Thực hành Công nghệ tế bào động vật 

- Sinh viên biết phương pháp pha loãng, xác định một số chỉ tiêu trong đánh giá chất lượng tinh trùng vật nuôi. Đối tượng:[r]

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

Bộ môn CNSH Động vật-Khoa Công nghệ sinh học

BÀI 01

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHA CHẾ, BẢO QUẢN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG VÀ CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ TRANG THIẾT

BỊ CHỦ YẾU TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM CNSH ĐỘNG VẬT

Mục đích bài thực tập:

- Sinh viên biết cách tổ chức, bố trí các khu vực chức năng của phòng thí nghiệm CNSHĐV

- Sinh viên hiểu rõ và thực hiện các thao tác cơ bản về sử dụng trang thiết bị, dụng

cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm

- Sinh viên biết cách tra cứu, chuẩn bị và pha chế một số hóa chất cơ bản dùng trong nuôi cấy tế bào động vật

1 Nội dung:

1.1 Pha chế, bảo quản và sử dụng một số môi trường thông dụng trong phòng thí nghiệm CNSH động vật

1.1.1 Môi trường, hóa chất, vật tư thông dụng

- Môi trường PBS

- Môi trường DMEM

- Môi trường TCM199

- Môi trường M12

- Môi trường M16

- Fetal Bovine Serum

- Peniciline-Streptomycine

- DMSO, Glycerol

- BSA, Hyaluronidase

- Trypsin-EDTA

- Millipore

- Buồng đếm hồng cầu (Neubauer, Thoma)

- Flask nuôi tế bào

- Đĩa thao tác và nuôi tế bào các loại

1.1.2 Pha chế m«i trưêng PBS với thµnh phÇn như sau (dïng pha 1 lÝt):

Hãa chÊt Khèi lưîng (gram)

Bovine Serum Albumin 2-4

1.2 Sử dụng một số trang thiết bị chủ yếu

1.2.1 Các khu vực chức năng của phòng thí nghiệm

- Khu vực xử lý mẫu

- Khu vực tiền khử trùng

- Khu vực thao tác và nuôi cấy tế bào

- Khu vực bảo quản tế bào

- Khu vực phụ trợ (cất giữ quần áo, vật tư, hóa chất…)

1.2.2 Trang thiết bị và cách vận hành:

- Tủ hút an toàn sinh học cấp II

- Kính hiển vi soi nổi

- Bàn ấm để mẫu

- Đồng hồ bấm giây

- Máy hút môi trường cầm tay

- Tủ nuôi điều chỉnh CO2

- Bình chứa CO2 lỏng

- Kính hiển vi phản pha

- Bình Nitơ

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy đo pH

- Máy khuấy từ có gia nhiệt

- Máy ly tâm thường

- Máy ly tâm lạnh

- Bể rửa siêu âm

- Máy vortex

- Máy làm ấm ống nghiệm

- Máy bơm hút mini chân không

- Tủ nuôi xách tay

- Kính hiển vi quang học

- Bàn ấm trên kính hiển vi soi nổi

- Kính hiển vi vi thao tác

- Tủ khử trùng có đèn cực tím

- Tủ sấy

- Máy xung điện BTX

- Máy cắt kim

- Máy mài kim

- Máy cất nước

- Máy khử ion nước

- Máy PCR

- Máy Realtime PCR

- Máy soi gel

BÀI 02

Mục đích bài thực tập:

- Sinh viên hút trứng từ buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…), quan sát, thao tác và đánh giá chất lượng trứng trên kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000

Đối tượng: - Buồng trứng (lợn, bò, dê, trâu…) được thu ngay khi con vật bị chết,

vận chuyển về phòng thí nghiệm Các trứng bên trong nang được chọc hút bằng sử dụng bơm tiêm loại 5ml

2.1 Thu nhận trứng từ buồng trứng vật nuôi

2.1.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất

- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000

- Pipetman loại 1ml, 200ul

- Đĩa nhựa NUNC to (02 cái)

- Đĩa nhựa NUNC bé (06 cái)

- Bơm tiêm loại 5ml (01 cái)

- Găng tay (01 cái)

- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS

2.1.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1:

- Hút 20 ml môi trường PBS cho vào đĩa NUNC to số 01 bằng pipetman loại 1ml

Bước 2:

- Hút 02 ml môi trường PBS từ đĩa NUNC to 01 nói trên vào bơm tiêm

Bước 3:

- Tay đeo găng cầm buồng trứng, nhẹ nhàng vừa chọc vừa hút các nang trên bề mặt buồng trứng (lặp lại vài lần đến khi hút hết tất cả các nang)

Bước 4:

- Tháo kim tiêm, bơm rất cẩn thận môi trường có trứng, dịch nang, các loại tế bào…

từ bơm tiêm vào đĩa NUNC to số 01

Bước 5:

- Lặp lại bước 3 và 4 vài lần đến khi hút hết tất cả các nang trên bề mặt buồng trứng

2.2 Thao tác với trứng động vật bậc cao

Bước 6:

- Chuẩn bị đĩa 06 đĩa NUNC nhỏ (đánh số từ 01 đến 06, mỗi số tương ứng 01 sinh

viên), mỗi đĩa nạp 03 ml môi trường PBS (có bổ sung kháng sinh, 10% FBS)

- Soi tìm trứng (đĩa NUNC to 01) trên kính hiển vi soi nổi NIKON SMZ1000 theo

nguyên tắc hình chữ “chi”

- Hút toàn bộ trứng có trong đĩa NUNC to 01 bằng sử dụng pipetman loại 200ul, chuyển vào đĩa môi trường NUNC nhỏ số 01 (sinh viên làm chung bước này)

Bước 07:

- Từ đĩa NUNC nhỏ 01, sinh viên số 01 chuyển toàn bộ trứng sang đĩa NUNC nhỏ

02

- Từ đĩa NUNC nhỏ 02, sinh viên số 02 chuyển toàn bộ trứng sang đĩa NUNC nhỏ

03

- Tương tự với các sinh viên khác

2.3 Phân loại trứng bằng kính hiển vi soi nổi

Bước 08:

hợp trạng thái của nguyên sinh chất

Bước 09:

- Nhóm sinh viên hội ý, ghi và báo cáo kết quả

- Giáo viên hướng dẫn thực tập kiểm tra kết quả: sai khác < 20% so với kết quả của giáo viên thì nhóm sinh viên được đánh giá là đạt yêu cầu, > 20% thì không đạt yêu cầu (phải thực hành lại vào buổi khác)

BÀI 03

Mục đích bài thực tập:

- Sinh viên biết tìm thông tin và chọn lọc các phương pháp, dụng cụ, vật tư, hóa

chất để nhân nuôi in vitro tế bào động vật (www.invitrogen.com)

- Sinh viên quan sát, thu nhận, thao tác, đếm tế bào và nhân nuôi, bảo quản lạnh tế bào granulose, cumulus bằng sử dụng buồng đếm hồng cầu

Đối tượng:

- Trang web: www.invitrogen.com

- Tế bào granulose, cumulus của động vật

3.1 Thu thập, đánh giá số lượng và chất lượng tế bào

3.1.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất

- Tủ hút an toàn sinh học cấp II

- Kính hiển vi quang học NIKON E200

- Kính hiển vi phản pha NIKON TS100

- Đèn cồn, bật lửa

- Tủ nuôi điều chỉnh CO2

- Máy ly tâm

- Pipetman loại 1ml, 200ul

- Đĩa nhựa NUNC to (01 cái)

- Đĩa nhựa NUNC bé (02 cái)

- Đĩa nhựa 4 lỗ NUNC (01 cái)

- Ống ly tâm có nắp đậy loại 15ml (06 cái)

- Môi trường PBS bổ sung kháng sinh, 10% FBS

- Môi trường DMEM bổ sung kháng sinh, 10% FBS

- Trypsin-EDTA

- Hyaluronidase

- Dầu khoáng (Mineral Oil)

- Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

- Kháng sinh Penni/Strep

- Fetal Bovine Serum

3.1.2 Phương pháp tiến hành

Bước 1:

- Dùng pipetman loại 1 ml hút dung dịch và tế bào trong đĩa NUNC lớn 01 của bài thực hành số 02, chia đều vào 02 ống ly tâm loại 15 ml (đã có sẵn 03ml PBS, 10%FBS và kháng sinh), đậy nắp Cân bằng và đặt đối xứng 02 ống trên vào máy ly tâm

Bước 2:

- Ly tâm 1200 rpm/5 phút

Bước 3:

3a - Hút bỏ môi trường bên trên một cách cẩn thận từ trên xuống, còn khoảng 0,5

ml thì dừng lại

3b - Thêm môi trường PBS (đã có bổ sung kháng sinh và 10% FBS) vào ống ly tâm đến vạch 5ml, hút trộn đều mẫu

Bước 4:

- Lặp lại bước 2 và 3a

Bước 5:

- Lấy 50 ul mẫu dung dịch có tế bào từ bước 3a, cho lên đĩa NUNC nhỏ, đặt lên kính hiển vi phản pha NIKON TS100 để quan sát

- Thêm 05ul Trypsin-EDTA/05ul Hyaluronidase để phân tách tế bào (02-03 phút/370C) (nếu cần)

Bước 6:

- Dùng môi trường PBS để pha loãng và đếm số lượng tế bào bằng sử dụng buồng đếm Thoma, kính hiển vi quang học NIKON E200 (chia 02 lượng tế bào đang có: ½

nuôi in vitro (bước 7-9), ½ bảo quản lạnh (bước 10-12))

3.2 Nhân nuôi in vitro tế bào trong tủ nuôi

Bước 7:

- Chuẩn bị dung dịch 05 ml DMEM có tế bào với nồng độ 1x106 cho vào lỗ của đĩa nuôi 04 giếng NUNC, phủ dầu khoáng (0,5 ml/ giếng)

Bước 8:

- Đậy nắp và cho đĩa nuôi 04 giếng NUNC vào tủ nuôi đã điều chỉnh 37OC, 5%CO2

Bước 9:

- Đánh giá khả năng sống của tế bào vào ngày kế tiếp bằng soi kính hiển vi phản pha NIKON TS100

3.3 Bảo quản lạnh tế bào

Bước 10:

- Chuẩn bị dung dịch 02 ml DMEM có bổ sung 10% DMSO, 10% FBS

Bước 11:

- Cho tế bào vào dung dịch DMEM nói trên

Bước 12:

- Hạ nhiệt độ (+40C trong 30 phút, -200C trong 30 phút) và bảo quản lạnh tế bào ơ -1960C Giải đông 370C-01 phút, kiểm tra chất lượng tế bào

BÀI 04

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA TINH TRÙNG ĐỘNG VẬT

- Sinh viên biết phương pháp pha loãng, xác định một số chỉ tiêu trong đánh giá chất lượng tinh trùng vật nuôi

Đối tượng:

- Tinh trùng lợn, bò

4.1 Chuẩn bị buồng đếm và mẫu tinh trùng

4.1.1 Tính toán nồng độ tế bào bằng cách sử dụng buồng đếm:

C: Nồng độ tế bào ban đầu (số lượng tế bào/ml)

N: Số lượng tế bào đếm được trong 05 ô lớn

H: Hệ số pha loãng (giả sử là 20 lần)

Buồng đếm Thoma, Neubauer có ba thông số cơ bản sau:

- Một ô lớn gồm 16 ô nhỏ

- Độ sâu của các ô nhỏ và lớn: 0,1mm

- Diện tích mặt đáy của một ô nhỏ: 1/400 mm2

C = ?

- Sau khi hội ý, nhóm sinh viên điền kết quả sau dấu ? và báo cho giáo viên hướng

dẫn thực tập kết quả

- Giáo viên hướng dẫn tiếp nhận kết quả

4.2 Xác định số lượng tinh trùng

- Bất hoạt tinh trùng bằng dung dịch NaCl 10%

- Cho 07 ul mẫu lên buồng đếm đã gắn lamen đúng tiêu chuẩn

- Xác định vị trí ô đếm trên kính hiển vi Nikon, vật kính từ nhỏ đến lớn (từ 04 đến 40)

- Vi chỉnh kính hiển vi để nhìn rõ tinh trùng và các ô của buồng đếm

- Đếm số lượng tinh trùng trong 05 ô lớn (lặp lại 03 lần cho mỗi mẫu tinh trùng) và tính trung bình

4.3 Xác định tinh trùng kỳ hình

- Tinh trùng kỳ hình: là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh trùng bình thường và không hoặc có khả năng thụ thai kém

- Để kiểm tra tinh trùng kỳ hình, người ta dùng phương pháp soi trực tiếp hoặc nhuộm bằng xanh metylen, tím violet, Giêm xa,…