Nghiên cứu biểu hiện protein e2 của virus dịch tả lợn cổ điển (classical swine fever) bằng hệ thống baculovirus

Kiểm tra biểu hiện gen E2 trong Baculovirus tái tổ hợp bằng phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp ..... - Đánh giá

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin

vô hoạt chứa tiểu phần E2 trên hệ thống Baculovirus phòng bệnh dịch tả lợn” thuộc

chương trình Công nghệ sinh học nông nghiệp và thủy sản của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn do TS T rần Thị Thanh Hà làm chủ trì

Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận văn này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn này Đề tài có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho đề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Xengphavone Khonmany

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, cán bộ công nhan viên sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS Bùi Thị Tố Nga và TS Đặng Vũ Hoàng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, , Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam), đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Xengphavone Khonmany

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng viii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xiii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học 2

1.5 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Hiểu biết về vi rút dịch tả lợn (DTL) 3

2.1.1 Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới 3

2.1.2 Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam 4

2.1.3 Cấu trúc của vi rút DTL 5

2.1.4 Sức đề kháng của vi rút DTL 7

2.2 Bệnh dịch tả lợn 7

2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh DTL 7

2.2.2 Loài mắc 7

2.2.3 Phương thức truyền lây 8

2.2.4 Lứa tuổi mắc bệnh 8

2.2.5 Chất chứa của và độc lực của vi rút 9

2.2.6 Triệu chứng 9

2.2.7 Bệnh tích 11

2.2.8 Phương pháp chẩn đoán bệnh DTL 12

2.2.9 Phòng chống bệnh DTL 17

2.3 Vắc xin phòng dịch tả lợn 19

2.3.1 Vắc xin sản xuất trong nước và đang lưu hành tại Viêt Nam 19

2.3.2 Vắc xin được phép nhập khẩu và đang lưu hành tại Viêt Nam 20

2.4 Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus trong sản xuất protein tái tổ hợp của vi rút 21

Phần 3 Đối tượng, nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

3.4 Nguyên liệu nghiên cứu 23

3.4.1 Các loại tế bào 23

3.4.2 Môi trường cho nuôi cấy tế bào 23

3.4.3 Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR 24

3.4.4 Hóa chất dùng trong điện di 24

3.4.5 Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus 24

3.4.6 Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng trong phản ứng Western blot 24

3.4.7 Máy móc, thiết bị 24

3.4.8 Các vật liệu khác 25

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.5.1 Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của Viện Thú y 25

3.5.2 Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng RT– PCR, xác định TCID50 của vi rút theo phương pháp thường quy của Viện Thú y 25

3.5.3 Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 và nhân gen và tinh sạch DNA bằng phương pháp thường quy 26

3.5.4 Tạo dòng protein mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất 27

3.5.5 Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger 30

3.5.6 Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to -bac Expression System), quy trình công nghệ của Viện Thú y Nhật Bản 30

3.5.7 Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein

E2 trên tế bào côn trùng (theo công bố của Barbara Malitscheck et al.,

1999) 31

3.5.8 Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ hợp 32

3.5.9 Phương pháp Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp 32

Phần 4 Kết quả và thảo luận 37

4.1 Kết quả nhân chủng vi rút dtl, kiểm tra các đặc tính vi rút của chung gốc 37

4.1.1 Kết quả nuôi cấy tế bào 37

4.1.2 Kết quả gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a 38

4.1.3 Kiểm tra đặc tính củng gốc, xác định sự có mặt của vi rút DTL bằng phản ứng RT-PCR phát hiện đoạn gene noncoding E2 của vi rút DTL phân lập trên tế bào PK15a 39

4.2 Thiết kế mồi đặc hiệu và khuếch đại protein E2 của vi rút dịch tả lợn bằng phương pháp rt-pcr 40

4.3 Tạo dòng protein mã hóa E2 trong vector tách dòng pfastbac, kiểm tra trình tự khung protein biểu hiện 41

4.3.1 Tạo dòng gen E2 của vi rút dịch tả lợn trong véc tơ tách dòng pFastBac1/NT-TOPO 41

4.3.2 Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng 44

4.3.3 Kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng phương pháp Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) trên tế bào côn trùng và Western Blot 46

4.4 Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống baculovirus 47

4.4.1 Kết quả thực hiện phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) đối với mẫu huyết thanh thực địa 47

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

Tài liệu tham khảo 51

Một số hình ảnh thực hiện đề tài 58

ASEAN Association of Southeast Asian Nations

CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

CSFV Classical swine fever virus

GP Glycoprotein

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium

OIE Office Internationale des Epizooties

RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt enzyme 29 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ

hợp mang Protein E2 trên tế bào côn trùng 31 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức Thú y

thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 9 năm 2018 4

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen Flavivirus 6

Hình 2.3 Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR 17

Hình 4.1 Tế bào PK15a sau 24 giờ nuôi cấy với độ phóng đại 20X 37

Hình 4.2 Tế bào PK15a gây nhiễm vi rút DTL với độ phóng đại 20X 38

Hình 4.3 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 39

Hình 4.4 Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 40

Hình 4.5 Cấu trúc vector pFastBac/NT TOPO 41

Hình 4.6 Sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên đã được lựa chọn để kiểm tra khả năng mang véc tơ pFastBac_E2 tái tổ hợp 42

Hình 4.7 Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen E2 trên khuôn plasmid từ các khuẩn lạc lựa chọn 42

Hình 4.8 Trình tự gen và khung đọc của gen E2 của vi rút dịch tả lợn chủng VN91 được tách dòng 43

Hình 4.9 Kết quả so sánh trình tự gen và nhận diện loài sử dụng công cụ Blast giữa trình tự gen E2 vi rút Dịch tả lợn và ngân hàng NCBI 44

Hình 4.10 Sơ đồ chủng biểu hiện gen và Baculovirus tái tổ hợp với hệ thống biểuhiện Bac-to-Bac Expression System của hãng Invitrogen (Invitrogen, 2008) 44

Hình 4.11 Sơ đồ các bước tái tổ hợp protein E2 của vi rút DTL bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus 45

Hình 4.12 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh và chất chỉ thi Bluo-gal và các khuẩn lạc này có thể là các dòng chứa Bacmid tái tổ hợp 45

Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR 46

Hình 4.14 Hình ảnh tế bào côn trùng SF21AE nuôi ở 27oC trong 72 giờ 47

Hình 4.15 Kết quả IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn 48

Hình 4.16 Kiểm tra biểu hiện gen E2 trong Baculovirus tái tổ hợp bằng phương pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Xengphavone KHONMANY

Tên Luận văn: Nghiên cứu biểu hiện Protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển

(Classical Swine Fever) bằng hệ thống Baculovirus

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Hóa sinh-Miễn dịch, Viện Thú y (Việt Nam) Các loại tế bào dòng: PK15a, tế bào côn trùng: SF21AE và TN5 Vi rút DTL Môi trường cho nuôi cấy tế bào: Môi trường DMEM, tripsin EDTA, Huyết thanh bào thai bê, PBS (Phosphate Buffer saline), kháng nấm kháng sinh của hãng Gibco, nước cất 2 lấn

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR: Trizol Chloroform, Iso-Propanol, Ethanol 100% và các thành phần trong tổng hợp cDNA và PCR: Nuclease-free water, Random Primer, Ribonucleic Acid (RNA), First strand buffer, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Reverse Transcriptase, MgCl 2 , PCR buffer 10x, Taq polymerase (của hãng Promega), Reverse Primer R2, Forward Primer F2

Hóa chất dùng trong điện di: Agarose, TAE, loading dye, DNA marker, Etidium Bromide (của hàng Sigma, Cat No H5041)

Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus

Máy móc, thiết bị: Buồng cấy vô trùng, cân phân tích, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm 370C

có 5% CO 2, tủ ấm 270C, kính hiển vi soi ngược, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C, tủ lạnh

-800C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm, kính hiển vi soi ngược, màng lọc 0,45µm, vontex, máy đo pH điện tử, máy khuấy từ, máy chạy PCR, Hệ thống điện di, Bộ điện di, Máy soi chụp ảnh gel, Máy cô đặc SPD 1010, Máy siêu âm

Các vật liệu khác: Chai nuôi cấy T25, T75, T150, đĩa nuôi cấy 96 giếng, ống ly tâm 15ml, 50 ml của hãng Corning, Eppendorf 1,5ml, Eppendorf 2,0ml, PCR tube 1,5ml; 0.5ml; 0,2ml, Pipette và đầu tip tương ứng 1000µl, 200 µl, 100µl, 10µl, 2µl (Đầu

tip free RNase), máng nhựa, giá đựng, găng tay, khẩu trang, cồn sát trùng và các máy, thiết bị khác trong phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu

- Nhân chủng vi rút DTL, kiểm tra các đặc tính vi rút của chủng gốc

- Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 của vi rút DTL, khuếch đại gen E2, tinh sạch DNA

- Tạo dòng gen mã hóa E2 trong vector tách dòng pFastBac, kiểm tra trình tự gen

- Tạo bacmid mang protein E2 của vi rút DTL

- Chuyển nạp bacmid vào tế bào côn trùng SF21AE, tạo Baculovirus tái tổ hợp mang protein E2

- Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus

Phương pháp nghiên cứu

Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y:

- Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của Viện Thú y

- Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng TR–PCR, xác định TCID50 của vi rút DTL theo phương pháp thương quy của Viện Thú y

- Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2, nhân gen và tinh sạch DNA bằng phương pháp thường quy

- Tạo dòng gen mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Giải trình tự gen, kiểm tra trình tự khung gen biểu hiện sử dùng Kít theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to bac expression system) quy trình công nghệ của Viện Thú y Nhật bản

- Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 trên

tế bào côn trùng theo công bố Barbara Malitscheck et al., 1999

- Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ hợp hoặc Phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên E2 tái tổ hợp theo quy trình của Viện Thú y

Kết quả chính và kết luận:

Từ những nghiên cứu đã đạt được ở trên chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập thành công phương pháp trung hòa vi rút và ứng dụng thành công quy trình thực hiện VNT với các mẫu huyết thanh thực địa Tiến hành tái tổ hợp protein E2 của vi rút dịch tả lợn bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus trên tế bào côn trùng Chủng vi rút VN91 phân lập tại Việt nam được sử dụng làm khuôn mẫu để tái tổ hợp protein E2 Trình tự toàn bộ gen chủng vi rút VN91

đã được chúng tôi công bố năm 2018 (GenBank: LC374604) Kết quả nghiên cứu cho thấy protein E2 tái tổ hợp của vi rút dịch tả lợn có hoạt tính sinh học tự nhiên, được nhận diện bới kháng thể kháng vi rút dịch tả lợn Đồng thời, kết quả thu được cũng cho thấy kháng nguyên E2 tái tổ hợp là ứng cử viên tiềm năng để phát triển vắc xin thế hệ mới phòng bệnh dịch tả lợn tại Việt Nam

Đã ứng dụng thành công hệ thống biểu hiện Baculovirus nhằm tái tổ hợp protein E2 của vi rút DTL phân lập tại Việt Nam Protein E2 tái tổ hợp trong nghiên cứu này mang hoạt tính sinh học tự nhiên (được nhận diện bởi kháng thể kháng vi rút DTL)

Đã đánh giá được hoạt tính miễn dịch của kháng nguyên E2 tái tổ hợp và vai trò tiềm năng của interferon alpha trong đáp ứng miễn dịch tạo bởi kháng nguyên E2 tái tổ hợp, trong đó kháng nguyên protein E2 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trung hòa với vi rút DTL và interferon alpha làm tăng đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm protein tái tổ hợp protein E2

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Xengphavone KHONMANY

Thesis title: Study on Protein E2 expression of classical swine fever virus by Baculovirus

system

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

The objective of the study was to study the protein E2 expression of classical swine fever virus using insect cell as a diagnostic and bio-material for the prevention of classical swine fever in Vietnam

Material and Research Methods

Research location: Department of Biochemistry - Immunology, National Institute

of Veterinary Medicine (Vietnam)

Flow cell types: PK15a, insect cells: SF21AE and TN5 Classical swine fever (CSF) virus

Environment for cell culture: DMEM environment, EDTA tripsin, calf fetal serum, PBS (Phosphate Buffer saline), antibiotic resistant fungus Gibco, distilled water 2 times Materials, chemicals, bio-products used in RT-PCR reaction: Trizol Chloroform, ISO-Propanol, 100% Ethanol and components in cDNA and PCR synthesis: Nuclease- free water, Random Primer, Ribonucleic Acid (RNA) , First strand buffer, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Reverse Transcriptase, MgCl2, PCR buffer 10x, Taq polymerase (Promega), Reverse Primer R2, Forward Primer F2

Chemicals used in electrophoresis: Agarose, TAE, loading dye, DNA marker, Etidium Bromide (of Sigma, Cat No H5041)

Materials used for cloning and expression of recombinant protein by Baculovirus system

Machine, equipment: Sterile implant chamber, analytical balance, autoclave, oven, warm cabinet 370C with 5% CO2, 270C incubator, inverted microscope, 40C refrigerator, refrigerator -300C, refrigerator - 800C, liquid nitrogen cylinders, centrifuges, inverted microscopes, 0.45µm filter membranes, vontex, electronic pH meter, magnetic stirrer, PCR machine, electrophoresis system, electrophoresis unit, scanner Gel image, SPD 1010 Concentrator, Ultrasound machine

Other materials: T25, T75, T150 culture bottle, 96 well culture dish, 15ml centrifuge tube, 50 ml of Corning, Eppendorf 1.5ml, Eppendorf 2.0ml, 1.5ml PCR tube; 0.5ml; 0.2ml, Pipette and tip are 1000µl, 200 µl, 100µl, 10µl, 2µl (tip free RNase), plastic trough, rack, gloves, mask, alcoholic disinfection and machines, equipment other in the laboratory

Research content

- Multiplication of CSF virus, checking the virus characteristics of the original strain

- Design primer specific gene E2 of CSF virus, E2 gene amplification, DNA purification

- Generating E2 encoding gene line in pFastBac cloning vector, checking gene sequence

- Create bacmid with E2 Protein of CSF virus

- Transfer bacmid into SF21AE insect cells, creating recombinant Baculovirus with protein E2

- Evaluate the biological activity of recombinant E2 protein by Baculovirus

expression system

Methods

In order to conduct research and to carry out the contents of the project, we have used a combination of modern and regular methods of research in the field of Veterinary Medicine:

- CSF virus strain, test the virus characteristics of the original strain

- Protein E2 design of classical swine fever virus, protein E2 amplification, DNA purification

- Creates an E2 encoding protein in the pFastBac splitter vector, which checks for sequences of expression genomes

- Creates a bacmid carrying the protein E2 of the classical swine fever virus

- Bacitline transfer into SF21AE insect cells, recombinant Baculovirus carrying the protein E2

- Evaluation of the biological activity of recombinant protein E2 by Baculovirus expression system

Main findings and conclusions

From the research, we have made some conclusions as follows:

In this study, we have successfully established virus neutralization method and successfully applied VNT procedure with field serum samples Conducted E2 protein

recombination of swine cholera virus by Baculovirus expression system on insect cells VN91 virus strain isolated in Vietnam is used as a template to recombine protein E2 The whole sequence of the VN91 virus genome was published in 2018 (GenBank: LC374604) The study results showed that the recombinant E2 protein of swine cholera virus has natural biological activity, was identified by antibodies against swine cholera virus At the same time, the results also showed that the recombinant E2 antigen is a potential candidate to develop a new generation vaccine for swine cholera in Vietnam Successful application of Baculovirus expression system to recombine E2 protein

of CSF virus isolated in Vietnam Recombinant E2 protein in this study has natural biological activity (identified by antibody against CSF virus)

The immunological activity of the recombinant E2 antigen and the potential role

of interferon alpha in the immune response generated by recombinant E2 antigen has been assessed, in which E2 protein antigen has the ability to produce immunity response Neutralization with CSF virus and interferon alpha increases the immune response of pigs injected with protein recombinant protein E2

PHẦN I1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ngày nay, với những mô hình chăn nuôi quy mô công nghiệp ngày càng phát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp Trong đó, bệnh Dịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao (85-100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế lớn nhất cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó

Dịch tả lợn là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những

nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một vi rút thuộc chi Pestivirus, họ

Flaviviridae Vi rút này có tính kháng nguyên chung với vi rút gây bệnh tiêu

chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và vi rút bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus)

Trong công tác chẩn đoán hay phòng và trị bệnh, các phương pháp truyền thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày càng khó kiểm soát Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống Trong thú y, sinh học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đoán, phòng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn nuôi Việt Nam

Để phân tích chính xác vi rút gây bệnh DTL với những vi rút khác cùng chi Pestivirus như BVDV, BDV , kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với những đoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổng kết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước Trong những năm gần đây,

ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về vi rút DTL của các tác giả, tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những vi rút phân lập được từ các ổ dịch Protein E2 là một

trong những gen của bộ gen vi rút DTL cổ điển được sử dụng nhiều trong những

nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Vì vậy việc thực hiện đề tài “

Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống Baculovirus ” nhằm ứng dụng vào công tác chẩn đoán bệnh và tạo tiền đề cho

những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Dịch tả lợn sau này

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn

cổ điển sử dụng tế bào côn trùng làm sinh phẩm dùng trong chẩn đoán và nguyên liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng bệnh Dịch tả lợn cổ điển tại Việt Nam

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Protein E2 của vi rút DTL cổ điển phân lập tại Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2018 tới tháng 2/2019

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Bộ môn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam)

năng tạo đáp ứng miễn dịch cao cho vật chủ

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT DỊCH TẢ LỢN (DTL)

2.1.1 Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới

Bệnh Dịch tả lợn (DTL) được đưa vào danh sách loại A của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) như 1 bệnh truyền lây mạnh và gây thiệt hại kinh tế cho ngành

chăn nuôi lợn của thế giới (Moennig Floegel-Niesmann et al 2003) Những

nghiên cứu trước đây cho thấy bệnh lây lan chủ yếu qua đường mũi và miệng Ngoài ra, vi rút dịch tả lợn cũng bị truyền lây qua tinh dịch hay thức ăn tạp nhiễm

(Floegel Wehrend et al 2000)

Quá trình phát triển của bệnh DTL khá phức tạp và diễn biến dưới nhiều thể bệnh khác nhau, tùy thuộc vào độc lực của vi rút, sự tương tác giữa vi rút và cơ thể vật chủ (Paton and Greiser-Wilke 2003) Nhìn chung, các thể bệnh có thể được phân loại như sau: Nhiễm sau khi sinh (post-natal infections): bao gồm thể quá cấp, cấp tính và á cấp tính; Nhiễm qua nhau thai (trans-placental infections); Nhiễm mạn tính

(persistent infections) (Koenen Van Caenegem et al 1996; Dũng 1999)

Năm 1810 bệnh DTL được (Hanson 1957) mô tả lần đầu ở Tennessce Đến năm 1833, bệnh DTL được thông báo đầu tiên ở Ohio (Bắc Mỹ), bệnh lan ra cả nước Mỹ nhất là vùng Cornbert, dịch bệnh diễn ra ở Pháp năm 1862, ở Đức 1893 (Dahle and Liess 1992) và sau đó bệnh lan ra khắp Châu Mỹ, Châu Âu và Châu

Á (Dũng 1999; Paton and Greiser-Wilke 2003)

Theo (Fuchs 1968) bệnh xuất hiện đầu tiên ở Anh vào năm 1862, sau đó lây lan sang các nước châu Âu khác là Đan Mạch, Thụy Điển vào năm 1887 Các nhà khoa học Mỹ cho rằng bệnh xuất phát từ châu Âu và lan sang khắp các nước trên thế giới, ở Nam Mỹ năm 1899, Nam Phi năm 1900

Năm 1978 bệnh hoàn toàn bị khống chế ở Bắc Mỹ và sau đó cũng đã được thanh toán ở Úc và toàn bộ các nước ở Tây Âu (Paton and Greiser-Wilke 2003; Singh and Rajak 2017) Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong công tác kiểm soát dịch bệnh, song bệnh DTL vẫn còn xuất hiện ở một số nước thành viên Châu Âu và gây thiệt hại nặng về kinh tế Cụ thể: ở Hà Lan, chi phí trực tiếp để khống chế bệnh DTL lên tới 93 triệu USD năm 1983 - 1985 Nhiều ổ dịch nghiêm trọng đã xảy ra ở Bỉ, Đức năm 1994, và Pháp năm 1997 (Moennig 2000) Hơn nữa bệnh DTL vẫn còn là vấn nạn và lây lan mạnh mẽ ở Nam và Trung Mỹ, vùng Caribbean, Châu Á và Đông

Âu (Moennig 2000, Moennig, Floegel-Niesmann et al 2003) Hiện nay, tuy dịch đã

được khống chế, nhưng bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ như ở Hà Lan năm 1997–1998

(Crauwels et al., 2003), và vi rút DTL vẫn lưu hành tại một số nước ở châu Âu (Blome et al., 2010; Bhaskar et al., 2015).

Hình 2.1 Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức

Thú y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 9 năm 2018

Nguồn http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/official-disease-status/

2.1.2 Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1923 - 1924 bởi Houdener Từ đó đến nay vẫn còn tồn tại phổ biến và luôn là mối đe doạ nghiêm

trọng đối với ngành chăn nuôi lợn nước ta (Dat et al., 1985; Dũng 1999)

Năm 1960 bệnh xảy ra ở Nghệ An, Phú Thọ Năm 1968 có 481 ổ dịch được phát hiện ở miền bắc, tiếp đó năm 1971 bệnh DTL đã xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh Sài Gòn Năm 1974 xảy ra ở 17 tỉnh thành phía bắc làm thiệt hại hơn 4 vạn con lợn Bệnh đã lây lan sang các tỉnh ở Nam Bộ năm 1981, Thừa Thiên Huế năm 1990 (Dũng 1999; Duyên Khuyên và cs.,2000)

Các tỉnh thuộc Trung Trung Bộ dịch xảy ra tương đối rộng vào các năm 1976 - 1978: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ dịch

Từ những năm 1980 trở lại đây, theo chương trình quốc gia phòng chống các bệnh truyền nhiễm quan trọng nói chung và bệnh DTL nói riêng trên đàn lợn bằng việc sử dụng vắc xin đã thu được những thành quả nhất định, do đó đã phần nào khống chế được dịch bệnh Mặc dù vậy bệnh DTL vẫn xem là một trong những bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi ở nước ta Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi (thể hiện

rõ ở miền Bắc) và do biến động số lượng của đàn lợn trong năm nên bệnh có lúc tăng lúc giảm (Bùi, 2001)

Việc tiêm phòng theo mùa vụ và tiêm phòng bổ sung thường xuyên góp phần ổn định và hạn chế sự lây lan của dịch, nhưng trong sản xuất thực tế vì nhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, do đó bệnh DTL vẫn xảy ra vào các tháng trong năm Lợn bệnh thường thể hiện ở thể mạn tính và các trường hợp khác là do nhiễm vi rút khi sơ sinh, bệnh có thể kéo dài và là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Nguyễn Hồ và cs 2002; Nguyễn Trần, 2005; Phạm 2005)

2.1.3 Cấu trúc của vi rút DTL

Những mô tả đầu tiên về vi rút gây bệnh DTL đã chỉ ra rằng vi rút DTL

thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae vi rút DTL có quan hệ mật thiết và có

chung tính kháng nguyên với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV) và vi rút gây bệnh biên giới ở cừu (BDV), cả hai loại vi rút này đều có khả năng gây bệnh tiêu chảy trên lợn Vi rút gây bệnh DTL là thuộc loại RNA vi rút nhỏ một sợi và

có vỏ bọc ngoài là lipoprotein, đường kính 40 - 50nm, khác hẳn với DNA vi rút lớn gây bệnh DTL châu phi (African swine fever - ASF), mặc dù cả hai loại vi rút này đều gây những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tương tự nhau (Meyers,

Rümenapf et al., 1989; Hoffmann Beer et al., 2005; Leifer, Everett et al., 2010)

Về mặt cấu trúc, bộ gen của vi rút DTL chỉ gồm một khung đọc mở đơn lớn

(open reading frame - ORF) và có chiều dài khoảng 12,3 kb (Meyers Thiel et al.,

1996) Dự vào phân tích trình tự toàn bộ genome của vi rút DTL, các nhà khoa học

đã chia vi rút DTL làm 3 nhóm chính và 4 phân nhóm phụ, bao gồm: 1.1, 1.2, 1.3; 2.1, 2.2, 2.3; 3.1, 3.2, 3.3, và 3.4 Nhóm 1 là nhóm có lịch sử lâu đời nhất và gây bệnh phổ biến ở châu Âu trong giai đoạn 1920 - 1970; nhóm 2 là tác nhân gây ra

những ổ dịch vào thập niên 90 (Paton McGoldrick et al., 2000) Nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các ổ dịch ở Hà Lan và Anh gây ra bởi vi rút DTL thuộc genotype 2.1

(Oleksiewicz Rasmussen et al., 2003; Sarma Mishra et al., 2011; Postel Schmeiser

et al., 2012) Vi rút DTL thuộc nhóm 3 là phổ biến nhất ở Châu Á (Sakoda Ozawa et al., 1999; Sabogal Mogollón et al., 2006; Sun Yin et al., 2013)

Những nghiên cứu về cấu trúc của vi rút DTL cho thấy khung đọc mở của vi rút này mã hóa cho một glycoprotein có kích thước khoảng 3900 amino axit, gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1, và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (Npro, NS2, NS3,

NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Lowings Ibata et al., 1996; Meyers Thiel et al., 1996; Crauwels Nielen et al., 2003; Deng Huang et al., 2005; Desai Sharma et al., 2010; Sun Yin et al., 2013) Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của vi rút

sẽ được xử lý thành những protein vi rút riêng biệt Protein đầu tiên mã hoá là Npromột protein không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C Peptidase ký chủ phân cắt những vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở vị trí E2/p7 NS2 - 3 được phân cắt bởi autoprotease NS2 Sự phân cắt của polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme

protease serine NS3 - 4A (Lowings Ibata et al.,1996)

Các protein cấu trúc đóng vai trò quan trọng trong khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của vi rút DTL, trong đó hai protein cấu trúc vỏ, Erns và E2, là những protein có khả năng sinh miễn dịch mạnh nhất (Paton and Greiser-Wilke 2003)

Hình 2.2 Cấu trúc bộ gen Flavivirus

Nguồn: https://jvi.asm.org/content/83/24/12895/figures-only

2.1.4 Sức đề kháng của vi rút DTL

Sức đề kháng của vi rút DTL phụ thuộc vào trạng thái vật lý của chất chứa

vi rút, vi rút trong dịch nuôi cấy tế bào sẽ bị vô hoạt ở 600C trong 10 phút, vi rút

có thể tồn tại 27 ngày ở thịt đông lạnh, 73 ngày ở tuỷ xương và 168 ngày ở thịt xông khói Trong môi trường thiên nhiên, ở nhiệt độ thấp dưới 100C vi rút sống

và giữ nguyên độc lực gây bệnh hàng tháng Ở nhiệt độ bình thường 18 - 300C, chúng có thể sống nhiều tuần, nhưng dưới ánh sáng trực tiếp của mặt trời thì chúng không tồn tại lâu hơn 10 giờ Trong chuồng và phân, vi rút bị bất hoạt sau vài ngày Vi rút dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao trên 750C, bị vô hoạt ở 600C trong

10 phút, 560C trong 1 giờ Vi rút bị tiêu diệt trong môi trường có chất làm tan

lipid, có enzyme protease (Dat et al., 1985)

Vi rút DTL bất hoạt ở pH<3 hoặc pH>11, rất nhạy cảm với Ete, Chloroform, PVP iodine, Benzalkonium, Dezoxicholat Natri, nước vôi 10%, Formol 1 - 2% Phencol, Hyzol, … nhưng khá bền vững với Trypsin Thuốc sát khuẩn hữu hiệu thường dùng hiện nay là PVP.iodine 10%, B.K.Vet, Formol 1,5 2%, Virkon.S (Bùi, 2001)

2.2 BỆNH DỊCH TẢ LỢN

Bệnh DTL là bệnh truyền nhiễm của loài lợn, có tốc độ lây lan nhanh và thường ghép với bệnh khác như phó thương hàn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn hoặc bệnh do Mycoplasma (DUNNE 1975, Wentink and Terpstra 1999) Trước

đây gọi là hog cholera, là do vi rút DTL gây ra và có thể dẫn đến bệnh suất và tử vong cao ở lợn Bệnh này được báo cáo cho Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) và phát hiện virus có thể làm giảm đáng kể xuất khẩu thịt lợn (Paton and Greiser-Wilke 2003)

2.2.1 Nguyên nhân gây bệnh DTL

Bệnh do một loại vi rút có cấu trúc RNA thuộc chi Pestivirus, họ

Flaviviridae gây ra (Wikipidia 2018) Vi rút tồn tại lâu ở ngoài môi trường, có

thể sống sót vài ngày trong phân lợn, vài tháng đến vài năm trong thịt đông lạnh Tuy nhiên, đây là loại vi rút có sức đề kháng yếu, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao và các chất sát trùng thông thường như xút (NaOH) 2%, nước vôi 5%

2.2.2 Loài mắc

Vi rút DTL có mặt hầu khắp các quốc gia trên thế giới và lợn là ký chủ duy nhất (bao gồm cả lợn nhà và lợn rừng) Bệnh có thể lây từ lợn rừng sang lợn nhà

hoặc ngược lại Các loài động vật khác và người không mắc bệnh này (Dat và cs 1985; Nguyễn Hồ và cs 2002; Nguyễn và Trần 2005, Phạm 2005) Nhiều tác giả

đã gây bệnh cho chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng bệnh không biểu hiện trên những loài vật thí nghiệm này Năm 1941, Tenbroek thông báo về việc nuôi cấy thành công vi rút DTL trong môi trường tế bào dịch hoàn lợn trong dung dịch Tyrode (Bùi, 2001) Năm 1950, Corone và Albis thực hiện thí nghiệm tiêm truyền vi rút DTL vào phôi trứng vịt và đã thích ứng với vi rút DTL trên phôi vịt Sau đời thứ 8 cấy truyền qua phôi vi rút đã mất độc lực với lợn nhưng gây được miễn dịch cho lợn Fonanelli và cộng sự đã thử tiêm cho phôi gà nhưng không thành công (Bùi, 2001)

2.2.3 Phương thức truyền lây

Nguồn lây truyền mầm bệnh là các chất bài tiết, dịch tiết, máu, hạch lâm ba, lách của lợn bệnh chứa vi rút Những lợn khỏi bệnh sau 2 tháng vẫn bài thải mầm bệnh ra ngoài môi trường làm nguồn lây nhiễm cho cá thể khác Những lợn con

bị nhiễm bệnh này sẽ thải ra một lượng lớn vi rút, và các triệu chứng lâm sàng có thể xuất hiện sau một vài tháng Do đó, chúng bị lây nhiễm trong suốt đời sống

và sẽ không dễ để phát hiện (Van Oirschot, 2003)

Theo các nghiên cứu cho thấy vi rút lây truyền theo chiều ngang và theo chiều dọc: Lây truyền vi rút theo chiều ngang trực tiếp giữa các con ốm với con khỏe, hoặc lây gián tiếp qua các chất bài tiết, qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, phương tiện vận chuyển hay do tiếp xúc với các động vật mang mầm bệnh Lây truyền vi rút theo chiều dọc từ mầm bệnh trong các phôi (Van Oirschot, 2003) Lây truyền theo chiều dọc thường dẫn đến chết non, hoặc những con lợn con sinh ra

bị bệnh, do lợn mẹ mang bệnh (carrier sows) thường sinh ra các con lợn con bị nhiễm bệnh (Paton and Greiser-Wilke, 2003; Van Oirschot, 2003)

2.2.4 Lứa tuổi mắc bệnh

Bệnh thường xảy ra ở mọi lứa tuổi song tập trung nhiều nhất ở lợn con theo

mẹ và lợn mới cai sữa Trong những năm gần đây việc tiêm phòng đã được chú ý

do vậy tuổi mắc phụ thuộc nhiều vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịch của đàn lợn Lợn đực và lợn nái không biểu hiện triệu chứng lâm sang nhưng có tỷ lệ

mang trùng vi rút DTL (Dat et al., 1985)

Theo Bùi Quang Anh và cộng sự, lợn từ 2 - 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ 19,42%; lợn trên 6

tháng tuổi 12,08%; còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất 0,212,46% nhưng lại là nguồn mang trùng và lây lan dịch bệnh (Bùi, 2001)

2.2.5 Chất chứa của và độc lực của vi rút

Trong cơ thể, vi rút hấp thu mạnh trên bạch cầu nên máu có độc lực sớm nhất; các chất bài xuất như nước dãi, nước mũi, nước mắt, nước tiểu, phân, các phủ tạng đều chứa vi rút; hạch lâm ba và lách chứa nhiều vi rút nhất Các chủng

vi rút có độc lực cao thường gây bệnh thể cấp tính, các chủng có độc lực thấp thường gây ra thể á cấp tính hoặc thể không điển hình (Mesplède and Albina 1997) Các chủng vi rút có độc tính khác nhau thì có tốc độ lây lan bệnh khác nhau; những chủng vi rút cường độc lây lan nhanh hơn và gây ra tỷ lệ chết cao hơn so với chủng độc lực thấp (Terpstra 1991)

Những lợn bị nhiễm bệnh có thể thải vi rút trước khi phát bệnh và tiếp tục thải vi rút trong quá trình bệnh, sự thải vi rút chỉ dừng lại khi kháng thể được sinh ra Vì vậy những lợn bị nhiễm vi rút có độc lực cao có thể thải vi rút với số lượng lớn trong thời gian 10 -20 ngày, những lợn bị bệnh thể mãn tính thải vi rút liên tục hoặc từng đợt cho đến khi chết

2.2.6 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ 3 - 7 ngày và tuỳ theo độc lực của vi rút, lứa tưổi, giống, thể trạng, trạng thái miễn dịch mà bệnh có thể xuất hiện ở một trong 4 thể với các triệu chứng như sau:

2.2.6.1 Thể quá cấp tính

Còn gọi là bệnh DTL trắng, thường xuất hiện ở đầu ổ dịch, lợn con mẫn cảm với thể này hơn lợn trưởng thành Con vật ủ rủ cao độ, sốt kịch liệt, chết nhanh khi chưa xuất hiện triệu chứng bệnh tích đặc trưng, con vật giãy dụa rồi chết nhanh trong vòng 24 - 48 giờ, tỷ lệ chết tới 100%

2.2.6.2 Thể cấp tính

Thể này thường gặp, thời gian nung bệnh từ 2 - 4 ngày Lợn có các triệu chứng chung: ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ ăn, sốt cao 41 – 42 °C kéo dài đến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồng đống lên nhau ở góc chuồng

Trong quá trình nghiên cứu (Dat và Lien 1985) đã quan sát được triệu chứng lâm sàng của lợn bị bệnh DTL ở những lứa tuổi khác nhau như sau:

+ Ở lợn con theo mẹ dưới 1 tháng tuổi: gầy yếu, run rẩy, sốt cao 41,5 °C phân trắng không tiêu, mắt có dử và chảy nước mắt, có con ỉa phân loãng màu

vàng, co giật Lợn trong đàn chết dần trong vòng 10 - 15 ngày, con nào sống sót thì còi cọc chậm lớn Tình trạng này thường thấy ở những đàn lợn sau tiêm phòng 1 - 5 ngày

+ Ở lợn từ 1 - 2 tháng tuổi: tai, mũi, cổ, chân bầm tím như bị thiếu ô xy, phân loãng, vàng hoặc trắng như vôi, bỏ ăn, về sau xuất hiện những nốt xuất huyết như muỗi đốt

+ Ở lợn 2 - 3 tháng tuổi: ngoài các triệu chứng trên còn bị gầy yếu rất nhanh, lông xù lên rất rõ

+ Ở Lợn thịt: sốt cao, phần lớn bị táo bón, một số ít bị ỉa chảy, mắt có dử, chảy nước mắt, bỏ ăn; do diễn biến cấp tính nên bề ngoài vẫn béo, ít giảm cân + Ở lợn nái mang thai đã được tiêm phòng trong vùng có dịch: Bỏ ăn, sốt nhẹ

và sau đó trở lại bình thường, nhưng có khi bị sảy thai, thai gỗ, đẻ ra thì thai chết, con nào còn sống thì cũng chỉ được vài ngày, nhưng lợn mẹ vẫn sống khỏe mạnh Ở những lợn nái nhiễm những chủng vi rút có độc lực trung bình hoặc độc lực thấp có thể trở thành những con vật mang trùng (điều này gây rất nhiều khó khăn cho công tác phòng chống và thanh toán bệnh DTL) Đa số lợn con bị nhiễm bệnh từ trong bụng mẹ sẽ chết sau khi sinh hoặc chết lưu trong tử cung lợn mẹ, nhưng đôi khi vẫn

có con sinh ra khỏe mạnh nhưng đã mang trùng và gây bệnh DTL muộn

2.2.6.3 Thể mãn tính

Thể này do chủng vi rút có độc lực trung bình gây nên hoặc từ thể cấp tính chuyển sang Con vật có triệu chứng như thể cấp tính, gầy còm, ỉa chảy liên miên, lúc sốt lúc không, bỏ ăn, mắc các bệnh kế phát do vi khuẩn Bệnh kéo dài vài tuần hoặc hàng tháng trước khi chết

Vi rút có thể truyền qua nhau thai nên nếu lợn nái mắc bệnh, tuỳ theo chủng

vi rút và thời gian mang thai, lợn có biểu hiện sảy thai, thai chết lưu hoặc đẻ non Nếu lợn nái mắc bệnh khi mang thai lúc 50 - 70 ngày, có thể sinh con có mang mầm bệnh Con đẻ ra có thể bị chết ngay hoặc một số lúc đầu sinh ra biểu hiện bình thường sau có biểu hiện run rẩy, còi cọc, không sốt, chết sau một vài tuần hoặc vài tháng được gọi là “DTL phát muộn”

2.2.6.4 Thể không điển hình

Thể này biểu thị dưới các dạng rất khác nhau nhưrối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, chết lưu, thai gỗ, dị dạng gây run rẩy bẩm sinh, rối loạn vận động…) chậm lớn, chết rải rác Hơn nữa, trong các trường hợp không

điển hình, vi rút DTL có thể lưu hành một cách không rõ ràng nhất là ở lợn sinh sản với các trường hợp lâm sàng nổ ra lẻ tẻ khi có các điều kiện không thuận lợi

(Duyên Khuyên và cs.,2000; Moennig Floegel-Niesmann et al., 2003)

Thể không điển hình là thể khó phân biệt của bệnh DTL vì bệnh kéo dài và không có các thời kỳ rõ rệt Thể bệnh nhẹ hơn bình thường và thường chỉ một loại phủ tạng có bệnh tích: chẳng hạn chỉ phổi, ruột hay thần kinh đặc biệt bị bệnh Triệu chứng sẽ dễ quan sát ở những con lợn trong trạng thái có sức khoẻ kém Lợn chậm phát triển và suy dinh dưỡng, các bệnh tích và triệu chứng không

giống bệnh DTL thông thường (Moennig Floegel-Niesmann et al 2003)

lệ 48,33% Ngoài ra, một số tổn thương khác cũng được quan sát thấy như: xuất huyết ở da (28,33%); loét ở miệng (16,77%); loét ở hạch amygdale (16,17%); loét ở ruột già (38,33%) Tổn thương xuất huyết thấy ở hầu hết các cơ quan: hạch lâm ba, thận, dạ dày, ruột non, ruột già và trên da (Trần Anh Đào 2009)

Theo (Dat và Lien 1985) bệnh DTL là bệnh dịch tễ đàn, do vậy khi quan sát lâm sàng và bệnh tích phải quan sát từ 3 - 5 con trở lên; nhưng tìm ra đầy đủ các bệnh tích điển hình của bệnh DTL trong thời gian gần đây là rất khó

Thể cấp tính và mãn tính có thể quan sát thấy bệnh tích xuất huyết lấm tấm

ở da, kích thước khác nhau do hoại tử thoái hoá tế bào nội bì và máu khó đông Xuất huyết xảy ra nhiều nhất ở hạch lâm ba, thận, ít hơn ở tim, màng thanh dịch, bóng đái, niêm mạc ruột, thanh quản, da và dưới da Hạch lâm ba thường sưng to

và xuất huyết ở các xoang ngoại biên làm cho hạch lâm ba giống đá hóa vân Xuất huyết ở thận chủ yếu là lấm chấm và thường nằm dưới vỏ Lách có kích thước bình thường, thấy nhồi huyết dọc theo rìa, làm cho lách có hình răng cưa

Vi rút tác động gây mụn loét ở niêm mạc ruột già sau khi gây hoại tử ở những nang lâm ba riêng biệt Những mụn loét xuất hiện dày, tròn hình cúc áo trên bề

mặt có những khối sợi huyết tạo những vòng tròn đồng tâm Những khối sợi huyết đông đặc lại từng đợt làm mụn loét dầy lên Ngoài ra có thể quan sát thấy

hiện tượng có nước nhầy, lắng đọng sợi fibrin, xuất huyết cục bộ màng nhày của

đường tiêu hóa, đường hô hấp, phổi, cuối cùng nhiễm bệnh kế phát xảy ra (Van Oirschot 1999) Tùy theo từng ổ dịch, độc lực của vi rút, sức đề kháng của con vật, thời gian cảm nhiễm… mà bệnh tích ở từng con ở từng ổ dịch có thể không giống nhau và không đầy đủ như đã nêu Theo quan sát trong thời gian gần đây thì việc tìm thấy đầy đủ các bệnh tích, triệu chứng của bệnh DTL là rất khó Tuy nhiên, theo (Dân Liên và cs.,2000), bệnh tích của lợn có triệu chứng lâm sàng DTL tại các lò giết mổ ở Bà Rịa - Vũng Tầu chủ yếu là: Thận sưng xuất huyết, bàng quang xuất huyết, lách nhồi huyết, phổi viêm xuất huyết, hạch ruột sưng, xuất huyết, …

Thể bệnh mãn tính và thể bệnh phát muộn (Late onset) thường thấy teo tuyến Thymus và sưng các khớp của xương sườn ở lợn con (Van Oirschot 1999) Trong trường hợp bệnh DTL xảy ra ở lợn con thường ghép với bệnh phó thương hàn, E.Coli, gây những nốt loét tràn lan ở ruột, viêm phổi, làm lu mờ bệnh tích của bệnh DTL (Dat và Lien 1985)

2.2.7.2 Bệnh tích vi thể

Đặc trưng nhất là ở hệ lưới nội bì của thành mạch quản, các tế bào nội bì sưng to, thoái hóa, thủy thũng; các mạch quản ngoại biên bị giãn rộng, một số bị tắc mạch dẫn tới bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL là xung huyết, xuất xuyết, nhồi huyết (thường thấy ở lách, hạch lympho, thận và đường tiêu hóa), hoại tử, viêm não, viêm màng não đặc trưng bởi sưng và thoái hóa các tế bào nội bì, nghẽn mạch, thấm nhiễm lymphocyte quanh mạch Theo (Van Oirschot 1999), sự gia tăng về số lượng các đại thực bào và sự suy yếu của hệ đơn bào ở giữa hạch bạch huyết, lách, hạch amidan và những đám hạch ruột xảy ra trong trường hợp bệnh mãn tính

2.2.8 Phương pháp chẩn đoán bệnh DTL

2.2.8.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa trên các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh: ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ

ăn, sốt cao 41- 42 °C kéo dài đến lúc gần chết, lợn con thường nằm chồng đống lên nhau ở góc chuồng; con vật có biểu hiện nôn mửa, trong thời gian sốt con vật

đi táo, khi thân nhiệt hạ con vật đi ỉa chảy nặng; viêm kết mạc và giác mạc mắt, viêm niêm mạc mũi, chảy nước mũi lúc đầu trong sau đục đặc dần, có khi đóng

lại ở khoé mũi làm cho vành mũi nứt nẻ; đi siêu vẹo, loạng choạng, liệt hai chân sau hoặc liệt nửa thân sau; tỷ lệ chết có thể là 100%

Cần chẩn đoán phân biệt với một số bệnh sau: bệnh phó thương hàn, bệnh đóng dấu, bệnh tụ huyết trùng, bệnh giả dại

2.2.8.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng, bệnh tích

Trong thực tế sản xuất tại các địa phương, việc dựa vào các triệu chứng, bệnh tích để chẩn đoán bệnh DTL là chủ yếu, tuy nhiên kết quả của phương pháp này có độ chính xác không cao; nhưng rất cần thiết để có kết quả sơ chẩn ban đầu trước khi tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm

2.2.8.3 Chẩn đoán vi rút học

Chẩn đoán vi rút học phải được tiến hành nhanh chóng ngay trong ngày khi lấy bệnh phẩm; phương pháp chẩn đoán vi rút học bao gồm: Kiểm tra máu và bệnh phẩm trên kính hiển vi bằng cách làm tiêu bản, tiêm truyền động vật thí nghiệm

a Mẫu bệnh phẩm

- Trên động vật chết: Lách, hạch lympho, thận, amidan

- Trên động vật sống: máu có chất chống đông, máu đựng trong ống nghiệm khô; thai sảy

b Phương pháp kiểm tra trên kính hiển vi bệnh phẩm máu và phủ tạng

Làm tiêu bản, nhuộm gram để kiểm tra trên kính hiển vi; nếu không thấy vi khuẩn thì có thể nghi đó là bệnh DTL thuần túy sau khi đã có kết quả chẩn đoán lâm sàng (các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh DTL); trường hợp có

vi khuẩn thì có thể nghi ghép với bệnh đã phát hiện ra vi khuẩn (Lương 1997)

c Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm

Phương pháp phát hiện bệnh DTL cổ điển chính xác nhất là tiêm truyền cho lợn (Pearson 1992) Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là tốn thời gian (Có thể 3 - 4 tuần lễ) và tiền của Phương pháp này thường được áp dụng khi các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích không đủ để kết luận bệnh hoặc để có cơ sở pháp lý công bố dịch

d Phân lập vi rút

Được coi là phương pháp xác định vi rút với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất Có thể phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm, máu Vi rút DTL sau đó sẽ được

nuôi cấy trên môi trường thận lợn Sau đó sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang để xác định sự nhân lên của vi rút

e Phản ứng kháng thể huỳnh quang trực tiếp

Phương pháp xác định vi rút DTL cho kết quả nhanh, đáng tin cậy Để phân biệt vi rút DTL với các pestivirus khác, cần phải sử dụng kháng thể đơn dòng Mẫu thường được sử dụng là hạch amidan Trong thể á cấp tính hoặc mạn tính, mẫu thường được lấy để làm phản ứng là hồi tràng Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp này không như phân lập vi rút, tuy phản ứng âm tính nhưng chưa chắc lợn không mắc bệnh DTL

f Phản ứng ELISA

Đễ thực hiện, có thể sử dụng để chẩn đoán sớm bệnh DTL ở đàn lợn, cho kết quả sau 36 giờ Phản ứng sandwich ELISA thường sử dụng kháng thể đơn dòng phát hiện các loại kháng nguyên của vi rút Nguyên liệu được sử dụng để tiến hành là mẫu bệnh phẩm, huyết thanh, huyết tương, buffy coat, hoặc máu toàn phần được chống đông bằng EDTA

g Phản ứng PCR

Được sử dụng để phát hiện vi rút DTL, RNA của vi rút có thể phát hiện được từ mẫu máu của lợn sống hoặc mẫu bệnh phẩm Phản ứng cho kết quả nhanh, có độ tin cậy cao

2.2.8.4 Chẩn đoán huyết thanh học

a Chẩn đoán bằng thí nghiệm trung hòa trên thỏ

Nguyên lý: vi rút DTL cường độc và vi rút nhược độc có tính gây bệnh khác

nhau cho thỏ và cho lợn, nhưng có tính kháng nguyên giống nhau Có thể dùng vi rút DTL cường độc tiêm cho thỏ để gây miễn dịch Sau đó chứng minh tính miễn dịch của thỏ đối với vi rút DTL bằng cách tiêm vi rút nhược độc DTL (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Dùng bệnh phẩm là lách, hạch của lợn nghi mắc bệnh DTL nghiền với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/10 - 1/20, xử lý kháng sinh, sau đó tiêm cho 3 thỏ khỏe mạnh, mỗi con 1ml huyễn dịch vào tĩnh mạch tai Sau 5 - 10 ngày, dùng giống vi rút nhược độc DTL pha thành huyễn dịch 1/10 - 1/20 tiêm vào tĩnh mạch của 3 thỏ thí nghiệm nói trên; cũng đồng thời tiêm huyễn dịch này cho 3 thỏ khỏe mạnh đối chứng

Kết quả

- Phản ứng dương tính nếu ba thỏ thí nghiệm không có phản ứng sốt Trong khi đó thỏ đối chứng có sốt điển hình Lấy máu của 3 thỏ thí nghiệm này tiêm cho 3 thỏ khỏe mạnh khác, ba thỏ này cũng không sốt Điều đó chứng tỏ vi rút nhược độc DTL đã bị kháng thể DTL trung hòa Kết luận bệnh phẩm có vi rút DTL

b Phương pháp miễn dich khuyếch tán trên thạch

Chuẩn bị:

- Kháng thể chuẩn: chế bằng cách tối miễn dịch cho ngựa

- Kháng nguyên nghi: bệnh phẩm lấy là lách lợn bệnh, nghiền với nước sinh lý, theo tỷ lệ 1/1, có pha thêm 1 - 2% axit phenic, lọc qua gạc và ly tâm lấy nước trong

- Kháng nguyên dương: là hạch, lách lợn đã tiêm vi rút cường độc DTL, cũng được chế như trên

- Kháng nguyên âm: là hạch, lách lợn khỏe mạnh, được chế như trên

- Đun nóng chảy thạch, để nhiệt độ hạ xuống còn 40 - 450C rồi đổ thạch vào đĩa petri hoặc trên phiến kính; để đông thạch; đục lỗ trên thạch, đường kính mỗi

+ Âm tính: ở phần thạch giữa lỗ kháng thể DTL và lỗ kháng nguyên nghi không có đường kết tủa màu trắng

c Phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu

Bình thường vi rút DTL không hấp thụ được lên hồng cầu, do đó phải xử lý hồng cầu bằng axit tanic 1%, chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu và một nhóm chức khác gắn với vi rút DTL; khi đó vi rút dễ dàng hấp thụ lên hồng cầu thỏ, cừu, chuột lang nhưng không gây ngưng kết hồng cầu Khi gặp kháng thể tương ứng, vi rút DTL sẽ kết hợp với kháng thể đó, hồng cầu dính lại qua cầu nối kháng thể gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu

d Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

- Dùng kháng thể DTL đã được nhuộm màu huỳnh quang, cho tác động với kháng nguyên là bệnh phẩm nghi có chứa vi rút DTL (hạch, lách lợn bệnh) đã được cố định trên tiêu bản Nếu:

- Kháng thể DTL gặp kháng nguyên tương ứng tức là vi rút có trong bệnh phẩm thì xuất hiện sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, phức hợp này sẽ bám chặt vào nhau, khi rửa nước không bị trôi đi Soi trên kính hiển

vi huỳnh quang sẽ thấy có sự phát sáng của phức hợp kháng nguyên - kháng thể DTL được nhuộm màu huỳnh quang

- Ngược lại, kháng thể DTL không gặp kháng nguyên tương ứng thì khi rửa nước sẽ bị trôi đi, do đó soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ không có sự phát sáng của chất huỳnh quang

e Phản ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme linked immuno sorbent assay – ELISA)

Trong nghiên cứu bệnh DTL, dùng phản ứng ELISA dựa trên nguyên lý cạnh tranh giữa kháng thể có trong huyết thanh kháng vi rút DTL và kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng glycoprotein gp 55 của vi rút DTL, giúp hạn chế phản ứng chéo với các pestivirus khác Phương pháp này có thể phát hiện kháng thể sau khi nhiễm 10 - 15 ngày

Phương pháp trung hòa: để phát hiện kháng thể trung hoà vi rút DTL có trong huyết thanh Sử dụng huyết thanh pha loãng theo cơ số 2, trộn với vi rút DTL nồng độ 100TCID50/ml Sau khi ủ 1 giờ, hỗn dịch được cho vào đĩa môi trường tế bào PK15 (lặp lại thí nghiệm trong 2 giếng) Sau 2 - 4 ngày, tế bào được nhuộm với kháng thể đặc hiệu kháng vi rút DTL Hiệu giá kháng thể chính

là logarit của độ pha loãng huyết thanh cao nhất có khả năng ngăn cản sự nhân lên của vi rút ở 1 - 2/2 giếng phản ứng

Vì có phản ứng chéo giữa các pestivirus, huyết thanh cần chẩn đoán phải được trung hoà với các chủng BVDV và BDV chuẩn Nếu hiệu giá kháng thể giữa các vi rút chênh lệch nhau ≥ 4 lần thì mới được kết luận về nguyên nhân bệnh Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra mang tính sàng lọc những đàn xung quanh ổ dịch để đề xuất biện pháp phòng chống dịch

f Phản ứng miễn dịch sinh học phân tử (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction - RT-PCR), giải trình tự gen

Là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành cDNA Nhạy

và đa năng, RT - PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối 5’ và 3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA Thêm vào đó,

RT - PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự được sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế Bước đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA Một mồi oligodeoxynucleotide được lai với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA Kết thúc tiến trình tạo cDNA là

chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA

Nguyên lý phản ứng RT - PCR: Thông tin di truyền của các RNA vi rút

được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (RT) để có thể nhân gene đặc hiệu trong PCR Sau đó tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thông thường

2.2.9 Phòng chống bệnh DTL

Bệnh DTL là bệnh nguy hiểm cho ngành chăn nuôi lợn Nếu dịch xảy ra thì thiệt hại rất lớn về kinh tế nên việc phòng bệnh có ý nghĩa vô cùng quan trọng

2.2.9.1 Trên thế giới

Các biện pháp phòng dịch được thực hiện nhằm ngăn chặn sự xâm nhập

của vi rút Sự nhập khẩu lợn giống và các sản phẩm thịt lợn chưa xử lý nhiệt đều

bị cấm Thêm vào đó các thức ăn thừa của hành khách từ máy bay, tàu thủy và tàu hỏa liên vận quốc tế đều được hủy để tránh nhập bệnh từ bên ngoài

Trong những năm 1980 việc ngừng và sau đó cầm tiêm phòng DTL trong các nước thuộc Liên Minh Châu Âu đã đặt ra các biện pháp phòng bệnh chặt chẽ khác chú ý đến các yếu tố có nguy cơ lây lan (nước thải nhà bếp, tiếp xúc với các yếu tố lây nhiễm…) Liên minh Châu Âu đã từng cho là đã thanh toán được bệnh DTL thì chính bệnh này đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên minh

Đối với những nước đã thanh toán được bệnh DTL, để ngăn chặn bệnh DTL nhập từ nước ngoài vào người ta áp dụng biện pháp cấm nhập lợn sống hoặc thịt lợn và các sản phẩm chưa xử lý nhiệt Những thức ăn thừa của hành khách nhập cảnh từ máy bay, tàu thủy đều phải hủy bỏ để tránh mầm bệnh mang từ ngoài vào

2.2.9.2 Phòng chống bệnh ở Việt Nam

Bệnh DTL tại Việt Nam đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quy định phải tiêm phòng bắt buộc và khi dịch xảy ra thì phải công bố dịch Biện pháp phòng dịch hiện nay là:

- Tiêm phòng vắc xin DTL định kỳ hằng năm (mỗi năm 2 lần), tiêm bổ sung cho đàn lợn mới sinh ra và mới nhập về Chính việc tiêm phòng này đã hạn chế rất nhiều các ổ dịch trên địa bàn cả nước Tuy nhiên còn nhiều lý do khác nhau mà bệnh DTL vẫn là mối đe dọa cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta, đặc biệt là ở những vùng sâu, vùng xa, vùng có kinh tế khó khăn, vùng đồng bào dân

tộc ít người Theo (Dat et al., 1985) việc áp dụng lịch tiêm phòng 2 hoặc 3 vụ/1

năm góp phần hạn chế rất nhiều dịch, nhưng vẫn còn những lợn đang chửa hoặc lợn con theo mẹ dưới 1 tháng tuổi không được tiêm phòng, đối tượng này là nguồn mẫn cảm; nhiều ổ dịch xảy ra do những loại lợn này

Việc xác định thời gian, tháng tuổi tiêm phòng vắc xin đối với lợn con là quan trọng, tránh ảnh hưởng của miễn dịch thụ động và đảm bảo cho lợn con có

miễn dịch sớm nhất (Dat et al., 1985) đã kết luận: Ở lợn dưới 30 ngày tuổi, miễn

dịch thụ động bảo hộ 100% Lợn con từ 35 ngày tuổi trở lên khả năng miễn dịch thụ động giảm và mất hết ở 45 ngày tuổi Miễn dịch thụ động ở lợn con không ngăn cản quá trình tạo miễn dịch, nhưng miễn dịch chủ động chống DTL ở lợn dưới 30 ngày tuổi không chắc chắn và chỉ tồn tại trong vòng không đầy 1 tháng Lợn 45 ngày tuổi miễn dịch chủ động bằng vắc xin kéo dài được 6 tháng

Thời kỳ từ 30 - 45 ngày tuổi là thời kỳ chuyển tiếp từ bảo hộ do miễn dịch thụ động sang bảo hộ bằng miễn dịch chủ động Do vậy việc tiêm phòng vắc xin DTL chủng C phải được tiến hành trong thời gian này

Thời gian tiêm phòng vắc xin như sau: Đối với lợn nái: tiêm phòng trước khi phối giống 3 tuần hoặc trước khi đẻ 1 tháng để tạo kháng thể cao truyền sang con qua sữa đầu

Đối với lợn con: Nếu lợn mẹ chưa tiêm phòng thì nên tiêm vắc xin sớm vào 10 - 15 ngày tuổi, sau đó tiêm nhắc lại trước khi cai sữa Trường hợp lợn mẹ

đã được tiêm phòng thì tiêm phòng cho lợn con lúc 30 ngày và tiêm nhắc lại lúc

2.3.1 Vắc xin sản xuất trong nước và đang lưu hành tại Viêt Nam

Ở Việt Nam, hiện có một số loại vắc xin phòng bệnh DTL trong danh mục được phép lưu hành và hiện có 04 loại vắc xin sau sản xuất trong nước và đang lưu hành tại Việt Nam, bao gồm:

1) Vaccin Dịch tả lợn: sản xuất bởi Công ty cổ phần dược và vật tư thú y HANVET: là chứa ít nhất 100 PD vi rút DTL nhược độc thỏ hóa (chủng C) và chất bổ trợ, được đóng gói dưới dạng lọ, với thể tích: 50; 100; 250; 500 liều, đăng ký theo số: TW-X2-209 (Hanvet 2018, Nuôi 2018)

2) Dịch tả heo: của Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương NAVETCO: là vắc xin dạng đông khô được sản xuất từ vi rút DTL nhược độc thỏ hóa chủng C trên

tế bào Vắc xin rất an toàn, tạo miễn dịch nhanh, mạnh và kéo dài (Navetco 2018) 3) Dịch tả lợn đông khô: sản xuất bởi Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương VEVACO: là vắc xin DTL đông khô, có hoạt chất chính là: Kháng nguyên

DTL, được đóng gói dưới dạng lọ với khối lượng: 5; 10; 15; 20; 25; 50 liều, đăng

ký theo số: TW-XI-12 (Nuôi 2018, Vetvaco 2018)

4) Vắc xin Dịch tả lợn: sản xuất bởi Phân viện thú y Miền Trung – Viện thú y: là vắc xin DTL có hoạt chất chính là vi rút DTL chủng C, đóng gói dưới dạng

lọ với thể tích: 10, 25, 50 liều (2ml đk), đăng ký theo số: TW IV-3 (Nuôi 2018, TRUNG 2018)

2.3.2 Vắc xin được phép nhập khẩu và đang lưu hành tại Viêt Nam

Hiện nay có một số loại vắc xin phòng bệnh DTL trong danh mục được phép lưu hành và hiện có 5 loại vắc xin được nhập khẩu từ nước ngoài và đang lưu hành tại Việt Nam, bao gồm:

1) Bio – LHC: là vắc xin DTL có hoạt chất chính là Tissue culture Hog Cholera LPC-PRK vi rút, sản xuất bởi Công ty FORMOSA BIOMEDICAL nhập khẩu từ nước Đài Loan (TAIWAN) Đóng gói dưới dạng lọ với khối lượng: 10; 20; 50; 100; 500; 1.000; 2.000 liều, đăng ký theo số: FBI-1 (AMAVET 2018, Nuôi 2018)

2) Hog Cholera Cell Culture Live: của Công ty KAOHSIUNG CAL PRODUCT, nhập khẩu từ nước Đài Loan (TAIWAN): có hoạt chất chính là

BIOLOGI-vi rút DTL chủng LPC-CN nhược độc, được đóng gói dưới dạng: chai, với thể tích: 10; 20; 50 liều, đăng ký theo số: KBP-1 (Nuôi 2018)

3) Porcilis Pesti: sản xuất bởi Công ty INTERVET nhập khẩu từ nước HÀ LAN (NEITHERLAND), có hoạt chất chính là vi rút DTL cổ điển Porcilis Pesti được đóng gói dưới dạng: Lọ, với thể tích: 50, 100, 250 ml, đăng ký theo số: IT-

94 (Nuôi 2018)

4) Porcilis CSF live: sản xuất bởi Công ty INTERVET, nhập khẩu từ nước:

HÀ LAN (NEITHERLAND), có hoạt chất chính là vi rút Hogcholera nhược độc, Porcilis CSF live được đóng gói dưới dạng lọ, với khối lượng hoặc thể tích: 10;20;50;100 liều, đăng ký theo số: IT-126 (Nuôi 2018)

5) HOG CHOLERA VAC: của Công ty Daesung Microbiological Labs, Korea (Hàn Quốc), là vắc xin nhược độc được sản xuất theo công nghệ tế bào, vi rút (dòng LOM-E + Strain) được làm yếu đi, nuôi cấy chuyển tiếp qua nhiều đời trên tế bào thận của bê vừa mới sinh (BK) và được ướp lạnh - làm khô, được đóng gói dưới dạng chai, với khối lượng: 5, 10, 20, 30, 50 liều, đăng ký theo số: DAS-23 (E.P.S 2018)

2.4 ỨNG DỤNG HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACULOVIRUS TRONG SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP CỦA VI RÚT

Hệ thống biểu hiện Baculovirus (Baculovirus expression system) đã được nghiên cứu và phát triển trong nhiều năm qua và được ứng dụng rộng rãi trong y học hiện đại, bao gồm cả trong thú y và nhân y Từ một công nghệ bị coi là “kỳ lạ”, đến nay hệ thống biểu hiện Baculovirus đã trở thành công nghệ chủ đạo và được xem như một công cụ sinh học hữu ích để tái tổ hợp những protein quan trọng Với một nguồn Baculovirus bacmid sẵn có, cộng thêm kỹ thuật tái tổ hợp

Baculovirus đơn giản và dễ thực hiện trên vi khuẩn E.coli đã làm tăng thêm

những ưu việt của hệ thống biểu hiện này khi so sánh với các hệ thống biểu hiện khác Những nghiên cứu cơ bản trên hệ thống Baculovirus gần đây cũng như trong lĩnh vực sinh học tế bào côn trùng đã cung cấp những bằng chứng quan trọng cho thấy hệ thống biểu hiện Baculovirus đáp ứng được mọi yêu cầu cần thiết cho việc tái tổ hợp những protein quan trọng dùng trong y học Đặc biệt, khả năng biểu hiện hàng trăm, thậm chí hàng nghìn gen lạ bằng hệ thống Baculovirus và tế bào côn trùng đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu trước đây Hiện nay, vấn đề duy nhất là làm sao kết hợp nhiều kỹ thuật thích hợp để hoàn thiện chất lượng của protein cũng như kéo dài thời gian ổn định của các gen được tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện này (van Oers and Vlak 2007; Lin,

Chung et al.,2014)

Trong nhiều năm qua, hệ thống Baculovirus đã được sử dụng để biểu hiện nhiều loại protein khác nhau Nhiều công trình khoa học đã cho thấy hệ thống Baculovirus có khả năng tái tổ hợp nhiều loại protein mong muốn với số lượng protein tái tổ hợp lớn đáng kể Khả năng biến nạp vào nhiều loại tế bào động vật khác nhau của Baculovirus cũng đã được chứng thực trong nhiều nghiên cứu

(Koroleva Spirin et al.,2010) Hệ thống này cũng đã được sử dụng như vector biểu hiện để chế tạo vắc xin chống lại vi rút SARS-CoV (Bai Lu et al., 2008),

Van Oers và cộng sự đã biểu hiện thành công rất nhiều loại glycoproteins của vi rút bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus với mục đích sản xuất vắc xin, (van Oers

and Vlak 2007; Zhou Xue et al., 2010) Sự biểu hiện thành công glycoprotein E1

của vi rút gây bệnh DTL bằng hệ thống Baculovirus cũng đã được Hulst công bố

trước đó (Huls, Westra et al.,1993)

Trong những năm gần đây, hệ thống biểu hiện Baculovirus được ứng dụng

để biểu hiện một số loại protein như ORF2 của vi rút PCV2 hay

HEMAGGLUTININ (HA) của vi rút cúm A/H5N1 đều mang lại hiệu quả cao Những protein được tạo ra đều mang hoạt tính sinh học tự nhiên, mang lại tiềm năng cho việc tự chủ sản xuất vắc xin tái tổ hợp công nghệ mới tại Việt Nam Những thành công bước đầu trong việc sử dụng hệ thống Baculovirus để chế tạo vắc xin tái tổ hợp đối với cúm gia cầm (Avian Influenza), vắc xin phòng

vi rút parvo ở lợn (PPV) bằng cách sử dụng hệ thống Baculovirus nhằm tạo các hạt giảvi rút (virus-like particles, VLPs) đang được xem là một hướng đi mới

trong nghiên cứu chế tạo vắc xin (Hu and Zhang 2014; Park Kim et al., 2017)

theo đó các loại vắc xin này cho thấy tính ưu việt về hiệu lực cũng như giá thành vắc xin rẻ hơn Ngoài ra, rất nhiều loại vắc xin dùng cho thú y được sản xuất trên

tế bào côn trùng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường (Snijder Kikkert et

al.,2013; Bian Sun et al.,2017)

Trong hệ thống biểu hiện Baculovirus, ngoài tế bào côn trùng (insect cell),

ấu trùng và nhộng cũng được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp Ưu điểm nổi bật của hệ thống biểu hiện này là Baculovirus không có khả năng nhân lên (replication) trên tế bào động vật và chúng được xem như là rất an toàn với động vật, chim và cá Chính vì vậy, công nghệ tái tổ hợp protein sử dụng Baculovirus

đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất vắc xin thương mại cho người và động vật

(Lin Chung et al., 2014) Tuy nhiên, việc ứng dụng công cụ hữu ích này trong

thú y và nhân y tại Việt Nam còn rất hạn chế