tổng hợp và xây dựng tiêu chuẩn tạp a và tạp d của ramipril

Tuy nhiên, các chuẩn tạp này đang được bán với giá rất đắt và chưa có trongngân hàng chất đối chiếu Việt nam, điều này gây khó khăn, bị động cho công tác kiểmnghiệm nguyên liệu và th

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN TRẦN THIÊN THANH

TỔNG HỢP VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN TẠP A VÀ TẠP

D CỦA RAMIPRIL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

TP HỒ CHÍ MINH - 2020

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN TRẦN THIÊN THANH

TỔNG HỢP VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN TẠP A VÀ TẠP D

CỦA RAMIPRIL

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS NGÔ THỊ THANH DIỆP

TP HỒ CHÍ MINH – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trongbất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Trần Thiên Thanh

TÓM TẮT

Mở đầu – Mục tiêu: Ramipril là thuốc ức chế men chuyển angiotensin (ACE) được sử

dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim và các bệnh về thận.Ramipril methyl ester (tạp A), ramipril diketopiperazin (tạp D) trong USP 41 và BP2018) là các tạp phải kiểm tra trong cả chuyên luận nguyên liệu lẫn thành phẩm củaramipril Tuy nhiên, các chuẩn tạp này đang được bán với giá rất đắt và chưa có trongngân hàng chất đối chiếu Việt nam, điều này gây khó khăn, bị động cho công tác kiểmnghiệm nguyên liệu và thành phẩm của ramipril Tại Việt Nam hiện vẫn chưa có côngtrình công bố về nghiên cứu tổng hợp tạp A và tạp D Do đó, việc tổng hợp tạp A và tạp

D có độ tinh khiết cao làm cơ sở cho việc thiết lập chất đối chiếu là cần thiết

Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Ramipril methyl ester (tạp A của ramipril) và Ramipril

diketopiperazin (tạp D của ramipril)

Phương pháp nghiên cứu:

Tạp A được tổng hợp từ nguyên liệu bằng phản ứng chuyển hóa ester trong môi trườngmethanol Tạp D được tổng hợp từ nguyên liệu ramipril bằng phản ứng đóng vòng trongmôi trường toluen Sản phẩm sau khi tổng hợp và tinh chế được xác định cấu trúc bằngcác kỹ thuật phổ nghiệm như IR, MS, NMR, được xác định độ tinh khiết bằng phươngpháp HPLC qui về 100% diện tích pic và được đánh giá để thiết lập làm chất đối chiếu

Kết quả

Tạp A được tổng hợp thành công với hiệu suất toàn quy trình 39,2 % Sản phẩm thu đượcđạt độ tinh khiết sắc ký trên 98,8 % đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu Giá trị độ tinhkhiết ấn đinh của tạp A là 99,01 %

Tạp D đã được tổng hợp thành công với hiệu suất toàn quy trình 57,5 % Sản phẩm thuđược đạt độ tinh khiết sắc ký trên 99 %, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu Giá trị độtinh khiết ấn định của tạp D là 99,27 %

SYNTHESIS AND ESTABLISHMENT OF RAMIPRIL METHYL ESTER(IMPURITY A) AND RAMIPRIL DIKETOPIPERAZINE (IMPURITY D)REFERENCE STANDARD OF RAMIPRIL

Background - Objectives

Ramipril is an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor, used to treat high bloodpressure, heart failure, and diabetic kidney diseases The BP 2018 and USP 41 requireconducting ramipril methyl ester (as related compound A), and ramipril diketopiperazine(as related compound D) impurity test in ramipril pharmaceutical substances andcorresponding finished products However, these related compounds are costly withlimited accessibility that affects implementation of this impurity test There have been

no published local studies on chemical synthesis of ramipril methyl ester and ramiprildiketopiperazine so far Therefore, this study was conducted with aim of synthesis oframipril methyl ester and ramipril diketopiperazine with high purity that conforms toestablish reference standard

Method

Impurity A was synthesized from ramipril by transesterification reaction in methanol.Impurity D was synthesized from ramipril by cyclization reaction in toluene media Theobtained products were determined chemical structure from its IR, MS, NMRspectroscopic data, purified by HPLC and established as reference standards

Ramipril diketopiperazine (impurity D) was successfully synthesized with 57.7% yield.

By using HPLC-PDA, its chromatographic purity was determined over 99% on the basic

of peak area normalization method and conformed to establish reference standard Theassigned value of impurity D is 99.27%

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.TỔNG QUAN VỀ RAMIPRIL 3

1.1.1 Danh pháp, cấu trúc 3

1.1.2 Tính chất 4

1.1.3 Dược lý 7

1.1.4 Dược động học 8

1.1.5 Tạp chất liên quan 8

1.2.TỔNG QUAN VỀ TẠP A VÀ TẠP D CỦA RAMIPRIL 10

1.2.1 Tạp A 10

1.2.2 Tạp D 11

1.2.3 Một số công trình nghiên cứu 12

1.2.4 Giới hạn cho phép của tạp A và tạp D trong nguyên liệu và chế phẩm theo USP 41, BP 2018, DĐVN V [1], [8], [17] 12

1.2.5 Kiểm nghiệm tạp chất liên quan trong nguyên liệu và chế phẩm theo dược điển một số nước 14

1.3.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT 17

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng 17

1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 17

1.3.3 Phương pháp quang phổ hồng ngoại 17

1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 18

1.3.5 Nhiệt độ nóng chảy 18

1.3.6 Phương pháp phân tích nhiệt vi sai 18

1.4.CHẤT ĐỐI CHIẾU 18

1.4.1 Định nghĩa 18

1.4.2 Phân loại chất đối chiếu 19

1.4.3 Thiết lập chất đối chiếu 19

1.4.4 Đóng gói, bảo quản, sử dụng 19

1.4.5 Độ ổn định và chu kỳ đánh giá lại 20

1.4.6 Hạn dùng của chất đối chiếu 20

CHƯƠNG 2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 21

2.2.1 Nguyên liệu 21

2.2.2 Dung môi, hóa chất 21

2.2.3 Trang thiết bị 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Tổng hợp, tinh chế, thử tinh khiết, xác định cấu trúc tạp A 22

2.3.2 Tổng hợp, tinh chế, thử tinh khiết, xác định cấu trúc tạp D 27

2.3.3 Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết 28

2.3.4 Đánh giá tạp A và D 30

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 TỔNG HỢP, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC SẢN PHẨM A… 32

3.1.1 Tổng hợp 32

3.1.2 Xác định độ tinh khiết 35

3.1.3 Xác định cấu trúc 39

3.2 TỔNG HỢP, XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC SẢN PHẨM D 44

3.2.1 Tổng hợp – tinh chế 44

3.2.2 Xác định độ tinh khiết 46

3.2.3 Xác định cấu trúc 50

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT TẠP A VÀ TẠP D 55

3.3.1 Điều kiện sắc ký 55

3.3.2 Thẩm định quy trình 57

3.4.THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 64

3.4.1 Tạp A 64

3.4.2 Tạp D 66

3.5.BÀN LUẬN 69

3.5.1 Tổng hợp và tinh chế tạp A, tạp D 69

3.5.2 Quy trình xác định độ tinh khiết tạp A và D bằng HPLC 71

3.5.3 Xác định cấu trúc tạp A và tạp D 72

3.5.4 Đánh giá tạp A và tạp D 73

CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

4.1 KẾT LUẬN 74

4.2 KIẾN NGHỊ 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC… 79

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

CAS Chemical Abstract Services

DSC Differential Scanning Calorimetry Phân tích quét nhiệt vi sai

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện

FDA Food and Drug Administration Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực

phẩmGHS Globally Harmonized System Hệ thống hòa hợp toàn cầu

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH International Conference

on Harmonization Hội nghị quốc tế về sự đồng thuậniPrOH Isopropanol

IUPAC International Union of Pure

and Applied Chemistry

Liên đoàn Quốc tế về Hóa họcthuần túy và ứng dụng

Ký hiệu,

N Number of Theoretical Plate Số đĩa lý thuyết

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

s: singlet,d: doublet, t: triplet, dd: doublet of doublet Cộng hưởng từ hạt nhân

NaOH Natri hydroxyd

PTFE Polytetrafluoroethylene

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TFA Trifluoroacetic acid

USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ

UV–Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại – khả kiến

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ramipril 3

Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp ramipril 4

Hình 1.3 Phổ hồng ngoại của ramipril 5

Hình 1.4 Phổ khối của ramipril 5

Hình 1.5 Phổ NMR của ramipril 6

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử ramipril 6

Hình 1.7 Công thức cấu tạo ramipril methyl ester 11

Hình 1.8 Công thức cấu tạo ramipril diketopiperazin 11

Hình 2.1 Quy trình tổng hợp tạp A (1) 23

Hình 2.2 Quy trình tổng hợp tạp A (2) 24

Hình 3.1 Kết quả khảo sát thời gian tổng hợp ở 75 oC, 85 oC 33

Hình 3.2 Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế A với ba hệ dung môi khai triển 35

Hình 3.3 Biểu đồ DSC của sản phẩm tinh chế A 36

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế A với pha động 1 38

Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế A với pha động 2 38

Hình 3.6 Hình minh họa phổ UV – Vis của sản phẩm tinh chế A 39

Hình 3.7 Phổ IR sản phẩm tinh chế A 40

Hình 3.8 Phổ MS sản phẩm tinh chế A 40

Hình 3.9 Phổ 1H NMR sản phẩm tinh chế A 41

Hình 3.10 Phổ 13C NMR sản phẩm tinh chế A 42

Hình 3.11 Cấu trúc tạp A 42

Hình 3.12 Kết quả khảo sát các mốc thời gian khi phản ứng ở điều kiện 125 oC 44

Hình 3.13 Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế D với ba hệ dung môi khai triển 46

Hình 3.14 Biểu đồ DSC của sản phẩm tinh chế D 47

Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế D với pha động 1 49

Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tinh chế D với pha động 2 49

Hình 3.17 Hình minh họa phổ UV – Vis sản phẩm tinh chế D 50

Hình 3.18 Phổ IR sản phẩm tinh chế D 51

Hình 3.19 Phổ MS sản phẩm tinh chế D 51

Hình 3.20 Phổ 1H NMR sản phẩm tinh chế D 52

Hình 3.21 Phổ 13C NMR sản phẩm tinh chế D 52

Hình 3.22 Công thức cấu tạo tạp D 52

Hình 3.23 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu các mẫu phân hủy tạp A 55

Hình 3.24 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu mẫu phân hủy tạp D 56

Hình 3.25 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống tạp A 58

Hình 3.26 Sắc ký đồ kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống tạp D 58

Hình 3.27 Sắc ký đồ mẫu trắng, các mẫu phân hủy tạp A 59

Hình 3.28 Sắc ký đồ mẫu trắng, các mẫu phân hủy tạp D 60

Hình 3.29 Cơ chế phản ứng quy trình tổng hợp tạp A 70

Hình 3.30 Cơ chế phản ứng quy trình tổng hợp tạp D 71

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Dữ liệu phổ NMR của ramipril 7

Bảng 1.2 Tạp chất liên quan của ramipril theo dược điển một số nước 9

Bảng 1.3 Giới hạn cho phép tạp A và tạp D trong nguyên liệu và thành phẩm 13

Bảng 1.4 Giới hạn hàm lượng cho phép các tạp trong nguyên liệu 13

Bảng 1.5 Giới hạn hàm lượng cho phép các tạp trong chế phẩm 13

Bảng 1.6 Điều kiện sắc ký xác định tính tương thích hệ thống USP 41 15

Bảng 1.7 Điều kiện sắc ký theo BP 2018 16

Bảng 1.8 Chuẩn bị dung môi pha động, dung dịch chuẩn, dung dịch thử 16

Bảng 2.1 Dung môi – hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 2.2 Một số trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.3 Điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết của tạp A 25

Bảng 2.4 Điều kiện khảo sát hệ pha động xác định độ tinh khiết sản phẩm A 26

Bảng 2.5 Điều kiện sắc ký xác định độ tinh khiết của tạp D 28

Bảng 2.6 Hệ pha động xác định độ tinh khiết sản phẩm D 28

Bảng 2.7 Nồng độ các dung dịch thử 30

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng 32

Bảng 3.2 Kiểm tra sản phẩm phản ứng bằng HPLC 33

Bảng 3.3 Hiệu suất quá trình tổng hợp tạp A 33

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát dung môi kết tinh sản phẩm A bằng HPLC 34

Bảng 3.5 Hiệu suất quá trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm A 34

Bảng 3.6 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm tinh chế A 36

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động HPLC sản phẩm tinh chế A 37

Bảng 3.8 Chương trình rửa giải với pha động ACN – TEA 0,01 % + TFA pH 4 37

Bảng 3.9 Chương trình rửa giải với pha động MeOH – TEA 0.01 % + TFA pH 4 37

Bảng 3.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế A 39

Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR sản phẩm A 43

Bảng 3.12 Khảo sát điều kiện phản ứng tổng hợp tạp D 44

Bảng 3.13 Hiệu suất quá trình tổng hợp sản phẩm D 45

Bảng 3.14 Hiệu suất quá trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm D 45

Bảng 3.15 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm tinh chế D 47

Bảng 3.16 Chương trình rửa giải gradient với pha động ACN – Nước 48

Bảng 3.17 Chương trình rửa giải gradient với pha động MeOH – Nước 48

Bảng 3.18 Xác định độ tinh khiết sản phẩm tinh chế D 50

Bảng 3.19 Kết quả dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tinh chế D 53

Bảng 3.20 Kết quả đánh giá tạp A 54

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá tạp D 54

Bảng 3.22 Điều kiện sắc ký quy trình xác định độ tinh khiết 56

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống (n=6) 57

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và phân tích tính tuyến tính tạp A 61

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và phân tích tính tuyến tính tạp D 61

Bảng 3.26 Kết quả khảo sát độ lặp lại tạp A 62

Bảng 3.27 Kết quả khảo sát độ lặp lại – độ chính xác trung gian tạp D 63

Bảng 3.28 Kết quả xác định độ tinh khiết tạp A trong quá trình đóng lọ 64

Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ tạp A 65

Bảng 3.30 Kết quả phân tích ANOVA tạp A 65

Bảng 3.31 Kết quả xác định giá trị ấn định tạp A 66

Bảng 3.32 Kết quả xác định độ tinh khiết tạp D trong quá trình đóng lọ 67

Bảng 3.33 Kết quả đánh giá đồng nhất lọ tạp D 67

Bảng 3.34 Kết quả phân tích ANOVA tạp D 68

Bảng 3.35 Kết quả xác định giá trị ấn định tạp D 68

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, tăng huyết áp là một bệnh mãn tính khá phổ biến,thường gặp ở người cao tuổi Bệnh xảy ra khi áp lực của máu tác động lên thành độngmạch cao hơn bình thường, lúc đó huyết áp đo được đạt mức 140/90 mmHg hoặc caohơn, gây ra nhiêu biến chứng tim mạch quan trọng: tai biến mạch máu não, suy tim, bệnhtim mạch vành, nhồi máu cơ tim…

Nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp dạng uống hàng ngày được chia thành các loại: chẹnbeta, ức chế men chuyển, lợi tiểu, đối kháng calci và thuốc có tác dụng lên hệ thần kinhtrung ương Trong đó, ramipril là một chất ức chế men chuyển angiotensin (ACE) được

sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim và các bệnh về thận.Hiện nay, đa số trong các chuyên luận trong Dược điển tham chiếu BP 2018, USP 41 vàDược Điển Việt Nam V đều yêu cầu kiểm tra tạp chất liên quan [1], [8], [17] Theo thông

tư 32/2018/TT-BYT ban hành 12/11/2018 hướng dẫn về đăng ký lưu hành thuốc vànguyên liệu làm thuốc của Cục quản lý Dược Việt Nam, yêu cầu thực hiện đầy đủ cácchỉ tiêu về tiêu chuẩn chất lượng thuốc, trong đó có chỉ tiêu tạp chất, theo quy định củaDược điển hoặc báo cáo đầy đủ về tạp chất đối với những hoạt chất mới Để thực hiệnviệc kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm, cần có các tạp chuẩn

USP 41, BP 2018 và DĐVN V đã có chuyên luận ramipril và thành phẩm viên nén viênnang, trong đó tạp A và tạp D là một trong các tạp cần kiểm soát trong nguyên liệu vàthành phẩm [1], [8], [17] Tạp A là tạp hình thành trong quá trình tổng hợp ramipril vàtạp D là tạp phân hủy của ramipril trong quá trình bảo quản [9]

Tuy nhiên, hiện nay ở Viện kiểm nghiệm TPHCM và Viện kiểm nghiệm thuốc trungương vẫn chưa có tạp chuẩn của ramipril [4] Vì vậy, các cơ sở sản xuất phải mua tạpchuẩn từ nước ngoài với giá khá cao, làm tăng giá thành của thành phẩm và gây khókhăn hạn chế trong việc quản lý cũng như kiểm soát thuốc chứa ramipril đang lưu hànhtrên thị trường

Tại Việt Nam hiện vẫn chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A và tạp D đượccông bố Hiện nay tạp A và D đã được thương mại hóa với giá thành được công bố tạiwebsite của USP: tạp A lọ 30 mg 785 $, tạp D lọ 20 mg 775 $ [33], [32].

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Tổng hợp và xây dựng tiêu chuẩn tạp A và tạp

D của ramipril” được thực hiện với mục tiêu cung cấp quy trình tổng hợp, tinh chế tạp

chất và đánh giá tạp chất A và tạp chất D của ramipril, nhằm giúp việc kiểm tra chấtlượng nguyên liệu đầu vào và thành phẩm, góp phần kiểm soát và nâng cao chất lượngthuốc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Công thức phân tử: C23H32N2O5 [25].

Khối lượng phân tử: 416,5 g/mol [25].

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ramipril.

Ramipril được tổng hợp đầu tiên bởi công ty hóa học Đức Hoechst, được cấp bằng sángchế năm 1981 và sau 8 năm được phê duyệt như thuốc kê đơn Ramipril tinh chế ở dạngtinh thể màu trắng, là chất có cấu trúc phức tạp bao gồm một nhóm ethyl ester và mộtnhóm acid carboxylic [23]

Hiện nay, ở Việt Nam, một số công ty dược sản xuất ramipril như công ty cổ phần dượcphẩm SaVi với tên biệt dược ramifix với hàm lượng 2,5 mg và 5 mg, công ty cổ phầnDomesco biệt dược Suritil với hàm lượng 5 mg, công ty cổ phần Đạt Vi Phú biệt dượcGensler với hàm lượng 5 mg, công ty cổ phần dược phẩm Minh Dân biệt dược ramiprilhàm lượng 10 mg [3]

Quy trình tổng hợp ramipril được công bố trong nhiều công trình như các bằng sáng chếWO2009122433A2 (được Ashok đăng ký năm 2009), WO2003045916A1 … Quy trìnhtổng hợp được tóm tắt như sau [6], [34]:

Hình 1.3 Phổ hồng ngoại của ramipril

Phổ FT-IR của ramipril: νmax cm-1 C-H sp3 (2931,2), C=O của ester, acid (1748) (1650),C-O (1184), vòng benzen thế mono (750) và (700) [16]

Hình 1.4 Phổ khối của ramipril.

Phổ khối MS-ESI(+) cho tín hiệu ion tựa phân tử (M+H)+ với m/z = 417,2792; phù hợp

với khối lượng phân tử lý thuyết theo IUPAC của ramipril (C23H32N2O5, M = 416,5)[2121]

Hình 1.5 Phổ NMR của ramipril

Hình 1.6 Cấu trúc phân tử ramipril

Dữ liệu phổ NMR của ramipril theo tài liệu tham khảo [1010], [20] được thể hiện ở Bảng

1.1.

Bảng 1.1 Dữ liệu phổ NMR của ramipril.

Ramipril là thuốc ức chế enzym chuyển angiotensin, có tác dụng điều trị tăng huyết áp

và suy tim Giống các thuốc ức chế ACE khác (trừ captopril và lisinopril), ramipril làmột tiền dược (pro-drug), sau khi thủy phân ở gan tạo thành chất chuyển hóa ramiprilat

có hoạt tính chứa hai gốc acid Chất này hoạt động như một chelat kim loại Hai nhómCOOH liên kết với ion kẽm của ACE do đó ngăn chặn hoạt động xúc tác của enzym.Ramprilat có ái lực với enzym lớn hơn gần 50 lần so với captopril [23].

Ramipril giống như tất cả các chất ức chế ACE, có các phản ứng phụ bất lợi Các tácdụng phụ thường gặp bao gồm nhức đầu, chóng mặt, ho khan, phát ban trên da, đau ngực

và đau cơ hoặc chuột rút [23]

1.1.4 Dược động học

Sau khi uống ít nhất 50 – 60 % liều dùng được hấp thu, thức ăn không ảnh hưởng tớimức độ nhưng có thể làm chậm tốc độ hấp thu Ramipril được chuyển hóa ở gan thànhramiprilat – chất chuyển hóa có hoạt tính, các chất chuyển hóa khác đều bất hoạt Nồng

độ đỉnh trong huyết tương của ramiprilat đạt được sau khi uống khoảng 2 – 4 giờ Saukhi uống 1 liều, thuốc bắt đầu tác dụng trong vòng 1 đến 2 giờ, đạt hiệu quả tối đa từ 4– 6,5 giờ và tác dụng kéo dài khoảng 24 giờ Tuy nhiên, để thuốc phát huy đầy đủ hiệuquả điều trị cần dùng thuốc vài tuần

Ramiprilat gắn protein huyết tương khoảng 56% Ramipril được thải trừ qua thận dướidạng ramiprilat, dạng các chất chuyển hóa khác và cả dạng không đổi [23]

1.1.5 Tạp chất liên quan

Trong chuyên luận ramipril và chuyên luận thành phẩm ramipril theo BP 2018, USP 41

DĐVN V có quy định các tạp chất liên quan cần kiểm tra được trình bày trong Bảng 1.2

[8] [17]

Bảng 1.2 Tạp chất liên quan của ramipril theo dược điển một số nước.

DĐVN

Tạp A Tạp A

Tạp A(ramiprilmethyl ester) Acid (2S,3aS,6aS)-1-[(2S)-2-[[(1S)-1-

phenylpropyl]amino]propanoyl]octahydrocyclopenta [b]pyrrol-2-carboxylic

(methoxycarbonyl)-3-Tạp B Tạp B

Tạp B(ramiprilisopropylester)

Acid methylethoxy)carbonyl]-3-

(2S,3aS,6aS)-1-[(2S)-2-[[(lS)-1-[(l-phenylpropyl]amino]propanoyl]octahydrocyclopenta [b]pyrrol-2-carboxylic

Tạp C Tạp C

Tạp C(hexahydroramipril)

Acid (ethoxycarbonyl)-

(2S,3aS,6aS)-l-[(2S)-2-[[(1S)-3-cyclohexyl-1-propyl]amino]propanoyl]octahydrocyclopenta 2-carboxylic

[b]pyrrol-Tạp D Tạp D

Tạp D(ramiprildiketopiperazin) Ethyl (2S)-2-[(3S,5aS,8aS,9aS)-3-methyl-l,4-

dioxodecahydro-2H-cyclopenta[4,5]pyrrolo[1,2-a]pyrazin-2-yl]-4-phenyIbutanoat

Theo tài liệu ICH Q3AR, tạp chất được phân loại thành các loại: tạp hữu cơ, tạp vô cơ

và dung môi tồn dư Trong đó, tạp hữu cơ có thể xuất hiện trong quá trình sản xuất vàbảo quản, có thể được xác định hoặc không xác định Tạp A và tạp D đều là tạp hữu cơxuất hiện trong quá trình sản xuất và bảo quản ramipril

Phân tử lượng: 402,5 g/mol [26].

Công thức phân tử: C22H30N2O5 [26].

Công thức cấu tạo:

Hình 1.7 Công thức cấu tạo ramipril methyl ester.

Tính chất vật lý: Tinh thể màu trắng [32]

Nhiệt độ nóng chảy: 132 -140,5 oC [32]

Độ tan: tan tốt trong cloroform, acetonitril, methanol, kém tan trong isopropanol, nước

ở nhiệt độ thường [32]

Độc tính: nghi ngờ làm tổn hại đến khả năng sinh sản hoặc thai nhi Có thể gây tổn

thương các cơ quan (tim mạch) thông qua tiếp xúc kéo dài hoặc lặp đi lặp lại LD50 ởchuột: > 1000 mg/kg [32]

Phân tử lượng: 398,5 g/mol [27].

Công thức phân tử: C23H30N2O4 [27].

Công thức cấu tạo:

Hình 1.8 Công thức cấu tạo ramipril diketopiperazin

Tính chất vật lý: tinh thể rắn, bột màu trắng [22]

Nhiệt độ nóng chảy: 121,2 oC [22]

Tính chất dược lý và độc tính: độc tính với cơ quan hô hấp nếu thường xuyên hít phải

[33]

1.2.3 Một số công trình nghiên cứu

Năm 2000, Hogan và các cộng sự đã tiến hành thử nghiệm – phát triển phương pháp sắc

ký lỏng dùng để xác định các tạp chất liên quan của ramipril trong viên nang Altace Kếtquả thu được cho thấy các thông số sắc ký tạp D như thời gian lưu 28 - 29 phút; percloratđược dùng như là tác nhân tách tạp D và tạp C; nhiệt độ pha động 65 oC và chỉ ra tạp D

là tạp phân hủy chính của ramipril, có thể tìm thấy trong các chế phẩm đã quá hạn sửdụng [77]

Năm 2005, tính ổn định của Ramipril được Hanysov và cộng sự tiến hành nghiên cứutrong các điều kiện pH khác nhau Hệ dung môi pha động trong HPLC sử dụng NaClO4với triethylamin và chỉnh pH bằng H3PO4 Kết quả cho thấy tách được nguyên liệu vàtạp C, D, E [14] Năm 2010, Diego và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khảo sát hệ dungmôi sắc ký lớp mỏng tách các sản phẩm thoái hóa của ramipril [15]

Năm 2008, Rajenra và cộng sự nghiên cứu về tổng hợp và xác định cấu trúc của hai tạpphân hủy ramipril là ramipril diketopiperazin và ramiprilat Trong đó, ramiprildiketopiperazin có thể điều chế bằng phương pháp cho ramipril phản ứng trong dungmôi thích hợp ở nhiệt độ khoảng 120 oC trong vòng từ 6-8 giờ [Error! Reference source

Giới hạn hàm lượng cho phép tạp A và D trong nguyên liệu và thành phẩm theo USP 41

được trình bày trong Bảng 1.3.

Bảng 1.3 Giới hạn cho phép tạp A và tạp D trong nguyên liệu và thành phẩm.

1.2.5 Kiểm nghiệm tạp chất liên quan trong nguyên liệu và chế phẩm theo dược điển một số nước

USP 41

Nguyên liệu ramipril

Dung dịch A: hòa tan 2,0 g NaClO4 bằng 800 ml nước và 0,5 ml triethylamin Điều chỉnhbằng H3PO4 tới pH khoảng 3,6 ± 0,1 và thêm vào 200 ml acetonitril

Dung dịch B: hòa tan 2,0 g NaClO4 bằng 300 ml nước và 0,5 ml triethylamin Cân bằngtới pH 2,6 ± 0,1 bằng H3PO4 và thêm 700 ml acetonitril

Dung dịch tương thích hệ thống: hòa tan 0,5 mg/ml các chuẩn ramipril, chuẩn tạp A,

chuẩn tạp B, chuẩn tạp C và chuẩn tạp D vào dung dịch B

Dung dịch chuẩn: 5 µg/ml chuẩn ramipril vào dung dịch B.

Dung dịch thử: 1 mg/ml ramipril vào dung dịch A, giữ lạnh dung dịch thử cho tới khi

bắt đầu tiêm

Thành phẩm viên nang ramipril

Dung dịch đệm: hòa tan 17 g KH2PO4 và 11,2 g NaClO4 trong 750 ml nước trong bìnhđịnh mức 1000 ml, thêm nước đến vạch, điều chỉnh bằng H3PO4 tới pH 2,3

Dung dịch pha loãng: acetonitril: acid phosphoric (2:3).

Dung dịch A: acetonitril: dung dịch đệm: nước (1:2:2).

Dung dịch B: acetonitril: dung dịch đệm: nước (9:10:6).

Dung dịch chuẩn: hòa tan 0,2 mg/ml chuẩn ramipril và 0,002 mg/ml chuẩn tạp A trong

dd pha loãng

Dung dịch thử: 0,2 mg/ml ramipril trong dung dịch H3PO4.

Dung dịch kiểm tra độ nhạy: 0,1 µg/ml ramipril trong dung dịch pha loãng.

Thành phẩm viên nén ramipril

Dung dịch A: 2 g NaClO4 trong hỗn hợp 0,5 ml triethylamin và 800 ml nước và 200 mlacetonitril Điều chỉnh tới pH 3,6 bằng H3PO4

Dung dịch B: 2 g NaClO4 trong hỗn hợp 0,5 ml triethylamin và 300 ml nước và 700 mlacetonitril Điều chỉnh tới pH 2,6 bằng H3PO4.

Dung dịch tương thích hệ thống: 50 µg/ml mỗi chuẩn ramipril, chuẩn tạp A, chuẩn tạp

D trong dung dịch B

Dung dịch kiểm tra độ nhạy: 1 µg/ml ramipril chuẩn trong dung dịch B.

Dung dịch chuẩn: 0,005 mg/ml chuẩn ramipril trong dung dịch B.

Dung dịch thử: nghiền thành bột 20 viên và chuyển 1 phần bột vào bình nón Thêm vào

60 % thể tích bình bằng dung dịch A, đánh siêu âm trong 30 phút Pha loãng bằng dungdịch A Lọc dung dịch bằng đầu lọc có kích thước 0,45 µm

Điều kiện sắc ký, tính tương thích hệ thống được trình bày trong Bảng 1.6.

Bảng 1.6 Điều kiện sắc ký xác định tính tương thích hệ thống USP 41.

Điều kiện sắc ký

Cột

1,0 mm x 25cm; 3 µmL1

4,0 mm x

25 cm, 3

µm L1

4,6 mm x 15cm,5 µm L1

Tính tương thích hệ thống

𝑟𝑢: diện tích từng pic riêng lẻ trong dung dịch thử;

𝑟𝑠: diện tích pic của ramipril trong dung dịch chuẩn;

Cu: nồng độ ramipril trong dung dịch thử (mg/ml);

𝐶𝑠: nồng độ ramipril trong dung dịch chuẩn (mg/ml);

F: độ đáp ứng tương đối.

BP 2018, DĐVN V

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng DĐVN V chỉ có chuyên luyện kiểm trong nguyênliệu, không có chuyên luận kiểm trong chế phẩm Tiến hành chuẩn bị dung môi phađộng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và điệu kiện sắc ký đối với nguyên liệu và chế

phẩm được trình bày trong Bảng 1.7 và Bảng 1.8.

Bảng 1.7 Điều kiện sắc ký theo BP 2018

Pha động B: hòa tan 2,0 g NaClO4 trong hỗn hợp0,5 ml triethylamin và 300 ml nước; có pH 2,6 vàthêm 700 ml acetonitril

Hỗn hợp gồm 350 thể tích acetonitril+ 680 thể tích dung dịch có pH 3,9nồng độ 1,4 % kl/tt NaClO4 và 0,58 %kl/tt H3PO4 Hỗn hợp được điều chỉnhtới pH 2,6

Dung dịch thử: Hòa tan 20,0 mg chất cần kiểm tra

trong pha động A và pha loãng thành 20,0 ml bằngdung dịch pha động A

Dung dịch đối chiếu (a): Hòa tan 5 mg tạp A, 5

mg tạp B, 5 mg tạp C và 5 mg tạp D trong 5 mldung dịch thử, và pha loãng thành 10 ml với phađộng B

Dung dịch đối chiếu (b): Pha loãng 5,0 ml dung

dịch thử thành 100,0 ml với pha động B Pha

Dung dịch 1: Hòa tan 25 mg ramipril

trong dung môi pha động và đánh siêu

âm trong 10 phút, lọc qua bằng đầulọc 0,45 µm

Dung dịch 2: Pha loãng dung dịch (1)

20 lần bằng dung môi pha động

Dung dịch 3: Pha loãng dung dịch (1)

100 lần với dung môi pha động

Dung dịch 4: Pha lần lượt dung dịch

0,05 % kl/tt ramipril và 0,0005 % kl/tt

loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50,0 ml với phađộng B.

Dung dịch đối chiếu (c): Pha loãng 1,0 ml dung

dịch đối chiếu (b) thành 10,0 ml với pha động B

của từng tạp A, tạp D, tạp K trongdung môi pha động

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền Một dung dịch mẫu thửđược chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (silica gel, nhôm oxyd) tráng trên nên phẳng(kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh

Dung môi khai triển di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫuthử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đố gồm nhiều vết có Rf khác nhau.Có 2 loại bản mỏng: bản mỏng phân tích và bản mỏng chế hóa Bản mỏng phân tíchđược ứng dụng để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng cách chấm tương đốiđậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môikhác nhau Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn với Rf khác nhau thì có thể sơ bộ kếtluận rằng mẫu thử một chất tinh khiết

1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp khá phổ biến và là phương pháp không làm phá

vỡ cấu trúc, nếu kết hợp với các thiết bị hiện đại có thể thu được dữ liệu từ mẫu có khốilượng nhỏ hơn một miligam Phương pháp này có thể cho biết các nhóm chức, sự liênkết nguyên tử, sự tương tác nội ngoại phân tử cũng như cấu hình và cấu dạng tương đối.Khi có sự hiện diện tạp chất sẽ thay đổi số lượng proton và độ dịch chuyển hóa học

1.3.3 Phương pháp quang phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại của các hợp chất hữu cơ thường là một đường cong với các đỉnh hấp thuđại diện cho các nhóm chức nhất định trong phân tử Do đó, kỹ thuật đo phổ hồng ngoạiđược sử dụng như một phương pháp dấu vân tay cho việc xác định một hợp chất chưabiết, hoặc kiểm tra sự tổng hợp của một hợp chất đã biết với các nhóm chức xác định

Phổ hồng ngoại cũng được dùng để kiểm tra sự tinh khiết của một hợp chất sau khi côlập được, được tiến hành bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu tổng hợp và mẫu chuẩnhoặc so sánh với phổ IR chuẩn nếu có

1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khi tiến hành phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC, trong các điều kiện sắc ký khácnhau, nếu một chất chỉ cho một pic đối xứng, không bị chồng bởi các pic kế cận thì khảnăng đó là một chất tinh khiết Nhờ độ phân giải và độ tin cậy cao cùng với các bộ phậnphát hiện cung cấp các thông tin cấu trúc, HPLC là một công cụ rất hữu ích trong việcxác định độ tinh khiết của các hợp chất khác nhau

1.3.5 Nhiệt độ nóng chảy

Các chất tinh khiết bao giờ cũng có một nhiệt độ nóng chảy xác định Khoảng nhiệt độ

từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn thường chênh lệchkhoảng 1 -2 oC Nếu có lẫn tạp chất nhiệt độ độ bắt đầu nóng chảy sẽ thấp hơn và khoảngcách nhiệt độ nóng chảy sẽ rộng hơn so với một chất tinh khiết

Để xác định khoảng chảy và điểm chảy, tùy theo tính chất vật lý, dạng tồn tại từng chất,có thể áp dụng một trong các phương pháp 1, 2 hay 3 theo phụ lục 6.7, DĐVN V

1.3.6 Phương pháp phân tích nhiệt vi sai

DSC là một kỹ thuật phân tích nhiệt được dùng phổ biến trong nghiên cứu vật lý chấtrắn, khoa học vật liệu, hóa học, cho phép xác định các tính chất chuyển pha nhiệt củamẫu thông qua việc do dòng nhiệt tỏa ra hoặc thu vào từ một mẫu được đối nóng trongdòng nhiệt với nhiệt độ quét ở các tốc độ khác nhau Thuật ngữ “vi sai” chỉ việc xác định

sự sai khác giữa nhiệt độ (dòng nhiệt) của mẫu đối với một mẫu chuẩn được đặt trongcùng một điều kiện

1.4.1 Định nghĩa

Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thửđã được quy định về hóa học, vật lý, sinh học Trong các phép thử đó, các tính chất của

chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độtinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [1]

1.4.2 Phân loại chất đối chiếu

Chuẩn sơ cấp hay chuẩn gốc là chuẩn được thừa nhận không cần phải so sánh với chấtkhác

Chuẩn thứ cấp được thiết lập dựa trên chuẩn sơ cấp, gồm có chuẩn chính thức vùng hayquốc gia

Chuẩn làm việc, được thiết lập dựa trên chuẩn chính thức

1.4.3 Thiết lập chất đối chiếu

Chọn hóa chất làm đối tượng, có thể áp dụng kỹ thuật tinh chế để đạt độ tinh khiết cầnthiết Định danh bằng các phương pháp phổ học (UV-Vis, IR, NMR, MS, NMR) hay sắc

ký (sắc ký lớp mỏng, HPLC)

Xác định độ tinh khiết của chất cần làm chất đối chiếu:

- Các phương pháp trực tiếp: sắc ký, quang phổ, phân tích nhiệt, xác định tạp chất vô cơ,các chất dễ bay hơi (nước, dung môi tồn dư)

- Các phương pháp gián tiếp: năng suất quay cực, phân tích nguyên tố, chuẩn độ cácnhóm chức

- Đánh giá tạp chất liên quan bằng nhiều phương pháp khác nhau

- Định lượng bằng một phương pháp đã được thẩm định, thực hiện ở các phòng thínghiệm khác nhau

- Đánh giá kết quả, ấn định hàm lượng dựa trên kết quả liên phòng

1.4.4 Đóng gói, bảo quản, sử dụng

Để đáp ứng mục đích sử dụng, chất đối chiếu phải được bảo quản, theo dõi và dử dụngđúng Theo quy định thông thường, chất đối chiếu phải được đựng trong bao bì gốc, kín,có nhãn rõ ràng Điều kiện bảo quản tốt nhất là chất đối chiếu được đóng trong lọ thủytinh nâu tránh ánh sáng, quá trình đóng được thực hiện trong buồng nitơ hoặc chân không

và bảo quản ở 5 oC, nếu cần có điều kiện bảo quản đặc biệt khác thì có hướng dẫn trênnhãn.

1.4.5 Độ ổn định và chu kỳ đánh giá lại

Điều quan trọng của chất đối chiếu là độ ổn định, do đó phải theo dõi bằng các kiểm trađánh giá lại thường kỳ các chất đối chiếu và thay thế chúng khi có những thay đổi quantrọng Chọn lựa phương pháp phân tích thích hợp để theo dõi độ ổn định của chất đốichiều tùy thuộc vào bản chất của chúng Quy trình chung để kiểm tra sản phẩm phânhủy, độ ẩm…

Tần suất đánh giá lại tùy thuộc vào các thông số như hàm lượng nước, mẫu thử dùng thửnghiệm, điều kiện bảo quản Sự chuẩn hóa lại các chất đối chiếu được đề nghị là hainăm, riêng với chất đối chiếu có độ nhạy cảm cao có thể là 6 tháng hoặc 12 tháng

1.4.6 Hạn dùng của chất đối chiếu

Chất đối chiếu không chỉ định hạn dùng, phần lớn được thay thế bằng lô sản xuất mớikhi có những biến đổi thuộc tính riêng quan trọng được ghi nhận sau khi được đánh giálại theo chu kỳ quy định

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Tạp A của ramipril Tên khoa học: acid (methoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]-1-oxopropyl]cyclopenta[b]pyrrol-2-

Co.Ltd – Trung Quốc sản xuất (Phụ lục 1).

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Bảng 2.1 Dung môi – hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu.

Bản mỏng silica gel Tổng hợp,

-Cloroform Sắc ký lớp mỏng VN - Chemsol 99,0%

n-butanol Tinh chế Xilong 99,5%

2.2.3 Trang thiết bị

Danh sách trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2 Một số trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.

Cột pha đảo C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Knauer Eurospher IICột pha đảo C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Knauer Eurospher II

Và một số dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp, tinh chế, thử tinh khiết, xác định cấu trúc tạp A

Tổng hợp

Tổng hợp tạp A theo 2 quy trình sau Hình 2.1.; Hình 2.2.

Quy trình 1: tạp A được tổng hợp bằng phương pháp bảo vệ gốc COOH gắn với vòng

5 cạnh thành gốc benzyl ester, sau đó thủy phân gốc ethyl ester và ester hóa thành methylester trong methanol Cuối cùng phá hủy gốc bảo vệ bằng H2, Pd/C

Hình 2.1 Quy trình tổng hợp tạp A (1).

Chuẩn bị

Ramipril nguyên liệu phản ứng với benzyl alcol, tạo thành gốc benzyl ester để bảo vệgốc acid carboxylic vòng pyrrol, sau đó thủy phân sản phẩm thu được trong môi trườngacid HCl ở pH thích hợp Tiến hành ester hóa trong methanol tạo methyl ester Phá hủygốc bảo vệ benzyl ester sẽ được tạp A

Quy trình 2: tham khảo các phương pháp chuyển hóa ester trong phản ứng điều chế dầu

biodiesel, gốc ester trong nguyên liệu khi phản ứng trong dung môi methanol với chấtxúc tác KOH hoặc NaOH có thể bị thay thế thành gốc methyl ester Trong các tài liệutham khảo, chất xúc tác KOH cho hiệu suất cao hơn so với NaOH, tỉ lệ nguyên liệu: chấtxúc tác : dung môi cho hiệu suất tốt nhất là 1 : 0,1: 10 [29]