm hoặc tái nhiễm bệnh SD và SXHD và cho thấy có ích hơnxét nghiệm ngăn ngưng kết hồng cầu [24]

1.2.5 Các xét nghiệm xác định kháng nguyên NS1

Một phương pháp chẩn đoán đơn giản trong giai đoạn cấp tính của nhiễm sốt xuấthuyết so với phân lập virus hoặc phát hiện acid nucleic là phát hiện các kháng nguyênvirus trong máu; tuy nhiên, việc phát hiện kháng nguyên trong giai đoạn cấp tính củanhiễm trùng thứ cấp có thể bị ảnh hưởng do virus miễn dịch IgG trước đó [18]

Những phát triển mới trong xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

và xét nghiệm miễn dịch nhanh nhắm vào protein không cấu trúc 1 (NS1) đã chỉ ra rằngnồng độ kháng nguyên NS1 cao có thể được phát hiện ở những bệnh nhân bị nhiễm sốtxuất huyết nguyên phát và thứ phát đến 9 ngày sau khởi phát bệnh NS1 được tổng hợp

bởi tất cả các Flavivirus và được tiết ra từ các tế bào động vật có vú bị nhiễm bệnh.

Kháng nguyên NS1 được tìm thấy trong máu, nước tiểu và nước bọt [10] Tuy nhiên,sự hiện diện của NS1 dạng tiết trong máu liên quan trực tiếp đến virus có trong máu

Do biểu hiện lâm sàng không điển hình trong giai đoạn đầu của bệnh nên việc phânbiệt bệnh nhân sốt xuất huyết với các trường hợp sốt cấp tính khác là một thách thứclớn đối với các bác sĩ lâm sàng vì có thể đưa đến chẩn đoán sai lầm nếu chỉ dựa trênchẩn đoán lâm sàng Các xét nghiệm dựa trên NS1 có vai trò quan trọng trong việcchẩn đoán SXH ở giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng sốt xuất huyết và hỗ trợ cho côngtác điều tra, giám sát dịch bệnh hiệu quả Nồng độ và thời gian tồn tại của NS1 trong

mẫu bệnh phẩm làm cho nó trở thành mục tiêu để phát triển xét nghiệm chẩn đoán Xétnghiệm dựa trên kháng nguyên NS1 được sử dụng cùng với dấu hiệu chẩn đoán huyếtthanh học (ví dụ: IgM kháng DENV) có thể tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của chẩn đoánsốt xuất huyết qua tất cả các giai đoạn của bệnh Hơn nữa, việc định lượng NS1 có thểgiúp dự đoán nguy cơ nhiễm DENV, vì nồng độ NS1 cao được tìm thấy có liên quanđến sốt xuất huyết [23],[30]

Năm 2000, ELISA đầu tiên có khả năng phát hiện DENV NS1 đã được phát triển.ELISA là kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với men Nếu mẫu thử có

kháng nguyên Dengue NS1, sẽ kết hợp với kháng thể kháng NS1 được phủ trên bề mặt

phiến nhựa Để phát hiện kháng nguyên được gắn, cộng hợp IgG gắn HRPO đượcthêm vào ở bước tiếp theo sẽ xúc tác các phản ứng màu Sự xuất hiện màu giúp xác

định có kháng nguyên Dengue NS1 có trong mẫu thử Giá trị mật độ quang (OD) của

phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng DENV hiện diện trong mẫu thử[17],[23]

Các xét nghiệm nhanh phát hiện kháng nguyên NS1 dựa trên nguyên lý sắc ký miễndịch (ICT), phát hiện kháng nguyên NS1 hiện diện trong máu toàn phần, huyết tương

và huyết thanh Kháng thể đặc hiệu với Dengue tạo phức với cộng hợp vàng được đặt

ở vùng cộng hợp và kháng thể kháng NS1 được cố định trên màng Khi mẫu dươngtính với kháng nguyên NS1 được đưa vào vị trí tiêm mẫu, kháng nguyên này bị bắt giữ

bởi kháng thể kháng NS1, tạo phản ứng với phức hợp kháng thể đặc hiệu Dengue và

keo vàng cho một vạch nhìn thấy ở vị trí T Một số xét nghiệm nhanh kết hợp cả khángnguyên và kháng thể IgM hoặc/và IgG trong cùng một bộ xét nghiệm nhằm mục đíchphát hiện nhiễm sốt xuất huyết ở cả giai đoạn cấp (khi virus đang lưu hành) và giaiđoạn hồi phục (khi xuất hiện kháng thể)

Các xét nghiệm nhanh rất dễ sử dụng, cung cấp kết quả trong vòng chưa đầy mộtgiờ Nó không yêu cầu cơ sở hạ tầng phòng xét nghiệm cao và do đó được ứng dụngrộng rãi tại hầu hết các phòng xét nghiệm, bệnh viện huyện, bệnh viện tỉnh, các trungtâm y tế dự phòng tại 20 tỉnh/ thành phố khu vực phía Nam và có tầm quan trọng trongviệc xác định dịch sốt xuất huyết Nhiều xét nghiệm nhanh sốt xuất huyết hiện đanglưu hành trên thị trường Việt Nam nhưng lại có ít bằng chứng về tính hiệu quả [24].

Một đánh giá về hiệu quả của xét nghiệm phát hiện NS1 dựa trên ELISA cho thấy

độ nhạy dao động từ 23% đến 90%, độ đặc hiệu từ 89% đến 100% Độ nhạy của xétnghiệm nhanh NS1 dự kiến sẽ thấp hơn các con số trên vì xét nghiệm nhanh thường có

độ nhạy thấp hơn xét nghiệm ELISA được thiết kế cho cùng một mục tiêu [23],[34]

Nội kiểm tra (Internal quality control – IQC) và ngoại kiểm tra xét nghiệm(External Quality Assessment - EQA) là hai hoạt động quan trọng trong kiểm tra chấtlượng giúp phát hiện ra các lỗi chính trong quá trình thực hiện xét nghiệm, khắc phụcvà đưa ra kết quả đạt độ tin cậy cho khách hàng Nội kiểm là các quy trình được chínhnhân viên PXN thực hiện để giám sát liên tục và nhanh quy trình xét nghiệm IQC thựchiện phân tích trên mẫu chứng đã được biết trước giá trị IQC được thực hiện hàng ngàytrong PXN, giúp phát hiện lỗi trong khi thực hiện xét nghiệm thường quy Ngoại kiểmtra xét nghiệm (đánh giá chất lượng từ bên ngoài) được sử dụng để mô tả một phươngpháp cho phép so sánh kết quả xét nghiệm của một phòng xét nghiệm đối với các phòngxét nghiệm khác, đánh giá chất lượng từ bên ngoài thuộc phạm trù ngoại kiểm tra nhưngtrọng tâm chủ yếu là đánh giá về kết quả xét nghiệm của PXN này so với các PXNkhác, xét nghiệm cùng một mẫu xét nghiệm với cùng kỹ thuật xét nghiệm Chươngtrình ngoại kiểm tra thông thường được tổ chức bởi một PXN chuẩn, đơn vị này phânphối mẫu xét nghiệm cho các phòng xét nghiệm thành viên cùng tham gia vào chươngtrình ngoại kiểm tra để làm xét nghiệm, sau đó thu thập các kết quả xét nghiệm để sosánh và đánh giá kết quả của các phòng xét nghiệm thành viên Kết quả sai ở các PXN

sẽ được nhà quản lý điều tra tìm hiểu các điểm không phù hợp và hỗ trợ khắc phục đểnâng cao chất lượng Bên cạnh đó cũng khuyến cáo các cơ sở sử dụng sinh phẩm phùhợp với các yêu cầu về chất lượng, điều kiện [32]

Ở Việt Nam, ngày nay do yêu cầu ngày càng cao về chất lượng, công tác nội kiểmxét nghiệm và ngoại kiểm xét nghiệm là hai yếu tố chất lượng cốt lõi nằm trong hệthống chất lượng mà mọi khoa phòng xét nghiệm cần có Nó đã và đang trở thành mộthoạt động thiết yếu và là nhu cầu thực tế và cần thiết của các phòng xét nghiệm y học

để bảo đảm kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở cho việc liênthông, công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, cơ sở y tế

có thực hiện xét nghiệm, nhằm giảm phiền hà, chi phí cho người bệnh, tiết kiệm nguồnlực của xã hội, đồng thời hội nhập mạng lưới kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm trongkhu vực và thế giới [3]

1.3.1 Chương trình ngoại kiểm NS1 trên thế giới

Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing - PT) được áp dụng trong PXN hơn 60năm trước như một công cụ để đánh giá các kết quả khác nhau của cùng một mẫu ở cácPXN khác nhau Kết quả PT/EQA đã được dùng để kích thích tiêu chuẩn hóa các quytrình và bộ mẫu chuẩn để đạt được kết quả đồng đều hơn giữa các PXN [21] Ngoại

kiểm về các kỹ thuật chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết Dengue được triển khai từ năm

1999 do Mạng lưới PXN Châu Âu về bệnh do virus du nhập (ENIVD) áp dụng cho xétnghiệm phát hiện kháng thể IgM và PCR phát hiện bộ gen virus [14], trung tâm kiểmsoát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu tổ chức PT đánh giá xét nghiệm chẩn đoán xét

nghiệm virus học sốt xuất huyết Dengue không liên tục từ năm 2010 đến nay, chủ yếu

về xét nghiệm PCR [15] Ngoại kiểm NS1 bắt đầu được Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

tổ chức ở khu vực Tây Thái Bình Dương năm 2013, quốc gia thuộc Châu Á-Thái BìnhDương năm 2015 [29] Tổ chức RCPA (Úc) cũng bổ sung thử nghiệm thành thạo NS1vài năm gần đây

1.3.2 Chương trình ngoại kiểm NS1 trong nước

Tại Việt Nam các chương trình ngoại kiểm đã được triển khai bao phủ khắp cảnước, tuy nhiên các PXN tham gia vẫn chưa thực hiện đầy đủ tất cả các chương trìnhngoại kiểm so với các xét nghiệm thực tế được thực hiện tại PXN Theo tiêu chí đánhgiá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học thì tất cả các xét nghiệm triển khai tại PXNđều phải thực hiện ngoại kiểm và nội kiểm Đây cũng là mục tiêu cần tiến đến của cáctrung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, nhằm kiểm soát, hỗ trợ và đánh giáchất lượng xét nghiệm của các PXN một cách toàn diện và liên tục [1]

Có 2 các chương trình ngoại kiểm huyết thanh học chẩn đoán sốt xuất huyết

Dengue (xét nghiệm phát hiện kháng thể IgM) tại Việt Nam do Viện Pasteur triển khai

từ năm 2012 cho các Trung tâm y tế khu vực phía Nam và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trungương từ năm 2016 cho các cơ sở y tế trong cả nước Hiện nay, nước ta chưa có trung

tâm tổ chức thử nghiệm thành thạo cho xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 củaDENV [9]

1.3.3 Lợi ích của ngoại kiểm

Việc tham gia vào chương trình EQA cung cấp dữ liệu và thông tin có giá trị, trong đó

- Đối với các PXN thực hiện xét nghiệm liên quan đến sức khỏe cộng đồng, EQA cóthể giúp đảm bảo rằng kết quả từ các PXN khác nhau trong các hoạt động giám sátlà tương đương nhau Sự tham gia EQA thường được yêu cầu để công nhận Ngoài

ra, sự tham gia EQA tạo ra một mạng lưới để liên lạc và có thể là một công cụ tốt đểtăng cường mạng lưới phòng thí nghiệm quốc gia Các mẫu nhận được để thử nghiệmEQA, cũng như thông tin được chia sẻ bởi nhà cung cấp EQA, rất hữu ích để tiếnhành các hoạt động giáo dục thường xuyên

1.3.4 Các phương thức ngoại kiểm

Có ba phương thức triển khai là thử nghiệm thành thạo (proficiency testing – PT),kiểm tra lại/phân tích lại (rechecking/retesting) và đánh giá tại chỗ (on-site evaluation).Trong đó thử nghiệm thành thạo là phương thức được sử dụng phổ biến cho mục tiêuđạt các tiêu chuẩn quốc gia, tiêu chuẩn quốc tế

- Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing - PT): Nhà cung cấp bên ngoài gửi

các mẫu chưa biết đến các PXN và kết quả của tất cả các PXN được phân tích, sosánh và báo cáo cho các PXN

- Kiểm tra lại (rechecking/retesting): Phòng xét nghiệm lựa chọn mẫu bệnh phẩm

ngẫu nhiễn gửi đến PXN tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích và đánhgiá lại các kết quả xét nghiệm mà PXN đã thực hiện

- Đánh giá tại chỗ (on-site evaluation): Đoàn đánh giá được lập bởi cơ quan có

thẩm quyền hoặc các tổ chức được công nhận sẽ đến đánh giá PXN định kỳ hoặc độtxuất Việc đánh giá theo các tiêu chí đã được phê duyệt [32]

1.3.5 Thử nghiệm thành thạo

Kiểm tra thành thạo hoặc PT, đã được sử dụng bởi các PXN trong nhiều năm Đây

là loại EQA được sử dụng phổ biến nhất, vì nó có thể áp dụng cho nhiều phương pháptrong PXN PT thích hợp cho hầu hết các xét nghiệm, và bao gồm một loạt các xétnghiệm hóa học, huyết học, vi sinh và miễn dịch Hầu hết xét nghiệm viên đều quenthuộc với quy trình PT và nhiều PXN sử dụng một số loại PT [32]

Những đơn vị triển khai chương trình thử nghiệm thành thạo trong lĩnh vực xétnghiệm y khoa trên thế giới hiện nay thường sử dụng thuật ngữ ngoại kiểm chất lượng(EQA) tương tự như thuật ngữ thử nghiệm thành thạo Thuật ngữ này được giới chuyênmôn công nhận và sử dụng một cách phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới [21],[32].Trong quy trình PT, các PXN nhận mẫu từ nhà cung cấp PT Nhà cung cấp này cóthể là một tổ chức (phi lợi nhuận hoặc lợi nhuận) được thành lập chuyên cung cấp mẫu

PT Các nhà cung cấp mẫu PT khác bao gồm các PXN tham chiếu trung tâm, các cơquan y tế chính phủ và các nhà sản xuất sinh phẩm hoặc thiết bị [32]

Trong một chương trình PT điển hình, các mẫu thử được cung cấp định kỳ Tầnsuất tối ưu là 3-4 lần mỗi năm Nếu chương trình không thể cung cấp mẫu với tần suấtnày, PXN có thể tìm kiếm các nguồn bổ sung Các PXN tham gia chương trình phântích các mẫu và gửi trả kết quả cho tổ chức trung tâm Kết quả được đánh giá và phântích, và các PXN được cung cấp thông tin về hiệu suất và so sánh với những ngườitham gia khác Các phòng xét nghiệm tham gia sử dụng thông tin liên quan đến hiệusuất để thực hiện các thay đổi và cải tiến phù hợp [32]

1.4.1 Mẫu huyết thanh/huyết tương (HT/HTg) có kháng nguyên NS1 đặc hiệu cho virus Dengue sử dụng trong ngoại kiểm

Hiện nay, bộ mẫu sử dụng cho các chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệmthường là mẫu chuẩn (RM - Reference material) và mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM

- Certified reference material)

- Mẫu chuẩn (RM) là vật liệu đủ đồng nhất và ổn định đối với một hoặc nhiều tính

chất quy định, được thiết lập phù hợp cho việc sử dụng dự kiến trong quá trình đo

- Mẫu chuẩn được chứng nhận (CMR) là mẫu chuẩn được đặc trưng bằng thủ tục

đo có hiệu lực đối với một hay nhiều tính chất quy định cùng với giấy chứng nhậnđưa ra giá trị tính chất xác định, độ không đảm bảo đo kèm theo và công bố về tínhliên kết chuẩn đo lường [6]

1.4.2 Các yêu cầu về chất lượng mẫu chuẩn NS1 Dengue

Mỗi bộ mẫu chuẩn cho trong chuẩn hóa phòng xét nghiệm có các yêu cầu khácnhau, tuy nhiên, do đặc thù gửi đến nhiều đơn vị để cùng đánh giá so sánh với giá trịchuẩn hoặc so sánh với nhau mà mẫu chuẩn có các yêu cầu chung như sau:

- Độ đồng nhất: Mỗi chương trình kiểm tra chất lượng xét nghiệm khi triển khai việc

gửi mẫu được thực hiện đến nhiều phòng xét nghiệm cùng lúc và các kết quả phảnhồi được so sánh vì vậy các mẫu cần đồng nhất

- Độ ổn định theo thời gian: Độ ổn định thường được kiểm tra nhằm đảm bảo các đại

lượng đo không bị thay đổi trong suốt quá trình nghiên cứu Theo quy đinh của ISO

13528 và TCVN 8245 (ISO Guide 35), mẫu thử ngoại kiểm cần được thử trong cácđiều kiện thay đổi xuất hiện trong quá trình triển khai chương trình ngoại kiểm nhưđiều kiện đóng gói, vận chuyển và xử lý mẫu khi được phân phối cho các đơn vịtham gia [6]

- Mẫu HT/HTg chuẩn được xác định đặc tính rõ ràng không có các yếu tố nguy cơgây bệnh truyền nhiễm như HIV, HCV, HbsAg, có triệu chứng sốt xuất huyết như

sởi, Rubella, Leptospira [29]

1.4.3 Các phương pháp sản xuất bộ mẫu NS1

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp sản xuất mẫu chuẩn NS1 khác nhaunhư mẫu chuẩn sản xuất theo phương pháp mẫu HT/HTg khô, mẫu HT/HTg thôngthường tùy thuộc vào tình hình thực tế của mỗi quốc gia và chiến lược của nhà cung

khô mẫu HT/HTg Tuy nhiên, việc đông khô mẫu HT/HTg đòi hỏi phải có thiết bị đôngkhô chuyên dụng và cần phải tính toán thể tích chính xác khi hoàn nguyên mẫu, việc

Nguyên lý

Nguyên lý cơ bản trong đông khô là thăng hoa, sự chuyển trực tiếp từ thể rắn thànhthể khí Cũng giống như sự bốc hơi, thăng hoa xảy ra khi một phân tử nhận đủ nănglượng để thoát khỏi các phân tử xung quanh nó Nước sẽ thăng hoa từ chất rắn (nướcđá) thành chất khí (hơi nước) khi các phân tử có đủ năng lượng để thoát ra nhưng điềukiện không phù hợp để chất lỏng hình thành Có hai yếu tố chính quyết định dạng tồntại của vật chất (rắn, lỏng hay khí): nhiệt độ và áp suất Một chất có thể tồn tại ở bất kỳtrạng thái cụ thể, nhiệt độ và áp suất phải nằm trong một phạm vi nhất định Theonguyên lý này, sản phẩm được làm đông khô vẫn giữ nguyên hình thái, khi hoàn nguyênbằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sản phẩm sẽ trở lại trạng thái ban đầu [28]

Quá trình đông khô trải qua 03 giai đoạn [16],[19],[28]:

Giai đoạn 1 hay là giai đoạn đông lạnh: mẫu chất lỏng được làm lạnh cho đến khi

băng tinh thể hình thành và tách khỏi các thành phần chất tan khác Đông lạnh thườngđược hoàn thành trong vài giờ Thông thường, nhiệt độ đóng băng nằm trong khoảng -

50 °C đến -80 °C Đông lạnh là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình đôngkhô, bởi vì sản phẩm có thể bị hỏng nếu thực hiện không tốt giai đoạn này

Giai đoạn 2 hay còn gọi là giai đoạn thăng hoa: áp suất được hạ xuống (khoảng

vài millibar) và cung cấp đủ nhiệt cho vật liệu để nước thăng hoa Khoảng 95% nướctrong vật liệu được thăng hoa Giai đoạn này đòi hỏi thời gian dài nhất trong ba giaiđoạn của quy trình đông khô (có thể là vài ngày đối với đông khô công nghiệp), bởi vì,nếu thêm quá nhiều nhiệt, cấu trúc vật liệu có thể bị thay đổi

Giai đoạn 3 hay còn gọi là bốc hơi ẩm còn lại: là giai đoạn nhiệt độ của mẫu tăng

dần trong khi vẫn duy trì áp suất thấp Nhiệt độ được tăng cao hơn so với giai đoạnthăng hoa và thậm chí có thể trên 0 °C, để phá vỡ mọi tương tác hóa lý đã hình thànhgiữa các phân tử nước và vật liệu đông lạnh Mục tiêu của quá trình này là giảm hàmlượng nước còn lại xuống mức chấp nhận được Mặc dù giai đoạn này thường đượchoàn thành trong vòng vài g iờ, nhưng đây là bước không thể thiếu trong quá trình đôngkhô vì lượng nước còn lại làm giảm chất lượng sản phẩm

1.4.4 Phương pháp đánh giá chất lượng bộ mẫu

Có rất nhiều phương pháp đánh giá chất lượng mẫu khác nhau tùy thuộc vào yêucầu của mẫu, tuy nhiên đối với chương trình ngoại kiểm tra về huyết thanh học NS1 thìtính chất ổn định và đồng nhất của mẫu là những tiêu chí quan trọng để đánh giá chấtlượng của mẫu Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC 17043:2011 và theo hướngdẫn TCVN 7366 và TCVN 8245, số lượng mẫu cần đánh giá tùy thuộc vào số lượngmẫu được sản xuất Đối với những lô nhỏ hơn 100, nên chọn tối thiểu 10% mẫu để thửnghiệm; nếu ít hơn 30 mẫu được sản xuất, nên chọn tối thiểu 3 mẫu [5],[33] Bên cạnh

đó việc đánh giá độ ổn định cũng là tiêu chí quan trọng cho các bộ mẫu chuẩn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Huyết tương (HTg) bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue của 20 tỉnh/thành phố khu

vực phía Nam được thu thập từ mẫu giám sát của Chương trình Phòng chống Sốt xuấthuyết Quốc gia

2.2 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu thực nghiệm

- Thu thập mẫu HTg có kết quả xét nghiệm kháng nguyên NS1 Sản xuất bộ mẫu cókháng nguyên NS1 Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của bộ mẫu huyết tương

có kháng nguyên NS1 của DENV sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng

- Thời gian thực hiện từ tháng 01/2019 đến tháng 07/2020 tại Viện Pasteur TP HCM

- Việc thu thập nguồn nguyên liệu từ những mẫu huyết tương lưu trữ tại Viện PasteurTP.HCM phù hợp với sự cho phép của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinhhọc Đai học Y Dược TP.HCM theo Quyết định số 211/HĐĐĐ-ĐHYD ngày 16 tháng

3 năm 2020 về việc chấp thuận các vấn đề đạo đức nghiên cứu y sinh

2.3 Dân số mục tiêu

Mẫu HTg bệnh nhân sốt xuất huyết của 20 tỉnh/thành phố khu vực phía Nam

2.3.1 Dân số chọn mẫu

Mẫu huyết tương bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue của 20 tỉnh/thành phố khu vực

phía Nam được thu thập từ mẫu giám sát của Chương trình Phòng chống Sốt xuất huyếtQuốc gia có kết quả xét nghiệm với NS1 Đồng thời mẫu huyết tương cho phản ứng

âm tính với xét nghiệm sàng lọc nhanh HIV1-2, HCVAb, HBSAg, sởi, Rubella,

Leptospira, Zika và Chikungunya.

2.3.2 Cỡ mẫu

Để có bộ mẫu có kháng nguyên đáp ứng được các tiêu chí đánh giá độ ổn định vàtính đồng nhất theo các quy định và hướng dẫn của tiêu chuẩn TCVN 8245:2009 vàISO 13528:2015 [5],[6], số lượng mẫu tối thiểu trong mỗi bộ mẫu được ước tính nhưsau:

Số đơn vị tham gia (1 mẫu/ đơn vị x 20 đơn vị) 20

Số mẫu dự phòng sự cố (50% số lượng mẫu) 10

± 5 oC để thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu

2.3.4 Tiêu chuẩn chọn mẫu

2.3.4.1 Tiêu chí đưa vào

- Có kết quả xét nghiệm NS1

- Mẫu có chất lượng tốt, không tán huyết, đông vón, thể tích từ 0,6 ml

- Mẫu huyết tương cho phản ứng âm tính với các xét nghiệm sàng lọc HIV 1-2,

HCVAb và HbsAg, sởi, Rubella, Leptospira, Zika, Chikungunya.

2.3.4.2 Tiêu chí loại trừ

- Mẫu bị loại nếu một trong các tiêu chuẩn trên không đạt yêu cầu

2.4 Dụng cụ - Trang thiết bị - Sinh phẩm – Hóa chất

Quá trình phân tích mẫu được thực hiện tại Viện Pasteur TP HCM, sử dụng cácdụng cụ, thiết bị và sinh phẩm, hóa chất sau:

 Dụng cụ

1 Chai thủy tinh 100 ml Duran 09-841-174

2 Chai thủy tinh 250 ml Duran 09-841-179

3 Phễu lọc chân không 500 ml Corning 431097

6 Hộp đựng mẫu 9x9 Greiner Bio One - Đức 802 202

7 Ống eppendorf 1,5 ml Greiner Bio One - Đức 616 201

8 Ống 1,5 ml có ron cao su Corning 430909

10 Ống nhựa 50 ml Greiner Bio One - Đức 227261

11 Đầu côn 10, 200, 1000 l Corning

-12 Thanh khuấy từ 6 x 20 mm Marienfeld-Đức 5700027

 Trang thiết bị

1 Tủ cấyan toàn sinh học cấp hai Telstar 512310

 Sinh phẩm, hóa chất

1 Test nhanh phát hiện kháng

2 Test nhanh phát hiện kháng

3 Test nhanh phát hiện kháng

4 Test nhanh phát hiện kháng

5 Test nhanh phát hiện kháng

6 Test nhanh phát hiện kháng

7 ELISA phát hiện kháng nguyên

9 Test nhanh HBsAg Standard Diagnostics 01FK11-P2-7

10 Test nhanh HCV Standard Diagnostics 02FK11-P2-8

12 SuperScript® III Platinum®

One-Step qRT-PCR Kit

Thermo FisherScientific – Mỹ 11732020

14 Bộ mồi và mẫu dò của Dengue/

-2.5 Phương pháp nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện quá trình sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm NS1

2.5.1 Thu thập mẫu từ mẫu giám sát

- Trong bộ mẫu ngoại kiểm, mẫu âm tính được thu thập từ bệnh viện Truyền máu vàHuyết học TP HCM, mẫu dương tính được thu thập từ nguồn mẫu sốt xuất huyết

Dengue của 20 tỉnh/thành phố khu vực phía Nam của Chương trình Phòng chống

Sốt xuất huyết Quốc gia và được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Arbovirus của ViệnPasteur TP HCM

(Lọc, bổ sung chất bảo quản, chia nhỏ, đông khô)

Đánh giá chất lượng bộ mẫu

(Độ ổn định, độ đồng nhất)

Ngoại kiểm

(20 đơn vị ở khu vực phía Nam)

- Mẫu bệnh phẩm khi được lưu trữ tại Viện Pasteur TP HCM sẽ được nhập liệu vàophần mềm Excel bao gồm những thông tin như họ tên bệnh nhân, tuổi, giới, địa chỉ,

mã số mẫu, ngày khởi sốt, ngày lấy mẫu, chẩn đoán và kết quả xét nghiệm Dengue.

- Danh sách chọn mẫu là danh sách ban đầu được loại trừ những bệnh nhân có bất kỳ

1 trong các yếu tố sau:

o Không thuộc chương trình mục tiêu quốc gia (ví dụ: mẫu thuộc chương trình

giám sát Zika, Chikungunya có kết quả NS1 DENV).

o Không có kết quả NS1 hoặc có kết quả NS1 âm tính

o Mẫu được thu thập không phải từ tháng 01/2019 đến tháng 12/2019

- Các mẫu trong danh sách sẽ được sắp xếp theo trình tự số thứ tự phòng thí nghiệmcủa ca bệnh

Bảng 2.1 Biểu mẫu dùng chọn mẫu sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm

Số labo Đề tài Mã số mẫu Ngày nhận mẫu Kết quả NS1

cơ gây các bệnh truyền nhiễm, đồng thời mẫu phải âm tính với các tác nhân có triệu

chứng lâm sàng tương tự sốt xuất huyết Dengue như sởi, Rubella, Leptospira,

Chikungunya, Zika.

Nhiều mẫu NS1 dương tính sẽ được trộn chung thành một mẫu có thể tích lớn, quátrình này có thể chứa các nguy cơ tiềm ẩn ảnh hưởng tới kết quả xét nghiệm Vì vậy,quy trình phối trộn từng nhóm HTg lại với nhau cần được khảo sát để phân tích các yếu

tố gây nhiễu khi kết hợp HTg Lượng chiết của từng mẫu HTg dương tính với testnhanh NS1 sẽ được trộn lại từng nhóm Các nhóm này được phân cấp dựa trên việc gộp

chung các nhóm mười (mười mẫu riêng lẻ hay còn gọi là nhóm G10), nhóm hai trăm(20 nhóm mười - nhóm G200) Các mẫu riêng lẻ được được phối trộn theo cùng thể tích.Mỗi nhóm G10 (nhóm mười), nhóm G200 (nhóm hai trăm) đều được thực hiện testnhanh và ELISA phát hiện NS1 Các xét nghiệm sàng lọc HbsAg, HCV Ab, HIV, sởi,

Rubella, Leptospira, Chikungunya, Zika được thực hiện trên nhóm G200 trước Nếu mẫuG200 dương tính với một tác nhân sàng lọc nào đó, 20 mẫu G10 phối trộn thành mẫuG200 đó sẽ được thực hiện xét nghiệm với tác nhân sàng lọc đó 10 mẫu huyết tươngban đầu được dùng để phối trộn mẫu G10 sẽ bị loại bỏ nếu mẫu G10 cho kết quả dươngtính

2.5.2.1 Xét nghiệm sàng lọc HIV Ab, VGB Ag, VGC Ab, sởi, Rubella, Leptospira, Zika,

Chikungunya

a Kỹ thuật xét nghiệm nhanh sàng lọc HIV Ab

o Để tất cả các thành phần của kit xét nghiệm và mẫu về nhiệt độ phòng (trongkhoảng 15 oC và 30 oC) trước khi mở và xét nghiệm

o Cho 50 l mẫu vào vùng nhỏ mẫu bệnh phẩm (được đánh dấu bởi biểu tượngmũi tên)

o Đợi tối thiểu 15 phút (tối đa 60 phút) và đọc kết quả

b Kỹ thuật xét nghiệm nhanh sàng lọc VGB Ag

o Để tất cả các thành phần của kit xét nghiệm và mẫu về nhiệt độ phòng (trongkhoảng 15 oC và 30 oC) trước khi mở và xét nghiệm

o Lấy dụng cụ ra khỏi túi nhôm, đặt trên mặt phẳng, khô

o Nhỏ 100 l mẫu vào giếng mẫu (S), sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch đệm Bắt đầutính thời gian

o Đọc kết quả trong vòng 20 phút

c Kỹ thuật xét nghiệm nhanh sàng lọc VGC Ab

o Để tất cả các thành phần của kit xét nghiệm và mẫu về nhiệt độ phòng (trongkhoảng 15 oC và 30 oC) trước khi mở và xét nghiệm

o Lấy dụng cụ ra khỏi túi nhôm, đặt trên mặt phẳng, khô

o Nhỏ 10 l mẫu và 4 giọt dung dịch pha loãng mẫu vào giếng mẫu (S), sau đónhỏ 1 giọt dung dịch đệm Bắt đầu tính thời gian

o Đọc kết quả trong vòng 5-20 phút

d Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể IgM của virus sởi, Rubella.

Xét nghiệm được thực hiện theo qui trình phát hiện kháng thể IgM của virus Rubella,

sởi bằng phương pháp ELISA (Kit Serion) của phòng thí nghiệm virus hô hấp - Viện

Pasteur TP HCM

e Phản ứng ngưng kết vi lượng trên kính hiển vi phát hiện Leptospira.

Xét nghiệm được thực hiện theo qui trình xét nghiệm huyết thanh học chẩn đoán

Leptospira QTVK3-XN 01-09 của phòng vi khuẩn lây truyền qua động vật.

f Kỹ thuật realtime RT-PCR phát hiện đồng thời 3 virus Zika, Chikungunya và Dengue

và phát hiện bộ gen DENV ( DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4)

- Chiết xuất RNA virus

Bước 1: Ly giải virus, biến tính protein, enzym RNase và enzym nội bào bằng dung dịch đệm AVL.

o 560 L dung dịch đệm AVL và 140 l mẫu

o Trộn đều trong 15 giây

 Lấy 630 l dung dịch chuyển vào cột ly tâm QIAamp

 Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lọc qua cột

 Chuyển cột ly tâm QIAamp sang ống thu thập mới

o Thu lần 2:

 Lấy 630 l dung dịch còn lại chuyển vào cột ly tâm QIAamp

 Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lọc qua cột

 Chuyển cột ly tâm QIAamp sang ống thu thập mới

Bước 4: Rửa.

o Rửa lần 1: bằng dung dịch đệm AW1

 Thêm 500 l dung dịch đệm AW1 vào cột QIAamp

 Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch lọc qua cột

 Chuyển cột QIAamp sang ống thu thập mới

o Rửa lần 2: bằng dung dịch đệm AW2

 Thêm 500 l dung dịch đệm AW2 vào cột QIAamp

 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phú, bỏ dịch lọc qua cột

 Chuyển cột QIAamp sang ống eppendorf 1,5 ml

Bước 5: Thu nhận RNA.

 Thêm 60 l dung dịch đệm AVE

 Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút

 Bỏ cột QIAamp

 Bảo quản RNA trong 60 L dung dịch đệm AVE ở nhiệt độ -20 oC

- Thực hiện phản ứng realtime RT-PCR

o Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bao gồm các thành phần:

Bộ mồi và mẫu dò DEN/

hoặc bộ mồi và mẫu dò DEN-1,

o Trộn đều hỗn hợp bằng pipet hoặc bằng máy trộn, ly tâm nhẹ khoảng 5 giây.Phân 15 L/giếng ra phiến nhựa hoặc thanh rời PCR

o Thêm 10 L RNA, trộn nhẹ bằng đầu ngón tay hoặc sử dụng pipet để trộn đềuhỗn hợp Dán plate bằng giấy dán dùng cho realtime PCR

o Cho vào máy PCR và khởi động chương trình nhiệt:

Phiên mã ngược 30 phút 50 oCBiến tính lần đầu 2 phút 95 oC

Chu kỳ gồm 2 bước 15 giây 95 oC 45 chu kỳ

Đọc tín hiệu ởbước 60 oC/ 1 phút

1 phút 60 oC

2.5.2.2 Phát hiện kháng nguyên NS1 của virus Dengue

a Kỹ thuật xét nghiệm nhanh

o Dùng ống nhỏ giọt cung cấp trong kit thử, nhỏ 1 giọt huyết tương (khoảng 25

l) mẫu vào giếng mẫu (S) của que thử bằng ống nhỏ giọt được cung cấp, sau

đó nhỏ 1 giọt dung dịch đệm Bắt đầu tính thời gian

o Khi phản ứng bắt đầu xảy ra, màu sẽ di chuyển dọc theo màng Chờ đến khivạch màu xuất hiện Đọc kết quả trong vòng 10-15 phút

- Test nhanh Humasis

o Để tất cả mẫu, khay thử ở nhiệt độ phòng trước khi thử nghiệm tối thiểu 15phút

o Tiến hành thử nghiệm ngay lập tức sau khi lấy khay thử ra khỏi túi nhôm.