Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của sâm việt nam chế biến

Khảo sát tác dụng sinh học của Sâm VN chế biến và các thành phần saponin trong Sâm VN: + Khảo sát sự thay đổi tác dụng kháng phân bào và chống oxy hóa của Sâm VN do quá trình chế biến..

LÊ THỊ HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA

SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018

LÊ THỊ HỒNG VÂN

KHƯU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM VIỆT NAM CHẾ BIẾN

Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền

Mã số: 9720206

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Minh Đức

PGS TS Nguyễn Ngọc Khôi

1 GS.TS NGUYỄN MINH ĐỨC

2 GS.TS NGUYỄN NGỌC KHÔI

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ

ANH VIỆT i

DANH MỤC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.THỰC VẬT HỌC CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX 3

1.2.THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX 8

1.3.THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ CÁC DẠNG CHẾ BIẾN KHÁC NHAU CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX 13

1.4.PHÂN TÍCH SAPONIN TRONG CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX 24

1.5.SÂM VIỆT NAM 30

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU 42

2.2.NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 45

2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

Chương 3 KẾT QUẢ 64

3.1.KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU 64

3.2.PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA SÂM VN 64

3.3.THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA SÂM VN CHẾ BIẾN 74

3.4.NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC SAPONIN TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN SÂM VN 107

3.5.SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VN QUA QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN 113

Chương 4 BÀN LUẬN 121

4.1.PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG SÂM VN 121

4.2.THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA SÂM VN CHẾ BIẾN 125

4.3.SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC DO QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN SÂM VN

133

KẾT LUẬN 137

KIẾN NGHỊ 139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 140 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG

ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH VIỆT

ADP Adenosine Diphosphate Adenosin Diphosphat

AST Aspartate Aminotransferase

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương quan

CTPT Công thức phân tử

DBMA 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene

DCF-DA 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein

diacetate DHPPD Dihydro Protopanaxadiol Dihydro Protopanaxadiol DHPPT Dihydro Protopanaxatriol Dihydro Protopanaxatriol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EA Ethyl acetate

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Xét nghiệm hấp thụ miễn

dịch liên kết với enzym ELSD Evaporative light scattering detector Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

FBS Fetal bovine serum

Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPMAE High Pressure Microwave

Assisted Extraction

Chiết xuất hỗ trợ vi sóng áp suất cao

HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray

Ionisation Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion hóa

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Correlation

Phổ tương quan dị hạt nhân

IBα Nuclear Factor of Kappa Light

Polypeptide Gene Enhancer in B-Cells Inhibitor alpha

IC50 Inhibition Concentration 50% Nồng độ ức chế 50%

iNOS Inducible NO Synthase Enzyme cảm ứng tổng hợp

nitric oxit IRAK1 IL-1 Receptor Associated Kinase 1 Kinase 1 kết hợp với thụ thể IL-1 IT-TOF-MS Iontrap-Time of Flight-Mass

Spectroscopy

Khối phổ bẫy ion thời gian bay

KLTP Khối lượng phân tử

LC/MS Liquid Chromatography-Mass

Spectroscopy

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

MAE Microwave assisted extraction Chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm

MeOH Methanol

miRNA Micro RNA

NF-B Nuclear Factor Kappa Beta Yếu tố nhân kappa B

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

Chữ viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt

RID Refractive Index Detector Đầu dò chỉ số khúc xạ

ROESY Rotating Frame Nuclear Overhauser

Effect Spectroscopy

Hiệu ứng hạt nhân Overhauser

ROS Reactive Oxygen Species Gốc tự do oxy hóa

Sâm VN Sâm Việt Nam

Enzyme Kinase 1 hoạt hóa yếu

tố sinh trưởng β của khối u TNF Tumor Necrosis Factor Yếu tổ hoại tử khối u

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc của gen trnK “Nguồn: Zhu, 2003” 5

Hình 1.2. Cây phát sinh loài dựa trên kết hợp dữ liệu gen trnK và trình tự gen 18S rRNA 6

Hình 1.3. Khung cơ bản của các saponin và phần đường phổ biến của các saponin thuộc chi Panax 9

Hình 1.4. Sự hình thành các ginsenosid trong quá trình chế biến (hấp) 15

Hình 1.5. Nhận diện và truyền tín hiệu lipopolysacharid (LPS) trong đại thực bào 23

Hình 1.6. Phần trên mặt đất (a) và phần dưới mặt đất (b) của Sâm VN 32

Hình 1.7. Các hợp chất polyacetylen phân lập từ phần dưới mặt đất của Sâm VN 34

Hình 1.8. Cấu trúc của saponin phân lập từ Sâm VN 35

Hình 3.9. Bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN 64

Hình 3.10.SKĐ SKLM của các bộ phận khác nhau của Sâm VN 64

Hình 3.11.SKĐ ELSD (a) và LC/MS (b) của rễ con Sâm VN 66

Hình 3.12.SKĐ HPLC/ELSD đại diện cho 5 bộ phận khác nhau của Sâm VN 68

Hình 3.13 Hình ảnh đại diện Sâm VN tươi (A), sấy khô (B) và sau chế biến (C) 74

Hình 3.14 SKĐ đại diện HPLC/ELSD phân tích các mẫu Sâm VN chưa chế biến (A) và Sâm VN chế biến ở 8 giờ (B) 75

Hình 3.15.Sơ đồ quy trình chiết các cao từ dược liệu Sâm VN chế biến 76

Hình 3.16.Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao EA 78

Hình 3.17 SKĐ HPLC/ELSD phân tích mẫu rễ con (a) và phân đoạn Bu 1.25 (b) 80

Hình 3.18 Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao Bu1 80

Hình 3.19 Quy trình phân lập các hợp chất từ cao chiết Bu2 82

Hình 3.20 Cấu trúc phần đường gắn vào vị trí C-20 của hợp chất 22 (a) và notoginsenosid Q (b) 101

Hình 3.21 Cấu trúc của hợp chất 22 102

Hình 3.22 Cấu trúc notoginsenosid D (hợp chất 23) 105

Hình 3.23.SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 105 ℃ 109

Hình 3.24.SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 120 ℃ 110

Hình 3.25.Độc tính trên tế bào đại thực bào phúc mạc 118

Hình 3.26.Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của các yếu tố tham gia

đường truyền tín hiệu viêm thông qua NF-κB khi xử lý với LPS 118

Hình 3.27.Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên sự chuyển vị NF-κB vào nhân tế

bào 119

Hình 3.28.Tác động của P-RT4 và OCT trên hoạt hóa NF-κB trong đại thực bào gây

bởi LPS 119

Hình 3.29.Tác dụng của P-RT4 và OCT trên gắn kết LPS lên TLR4 ở đại thực bào

chuyển nhiễm với MyD88 siRNA 120

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 3.1.Biểu đồ so sánh hàm lượng các saponin chính nhóm PPT, PPD và OCT

trong các bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN 74

Biểu đồ 3.2.Sự thay đổi hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT và

OCT trong quá trình chế biến Sâm VN ở 105 ℃ 111

Biểu đồ 3.3.Sự thay đổi hàm lượng saponin phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃ 112

Biểu đồ 3.4.Sự thay đổi hàm lượng saponin kém phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120

℃ 112

Biểu đồ 3.5.Hoạt tính chống gốc tự do DPPH của Sâm VN ở thời điểm chế biến khác

nhau tại 120 ℃ 114

Biểu đồ 3.6.Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃ trong

khoảng thời gian từ 2-20 giờ trên dòng tế bào ung thư phổi A549 115

Biểu đồ 3.7.Sự thay đổi tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 120 ℃ trên

dòng tế bào ung thư phổi A549 116

Biểu đồ 3.8.Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃ trong 8 giờ so

với Sâm VN chưa chế biến trên dòng tế bào ung thư phổi A549 116

Biểu đồ 3.9.Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của các

saponin phân lập từ Sâm VN chế biến 117

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Panax trên thế giới 4

Bảng 1.2. Phân bố một số loài Panax trên thế giới 7

Bảng 1.3. Phân bố một số saponin chính trong một số loài thuộc chi Panax 10

Bảng 1.4. Các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến P ginseng 16

Bảng 1.5. Tóm tắt chỉ tiêu phân tích trong các chuyên luận Dược điển của các loài Panax phổ biến 29

Bảng 1.6. Các saponin được phân lập từ Sâm VN 35

Bảng 1.7. Các tác dụng dược lý của Sâm VN đã nghiên cứu và công bố 39

Bảng 2.8. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-ELSD (mg/ml) 49

Bảng 2.9. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-UV (mg/ml) 49

Bảng 3.10. Kết quả LC/MS và Q-TOF-MS định danh các pic chính trên SKĐ HPLC của mẫu rễ con Sâm VN 65

Bảng 3.11. RSD (%) của diện tích đỉnh các saponin chính ở điều kiện áp lực 3,5 và 3,8 bar (n=6) 69

Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của 9 saponin chính trong Sâm VN 71

Bảng 3.13. Đường tuyến tính của 9 saponin chính với đầu dò ELSD và UV 71

Bảng 3.14. Độ lặp lại trong ngày và liên ngày của phương pháp HPLC-ELSD-UV 72

Bảng 3.15. Khối lượng Sâm VN ở các bộ phận khác nhau 73

Bảng 3.16. Hàm lượng1) saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ củ và rễ con 73

Bảng 3.17. Khối lượng các lô Sâm VN trước và sau chế biến 75

Bảng 3.18. Kết quả chiết xuất các cao chiết của Sâm VN chế biến 76

Bảng 3.19 Kết quả phân lập bằng SKC cao EA 78

Bảng 3.20 Kết quả phân lập từ cao Bu1 81

Bảng 3.21 Kết quả phân lập từ các phân đoạn của cao Bu2 82

Bảng 3.22. Dữ liệu về cảm quan, đặc điểm hóa học và MS của các hợp chất phân lập được 83

Bảng 3.23. Dữ liệu phổ 13C-NMR (C, 125 MHz) của hợp chất 8, 14, 15, 16 và N-R2 85

Bảng 3.24. Dữ liệu phổ 1H-NMR H*, m (J, Hz) của hợp chất 15, 16, 8 và N-R2 86

Bảng 3.25. Dữ liệu phổ 13C-NMR của các saponin hợp chất 17, 18 và 19 87

Bảng 3.26. Dữ liệu phổ 1H-NMR (H*, m (J, Hz)) của các saponin hợp chất 17, 18 và 19 88

Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N, C**) của các hợp chất 2, 7, 11, 12, 13 và 26 90

Bảng 3.28. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, C*, C5D5N) của các hợp chất 1a, 1b, 3a, 3b, 5, 6, 9, 10 95

Bảng 3.29. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) của các hợp chất 1a, 1b, 3a, 3b, 5, 6, 9 và 10 96

Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C) của hợp chất 20 và 21 so với G-Ra1 và N-R4 97

Bảng 3.31. Dữ liệu 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C**,) của hợp chất 22 99

Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C) của hợp chất 23 103

Bảng 3.33 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 4 và 24 105

Bảng 3.34. Thành phần saponin trong Sâm VN chế biến 107

Bảng 3.35. Hàm lượng1) saponin Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃, 8 giờ 108

Bảng 3.36. Chỉ số tương quan giữa thành phần hóa học saponin của các mẫu Sâm VN chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃ 113

Bảng 4.37. Cấu trúc các hợp chất saponin phân lập được từ Sâm VN chế biến 129

MỞ ĐẦU

Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) từ lâu đã được xem là vị thuốc hàng đầu trong

4 vị thuốc quý “Sâm, Nhung, Quế, Phụ” theo y học cổ truyền phương Đông Vị “Sâm”

ở đây đươc hiểu là Nhân sâm, vì một số loài khác cùng chi Panax có tác dụng tương tự cũng được gọi là sâm như Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium L.), Sâm Nhật (Panax

japonicus C A Meyer), Tam thất (Panax notoginseng Burk F.H Chen)

Hồng sâm là loại Nhân sâm được chế biến theo phương pháp cổ truyền bằng cách hấp

củ sâm tươi ở nhiệt độ cao có hay không có áp suất trong khoảng 2-6 giờ tùy theo tài liệu [50],[65] Cách chế biến này làm thay đổi về mặt thể chất của Nhân sâm giúp bảo quản Sâm lâu dài hơn Quá trình chế biến cũng làm thay đổi thành phần hóa học của Nhân sâm, đặc biệt là thành phần ginsenosid Các ginsenosid phân cực sẽ bị cắt đường

và khử nước tạo thành các ginsenosid mới không có trong bạch sâm như GRg3, Rg5, Rg6, -Rh2, -Rh3, -Rh4, -Rs3…[50],[98] Các thành phần mới này giúp tăng cường hoạt tính sinh học của Hồng sâm với tác dụng phòng chống ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa…[102],[130] Do vậy, tác dụng bổ dưỡng, tác dụng chữa bệnh tim mạch, suy nhược thần kinh, bệnh đáo thái đường và đặc biệt hơn là tác dụng phòng chống ung thư, kháng viêm và chống oxy hóa đã được chứng minh là mạnh hơn so với dạng Sâm chưa chế biến [65],[102] Do các biến đổi trên, trong hai dạng chế biến, Hồng sâm được cho là tốt hơn, đắt tiền hơn và sử dụng phổ biến hơn bạch sâm [50]

-Bên cạnh dạng chế biến phổ biến là Hồng sâm, hai dạng chế biến mới của Nhân sâm là Thái dương sâm (Sun ginseng, hấp Sâm ở nhiệt độ cao hơn với áp suất cao) và Hắc sâm (Black ginseng, hấp Sâm ở thời gian lâu hơn và nhiều lần hơn) đã được nghiên cứu Thành phần hóa học và tác dụng sinh học thay đổi đáng kể [103] Tóm lại, việc chế biến đã làm tăng tác dụng điều trị, hiệu quả và giá trị kinh tế của Nhân sâm

Sâm Việt Nam (Sâm VN, Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được phát hiện từ năm

1973, đến nay đã được thế giới biết đến qua những nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Sâm VN của các nhà khoa học Việt Nam với sự hợp tác với các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc và Ba Lan Thành phần hóa học chủ yếu và quan

trọng nhất của các loài thuộc chi Panax là saponin hay còn gọi là ginsenosid (ginseng

saponin) Qua những nghiên cứu bước đầu của Nguyễn Thới Nhâm [80] và những nghiên cứu sau này của Nguyễn Minh Đức, Trần Công Luận [59],[68] và Trần Lê

Quan [113],[112] đã xác định saponin là thành phần hóa học chính với 52 saponin và 8 polyacetylen được phân lập từ thân rễ và rễ củ của Sâm VN Bên cạnh đó, Võ Duy Huấn đã phân lập một số saponin từ lá Sâm VN, trong đó có 8 ginsenosid mới [115] Saponin có aglycon thuộc khung PPD và PPT, thành phần saponin chính có trong các

loài thuộc chi Panax khác, hiện diện trong Sâm VN với hàm lượng cao hơn, đồng thời

saponin có aglycon thuộc khung OCT có trong Sâm VN với hàm lượng rất cao mà

không có hoặc với hàm lượng thấp trong các loài thuộc chi Panax khác Sự khác biệt

này tạo nên sự khác biệt về tác dụng sinh học cho Sâm VN và hứa hẹn rất nhiều tác dụng mới cần được nghiên cứu Do đó, việc phân tích thành phần hóa học của Sâm VN rất cần thiết nhằm bổ sung dữ liệu về thành phần và hàm lượng các saponin có trong Sâm VN

Trong một nghiên cứu gần đây, thành phần hóa học saponin của Sâm VN chế biến bằng nhiệt (heating processing) đã được khảo sát Quá trình chế biến Sâm VN tương tự theo cách của Hồng sâm cho thấy có sự thay đổi của thành phần ginsenosid, thành phần ginsenosid kém phân cực được gia tăng hoặc mới hình thành trong khi các thành phần ginsenosid phân cực bị thay đổi trong quá trình chế biến [45]

Mục đích nghiên cứu dạng Sâm VN chế biến nhằm tạo ra một sản phẩm có chất lượng điều trị tốt và gia tăng giá trị sử dụng cho Sâm VN Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng của Sâm VN chế biến là cần thiết Với những lý do

trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Sâm VN chế

biến” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Phân tích, phân lập và xác định thành phần hóa học saponin trong Sâm VN

2 Phân lập và xác định cấu trúc thành phần saponin trong Sâm VN chế biến và khảo sát sự thay đổi thành phần hóa học saponin qua quá trình chế biến Sâm VN

3 Khảo sát tác dụng sinh học của Sâm VN chế biến và các thành phần saponin trong Sâm VN:

+ Khảo sát sự thay đổi tác dụng kháng phân bào và chống oxy hóa của Sâm VN do quá trình chế biến

+ Khảo sát tác dụng kháng viêm của các saponin có aglycon thuộc khung OCT

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỰC VẬT HỌC CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX

1.1.1 Phân loại thực vật chi Panax

Chi Panax L được Carl von Linné xác định từ năm 1753 với loài chuẩn là Panax

quinquefolium L và P trifoliatus L ở Bắc Mỹ Gần đây, các nhà thực vật học đã đặt

vấn đề về việc xem xét lại và phân loại các loài trong chi trên thế giới Căn cứ vào các đặc điểm hình thái của thân rễ (củ), lá, các phần phụ cũng như về thành phần hóa học, ADN, nhiễm sắc thể trong mối quan hệ về phân bố địa lí giữa các loài, các nhà thực vật học đã quyết định xác lập thêm một số loài, dưới loài hay nâng cấp các taxon dưới loài thành bậc loài hoàn chỉnh [27]

Theo Wen và CS [24], cho đến nay, có khoảng 18 loài thuộc chi Panax (Araliaceace)

đã được công bố Theo hệ thống phân loại thực vật của The Plant list [150] có 13 loài

thuộc chi Panax được chấp nhận Trong khi đó, hệ thống phân loại thực vật theo

Catalogue of life [151] thì có khoảng 13 loài với 2 thứ được liệt kê trong Bảng 1.1

1.1.2 Mối quan hệ phát sinh loài của chi Panax

Trước đây, việc nghiên cứu phát sinh loài (phylogenetic) của các loài thuộc chi Panax

dựa vào hai giả thuyết dựa trên các mối quan hệ tiến hóa đã được đề xuất (1) Dựa vào thành phần saponin triterpen và hình thái hạt giống theo Zhou và CS (1975) [143] và (2) sự khác biệt dựa trên nhiễm sắc thể theo Yang (1981) [133]

Thuyết tiến hóa của chi Panax được đề xuất bởi Zhou và CS (1975) phân loại các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính: Nhóm I bao gồm 3 loài có giá trị cao là P

ginseng, P notoginseng và P quinquefolius, nhóm II bao gồm các loài còn lại ngoại

trừ P pseudoginseng [143] Sự tương đồng của 3 loài ở nhóm I này dựa vào các đặc

điểm sau: thân rễ thẳng đứng, rễ chính giống hình dạng củ cà rốt, hạt tương đối lớn và thành phần triterpenoid cấu trúc dammaran 4 vòng có nhiều giá trị sinh học Tuy nhiên, những đặc điểm này cũng không thể hiện rõ ràng sự khác biệt trên sự tiến hóa của loài Nhóm II có đặc điểm thân rễ dài, thường có rễ củ không phát triển và có hạt nhỏ hơn, tương quan với những loài không thay đổi với sự phân bố không liên tục và thành phần chính là saponin triterpen cấu trúc olean Vì thế tác giả đề nghị rằng khi

so sánh với nhóm II, nhóm I có thể là nhóm nguyên thủy hơn với P notoginseng có lẽ

là thành viên nguyên thủy nhất giữa các loài thuộc chi Panax [143] Về thực vật học,

P pseudoginseng Wall được xếp vào nhóm I nhưng thành phần hóa học lại tương

đồng với nhóm II Chính vì vậy, P pseudoginseng Wall được xem là loài chuyển

tiếp tiến hóa giữa hai nhóm [147]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Panax trên thế giới

[129]

C Lee & J.Wen (2004) [24]

Catalogue of Life [151]

The Plant list [150]

1 P ginseng C A Meyer P ginseng P ginseng P ginseng

2 P japonicus C A Meyer P japonicus P japonicus P japonicus

3 P notoginseng (Burkill) F

H Chen ex C Chow & W

G Huang

P notoginseng P notoginseng P notoginseng

4 P pseudoginseng Wallich P pseudoginseng P pseudoginseng P pseudoginseng

5 P quinquefolius L P quinquefolius P quinquefolius P quinquefolius

P zingiberensis P zingiberensis P zingiberensis

8 P wangianus S.C.Sun P wangianus P wangianus P wangianus

9 P trifolius L P trifolius P trifolius P trifolius

P bipinnatifidus Seem var

16 P omeiensis J Wen P omeiensis

17 P major Ting P major

18 P elegantior (Burkill)

J Wen

19 P shangianus J Wen

(*) Ghi chú: P japonicus được Flora of China chia thành 4 thứ (var.) bao gồm var japonicus (T.Nees)

C A Meyer; var angustifolius (Burkill) C C Cheng & Chu; var major (Burkill) C Y Wu & Feng; var bipinnatifidus (Seemann) C Y Wu & K M Feng P bipinnatifidus Seem được Catalog of Life [151] chia thành 2 thứ gồm P bipinnatifidus var angustifolius và P bipinnatifidus var bipinnatifudus

Tuy nhiên Yang (1981) cho rằng P ginseng và P quinquefolius không thể được xem là

loàinguyên thủy nhất của chi Panax, do bởi NST của chúng là đa bội (tứ bội) (2n = 48 hoặc 44) Yang đề nghị P japonicus là loài nguyên thủy nhất của chi bởi vì bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (diploid, 2n=24) và phân bố địa lý khá rộng dù P notoginseng và P

pseudoginseng thuộc lưỡng bội do phân bố hạn hẹp [133]

Wen và Jimmer (1996) đã sử dụng trình tự vùng ITS (internal transcribed spacer) và vùng mã hóa 5.8S của ribosom trong nhân nhằm giải quyết các mối quan hệ phát sinh

loài trong 12 loài thuộc chi Panax [3] Kết quả cho thấy giữa 2 loài P quinquefolius và

P trifolius thuộc phía Đông bắc Mỹ, loài P quinquefolius được đề nghị có mối quan hệ

gần gũi với các loài ở Châu Á dựa vào trình tự ITS, trong khi loài P trifolius lại có đặc

điểm phát sinh loài khác biệt Trình tự ITS ít sai khác và mối quan hệ gần gũi giữa các loài trong vùng cho thấy sự tiến hóa nhanh chóng tạo ra sự đa dạng ở các loài thuộc chi

Panax ở dãy Himalayas và phía Trung và Tây Trung Quốc [129]

Độ dài trình tự gen cloroplast trnK và 18S rRNA của 13 Panax taxa đã được nghiên

cứu nhằm tìm ra mối liên hệ phát sinh loài và hỗ trợ xác định việc phân loại thực vật

(taxonomic) trong chi này Độ dài của trình tự gen trnK dao động từ 2537 bp đến 2573

bp tùy theo taxa, trong khi trình tự gen matK nằm trong intron của gen trnK là 1512 bp

trong tất cả các taxa (Hình 1.1) Đặc hiệu của trình tự trnK/matK cung cấp thông tin

sâu hơn về phát sinh sinh học (phylogeny) và phân loại của chi này [147]

Trình tự gen 18S rRNA có độ dài 1808-1809 bps, chỉ có 9 loại trình tự gen 18S rRNA

đã được quan sát ở trong 13 taxa Phân tích mối liên hệ họ hàng của dữ liệu kết hợp

trình tự gen trnK-18S rRNA cung cấp thông tin để giải quyết vấn đề phát sinh loài giữa các loài thuộc chi Panax trong 3 nhánh chính P pseudoginseng và P stipuleanatus có mối quan hệ họ hàng gần gũi với nhau [147] Dựa vào trình tự trực tiếp của gen trnK và gen 18S rRNA của 53 mẫu thuộc 13 Panax taxa, cho thấy trình tự của trnK cũng như trình tự đoạn gen matK có nhiều khả năng trong giải quyết vấn đề phát sinh loài và

phân loại thực vật trong chi này (Hình 1.2) [146] Kết hợp dữ liệu của trình tự gen

trnK-18S rRNA cung cấp thêm thông tin cho việc phân loại chính xác hơn là tách biệt

dữ liệu [146]

Hình 1.2 Cây phát sinh loài dựa trên kết hợp dữ liệu gen trnK và trình tự gen 18S rRNA Chú thích: PPH: P pseudoginseng subsp Himalaicus “Nguồn: Komatsu, 2001” [41]

Năm 2002, Zou và CS đã công bố thành phần hóa học của P japonicus var major (tên

địa phương là Ye-sanchi) thu thập tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [148],[149] Tuy

nhiên, thành phần hóa học của loài này hoàn toàn khác biệt với P japonicus đã được

công bố trước đây [63],[64]

Năm 2003, Zhu và CS (đồng tác giả với 2 bài báo trên) báo cáo một thứ mới với tên

P vietnamensis Ha & Grushv var fuscidiscus K.Komatsu, S Zhu & S.Q Cai

(Ye-sanchi, Dã tam thất) được tìm thấy ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc Tác giả cũng khẳng

định trình tự của gen 18S rRNA và trnK của loài này có tương đồng với Sâm VN (P

vietnamensis Ha et Grushv.) và khác với những mẫu P japonicus thu thập tại Nhật Bản

[146] Đây chính là loài đã được công bố trong nghiên cứu hóa học bởi Zou và CS

(2002) với tên P japonicus do sự nhầm lẫn về mặt hình thái thực vật

Dã tam thất và Sâm VN có cùng trình tự tại các nucleotid ở vị trí 357, 396, 606, 1205

và 1416 nhưng khác nhau ở vị trí 104 và 1043 [147] Điều này cho thấy P

vietnamensis var fuscidiscus có mối quan hệ gần gũi với P vietnamensis ở đặc điểm

thực vật và bằng chứng phân tử và được xác định là một thứ của P vietnamensis

Năm 2014, Phan Kế Long và CS cũng đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền của hai loài

Panax tại Lai Châu là P vietnamensis var fuscidiscus và P stipuleanatus so với Sâm

VN (P vietnamensis) trên cơ sở trình tự nucleotid vùng matK và ITS-rDNA [6]

Năm 2016, Nông Văn Duy và CS công bố thứ mới của Sâm VN tại núi Langbiang,

Lâm Đồng ở độ cao 1800-1900 m Dựa vào trình tự ITS1-5.8S-ITS2, thứ này khác với

Dã tam thất (P vietnamensis var fuscidiscus) ở 8 vị trí 217, 384, 465, 532, 562, 589,

590, 598 và khác với P vietnamensis ở 5 vị trí 384, 465, 554, 590, 598 [82]

Trình tự hoàn chỉnh của genome lục lạp của P vietnamensis (Ngân hàng gen số KP036471) đã được xác định Genome lục lạp của P vietnamensis cho thấy 99,1%;

99,2% và 99,1% tương tự ở mức độ trình tự nucleotid lần lượt với các loài thuộc chi

Panax như P ginseng, P quinquefolius và P notoginseng Tương tự với các nghiên

cứu trước đây, dựa vào cây phát sinh loài cho thấy P vietnamensis có liên quan gần gũi với P notoginseng hơn P ginseng và P quinquefolius [24],[146],[147]

1.1.3 Phân bố các loài thuộc chi Panax

Hầu hết các loài thuộc chi Panax hoang dã được tìm thấy ở Himalaya và Trung Quốc

Trước đây, phía Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và các tỉnh phía Bắc Việt Nam ở gần biên giới Trung Quốc - Việt Nam thuộc vào vĩ độ 23o Bắc vốn được xem là giới

hạn phân bố của các loài thuộc chi Panax Châu Á Tuy nhiên, Sâm VN lại tìm được ở

vĩ tuyến 15o Bắc, xa hơn về phía Nam so với giới hạn dự đoán trước đây của các loài

thuộc chi Panax (Bảng 1.2.)

Bảng 1.2 Phân bố một số loài Panax trên thế giới

1 P ginseng Nhân sâm

Vân Nam, Trung Quốc

4 P pseudoginseng San-qi Nepal và Đông Himalayas

5 P quinquefolius Sâm Mỹ

(American ginseng)

Mọc hoang và trồng tại Bắc Mỹ từ Mine đến Minnesota, Nam Florida, Tây Oklahoma và Nam Canada

6 P stipuleanatus Tam thất hoang Mọc hoang ở phía Bắc Việt Nam

Mọc hoang và trồng tại vùng núi Ngọc Linh, tỉnh Kon tum và Quảng Nam

11 P bipinnatifidus Sâm vũ diệp Mọc hoang dã ở phía Nam Trung Quốc và phía

Bắc VN

12 P sokpayensis Himalaya

Cho đến nay ở Việt Nam có 4 loài thuộc chi Panax đã được công bố: P bipinnatifidus Seem (Sâm vũ diệp); P notoginseng (Tam thất): loài di thực trồng ở phía Bắc VN; P

stipuleanatus (Tam thất hoang) và P vietnamensis (Sâm VN) [7] Hai thứ của Sâm VN

còn được phát hiện ở Vân Nam (Trung Quốc) và Lai Châu (Việt Nam) [6] (P

vietnamensis var fuscidiscus) và ở vùng núi Langbiang, cao nguyên Lâm Viên, Lâm

Đồng (P vietnamensis var langbianensis) [82]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX

Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Panax có thể phân thành 4 nhóm chính:

Saponin, polyacetylen, polysaccharid và flavonoid [22]

1.2.1 Saponin

Các nhà khoa học Nga lần đầu nghiên cứu saponin trong Panax ginseng và phân lập

các hợp chất có gắn đường đặt tên là panaxoside A, B (1962) và panaxoside C-F (1964) Cùng lúc nhóm nghiên cứu của GS Shibata (Nhật Bản) đã phân lập và mô tả các saponin tương tự và đặt tên là ginsenosid và thuật ngữ này được chấp nhận và dung rộng rãi cho đến nay [22] Cho đến nay, có khoảng hơn 300 saponin đã được phân lập

từ các loài thuộc chi Panax Những nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học, tác dụng dược lý của các loài thuộc chi Panax cho thấy rằng thành phần

saponin triterpenoid trong đó chủ yếu các ginsenosid đóng vai trò quan trọng đối với các tác dụng liên quan được công bố [135]

1.2.1.1 Phân loại saponin theo cấu trúc

Các saponin trong chi Panax đa số được phân loại cơ bản theo cấu trúc khung genin

(dammaran, oleanan):

Khung dammaran:

Protopanaxadiol (PPD): Các ginsenosid phổ biến của nhóm này là ginsenosid Ra1, Ra2, -Ra3, -Rb1, -Rb2, -Rb3, notoginsenosid Rs1, -Rs2, quinquenosid R1, malonyl-ginsenosid Rb1, -Rb2, -Rc và -Rd Đây là nhóm ginsenosid có nhiều thành phần nhất

-trong các cấu trúc dammaran của chi Panax [135]

Protopanaxatriol (PPT): Các ginsenosid phổ biến của nhóm này là ginsenosid Re,

-Rf, -Rg1 và notoginsenosid -R1, -R2 [135]

Ocotillol (OCT): Đặc trưng của nhóm này là cấu trúc có vòng epoxy gắn vào vị trí

C-20 Majonosid-R2 của Sâm VN là đại diện cho nhóm này [69]

Khung oleanan (OA) :

Saponin cấu trúc acid oleanolic: Saponin nhóm này có phần aglycon cấu trúc acid

oleanolic (triterpen 5 vòng) gồm các chikusetsu saponin và đại diện là ginsenosid Ro

Saponin có khung PPD và PPT phổ biến trong các loài Panax, trong khi saponin có

aglycon thuộc khung OCT ít hơn và còn lại rất ít là saponin có cấu trúc OA [98],[135]

Các saponin có khung không phổ biến khác

Một số các saponin phân lập từ một số loài thuộc chi Panax có khung khác với các

saponin có khung cơ bản như PPD, PPT, OCT hay OA

Hình 1.3 minh họa các saponin có khung cấu trúc cơ bản thuộc chi Panax

thuộc chi Panax

1.2.1.2 Phân bố của saponin chính trong các loài thuộc chi Panax

Các ginsenosid được phân bố trong các bộ phận khác nhau của các loài thuộc chi

Panax, từ rễ củ, thân rễ cho đến lá, hoa, hạt Tùy vào các loài khác nhau, việc phân bố

các loại ginsenosid cũng như hàm lượng của chúng trong các bộ phận này cũng tương

đối khác nhau (Bảng 1.3) [27],[135]

Bảng 1.3 Phân bố một số saponin chính trong một số loài thuộc chi Panax

1 P bipinnatifidus Thân rễ Rễ củ/ G-Rb 1, -Rd G-Re, N-N 24(R)-P-RT2

[98]

Hoa/ Hạt

G-Rb 1 , -Rb 2 , Rc, Rd,-I, -II, Floral-E, -F, -G,-K,-H,-O, -

-Tc, -Td

G-Re,-Rg 1 , F3,

-Rh 6 , F-A, D,-I,-J,-M,-N,-P,- Ka,-La,-Lb,-Ta,- Tb,-Ka,-Kc

Rb 2 , Rc, Rd, NR4

Ro, 1b, -IV, - IVa,

[110],[ 123]

Rễ củ/

Thân rễ

G-F2, -Ra 1 , -Ra 2 ,

-Ra 3 , -Rb 1 , -Rb 2 , MG-Rb 2 , -Rb 3 , -

Rc, -Rd, N-Fd, Gyp-XVII, N-A, -

C, B, D, E, Fa,

Fc, Fe, K, L, R4, Q-R 1 , -I, -II, III, -V

-G-F1, -Re, glucose Rf, -Rg 1 ,

20-20(S)-Rg2, 20(S)–

Rh 1 , NM, N, R1, -R2, -R3, -R6, -U, -H, -M, -J, G- M7cd, -F4

-24(R)–P-F11 G-Ro,

N-G, -I

[139] [138]

[121]

6 P

quinquefolius Lá/ Thân

G-Rb 1 , -Rb 2 , -Rb 3 , -Rc, -Rd, Q-L2, - L3, N-E

G-Re, 20(S)-Rg2 ,

20(S)-Rh1 , Q-L9 24(R)-P-F11 G-Ro

[20]

STT Loài Bộ phận PPD PPT OCT OA/ Khác TLTK

Hoa/ Hạt

G-Rb 1 , -Rb 2 , -Rb 3 , -Rc, -Rs 1 ,

Gypenosid IX, F8, -RC1, Q-III, G- I,-II, F-D

Rb 1 , -Rb 2 , Rc,

-Rd, Rd, Gyp-IX, P-RC1, Q-R1, -I, -

II, III, V, NA,

-C, -K

G-F1, -Re, -Rg 1 , M-Rg 1, 20(S)-Rg2 ,

20(S)-Rh1 , NR1, R2

GRo, CIV, IVa, Z-R1

gypenosid XVII, P-RC1, Q-R1, N-

Fa, Fd, VR7, R8, -R15, -R16, - R17, -R18, -R19,

-24(R)-R9,

24(S)-R9

20-O-Me-G-Rh1 , 20-gluco-Rf, -Re, -

Rg 1, 20(S)-Rh1 ,

20(R)-Rh1 , P-RS1, N-R1, -R6, V-R4, -R12, -R13, -R20,

24(S) -R21, R22, -R24, -R25

24(R)-PPT oxide II,

24(S)-P-F11 ,

24(S)-RT4 , M-R1, -R2, V-R1, -R2, - R5, -R6, - R10, -R11, - R14

G-Ro, Ma3, V- R3, - R23, -L8

H-[71],[7 2],[73], [148],[ 149]

20glucoGRf,

-Re, -Rg 1 , NR1, R6, Ye-D, -E, -F,

-24(S)-P-F11 ,

24(S)-RT4,

YeA, VR1, R2, Ye-B, -C

-I,

Ye-G

[148],[ 149]

Chú thích: B- (Bipinnatifidusosid); C- (Chiketsusaponin); Floral- (Floralginsenosid); FN-

(Floralnotoginsenosid); FQ- (Floralquinquenosid); G- (Ginsenosid); Gyp- (Gypenosid); H- (Hemslosid); M-(Majonosid); Mj- (Majorosid); Noto- (Notoginsenosid); P- (Pseudoginsenosid); Q- (quinquenosid); Ye-(Yesanchinosid); V- (Vinaginsenosid); Z- (Zingiberosid)

1.2.2 Các thành phần hóa học khác

Polysaccharid (glycan)

Nhóm hợp chất tan trong nước gồm từ 10 đến 1000 đơn vị đường đơn, bao gồm nhiều phân tử đường gắn với acid uronic có tên gọi panaxan A đến U Trọng lượng phân tử của chúng từ khoảng 10.000-150.000 Da Một vài heteroglycan chuỗi nhánh acid có

trọng lượng phân tử thay đổi từ 20.000 đến khoảng 1.900.000 Da đã được báo cáo

trong rễ, thân và lá của các loài thuộc chi Panax khác nhau Một số polysaccharid đã

được phân lập như sanchinan A (1.500.000 Da), hetero-polysaccharid PN (1.900.000 Da), ginsenan PA (160.000 Da), ginsenan PB (55.000 Da) đã được phân lập từ các bộ

phận khác nhau như rễ củ, thân, lá của các loài Panax [22]

Đặc biệt các peptidoglycan phân tử lượng cao được đặt tên là panaxan A-U có khối lượng phân tử từ 10.000 - 1.800.000 Da gồm các đơn vị D-glucopyranose liên kết (1→6) với các nhánh liên kết vị trí 1→3 [22] Cho đến nay có khoảng 35 hợp chất

polysaccharid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ các bộ phận khác nhau của P

ginseng [106]

Polyacetylen: Nhóm hợp chất hữu cơ với nối đôi và nối ba liên hợp Thành phần

polyacetylen chính của một số loài Panax là panaxynol (falcarinol) và falcarintriol

(panaxytriol) Panaxynol (heptadeca-1,9-diene-4,6-diyne-3-ol) là cấu trúc polyacetylen

lần đầu được phân lập từ P ginseng bởi Takahashi và CS [109]

Flavonoid: Bên cạnh nhóm hợp chất liệt kê trên, một vài flavonoid đã được phân lập

và định danh từ các loài thuộc chi Panax Kaempferol, trifolin và panasenosid đã được phân lập từ P ginseng Quercetin-3- O -sophorosid được phân lập từ lá của P

notoginseng Kaempferol-3,7-dirhamnosid và kaempferol-3-gluco-7-rhamnosid cũng

được phân lập từ P trifolium [98]

Tinh dầu: Thành phần chính của tinh dầu trong các loài thuộc chi Panax thuộc nhóm

sesquiterpen hydrocarbon (β-panasinsen, α-panasinsen, α-neocloven,

bicyclogermacren, β-farnesen, aromadendren và (E)-caryophyllen) và sesquiterpen

alcol (spathulenol, ginsenol, panasinsenol A và panasinsenol B) Tinh dầu của các loài

Panax khác nhau chủ yếu ở thành phần sesquiterpen hydrocarbon và các monoterpen

Hàm lượng của các thành phần như α-cadinol, α-bisabolol, thujopsen và acid

n-hexadecanoic tăng lên đáng kể với độ tuổi của sâm [21]

Hàm lượng và thành phần tinh dầu của 4 loài Panax gồm P notoginseng, P

stipulenatus, P japonicus và P vietnamensis cũng đã được phân tích bằng LC/MS Kết

quả cho thấy 1,2,4-trimethyl-benzen, octanal, acid nonanoic, 2-methyl-naphthalen, dimethylnaphthalene, acid lauric, heneicosan, acid phthalic diisobutyl ester, methyl hexadecanoat, falcarinol, octadecanoic acid-methyl ester và erucylamid là thành phần

1,7-chính của 4 loài Panax này [131]

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ CÁC DẠNG

CHẾ BIẾN KHÁC NHAU CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX

1.3.1 Phương pháp chế biến Nhân sâm

Phương pháp chế biến truyền thống

Bên cạnh dạng dùng phổ biến là Sâm tươi, Nhân sâm chủ yếu được chế biến thành các dạng phổ biến như Bạch sâm và Hồng sâm

 Bạch sâm: Nhân sâm được phơi sấy khô thông thường, có hay không tẩm đường

 Hồng sâm: Nhân sâm ở dạng khô hay tươi được hấp ở nhiệt độ cao 98-105 ℃ trong thời gian khác nhau (50-90 phút hay 2-3 giờ) Nhân sâm sau khi hấp được phơi sấy Việc chế biến này trước đây nhằm mục đích tăng thời gian bản quản cho Nhân sâm vì sau khi hấp và sấy khô, tinh bột trong củ sâm bị hồ hóa, làm tăng thể chất rắn chắc, giúp bảo quản lâu dài hơn

Phương pháp chế biến mới

Các phương pháp chế biến mới Nhân sâm nhằm mục đích thay đổi thành phần hóa học hướng đến sự thay đổi/ gia tăng tác dụng sinh học Điều kiện chế biến được thay đổi các tác nhân vật lý và tác nhân hóa học

Tác nhân vật lý: Thường là thay đổi nhiệt độ hoặc áp suất khi chế biến Các tác giả

nghiên cứu thay đổi nhiệt độ chế biến từ 110-180 ℃ từ 0,5-20 giờ [33] Với phương pháp chế biến này, hàm lượng G-Rg3 và G-Rg5 tăng lên đáng kể

Phương pháp chế biến thay đổi bằng tăng lượng khí O2 (50%) nhằm tăng tốc độ phản ứng (browning reaction) và có thể giảm thời gian chế biến Với phương pháp chế biến này cho thấy tác dụng chống oxy hóa tăng lên đáng kể

Một trong hai dạng chế biến theo phương pháp trên gần đây đã được nghiên cứu và thương mại hóa sản phẩm là “Sun ginseng” và “Black ginseng”

 Thái dương sâm (Sun ginseng): Là dạng chế biến Nhân sâm ở nhiệt độ cao hơn 120 – 150 ℃ so với điều kiện chế biến Hồng sâm Với dạng chế biến này, các thành phần ginsenosid có trong Hồng sâm tăng lên nhiều lần, đồng thời tạo nên một số thành phần ginsenosid mới với các tác dụng được tăng cường [39],[89]

 Hắc sâm (Black ginseng): đây là dạng chế biến mới bằng cách hấp và sấy Nhân sâm

9 lần Quy trình hấp và sấy 9 lần ở nhiệt độ từ 88-96 ℃ trong khoảng 2,5-4 giờ [103] Cách chế biến này mang lại cho Nhân sâm có màu đen đồng thời thành phần hóa học

và tác dụng dược lý thay đổi đáng kể

Tác nhân hóa học: Một số acid hữu cơ như acid ascorbic, acid malic và acid citric được

sử dụng với nồng độ khác nhau (tối đa 1 M) nhằm đánh giá sự thay đổi hàm lượng của G-Rg2, -Rg3, -Rh1 và -Rh2 Hàm lượng G-Rg2 gia tăng phụ thuộc nồng độ acid ascorbic Acid citric làm gia tăng sự hình thành các G-Rg2, -Rg3, -Rh1 và -Rh2 Nồng

độ acid và loại acid khác nhau ảnh hưởng đến sự thay đổi nồng độ các ginsenosid trên [107] Bên cạnh các acid trên, chế biến Nhân sâm với acid ascorbic ở pH 2-3 và trên 80

℃ làm gia tăng hàm lượng G-Rg3 Với thời gian chế biến 5 giờ, hàm lượng G-Rg3 tăng khoảng 16 lần ở pH=2 so với pH=3 Hàm lượng G-Rg3 cao nhất khi chế biến ở điều kiện pH=2 trong 9 giờ Nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng của G-Rg3 có thể tăng lên đến hơn 90 lần khi xử lý với acid ascorbic so với điều kiện thông thường [37]

Có thể chế biến Nhân sâm/ cao chiết Sâm với các acid hữu cơ hay thực vật chứa nhiều acid hữu cơ như Ngũ vị tử, Sơn tra, Sơn thù, Mộc qua, Ô mai, Quít, Chỉ xác (cam), Táo, quả Lựu và Chanh ở nhiệt độ từ 70-120 ℃ Với phương pháp chế biến này làm tăng tỉ lệ hàm lượng của ginsenosid (Rg3+Rg5)/(Rb1+Rb2+Rc+Rd) dao động khoảng 10-45 lần[88]

Ngoài ra các yếu tố như sự thay đổi áp suất hay nhiệt độ khác nhau (đến 150 ℃) và dung môi như nước hay ethanol-nước được sử dụng nhằm đánh giá sự thay đổi hàm lượng ginsenosid cũng như hoạt tính sinh học của Nhân sâm Hàm lượng các hợp chất phenol tăng từ 1,43 đến 11,62 mg/g, hoạt tính chống oxy hóa đều tăng do quá trình chế biến [50]

1.3.2 Sự thay đổi thành phần hóa học qua quá trình chế biến

1.3.2.1 Sự thay đổi thành phần ginsenosid

Quá trình chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ cao đã làm biến đổi các ginsenosid trong

Nhân sâm cũng như của các loài thuộc chi Panax khác Ở dạng chưa chế biến, thành

phần hóa học ginsenosid của Nhân sâm chủ yếu là các ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khung PPD như G-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd và PPT như G-Re, -Rg1 và -Rg2 Ở dạng Sâm chế biến như Hồng sâm, Thái dương sâm hay Hắc sâm, các thành phần ginsenosid phân cực này được chuyển hóa thành các ginsenosid kém phân cực hơn

Quá trình hình thành các ginsenosid thông qua việc cắt đường ở vị trí 20, 3 hay

C-6 (khó hơn) và khử nước tại vị trí C-20 của –OH tự do để hình thành nên các

ginsenosid kém phân cực (Hình 1.4.)

 Với các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD, các ginsenosid mới được hình

thành như 20(S) và 20(R) G-Rg3, -Rg5, -Rg6, -Rk1, -Rs1, -Rs7

 Các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT mới được hình thành hoặc gia tăng

hàm lượng như như: 20(S) và 20(R) Rg2, và -Rk3, 20(S) và 20(R) G-Rh1, -Rh2, -Rh4

Một lượng rất nhỏ G-Rh2 hiện diện cho thấy việc khử đường ở vị trí C-3 tương đối khó

trong quá trình chế biến G-Rg3 là một trong những thành phần phát sinh (artefact)

quan trọng nhất của Hồng sâm và các sản phẩm Nhân sâm chế biến khác Để tiêu

chuẩn hóa cho các chế phẩm chế biến như Hồng sâm, bên cạnh hai ginsenosid đại diện

cho nhóm PPD và PPT là G-Rb1 và -Rg1, người ta cũng thường dùng G-Rg3 làm tiêu

Các malonyl ginsenosid Rb1, -Rb2, -Rc và -Rd là thành phần đặc trưng cho Sâm tươi hay Bạch sâm Các malonyl ginsenosid này kém bền ở nhiệt độ cao, do vậy qua quá trình gia nhiệt khi hấp, các ginsenosid có gắn các malonyl ở vị trí C-6″ đường glucose

sẽ phóng thích nhóm malonyl và tiếp tục cắt một phần đường ở vị trí C-20 để tạo thành các ginsenosid thứ sinh như G-Rh1, -Rg3 và -Rh2

Bên cạnh P ginseng, các loài thuộc chi Panax khác cũng đã được nghiên cứu chế biến

tương tự Qua quá trình chế biến, các ginsenosid PPD và PPT phân cực bị cắt đường hoặc khử nước để chuyển thành các ginsenosid PPD và PPT kém phân cực và có thời gian lưu lâu hơn trên sắc ký đồ HPLC

Cấu trúc các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến [98] được trình bày

trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến P ginseng

Aglycon là PPD

1 20(S)-Ginsenosid Rg3 (a) -Glc 2 -Glc -H C 42 H 72 O 13 P ginseng

2 20(R)-Ginsenosid Rg3 (a) -Glc 2 -Glc -H C 42 H 72 O 13 P ginseng

3 Ginsenosid Rs 3 (a) -Glc 2 -Glc 6 -Ac -H C 44 H 74 O 14 P ginseng

4 Ginsenosid Rh 2 (a) -Glc -H C 36 H 62 O 8 P ginseng

13 20(S)-Ginsenosid Rg2 (a) -H -Glc 2 -Rha C 42 H 72 O 13 P ginseng

14 20(R)- Ginsenosid Rg2 (a) -H -Glc 2 -Rha C 42 H 72 O 13 P ginseng

R1O

3

6 12

R2

STT Saponin Khung R1 R2 CTPT Nguồn

17 Ginsenosid F 4 (c) -H -Glc 2 -Rha C 42 H 70 O 12 Lá, P ginseng

18 Ginsenosid Rs 6 (c) -H -Glc 6 -Ac C 38 H 62 O 9 P ginseng

19 Ginsenosid Rz 1 (c) -Glc 2 -Ac -H C 42 H 70 O 12 P ginseng

20 Ginsenosid Rh 4 (c) -H -Glc C 36 H 60 O 8 P ginseng

21 Ginsenosid Rk 3 (b) -H -Glc C 36 H 60 O 8 P ginseng

22 Ginsenosid Rs 7 (b) -H -Glc 6 -Ac C 38 H 62 O 9 P ginseng

23 Ginsenosid Rg 6 (b) -H -Glc 2 -Rha C 42 H 70 O 12 P ginseng

24 (20E)-ginsenosid Rg 9 (e) -H -Glc 2 -Glc C 42 H 70 O 13 P ginseng

25 (20Z)-ginsenosid Rg 9 (e) -H -Glc 2 -Glc C 42 H 70 O 13 P ginseng

26 Ginsenosid Rg 10 (e) -H -Glc 2 -Glc C 42 H 70 O 13 P ginseng

27 Ginsenosid SL2 (d) -H -Glc 2 -Rha C 42 H 70 O 14 Lá, P ginseng

-là 1,0-1,5% và cao chiết Hồng sâm khoảng 2,5% Sự thay đổi hàm lượng của acid amin

và đường tự do trong quá trình chế biến Sâm tươi sang Hồng sâm được thể hiện qua sự giảm hàm lượng acid amin từ 17,9 mg/g xuống còn 12,2 mg/g Điều này là do sự chuyển dạng của một số acid amin sang dạng kết hợp đường-amino khác nhau

Thành phần polysaccharid

Hàm lượng polysaccharid dạng acid trong Hồng sâm cao hơn 3 lần so với Bạch sâm Hàm lượng polysaccharid dạng acid trong Bạch sâm là 0,86% (rễ con), 0,63% (rễ

chính) và Hồng sâm là 4,7% (rễ con) và 7,5% (rễ chính) Sự gia tăng hàm lượng này là

do sự thoái giáng của các thành phần đường trong quá trình chế biến bằng cách hấp và sấy Sâm tươi [50] Polysaccharid trong Sâm có rất nhiều tác dụng như điều hòa hệ miễn dịch, chống mệt mỏi (anti-fatigue), kháng khối u (antitumor), chống kết tập tiểu cầu, chống oxy hóa, chống loét (antiulcer), chống bức xạ, bảo vệ gan, hạ đường huyết

và hoạt tính hạ lipid [105],[106],[122],[124]

Thành phần polyacetylen

Thành phần polyacetylen chủ yếu của P ginseng là panaxynol và panaxydol Trong

quá trình chế biến, panaxydol bị chuyển thành panaxytriol do hydrat hóa ở vòng epoxy

do nhiệt hoặc acid Đây cũng là thành phần polyacetylen đặc trưng của P ginseng chế

biến

1.3.3 Sự thay đổi tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Panax và các

thành phần ginsenosid sau chế biến

Sự thay đổi thành phần hóa học sau chế biến, đặc biệt là thành phần saponin đã làm thay đổi hoạt tính sinh học của Hồng sâm và các dạng chế biến của các loài thuộc chi

Panax Đa số các tác dụng sinh học như tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng tế bào

ung thư, tác dụng bảo vệ gan,… đều tăng lên so với dạng chưa chế biến là Bạch sâm

1.3.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa trên gốc tự do O2−, ONOO− và ·OH của

Thái dương sâm mạnh hơn Hồng sâm và Bạch sâm Maltol, acid vanillic và acid

p-coumaric thể hiện hoạt tính ức chế gốc tự do ONOO− Đồng thời maltol và acid

p-coumaric thể hiện hoạt tính chống gốc tự do ·OH Maltol là sản phẩm của phản ứng

Maillard (MRPs) Nồng độ của maltol gia tăng đáng kể trong quá trình chế biến Nhân sâm theo khuynh hướng phụ thuộc nhiệt độ chế biến Điều này cho thấy có mối quan

hệ giữa hoạt tính chống oxy hóa và chế biến Nhân sâm

Một nghiên cứu trên tác động chống stress oxy hóa sử dụng thử nghiệm DCF-DA, gây

ra bởi H2O2 phóng thích MDA và ROS cho thấy Hồng sâm làm giảm stress oxy hóa thông qua làm tăng các enzym chống oxy hóa nội bào như catalase, glutathion peroxidase và superoxid dismutase khi xử lý tế bào HepG2 với H2O2 [51],[102]

Như vậy, có thể thấy quá trình chế biến làm tăng cường tác dụng chống oxy hóa của Nhân sâm

1.3.3.2 Tác dụng kháng phân bào và kháng khối u

Ginsenosid là hoạt chất quan trọng nhất của Nhân sâm và cũng được chứng minh là có

tác dụng kháng ung thư in vitro và in vivo thông qua nhiều cơ chế khác nhau Rất nhiều

ginsenosid thể hiện độc tính trực tiếp hoặc ức chế tăng trưởng chống lại tế bào ung thư, trong khi một số khác thể hiện tác dụng chống di căn và tăng trưởng khối u Kết quả từ những nghiên cứu đoàn hệ đối với việc sử dụng Bạch sâm và Hồng sâm đã chứng minh một cách rõ ràng Nhân sâm có những thành phần đặc biệt có tác dụng bảo vệ chống lại ung thư và tác dụng này được chứng minh có liên quan đến thành phần của ginsenosid, đặc biệt là các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến Nhân sâm như là G-Rg3, -Rg5 và -Rh2 [52],[99], [100],[132]

Mối liên quan cấu trúc ginsenosid và tác dụng kháng ung thư

Saponin các loài thuộc chi Panax thuộc khung triterpen, với dây nối ở C-20 và các

phân tử đường gắn vào nhóm -OH của phần aglycon tại các vị trí 3, 6, 12 và 20 Hầu

hết saponin dammaran các loài thuộc chi Panax được phân thành ba nhóm chính PPD,

PPT và OCT Tuy nhiên hoạt tính sinh học của OCT chưa được nghiên cứu nhiều

Về mặt cấu trúc, ginsenosid nhóm PPT khác nhóm PPD do gắn nhóm -OH ở vị trí C-6

Ở nhóm PPD, phần đường gắn vào vị trí OH- của C-3 và nhóm -OH ở C-20 của phần aglycon Với nhóm PPT, phần đường được gắn vào nhóm -OH vị trí C-6 và C-20 của phần aglycon Chính sự khác nhau về cấu trúc này dẫn đến sự khác nhau trong tác dụng sinh học của ginsenosid đối với ung thư

Độc tính tế bào và tác động kháng phân bào của ginsenosid trên các dòng tế bào ung thư người và động vật đã được chứng minh trên rất nhiều nghiên cứu Dựa trên các kết quả nghiên cứu, có thể đánh giá hoạt tính kháng ung thư của ginseng saponin liên quan đến những yếu tố sau như:

 Số lượng phân tử đường, vị trí gắn đường

Hoạt tính kháng ung thư tỉ lệ nghịch với số lượng phân tử đường có trong cấu trúc ginsenosid Khi số lượng phân tử đường trong phân tử ginsenosid giảm, hoạt tính kháng ung thư được tăng cường [120],[127] Sự hiện diện của phân tử đường làm giảm tính kỵ nước của các chất và làm giảm tính thấm màng tế bào [126]

Khi sự tương tác với màng tế bào giảm, hoạt tính kháng ung thư cũng giảm Vì thế, chúng ta có thể thấy, hoạt tính kháng ung thư có tương quan nghịch với số lượng phân

tử đường, thực tế có thể quy cho khả năng hấp thu qua màng tế bào của các ginsenosid

Tỉ lệ hấp thu qua màng tế bào của các ginsenosid trên tế bào ung thư có thể giảm với sự gia tăng số lượng phân tử đường, do giảm tính kỵ nước [20]

Cấu trúc ginsenosid thuộc khung PPD và PPT khác nhau ở vị trí gắn đường Vị trí nhóm thế ở C-6 làm nên sự khác nhau về cấu trúc của PPD và PPT Sự khác nhau ở vị trí liên kết phân tử đường cũng có thể ảnh hưởng đến đáp ứng hoạt tính sinh học G-Rh2 (PPD) và G-Rh1 (PPT) có cấu trúc tương tự nhau, khác nhau ở vị trí gắn đường glucose vào vị trí C-3 và C-6 Tác dụng của G-Rh2 còn được tìm thấy có tác dụng

tương tự với 20(S)-PPD và 20(S)-PPT, trong khi tác dụng của 20(S) G-Rh1 thấp hơn 10

lần Điều này cho thấy rằng vị trí gắn đường tại C-3 hoặc C-6 luôn đóng vai trò quan trọng trong tác dụng kháng ung thư của ginsenosid [92],[127]

Với phân tử đường ở vị trí C-6, hoạt tính kháng ung thư sẽ giảm so với liên kết đường

ở C-3 hoặc C-20 Những thí nghiệm với mô hình phân tử và docking xác nhận rằng sự hiện diện của phân tử đường ở vị trí C-6 gia tăng sự cản trở phân tử trong không gian vào liên kết tế bào ngoại bào nên làm giảm hoạt tính kháng ung thư đáng kể

 Số lượng và vị trí nhóm hydroxyl

Ginsenosid tương tác với nhóm -OH của cholesterol ở trên màng tế bào và xen giữa cấu trúc của phân tử vào màng huyết tương Khả năng gắn và định hướng với màng tế bào bị ảnh hưởng bởi số lượng và vị trí nhóm hydroxyl phân cực Sự khử nối đôi C-24/25 và thêm vào nhóm -OH hoặc -OCH3 ở vị trí 25 làm tăng tiềm năng kháng ung thư của ginsenosid Sự khử nước ở vị trí C-20 làm gia tăng hoạt tính sinh học của ginsenosid [92],[127]

 Sự chọn lọc lập thể của đồng phân 20(S) và 20(R)

Dạng 20(S) và 20(R) của ginsenosid là dạng đồng phân lập thể của nhau phụ thuộc vào hướng của nhóm hydroxyl tại C-20 Về không gian, 20(S)-OH gần với hydroxyl gắn vào vị trí C-12 của ginsenosid trong khi OH ở đồng phân 20(R) thì xa hơn Sự khác nhau về hóa học lập thể dẫn dến sự khác nhau về tác dụng dược lý Đồng phân 20(S)

G-Rg3 loại bỏ gốc hydroxyl tốt hơn đồng phân 20(R) G-Rg3 Hợp chất ginsenosid có

cấu trúc 20(S) thể hiện tác dụng kháng phân bào tốt hơn so với đồng phân 20(R) Tuy nhiên, đồng phân 20(R) như 20(R) G-Rg3 thể hiện tác dụng ức chế sự di căn và xâm chiếm của tế bào ung thư mạnh hơn đồng phân dạng 20(S) [31] Những kết quả nghiên

cứu này cho thấy có sự liên quan của hydroxyl và đồng phân tại vị trí C-20 lên tác dụng sinh học và dược lý của ginsenosid

Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549 ( non-small cell lung cancer, NSCLC) của Nhân sâm

 Dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549

Ung thư phổi là một trong những trường hợp ung thư phổ biến nhất nhưng việc chẩn đoán tương đối kém Trong đó, ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) chiếm đến hơn 80% các trường hợp ung thư phổi NSCLC bao gồm các khối u biểu mô ác tính của phổi ngoại trừ tế bào ung thư phổi nhỏ (SCLC) được phân loại theo WHO [28] Tế bào A549 là tế bào ung thư phế nang biểu mô cơ bản của người Dòng tế bào này được phát triển đầu tiên bởi D J Giard và CS vào năm 1976 thông qua việc loại bỏ và nuôi cấy các mô ung thư phổi của người đàn ông da trắng 58 tuổi [56] Trong tự nhiên, đây là các tế bào vảy và chịu trách nhiệm cho sự khuếch tán một số chất, chẳng hạn như nước

và điện giải, qua các phế nang của phổi Nếu các tế bào A549 được nuôi cấy in vitro,

chúng phát triển thành lớp đơn, bám dính hoặc gắn vào bình nuôi cấy Một đặc tính của các tế bào này là chúng có thể tổng hợp lecithin và chứa nồng độ cao của các acid béo không bão hòa, quan trọng trong việc duy trì màng phospholipid của tế bào Dòng tế

bào A549 được sử dụng rộng rãi trong các mô hình in vitro cho mô hình tế bào biểu mô

phổi loại II trong nghiên cứu chuyển hóa thuốc và như là một vật chủ chuyển nhiễm (transfection host) [56]

 Các nghiên cứu Nhân sâm với tế bào ung thư phổi A549

Nhân sâm và ginsenosid đã được nghiên cứu rất nhiều với tác dụng kháng phân bào của các dòng tế bào ung thư Các ginsenosid được phân lập từ Nhân sâm hoặc sâm chế biến như G-Rh2, -Rg3, 25-OCH3-PPD, 20(S)-PPD,…thể hiện tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào A549 thông qua nhiều cơ chế khác nhau như G-Rh2 tăng biểu hiện của p53

và giảm biểu hiện của Bcl-2 [142] hay thay đổi miRNA [15], [125] hoặc tăng cường quá trình chết tế bào thông qua giảm biểu hiện của con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt

ở dòng tế bào A549 20(S)-PPD hứa hẹn là tác nhân trị liệu ung thư phổi được phân lập

sạch tổ chức viêm, phản ứng viêm giảm, tế bào sợi được hoạt hóa để thành lập collagen tạo thành sẹo làm lành vết thương [96]

Trong một số trường hợp viêm mạn tính kéo dài, các vị trí viêm không lành, có thể xuất hiện thêm các tổn thương thứ phát do sản xuất các enzym tiêu đạm (do vi khuẩn gây viêm tiết ra), necrosin, các gốc tự do (do các tế bào viêm tiết ra) gây các rối loạn, có thể dẫn đến bệnh lý [96]

Vai trò của đại thực bào trong phản ứng viêm: Chức năng chính của các tế bào miễn

dịch bẩm sinh là phát hiện và nhận diện các chất lạ/ chất gây hại thúc đẩy phản ứng phòng vệ Các đại thực bào (macrophage) tham gia tích cực vào tất cả các giai đoạn của quá trình viêm Đại thực bào là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống với vai trò chính là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các tế bào trình diện kháng nguyên, khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể Do đó, đại thực bào liên quan đến một số tình trạng bệnh lý miễn dịch

Các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokin gây viêm mạnh Các cytokin chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố họai tử khối u TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, nitric oxid (NO) vàc các phân tử dính kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm Do đó, việc kiểm soát sản xuất các chất này

có thể làm giảm khả năng viêm [10],[96]

Đại thực bào là tế bào có kích thước tương đối lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với các kích thích viêm tạo ra bởi lipopolysacharid (LPS) Ngoài ra, các thụ thể Toll- like (TLR, Toll like receptor) ở đại thực bào được biểu hiện mạnh hơn so với các tế bào bạch cầu khác nên nó thường được lựa chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu

cơ chế kháng viêm in vitro CD14 và moesin được biểu hiện trên màng tế bào đại thực

bào Sự kích hoạt LPS gây ra phosphoryl hóa moesin, gắn kết lên thụ thể TLR4 và MD-2 hoạt hóa MyD88 Sự truyền tín hiệu qua cơ chế này dẫn đến việc tạo ra các cytokin tiền viêm (Zawawi và CS, 2010) [13]

TLR là một protein màng, có thể nhận dạng ra các phân tử có sẵn ở trên mầm bệnh Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm ít nhất 10 loại khác nhau Chúng có

một vai trò cơ bản tới nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ mầm bệnh

 TLR2 có thể nhận dạng các lipoprotein các gốc đường có gắn lipid (lipoarabinomannan, một loại glycolipid) từ thành tế bào của vi khuẩn và nấm

 TLR4 nhận dạng lipopolysaccharid (LPS) từ thành tế bào của vi khuẩn Gram âm

 TLR9 có thể nhận dạng deoxycytidylat-phosphat-deoxyguanylat (CpG) có trong deoxyribonucleic acid (DNA) của vi khuẩn [13]

Một vi sinh vật có thể được nhận bởi rất nhiều TLR Thực tế, tổ hợp của TLR có thể tham gia vào các đáp ứng viêm do đại thực bào hoặc tế bào tua (dendritic cells) sinh ra trong quá trình cơ thể bị nhiễm mầm bệnh TLR bao gồm một đoạn nằm bên trong tế bào được gọi là thụ thể Toll/IL-1 (TIR) Quá trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động nhân tế bào là NF-B và sản xuất

ra các cytokin tiền viêm như TNF-α thông qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88 Tuy nhiên, quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt động của NF-κB thông qua TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiên mã của interferon (IFN) giống như quá trình sản xuất IFN kiểu 1 Do vậy trong số các thụ thể TL, TLR4 được nghiên cứu nhiều nhất [13]

[10] “Nguồn: Hasturk Hatice, 2012”

chứng về thể tích cũng như số lượng bạch cầu và protein trong dịch [96]

 Gây viêm mạn bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuột để tạo khối u, đánh giá khối lượng khô của khối u so với mẫu chứng [96]

 Đánh giá khả năng gây phù trên tai chuột bằng một số tác nhân như croton oil, 12- tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA), acid arachidonic (AA), ethyl phenylpropiolat (EPP) bằng cách tiêm tác nhân gây viêm vào tai phải của chuột và đánh giá độ phù dựa vào sự khác biệt của độ dày tai phải so với tai trái [96]

 Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch bằng cách tiêm vào cơ thể chuột chất chỉ thị màu trộn với acid Acid sẽ làm tăng tính thấm thành mạch làm cho chất chỉ thị màu thấm vào nội tạng Đo màu dịch nội tạng chuột để đánh giá mức độ gây viêm Hiện nay, mô hình gây viêm với tác nhân gây viêm mạnh như zymosan (phân lập từ nấm) được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Đánh giá hàm lượng chất trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham gia vào đường truyền tín hiệu viêm như cytokin, chemokin tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng viêm (IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase

(MAPKs) hay phản ứng oxy hóa Với mô hình in vivo này, tác dụng kháng viêm của

chất phân tích sẽ chính xác và chi tiết hơn ở mức độ phân tử [14]

 Mô hình ex vivo sử dụng LPS: Chuột được tiêm natri thioglucolat 4%, thu đại thực

bào phúc mạc, nuôi cấy đại thực bào và xử lý với LPS Đánh giá hoạt tính và cơ chế kháng viêm thông qua các yếu tố tham gia vào đường truyền tín hiệu viêm [83]

Tác dụng kháng viêm của Hồng sâm và thành phần ginsenosid

Rất nhiều ginsenosid thể hiện biểu hiện của iNOS và COX-2 và ức chế sản sinh NO và PGs ở đại thực bào cũng như ức chế yếu tố nhân kappa B hoặc điều hòa biểu hiện gen của iNOS và COX-2 Các ginsenosid như G-Rh1, -Rh2 và 20(S)-PPT, chất chuyển hóa của G-Rh1 hoặc G-Rg1 và chất K là chất chuyển hóa của G-Rb1, được báo cáo là ức chế sản sinh NO, PGE2 và ức chế NF-B Chất K cũng thể hiện sự ức chế biểu hiện của NF-B và COX-2 ở chuột Nhiều nghiên cứu cũng chứng minh các ginsenosid có tác dụng ức chế sự biểu hiện của NF-B và COX-2 [87]

1.4 PHÂN TÍCH SAPONIN TRONG CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX

Việc chế biến sâm bằng phương pháp hấp (heating processing) làm thay đổi thành phần hóa học của Sâm, đặc biệt là thành phần saponin Các saponin mới hình thành sau chế

biến thường bị cắt mất một đến vài phân tử đường (deglycosylat) hoặc bị khử nước tạo thành nối đôi (dehydrat) ở mạch nhánh C17 làm giảm độ phân cực của saponin Chính

vì vậy, việc phân tích toàn bộ thành phần saponin trong sâm chế biến bao gồm cả saponin phân cực và kém phân cực dẫn đến mức độ phức tạp cho các phương pháp phân tích Sau đây là một số phương pháp phân tích định tính và định lượng được dùng trong phân tích saponin của sâm

1.4.1 Phân tích định tính

 Phân tích dấu vân tay bộ chất chuyển hóa thực vật (metabolomic fingerprint):

Phân tích dấu vân tay chất chuyển hóa (metabolic fingerprint) đã được quốc tế chấp nhận để đánh giá chất lượng dược liệu Công cụ để phân tích dấu vân tay bộ chất chuyển hóa thực vật bao gồm LC/MS và NMR Với đầu dò MS, có thể phân tích các chất ở nồng độ rất thấp Thông tin phân mảnh thu được và số khối chính xác của kỹ thuật TOF-MS có thể cung cấp thông tin và khả năng định tính các saponin mới chưa biết NMR là phương pháp tin cậy nhất trong phân tích chuyển hóa metabolomics Phổ

1H-NMR trong kỹ thuật dấu vân tay NMR cung cấp thông tin hóa học phong phú Nồng độ của mỗi chất trong mẫu có thể dễ dàng tính toán dựa vào tương tác tín hiệu trên phổ Ngoài ra, không yêu cầu đường tuyến tính để chuyển cường độ tín hiệu sang nồng độ Trong trường hợp phổ phức tạp và tín hiệu bị chồng lấn trong phổ 1H-NMR cao, cấu trúc của các chất chuyển hóa có thể xác nhận lại bằng kỹ thuật 2D-NMR Các dữ liệu thu được được phân tích bằng các phương pháp thống kê Phân tích dữ liệu

đa chiều được sử dụng để nhận biết các mảnh và tìm các tín hiệu tách biệt Giữa các phân tích dữ liệu đa chiều, PCA và PLS-DA (partial least squares-discriminant) trở thành quy trình thường quy cho phân tích dữ liệu thô [19]

 Định danh cấu trúc dựa vào thư viện phổ khối:

Thách thức trong xác định dấu vân tay chất chuyển hóa thực vật là xác định chất chuyển hóa thứ cấp Tuy nhiên, có rất nhiều thành phần không dễ dàng phân lập và các chất đối chiếu không có sẵn trong phòng thí nghiệm Kỹ thuật kết nối HPLC/MS giúp định danh cấu trúc trực tiếp và nhanh chóng xác định các chất trong hỗn hợp cao chiết phức tạp của dược liệu Ứng dụng kỹ thuật IT-TOF-MS hoặc Q-TOF-MS là bước tiến trong định danh các thành phần trực tiếp trong các mẫu sâm Cơ chế phân mảnh và dự đoán ion từ các tài liệu tham khảo là cần thiết cho việc sàng lọc các chất đã biết và chưa biết trong cao chiết Nhân sâm Kỹ thuật định danh cấu trúc online được sử dụng

để định xác định các saponin từ P notoginseng bằng LC-ESI-MS, 35 saponin từ P

ginseng và 30 saponin từ P quinquefolius bằng LC-APCI-MS [93]

 Phân tích malonyl ginsenosid và thành phần chuyển hóa:

Trong quá trình bảo quản, chế biến và chiết xuất, sự biến đổi cấu trúc và hàm lượng các saponin của sâm bị thay đổi ít nhiều, đặc biệt là malonyl ginsenosid [119] Ở rễ sâm khô, hàm lượng malonyl ginsenosid bị giảm khi nhiệt độ sấy tăng lên Malonyl ginsenosid được tìm thấy dạng vết hoặc không được phát hiện trong các sản phẩm sâm chế biến như Hồng sâm [119]

Với đầu dò UV, malonyl ginsenosid thường không được phát hiện, chính vì vậy việc định lượng ginsenosid thường bỏ qua hàm lượng của malonyl ginsenosid Để cải thiện, đệm phosphat thường được dùng để tăng độ phân giải của dạng malonylat và ester của ginsenosid Trong trường hợp sử dụng đầu dò ELSD hay MS, đệm phosphat sẽ được thay bằng amoni acetat, amoni format và acid acetic Một phương pháp khác cũng được

sử dụng để xác định malonyl ginsenosid bằng phương pháp gián tiếp 2 bước thông qua việc sử dụng KOH để thủy phân saponin dạng acid sang dạng trung tính [39] Tuy nhiên, kết quả cũng chỉ là tương đối bởi vì các dẫn xuất khác cũng có thể bị chuyển hóa Trong trường hợp này, đầu dò APCI-MS hay ESI-MS rất thích hợp cho phân tích malonyl ginsenosid trong cao chiết Nhân sâm [119]

1.4.2 Phân tích định lượng

1.4.2.1 Định lượng saponin toàn phần

Trước đây saponin toàn phần chủ yếu được định lượng bằng phương pháp cân Quy

trình định lượng dựa vào chiết xuất lỏng lỏng với n-BuOH bão hòa nước Phương pháp

này có nhiều nhược điểm vì không loại được nhiều tạp và ảnh hưởng đến kết quả hàm lượng saponin toàn phần Phương pháp định lượng bằng phương pháp đo quang thực hiện bằng cách cho hỗn hợp saponin toàn phần phản ứng với acid sulfuric và đun nóng Hỗn hợp sau phản ứng sẽ được định lượng bằng cách đo độ hấp thu ở 485 nm

Liu và CS (1998) đã xác định hàm lượng saponin toàn phần dựa trên phản ứng của màu sapogenin với vanillin sau khi được thủy phân bằng acid Trong nghiên cứu ảnh hưởng

của nồng độ phosphat lên môi trường nuôi cấy P ginseng và P quinquefolius trong việc kích thích tổng hợp saponin và polysaccharid: dịch chiết được chiết phân bố với n-

BuOH và được triển khai trên bản mỏng với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (70:55:10) bão hòa với acid acetic Các saponin sẽ được hiện màu với iod Sau khi tách