Giám sát sự lưu hành và xác định một số đặc tính sinh học phân tử của virus cúm gia cầm type

Sự đóng góp của các gen H9N2, đặc biệt là các gen ribonucleoprotein RNP gây nhiễm trùng Trước thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Giám sát sự lưu hành và xác định một số

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN MẠNH THƯỞNG

GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH VÀ XÁC ĐỊNH

MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CÚM GIA CẦM TYPE A/H9N2 Ở GIA CẦM SỐNG BÁN TẠI MỘT SỐ CHỢ CỦA THÀNH PHỐ HÀ NỘI

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc./

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Mạnh Thưởng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú y đã quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Đình Thâu, người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Thú y, các thầy, cô tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban Lãnh đạo Cơ quan, cùng tập thể cán bộ, công chức Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Lai Châu; Phòng Dịch tễ - Cục Thú y; Chi cục Chăn nuôi và Thú y thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh; Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Mạnh Thưởng

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 4

2.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới 4

2.2.1 Tình hình chung 4

2.2.2 Tình hình dịch cúm H9N2 trên thế giới 10

2.3 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở việt nam 11

2.4 Căn bệnh 16

2.4.1 Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm 16

2.4.2 Cấu trúc, chức năng của Protein Hemagglutinin và Neuraminidase 19

2.4.3 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm 24

2.4.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 24

2.4.5 Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm 26

2.4.6 Triệu chứng 26

2.4.7 Bệnh tích 27

2.4.8 Chẩn đoán bệnh 27

2.5 Sơ lược hoạt động giám sát cúm gia cầm tại việt nam 28

2.5.1 Kết quả giám sát 28

2.5.2 Kết quả phân tích virus cúm gia cầm tại Việt Nam 31

2.6 Công tác phòng, chống bệnh cúm ở gia cầm 31

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 34

3.1 Đối tượng nghiên cứu 34

3.1.1 Đối tượng 34

3.1.2 Địa điểm 34

3.1.3 Thời gian 34

3.2 Nội dung nghiên cứu 34

3.3 Nguyên liệu 35

3.3.1 Mẫu thí nghiệm 35

3.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất lấy mẫu 35

3.4 Phương pháp nghiên cứu 36

3.4.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích 36

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu 36

3.4.3 Phương pháp xét nghiệm virus cúm A/H9N2 37

3.4.4 Phương pháp giải trình tự và phân tích gen HA 40

3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 40

Phần 4 Kết quả và thảo luận 42

4.1 Tình hình chăn nuôi, tiêm phòng và dịch bệnh cúm gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 42

4.1.1 Tình hình chăn nuôi gia càm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 42

4.1.2 Tình hình tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 44

4.1.3 Tình hình dịch cúm gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 46

4.2 Kết quả giám sát virus cúm A/H9N2 tại 5 chợ của các tỉnh, thành nghiên cứu 47

4.2.1 Kết quả lấy mẫu tại các tỉnh 47

4.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu bệnh phẩm 48

4.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus cúm gia cầm type A trong các mẫu môi trường 50

4.3 Một số đặc điểm phân tử gen ha của virus cúm gia cầm A/H9N2 tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2017-2018 51

4.3.1 Các trình tự gen tham chiếu được dùng trong nghiên cứu 51

v

4.3.2 Mối liên hệ di truyền dựa vào trình tự gen HA của virus cúm A/H9N2 57

4.5.3 Mối liên hệ di truyền dựa vào trình tự gen NA của virus cúm A/H9N2 58

4.4 Đánh giá một số yếu tố nguy cơ đối với sự lưu hành của virus cúm gia cầm 59

4.4.1 Đối tượng tiêu thụ 60

4.4.2 Nguồn gốc chăn nuôi (nguồn cung cấp) 62

4.4.3 Nơi lưu giữ số gia cầm còn lại không tiêu thụ hết 64

4.4.3 Nơi lưu giữ số gia cầm còn lại không tiêu thụ hết 65

4.4.4 Tần suất nhập mới 66

4.4.5 Tình trạng tiêm phòng 67

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 69

Tài liệu tham khảo 71

Phụ lục 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AI Avian Influenza - Cúm gia cầm

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Ct Cycle of threshold - Chu kỳ ngưỡng

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

HI Hemagglutination Inhibition - Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza - Cúm gia cầm thể độc lực cao LPAI Low Pathogenic Avian Influenza - Cúm gia cầm thể độc lực thấp

OIE Office International des Epizooties - Tổ chức Thú y Thế giới PB1 Polymerase basic protein 1

PB2 Polymerase basic protein 2

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế Thế giới

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations - Tổ chức

Nông lương Liên hợp quốc

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 – 2017 7 Bảng 2.2 Tình hình bệnh cúm H5N1 trên người giai đoạn 2003 - 2017 9 Bảng 2.3 Tóm tắt các chủng virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam giai đoạn

2003 - 2018 31 Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi và đoạn dò để phát hiện virus H9N2 36 Bảng 4.1 Kết quả thống kê đàn gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh giai đoạn 2015-

2018 43 Bảng 4.2 Kết quả thống kê tình hình tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại Hà Nội

và Bắc Ninh giai đoạn 2015-2018 45 Bảng 4.3 Kết quả lấy mẫu tại Hà Nội và Bắc Ninh 47 Bảng 4.4 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm type A trong mẫu từ gà tại các

chợ nghiên cứu 48 Bảng 4.5 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm type A trong mẫu môi trường 51 Bảng 4.6 Danh sách các trình tự gen HA được dùng tham chiếu 52 Bảng 4.7 Danh sách các trình tự gen NA được dùng tham chiếu 54 Bảng 4.8 Tổng hợp kết quả phân tích một số yếu tố nguy cơ 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ lịch sử đại dịch cúm ở người 5

Hình 2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017 6

Hình 2.3 Tình hình bệnh cúm H5N1 ở người giai đoạn 2003 - 2016 8

Hình 2.4 Bản đồ dịch tễ dịch cúm gia cầm năm 2016 - 2017 13

Hình 2.5 Biểu đồ so sánh tình hình cúm gia cầm trên cả nước 6 tháng đầu năm 2018 và 6 tháng đầu năm 2019 14

Hình 2.6 Biểu đồ so sánh số lượng gia cầm mắc cúm 6 tháng đầu năm 2018 và 6 tháng đầu năm 2019 15

Hình 2.7 Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm 17

Hình 2.8 Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A 19

Hình 2.9 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào chủ 25

Hình 3.1 Quy trình xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H9N2 39

Hình 4.1 Cây phả hệ của các chủng virus cúm dựa trên trình tự gen HA 57

Hình 4.2 Cây phả hệ của các chủng virus cúm dựa trên trình tự gen NA 58

ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Mạnh Thưởng

Tên luận văn: “Giám sát sự lưu hành và xác định một số đặc tính sinh học phân tử của

virus cúm gia cầm type A/H9N2 ở gia cầm sống bán tại một số chợ của thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh năm 2017”

Phương pháp nghiên cứu

- Dùng phương pháp điều tra hồi cứu về tình hình chăn nuôi gia cầm, diễn biến của dịch cúm gia cầm và thực trạng công tác tiêm phòng cúm gia cầm tại Thành phố Hà Nội và Tỉnh Bắc Ninh giai đoạn 2015 - 2018

- Phương pháp lấy mẫu: phương pháp thường quy đối với nghiên cứu virus

- Dùng phương pháp Realtime PCR để xác định sự có mặt của virus cúm A/H9N2 trong mẫu dịch hầu họng của gà và mẫu môi trường thu được từ 5 chợ buôn bán gia cầm sống tại địa bàn nghiên cứu

- Xác định biến đổi di truyền và nhánh virus cúm gia cầm type A/H9N2 lưu hành bằng kỹ thuật giải trình tự và phân tích trình gene HA và NA sử dụng phần mềm MEGA6.0 Cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp kết nối liền kề

- Sử dụng bảng câu hỏi dịch tễ học được thiết kế sẵn để phỏng vấn trực tiếp chủ gia cầm được chọn lấy mẫu Mẫu thí nghiệm và bảng câu hỏi được ghi theo cùng mã số nhằm đánh giá sự chi phối của các yếu tố có thể ảnh hưởng tới tỷ lệ lưu hành của virus cúm A

Kết quả nghiên cứu chính

- Kết quả thống kê tình hình chăn nuôi gia cầm tại địa bàn nghiên cứu giai đoạn

2015 - 2018 cho thấy: Tổng đàn gia cầm có sự tăng trưởng đều qua các năm Số lượng đàn gà chiếm tỷ trọng lớn nhất, dao động trong khoảng 75 - 76% tại Hà Nội và 78 - 80% tại Bắc Ninh, tổng đàn vịt chiếm từ 15 - 21%, còn lại là một số loại gia cầm khác chiếm một tỷ lệ không đáng kể

- Trong giai đoạn 2015 - 2018, kết quả thống kê tình hình tiêm phòng cúm gia cầm cho thấy tỷ lệ tiêm phòng cúm thường đạt cao trên 93% tại Hà Nội và Bắc Ninh

- Trong thời gian nghiên cứu tại 5 chợ buôn bán gia cầm sống tại Thành phố Hà Nội (chợ Hà Vỹ, chợ Ngũ Hiệp) và tỉnh Bắc Ninh (chợ Thị Cầu, chợ Đọ, chợ Gà), tổng

số mẫu thu được là 409 mẫu trong đó mẫu dịch hầu họng từ gà là 304 mẫu và 105 mẫu

là mẫu môi trường

- Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ lưu hành của virus cúm A trong mẫu từ gà chiếm 34.87% và tỷ lệ này trong mẫu môi trường là 44.76% Tỷ lệ này đặc biệt cao hơn tại các chợ bán lẻ như Ngũ Hiệp, chợ Thị Cầu và chợ Đọ (từ 19.81 - 43.4%) so với các chợ bán buôn gia cầm như Hà Vỹ hay chợ Gà (chỉ 1.89 đến 5.65%)

- Tỷ lệ dương tính với virus cúm A/H9 trong tổng số mẫu từ gà là 20.39% (62/304), tuy nhiên, tỷ lệ lưu hành của subtype này tương đối cao, chiếm 58.49% tổng

số mẫu dương tính với virus cúm A (62/106)

- Kết quả phân tích phả hệ các gen thu thập được cho thấy virus cúm A/H9N2 nằm trong phân nhánh Y280 (HA) và F98 like (NA) với tỷ lệ tương đồng rất cao với các chủng cúm A/H9N2 đã được công bố trong các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam

- Kết quả phân tích một số yếu tố nguy cơ đến tỷ lệ lưu hành của virus cúm A tại địa bàn nghiên cứu cho thấy: sự khác biệt có ý nghĩa (p value < 0.05) khi mua gà từ người buôn trung gian, mua gà từ các chợ gia cầm khác hoặc mua lại từ người bán khác trong cùng chợ Ngoài ra, nuôi nhốt gia cầm còn dư tại nhà sau ngày thực hiện buôn bán tại chợ cũng dẫn tới sự sai khác trong tỷ lệ lưu hành của virus cúm

Kết luận

- Công tác chăn nuôi gia cầm tại Thành phố Hà Nội và Tỉnh Bắc Ninh cho thấy sự tăng trưởng đều qua các năm với tỷ trọng lớn thuộc về ngành chăn nuôi gà

- Tỷ lệ tiêm phòng vaccine cúm tại Hà Nội và Bắc Ninh là tương đối cao

- Tỷ lệ lưu hành virus cúm ở môi trường là cao hơn so với mẫu lấy từ gà, tỷ lệ này cao hơn ở các chợ bán lẻ so với chợ bán buôn

- Tỷ lệ dương tính với virus cúm A không cao, tuy nhiên tỷ lệ lưu hành của virus cúm A/H9 là tương đối cao

- Có sự tương đồng di truyền cao giữa các chủng thu được từ nghiên cứu này với các chủng virus cúm A/H9N2 đã được phân lập tại các địa phương khác nhau của Việt Nam

- Một số yếu tố nguy cơ như nguồn gốc con giống và hoạt động buôn bán trung gian có ảnh hưởng đến sự lưu hành của virus cúm A

xi

THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Manh Thuong

Thesis title: “Circulation surveillance and identification of molecular biological

characteristics of Avian influenza A/H9N2 at live bird markets in Hanoi city and Bac Ninh province in 2017”

Methodology

- Utilizing the retrospective method to study the situation of poultry industry and the evolution of Avian Influenza as well as the vaccination status in Hanoi City and Bac Ninh province from 2015 to 2018

- Method of sample collection: regulated and specialized method for virus research

- Employing the Realtime PCR procedure to investigate the presence of A/H9N2 influenza virus in chicken oropharyngeal and environmental swabs collected from 5 live bird markets in studied areas

- Identifying genetic variation and circulation of A/H9N2 AIVs based on analyzing sequences and gene order HA and NA with MEGA 6.0 Phylogenetic tree was determined by Neighbour – Joining

- Directly interviewing selected poultry owners who agreed to participatein sample collection bypre-designed epidemiological questionnaire Samples and questionnaires are maked with the same codes for further evaluation of risk factors that could affect the prevalence of AIVs

Main finding

- Statistical results of the situation of poultry production in studied areas from

2015 to 2018 revealed that The total poultry population increased steadily over the years The largest proportion was chicken fluctuated in the range of 75 - 76% in Hanoi and 78 - 80% in Bac Ninh, respectively The proportion of duck was just 15 - 21%, and the negligible rate was other types of poultry

- During 2015 - 2018, statistical results of vaccination program against avian influenza usually achieved greater than 93% in Hanoi and Bac Ninh

- There were total of 409 pooled samples, including 304 oropharyngeal swabs samples and 105 environmental samples, collected from 5 live bird markets in Hanoi City (Ha Vy and Ngu Hiep market) and Bac Ninh province (Thi Cau, Do and Ga market)

- Analysis results showed that the prevalence of AIVs in chicken samples accounts for 34.87% and reachs at 44.76% in evironmental samples The possitive result was especially higher in retail markets such as Ngu Hiep, Thi Cau and Do which are from 19.81 - 43.4% in compared with wholesale markets of Ha Vy and Ga with infection rate from 1.89 to 5.65%

- The infection rate of AIV A/H9 was 20.39% (62/304) However, the prevalence

of this subtype was relatively high, accounting for 58.49% (62/106) of the total positive samples for AIV type A

- Phylogenetic analysis of the collected genes shows that the A/H9N2 AIV sallocated in the Y280 (HA) and F98 like (NA) clusters with the greatest similarity of genetic relation to other AIVs A/H9N2, previously documented in Vietnam

- Associated rick factors of A AIVs circulation rate in studied areas indicated that there was a significant difference (P value < 0.05) when chicken were purchased from middeman, other poultry markets or other chicken sellers in the same market Besides, rearing unsold chicken also led to differences in A AIVs circulation rate

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cúm gia cầm (AI - Avian Influenza) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm,

có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh, gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều nước trên thế giới (OIE, 2015)

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm

2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng hầu hết các địa phương trong cả nước Tính đến năm 2018, đã có 5.272 ổ dịch cúm gia cầm với khoảng trên 50 triệu con gia cầm các loại mắc bệnh phải tiêu hủy bắt buộc, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Nghiêm trọng hơn, virus cúm gia cầm đã lây sang người làm 127 người mắc bệnh, trong đó có 64 người tử vong (Cục Thú y, 2019)

Virus cúm gia cầm có hai loại kháng nguyên bề mặt chính là Hemagglutinin (H) và Neuraminidase (N) Có nhiều phân nhóm H và N, trong lịch sử virus có khả năng gây bệnh cao là H5 hoặc H7 và ở mức độ thấp hơn là H9 Virus cúm gia cầm hiện đang gây ra dịch lớn ở châu Á là A/H5N1, A/H5N6 Virus gây bệnh

ở Pakistan trong những năm gần đây là H7N3 và H9N2 Virus cúm gia cầm cũng được phân loại theo kiểu gen với 2 thể độc lực: thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) và thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza - LPAI) (FAO, 2006)

Virus cúm gia cầm A/H9N2 lần đầu tiên được phân lập từ gà tây vào năm

1966, khi virus này liên quan đến bệnh hô hấp nhẹ Ở châu Á, giám sát dài hạn tại các chợ gia cầm sống ở Hồng Kông từ năm 1975 đến 1985 đã phát hiện sự lưu hành của virus cúm H9N2 ở vịt khỏe mạnh Kể từ đầu những năm 1990, virus cúm H9N2 đã trở nên phổ biến ở gà nhà tại châu Á Đầu năm 2017, Indonesia đã phát hiện chủng virus cúm gia cầm độc lực thấp H9N2 gây giảm sản lượng trứng tới 70% tại các trang trại bị ảnh hưởng (FAO, 2018)

Nhiễm cúm gia cầm H9N2 gây thiệt hại nghiêm trọng về sản xuất và kinh tế cho người chăn nuôi gia cầm Nông dân chăn nuôi gia cầm ở Myanmar từ lâu đã yêu cầu chính phủ cho phép tiêm phòng cúm gia cầm (H9N2) để bảo vệ đàn gia cầm của họ (FAO, 2019)

Virus H9N2 phân lập từ gà ở Trung Quốc cho thấy sự trôi dạt kháng nguyên tiến hóa thành các nhóm kháng nguyên riêng biệt Sự trôi dạt kháng nguyên này có thể đã dẫn đến thất bại của các chương trình tiêm chủng và có thể

giải thích sự phổ biến hiện tại của virus cúm H9N2 tại Trung Quốc Việc xác định các acid amin trong các vị trí kháng nguyên H9 cho thấy sự phân bố các vùng kháng nguyên khác nhau giữa các phân nhóm khác Nhiều vị trí acid amin trong protein HA liên quan đến tính kháng nguyên của virus H9N2 đã được xác định Virus H9N2 có vai trò quan trọng do phạm vi vật chủ rộng, thích nghi với

cả gia cầm và động vật có vú, đồng thời có khả năng tái tổ hợp gen rộng rãi Virus cúm H9N2 đã được công nhận để tái tổ hợp với nhiều subtype khác, bao gồm H6N1, H6N2 và H5N1 Hơn nữa, virus cúm H7N9 tiếp tục tái tổ hợp với virus H9N2 lưu hành, dẫn đến nhiều kiểu gen của virus H7N9 Sự đóng góp của các gen H9N2, đặc biệt là các gen ribonucleoprotein (RNP) gây nhiễm trùng

Trước thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Giám sát sự lưu hành và xác định một số đặc tính sinh học phân tử của virus cúm gia cầm type A/H9N2 ở gia cầm sống bán tại một số chợ của thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh năm 2017”, từ đó có thể giám sát sự lưu hành và xác định những biến đổi

về mặt kháng nguyên của virus cúm A/H9N2 tại khu vực thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh, trên cơ sở đó đề xuất các giải pháp thích hợp phòng, chống cúm gia cầm, nhất là H9N2

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Nắm bắt tình hình chăn nuôi, dịch bệnh trên đàn gia cầm và công tác phòng, chống cúm gia cầm tại thành phố Hà Nội và tỉnh Bắc Ninh

- Xác định được sự lưu hành của chủng virus cúm gia cầm A/H9N2 trên địa bàn các địa phương nghiên cứu và một số yếu tố nguy cơ ảnh hưởng tới sự lưu

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

Nắm bắt được tổng quan về tình hình chăn nuôi, công tác phòng, chống dịch bệnh trên đàn gia cầm tại Hà Nội và Bắc Ninh

Giám sát nhằm phát hiện sớm và xác định tỷ lệ lưu hành, một số yếu tố nguy cơ ảnh hưởng tới sự lưu hành của virus cúm gia cầm và nắm được đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm A/H9N2 trên địa bàn thành phố Hà Nội

và tỉnh Bắc Ninh sẽ giúp chính quyền, các cơ quan, ban, ngành chức năng của địa phương có cái nhìn tổng thể về sự xuất hiện, lưu hành chủng virus gây bệnh trên địa bàn, từ đó có các giải pháp cụ thể phòng, chống lây bệnh cúm ở gia cầm và biện phòng tránh lây nhiễm bệnh cúm từ động vật sang người

Việc phân tích sự đồng nhất trình tự nucleotide và tương đồng amino acid của các chủng virus cúm gia cầm A/H9N2 là cơ sở dữ liệu quan trọng để tìm hiểu

về dịch tễ học và mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của loại virus cúm gia cầm lưu hành tại các tỉnh nghiên cứu

Nâng cao năng lực cho thú y cơ sở các kỹ thuật trong lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM

Cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở

gia cầm, do nhóm virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Đây là nhóm virus có biên độ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA (De Wit, 2008) Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) và 9 subtype

NA (từ N1 đến N9) Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA sẽ tạo ra nhiều subtyp khác nhau Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA) hoặc trao đổi các gen với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ, dẫn đến việc tạo nên nhiều subtyp có độc tính và khả năng gây bệnh khác nhau (Nguyễn

Bá Hiên và cs., 2014)

Trước đây, bệnh được gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), nhưng từ Hội

nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville (Mỹ) năm 1981 đã thay thế tên này bằng tên Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI Tên này dùng để chỉ các virus cúm type A có độc lực mạnh, lây lan nhanh và có tỷ lệ tử vong cao Tổ chức Thú y thế giới đã xếp HPAI thuộc danh mục A, là 1 trong 15 bệnh nguy hiểm ở động vật Tại nước ta, bệnh cúm gia cầm nằm trong danh mục các bệnh động vật trên cạn phải công bố dịch; Danh mục các bệnh truyền lây giữa động vật và người; Danh mục bệnh động vật cấm giết mổ, chữa bệnh; Danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phải áp dụng biện pháp phòng bệnh bắt buộc bằng vaccine cho động vật nuôi và Danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm phải áp dụng biện pháp giám sát định kỳ (Bộ NNPTNT, 2016)

2.2 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI

2.2.1 Tình hình chung

Cúm gia cầm lần đầu được phát hiện ở Italia vào năm 1878 với tên gọi là

dịch tả gà (Fowl plague) nhưng tới năm 1901 mới xác định được yếu tố gây bệnh

là căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua màng lọc và tới năm 1955 xác định được nguyên nhân chính xác gây bệnh cúm gia cầm là virus cúm type A thông qua kháng thể bề mặt A/H7N1 và A/H7N7 gây chết nhiều ở gà, gà tây và các loại động vật khác (Beard, 1998)

5

Bên cạnh đó virus cúm gia cầm còn lây lan và tạo ra các đại dịch gây tử vong rất lớn trên người Lịch sử các đại dịch cúm ở người xảy ra trên thế giới được mô tả theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ lịch sử đại dịch cúm ở người

Nguồn: Phạm Thành Long (2016) Năm 1918 - 1919, một đại dịch cúm (cúm Tây Ban Nha) đã nổ ra với mức

độ trầm trọng đã gây tử vong khoảng 20 -100 triệu người trên toàn thế giới Các nghiên cứu sau này đã chứng minh được virus gây ra đại dịch này là H1N1 (Taubenberger, 1997)

Đại dịch cúm H1N1 giai đoạn 2009 - 2010 đã gây nhiễm cho khoảng hơn

100 nghìn tới gần 400 nghìn người trên thế giới

Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên

gà tại Scotland vào năm 1959 và có thể là biến thể H5N1 đầu tiên trên thế giới Năm 1997 ở Hong Kong, lần đầu tiên virus cúm gia cầm H5N1 đã gây ra

ổ dịch trên gia cầm và lây sang người làm 18 người nhiễm bệnh, 6 người chết

và hàng triệu gia cầm đã bị tiêu hủy nhằm ngăn chặn dịch lây lan Đây là lần

đầu tiên virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên người (Wu et al., 2008)

Từ tháng 12/2003 đến tháng 3/2004, bệnh cúm gia cầm đã liên tiếp xảy ra với quy mô lớn ở 11 quốc gia và vùng lãnh thổ châu Á Sự lây lan nhanh chóng dịch cúm gia cầm xảy ra đồng thời ở một số nước đã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu Các chủng virus gia cầm độc lực cao đã được phân lập và định type

là chủng H5N1, ở Đài Loan là chủng H5N2 (Bùi Quang Anh, 2005; Nguyễn Tiến Dũng, 2004; Phạm Sỹ Lăng, 2004; Tô Long Thành, 2004) Từ đó đến nay, hàng năm dịch đều xảy ra tại nhiều nước trên thế giới với nhiều chủng virus khác nhau Tính đến hết tháng 9 năm 2018, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 75 quốc gia

và vùng lãnh thổ tại tất cả các châu lục trong đó chủ yếu tại các quốc gia châu Á (theo OIE) Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017 được thể hiện theo hình 2.2 và bảng 2.1

Hình 2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017

Như vậy, kể từ khi dịch cúm gia cầm tái bùng phát trở lại tới nay, hàng năm vẫn có rất nhiều quốc gia trên thế giới (từ 10 đến 57 quốc gia) thông báo đã xảy

ra các ổ dịch cúm gia cầm

Các quốc gia thuộc châu Á đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Camphuchia, Indonesia, Việt Nam được coi là khu vực tồn tại lâu dài các ổ dịch do có nhiều điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh lưu hành như tổng đàn gia cầm lớn, phương thức chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lạc hậu (Phạm Thành Long, 2016)

Không chỉ gây bệnh cho gia cầm, các chủng virus cúm đã lây sang người gây tỷ lệ tử vong rất cao, có khi lên tới 100% Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, từ năm 2003 đến tháng 2/2016, trên toàn thế giới đã có 844 trường hợp bệnh nhân mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 trong đó có 449 trường hợp tử vong chiếm tỷ lệ 53,20% tại 16 quốc gia trên thế giới Trong đó nghiêm trọng nhất là ở giai đoạn 2003 - 2009 với 468 ca mắc, 282 ca tử vong tại 15 quốc gia, giai đoạn

2010 - 2015 với 376 ca mắc, 167 ca tử vong tại 7 quốc gia

Các ca mắc và tử vong trên người tập trung chủ yếu ở các nước thuộc Châu

Á và Châu Phi đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á

Tình hình bệnh cúm gia cầm H5N1 ở người trên thế giới giai đoạn 2003 -

2016 được minh hoạ cụ thể theo hình 2.3 và bảng 2.2

Quốc vẫn diến biến ph

virus H7N9 biến đổi t

cao với động vật có vú

hiểu biết đầy đủ các ngu

không rõ ràng (http://ww

ình hình bệnh cúm H5N1 ở người giai đoạn

i Trung Quốc đã xảy ra dịch cúm A/H7N9 ởnước sau đó dịch tiếp tục được phát hiện tạkhác như Hồng Kông, Đài Loan, Canada và Ma

ch cúm A/H7N9 trên người ở Trung Quốc trở

m 2017, đã có 1.342 người bị nhiễm virus cúmong Hiện nay tình hình dịch cúm A/H7N9 trên

n phức tạp Đặc tính của virus cúm A/H7N9

i từ độc lực thấp thành độc lực cao rên gia

có vú, có khả năng lây lan rộng Tuy nhiên, đ

ác nguồn lây bệnh Đặc biệt biểu hiện cúm A/Htp://www.vncdc.gov.vn)

2003 - 2016

ở người trên nhiều

ại một số quốc gia

và Malaysia Đầu năm lên phức tạp, tính

2.2.2 Tình hình dịch cúm H9N2 trên thế giới

Virus H9N2 lần đầu tiên được phân lập từ gà tây vào năm 1966, khi virus này liên quan đến bệnh hô hấp nhẹ Ở châu Á, giám sát dài hạn tại các chợ gia cầm sống ở Hồng Kông từ năm 1975 đến 1985 đã phát hiện virus cúm H9N2 ở vịt khỏe Kể từ đầu những năm 1990, virus cúm H9N2 đã trở nên phổ biến ở gà nhà ở châu Á Đầu năm 2017, Indonesia đã phát hiện chủng virus cúm gia cầm độc lực thấp H9N2 gây giảm sản lượng trứng tới 70% tại các trang trại bị ảnh hưởng (FAO, 2018)

Nhiễm cúm gia cầm H9N2 gây thiệt hại nghiêm trọng về sản xuất và kinh tế cho người chăn nuôi gia cầm Nông dân chăn nuôi gia cầm ở Myanmar từ lâu đã yêu cầu chính phủ cho phép tiêm phòng cúm gia cầm (H9N2) để bảo vệ đàn gia cầm của họ (FAO, 2019)

H9N2 là loại virus cúm phổ biến nhất trên gà tại Trung Quốc Bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm, ngay cả trong các chương trình tiêm phòng dài hạn đã được áp dụng Qua nghiên cứu, các nhà khoa học cho rằng H9N2 là nguồn biến chủng cho virus H7N9 và H10N8, là hai chủng virus cũng đang lây nhiễm cho người Vai trò quan trọng của virus H9N2 quyết định bởi phạm vi vật chủ rộng, có khả năng thích nghi với cả gia cầm và động vật có vú

và tái tổ hợp gen rộng rãi Ở Trung Quốc, nơi được coi là tâm chấn của virus cúm gia cầm, virus H9N2 đã được phát hiện ở nhiều loài chim, bao gồm gà, vịt, chim cút, gà lôi, chim sẻ, chim bồ câu

Các nghiên cứu dịch tễ học và di truyền học cho thấy gen Hemagglutinin (HA) của virus cúm H9N2 có thể được chia thành các dòng gia cầm ở châu Âu

và châu Mỹ Dòng dõi Á-Âu liên quan đến ba dòng dõi khác nhau, bao gồm A/gà/Bắc Kinh/1/94 giống như (giống như BJ/94), A/chim cút/Hồng Kông/G1/97 (giống G1) và A/vịt/Hồng Kông/Y439/97 (giống Y439)

Virus cúm H9N2 có thể lây truyền qua giọt không khí, bụi, thức ăn hoặc nước Gà thường có vẻ khỏe mạnh sau khi bị nhiễm trùng nhưng một số trong chúng cho thấy trầm cảm và lông xù Các loại virus sao chép chính nó trong khí

quản Nó làm cho gà dễ bị nhiễm trùng thứ cấp, đặc biệt là nhiễm Escherichia

coli với tỷ lệ tử vong thấp nhất là 10% Ngoài ra, khí quản hoặc phế quản dễ bị

từ người sang người

2.3 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM Ở VIỆT NAM

Bệnh cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 do virus cúm gia cầm H5N1 độc lực cao (HPAI) gây ra Kể từ khi dịch xuất hiện, đến năm 2018, đã có 5.272 ổ dịch (lượt xã) cúm gia cầm với khoảng trên 50 triệu con gia cầm các loại mắc bệnh phải tiêu hủy bắt buộc, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Nghiêm trọng hơn, virus cúm gia cầm đã lây sang người làm 127 người mắc bệnh, số bệnh nhân tử vong là 64 người (Cục Thú y, 2019) Theo thông tin thống kê của Cục Thú y, diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam giai đoạn 2003 - 2008 được chia thành 6 đợt chính:

- Đợt 1: Từ tháng 12/2003 đến tháng 3/2004, dịch đã xảy ra ở 2.574 xã, 381 huyện thuộc 57 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là

45 triệu con, chiếm khoảng 16% tổng đàn gia cầm cả nước Trong năm 2003 có 3

ca mắc và tử vong ở người do virus cúm H5N1

- Đợt 2: Từ tháng 4 đến tháng 11/2004, dịch xuất hiện ở 46 xã tại 32 huyện thuộc 17 tỉnh, thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 84.078 con Trong năm 2004, có 29 ca H5N1 ở người, trong đó số tử vong là 20 người

- Đợt 3: Từ háng 12/2004 đến tháng 5/2005, dịch xảy ra ở 670 xã, 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầm tiêu huỷ là 1.296.184 con bao gồm 470.495 con gà và 825.689 thủy cầm Trong năm 2005, có 61 ca nhiễm H5N1 ở người, trong đó có 19 ca tử vong

- Đợt 4: Từ tháng 10/2005 đến 01/2006 với 24 tỉnh, thành có dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 3.972.763 con trong đó gà 1.338.523 con, thuỷ cầm và loài khác là 2.634.240 con

- Đợt 5: Bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 2007, đã xảy ra 269 ổ dịch tại 33 tỉnh, thành trong cả nước làm ốm chết và phải tiêu hủy bắt buộc là 397.943 con Trong năm 2007 có 8 ca H5N1 ở người, trong đó số người chết là 5 ca

- Đợt 6: Từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác tại 57 xã của 40 huyện thuộc 21 tỉnh Tổng số gia cầm tiêu huỷ là 60.090 con, trong đó có 23.498 gà, 36.592 thuỷ cầm Năm 2008 có 6 ca mắc cúm H5N1 ở người và 5 trong số 6 ca đã tử vong Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 68 xã của 34 huyện thuộc 17 tỉnh với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy trên 127.000 con Năm 2009 có 5

ca mắc H5N1 ở người và đều tử vong

Năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 46 xã của 24 tỉnh làm 42.614 con gia cầm mắc bệnh, chết và phải tiêu hủy bắt buộc Trong năm 2010, có 7 ca mắc H5N1 ở người và có 2 ca tử vong

Trong năm 2011 có 82 xã, 43 huyện thuộc 22 tỉnh có dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh 110.311 con, số tiêu hủy là 151.356 con (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013) Năm 2012 đã xảy ra 296 ổ dịch ở 112 huyện, 32 tỉnh làm ốm chết và phải tiêu hủy 616.109 con trong đó có 117.946 con gà, 479.859 vịt và 18.304 ngan (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013) Trong năm này có 4 ca mắc bệnh trên người

và có 2 ca tử vong

Năm 2013 đã xảy ra 104 ổ dịch cúm gia cầm tại 64 huyện, 31 tỉnh Số gia cầm ốm chết phải tiêu hủy bắt buộc là 141.687 con Ngoài việc xảy ra trên đàn gia cầm, trong năm 2013 còn phát hiện ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên chim yến tại Ninh Thuận làm ốm chết và tiêu hủy hơn 4.000 con và trên chim cút tại Tiền Giang với hơn 30.000 con chim cút phải tiêu hủy Trong năm này

có 2 ca mắc bệnh trên người và làm tử vong 1 người

Trong năm 2014 đã xảy ra 181 ổ dịch tại 96 huyện, 33 tỉnh trong cả nước,

số gia cầm phải tiêu hủy là 212.780 con Trong năm này có 2 ca mắc bệnh ở người và đều đã tử vong (Cục Thú y, 2014)

Tháng 8/2014, phát hiện ổ dịch cúm gia cầm A/H5N6 đầu tiên ở nước ta trên đàn gà 80 con của 1 hộ chăn nuôi tại xã Chi Lãng, huyện Tràng Ðịnh, tỉnh

13

Lạng Sơn Sau đó các ổ dịch cúm H5N6 tiếp tục được phát hiện tại các tỉnh khác trong cả nước Ðến cuối tháng 12/2014, cả nước đã xảy ra 7 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 6 xã, 6 huyện của 6 tỉnh làm 17.188 con gia cầm mắc bệnh phải tiêu hủy bắt buộc Ngoài ra trong quá trình giám sát chủ động, virus cúm A/H5N6 cũng được phát hiện tại các tỉnh Phú Thọ, Bắc Giang, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam (Cục Thú y, 2014)

Trong năm 2015, các ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã xuất hiện tại 18 xã, phường của 17 huyện, thị xã thuộc 11 tỉnh, thành phố Số gia cầm mắc bệnh là 14.138 con, số tiêu hủy là hơn 16.128 con Dịch cúm gia cầm A/H5N6 đã xảy ra tại 23 xã, 18 huyện của 12 tỉnh, thành trong cả nước làm ốm chết và phải tiêu hủy bắt buộc 34.624 con gia cầm các loại trong đó có 17.509 con gà, 7.052 thủy cầm

và 10.063 con chim cút (Cục Thú y, 2015)

Hình 2.4 Bản đồ dịch tễ dịch cúm gia cầm năm 2016 - 2017

Năm 2016, dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại 07 xã, phường của 06 huyện, thị xã thuộc 03 tỉnh, thành phố Số gia cầm mắc bệnh là 4.767 con, số tiêu huỷ là 6.182 con Dịch Cúm gia cầm A/H5N6 xảy ra tại 07 xã, phường của 06 huyện, thị xã thuộc 05 tỉnh, thành phố; số gia cầm mắc bệnh là 5.189 con; số gia cầm tiêu huỷ là 13.550 con, bao gồm cả gia cầm khỏe mạnh trong cùng đàn mắc bệnh (gà chiếm 91,90% trong tổng số chết, vịt chiếm 8,10%) (Cục Thú y, 2016) Trong năm 2017, toàn quốc đã xảy ra 34 ổ dịch cúm A/H5N1 tại 27 huyện

thuộc 17 tỉnh, thành phố; số gia cầm mắc bệnh là 39.636 con, tiêu hủy là 56.125

con Xảy ra 06 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 05 huyện thuộc 05 tỉnh với số gia cầm mắc bệnh là 10.680 con, số gia cầm tiêu hủy là 17.710 con (Cục Thú y, 2017) Năm 2018, đã xảy ra 07 ổ dịch cúm A/H5N6 tại 07 hộ chăn nuôi gia cầm thuộc 05 tỉnh, thành phố với 23.958 con gia cầm phải tiêu hủy So với năm 2017,

số hộ chăn nuôi gia cầm có dịch giảm 12 lần, số xã có dịch giảm 6 lần, số tỉnh có dịch giảm 4 lần; số gia cầm mắc bệnh và tiêu hủy giảm 3 lần (Cục Thú y, 2018)

Hình 2.5 Biểu đồ so sánh tình hình cúm gia cầm trên cả nước 6 tháng đầu

năm 2018 và 6 tháng đầu năm 2019

Từ năm 2015 tới 6 tháng đầu năm 2019 cả nước không ghi nhận ca bệnh Cúm A/H5N1 trên người

Thời gian xảy ra các ổ dịch cúm gia cầm A/H5N1 và A/H5N6 thường tập trung vào các tháng cuối năm và kéo dài tới các tháng đầu năm đặc biệt thường tập trung vào dịp Tết nguyên đán Điều này cũng phù hợp với thực tế tại nước ta đây là giai đoạn chuyển mùa, thời tiết thuận lợi; hoạt động chăn nuôi, vận chuyển buôn bán gia cầm diễn nhộn nhịp để phục vụ nhu cầu thịt gia cầm rất cao của người dân trong dịp Tết đã tạo điều kiện lý tưởng cho mầm bệnh phát triển và lây lan

Các ổ dịch thường tập trung chủ yếu tại các tỉnh thuộc 3 vùng đồng bằng lớn của cả nước là đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh duyên hải miền Trung và các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng Sông Cửu Long Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với đặc điểm đây là những vùng có tổng đàn gia cầm lớn, mật độ chăn nuôi gia cầm rất cao, hoạt động buôn bán, vận chuyển gia cầm và các sản phẩm gia cầm

3,000

23,871

0 5,000

rất nhộn nhịp, tình trạng buôn bán gia cầm nhập lậu qua biên giới tại các tỉnh phía Bắc, hoạt động nuôi vịt chạy đồng tại các tỉnh phía Nam do đó có nhiều cơ hội thuận lợi cho virus cúm phát tán và lây bệnh cho gia cầm

2.4 CĂN BỆNH

Cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở

gia cầm, do nhóm virus cúm typ A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Đây là nhóm virus có biên độ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA Nhóm virus cúm A có 16 subtyp HA (từ H1 đến H16) và 9 subtyp NA (từ N1 đến N9) Gia cầm, thủy cầm là nguồn lưu trữ mầm bệnh chủ yếu trong tự nhiên Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau

Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu về cúm gia cầm, các nhà khoa học đã công bố, nhóm virus cúm A có thêm 2 subtype HA (H17-H18) và 2 subtype NA (N10-N11), các chủng virus cúm A/H17N10 và H18N11 được phát hiện trên loài

dơi Peruvian (Tong et al, 2013)

Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là: nhóm virus cúm A (Influenza A), nhóm virus cúm B (Influenza B), nhóm virus cúm C (Influenza C) và nhóm Thogotovirrus Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF) và ở Thogotovirrus là

Glycoprotein (GP) (Ito et al., 1998; Murphy and Webster, 1996)

2.4.1 Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm

Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A qua kính hiển vi điện tử

có dạng hình khối tròn, hình trứng hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 -

120 nm Virus có vỏ bọc ngoài, phân tử lượng của hạt virus khoảng 250 triệu Da

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường

glycoprotein gồm: HA, NA, M1 (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender et

al., 1999; Zhao et al., 2008) Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử

NA và HA (tỷ lệ NA:HA khoảng 1:4), đây là 2 loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy

and Webster, 1996; Uiprasertkul et al., 2007)

ứng của virus (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007)

Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein

enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerasa của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (trên thực tế là 87,103 Da) (Murphy và Webster, 1996) Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ được cho là có liên quan đến vị trí amino acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 400C, còn ở virus thích nghi trên người là Lys - thích ứng nhiệt độ cơ thể người khoảng 370C) (Subbarao et al., 1998)

Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1- tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme promerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy và Webster, 1996) Gần đây, đã có phát hiện thêm 1 protein (PB1-F2) được mã hóa bởi 1 khung đọc

mở khác nhau của PB1, có vai trò gây ra hiện tượng apoptosis (hiện tượng tế bào

chết theo chương trình) (Tumpey et al., 2002)

Phân đoạn 3 (gen PA) kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao,

mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán

khoảng 83000 Da (trên thực tế là 96.103 Da) PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp

RNA của virus (Luong and Palese, 1992)

Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A

Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA, gồm hai tiểu phần là

HA1 và HA2 Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt cắt của enzyme

protease, đây là vùng quyết định độc lực của virus (Bosch et al., 1981; Gambotto

et al., 2008) Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không

được oxy hóa) và 77.103 Da (nếu được oxy hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da và

HA2 là 29.103 Da) (Keawcharoen et al., 2005; Luong and Palese, 1992)

Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ

Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài

thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) (Lê Thanh Hòa, 2004) Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Daton

Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước 1027 bp mã hóa cho protein đệm

(matrix protein - M) của virus Có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus Protein M1 là protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình

"nảy chồi" của virus Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân

tử là 11.103 Da, là protein chuyển màng - kênh ion cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus, trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ (Luong and Palese, 1993; Murphy and Webster, 1996; Basler, 2007)

Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non structural

protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen mã của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus

Như vậy, virus cúm A có hệ gen được cấu trúc từ 8 phân đoạn riêng biệt và

19

không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi tính kháng nguyên tạo nên chủng virus cúm A mới (Suarez and Schultz-Cherry, 2000)

Hình 2.8 Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A

Nguồn: Murphy and Webster (1996)

2.4.2 Cấu trúc, chức năng của Protein Hemagglutinin và Neuraminidase

2.4.2.1 Protein HA (Hemagglutinin)

Protein HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất

của từng chủng virus cúm A (David, 1999) có vai trò đặc biệt quan trọng

trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus Gen mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (invitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - Hemagglutinin Inhibitory antibody) Có 16 subtype HA đã được phát hiện (H1 - H16) Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm

của virus vào tế bào chủ (Bender et al., 1999; Wagner et al., 2002) Phân tử HA

có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ 2 tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2

(27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid

là tiểu đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích

(Bosch et al., 1981; Wagner et al., 2002)

Trên phân tử HA có 2 vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc aminoacid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử phân tử protein trên vỏ virus (David, 1999)

Sự biến đổi trong gen mã hóa cho gen kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hàng năm

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên

bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng

của virus ở các loài vật chủ khác nhau (Wagner et al., 2002) Vị trí acid amin 226

(aa226) của HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí

này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết

với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm Ngoài ra, một số vị trí acid amin khác: Glutamine 222, Glycine 224 cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Luong and Palese, 1993) Gen HA bao gồm hai đoạn HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho một dãy các aminoacid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của Protease Đây là vùng quyết định độc lực hay tính gây bệnh của của virus Phân tử HA1, HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm

Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí các aminoacid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi

21

là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA Protein

HA kích thích cơ thể sản sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type

HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus Vì thế, protein HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích đến của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ

thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay (Bosch et al., 1998)

Chuỗi Oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng, chuỗi này chứa một số aminoacid mang tính kiềm (basic aminoacid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới (David, 1999) Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng phân cắt HA càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúmA (Wolfgang Garten, 2008)

Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuôc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzyme protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid Virus cúm A không có gen tổng hợp enzyme protease, mà phải nhờ vào hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus Càng có nhiều điểm cắt protease hoàn chỉnh

và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzyme tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà mặng nề hơn (Wolfgang Garten, 2008)

2.4.2.2 Protein NA (Neuraminidase)

Protein Neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C3.2.1) là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng subtype NA Phân tử

NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn

vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng và phần kị nước gắn vào vỏ

capsid (Uiprasertkul et al., 2007)

Protein Neuraminidase có 3 chức năng chính:

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa các gốc acid sialic của màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp các hạt virus mới trên màng tế bào Virus cần phải

có NA thì mới có thể xâm nhập được qua lớp màng mucin của biểu mô hô hấp

Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus nhanh hơn

(Uiprasertkul et al., 2007)

NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu

Virus cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua màng nhầy

do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích Mặt khác, NA có khả năng phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúm và viêm phổi

kế phát do vi khuẩn Đột biến trong gen NA làm thay đổi những hoạt tính của

enzyme này (Cohen et al., 2013)

Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA

là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virrus không đặc hiệu hiện nay

(Aoki et al., 2007)

Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA

Sự đột biến trượt xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến hóa

là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA và đã được chứng minh rằng thông qua loại hình đột biến xóa gen này, virus cúm A/H5N1 sẽ tạo nên một

subtype N mới có độc lực cao hơn (Cohen et al., 2013)

Như vậy kháng nguyên HA và NA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế truyền lây sang người

2.4.2.3 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

a Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc,

23

không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã

và sao chép ở nhân tế bào đích Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thế “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt-xóa) một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus (Lê Thanh Hòa và cs., 2006) Tùy thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến (đột biến điểm) Tần xuất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A)

thì có 1 nucleotide sai khác (Wagner et al., 2002)

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA và

HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới hoặc làm thay đổi cấu trúc, thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể virus mới thay đổi độc

lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới (Wasilenko et al., 2008)

b Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbohydrate (oligosaccharide) vào với amino acid Asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA và NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = amino acid bất kỳ, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điển hình thành bộ mã của Asparagine tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy

ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, làm cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hòa sự nhân lên của virus (Baigent và Mc Cauley, 2001) Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng trộn kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh được cho người và rất có thể A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở

người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống dịch (Baigent và Mc Cauley, 2001)

c Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tương trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm và rất ít ở một số virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào có thể xảy ra sự hòa trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân đoạn gen của 2 chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở

loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Chen et al., 2006)

2.4.3 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là chim hoang dã (chủ yếu

là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên (De Wit and Foichier, 2008) Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi để virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở các loài vật chủ mới đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh

từ gia cầm sang người và giữa người với người (Webster et al., 2002)

2.4.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (Murphy and Webster, 1996) có những nét đặc trưng như sau:

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của

HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm

Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất) và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và

chuyển, RNA phụ thuộ

- RNA của virus được v

Trong nhân tế bào

khuôn là sợi âm của hệ

gen của virus mới nhờ

t virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ

t virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưn

ng tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quáosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ

ải phóng vào trong bào tương tế bào, hệ

c của tế bào tổng hợp các protein của virus

ộc (RNA-transcription, RNA-dependent) P

c vận chuyển vào trong nhân tế bào (Beard, bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp c gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng RNA-poymerase Các sợi này không được A

n mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nu

p ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được v

ời, các RNA thông tin của virus cũng sao ch

ân đoạn gen của virus và được enzyme PB2 g

ầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tươnổng hợp nên các protein của virus

nh cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus c

o quá trình chết theo (Beard, 1998)

ệ gen của virus sử virus và các RNA vận ent) Phức hợp protein eard, 1998)

o tương và dịch mã tại

irus cúm A trong tế

Nguồn: Beard (1998)

ận chuyển gắn lên

i là hiện tượng “nảy

i nhân lên tế bào để

kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng, các RNP của virus được hợp nhất với quá trình “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phòng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy and Webster, 1996)

2.4.5 Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm

Trong thực tế người ta chia virus cúm ra làm 2 loại: Loại virus độc lực thấp (LPAI) và loại có độc lực cao (HPAI)

LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại virus có khả năng lây nhiễm rộng rãi và tạo nên các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trêm cùng một tế bào và trở thành một loại virus HPAI nguy hiểm

HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48-72 giờ sau nhiễm Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào

xơ phôi gà, tế bào thận chó (MDCK) không có trypsin Các vụ dịch lớn đều do virus HPAI gây ra, thường là virus có kháng nguyên H5 và H7

Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus (De Wit and Foichier, 2008)

2.4.6 Triệu chứng

Biểu hiện lâm sàng của bệnh diễn biến rất đa dạng và phức tạp, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độc lực, số lượng virus, loài nhiễm bệnh, mật độ chăn nuôi, tiểu khí hậu chuồng nuôi, chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm virus… (Nguyễn Tiến Dũng, 2004)

Triệu chứng điển hình là gia cầm chết đột ngột, chết nhiều với tỷ lệ chết từ 20-100% Con vật sốt cao, ủ rũ, bỏ ăn uống, giảm đẻ, suy yếu và đứng tụm lại thành từng đám, lông xù, xơ xác, chảy nước mũi, dịch mũi nhày màu xám, khó thở, vươn cổ để thở, thở khò khè, hắt hơi, chảy nước mắt, viêm kết mạc mắt, nhắm mắt, sưng phù đầu, mào tích sưng phù, màu tím sẫm Con vật có triệu chứng thần kinh như co giật, mất thăng bằng, vận động xoay tròn

và xuất huyết (Lê Văn Năm, 2004; Alexander, 1993)

2.4.7.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể chủ yếu là xung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân ở não và một số cơ quan khác Mạch quản của cơ quan như mào, tích, gan, lách, phổi, thận, cơ tim, cơ vân, não bị giãn rộng và thâm nhiễm tế bào (Beard, 1998)

2.4.8 Chẩn đoán bệnh

2.4.8.1 Chẩn đoán dựa vào dịch tễ học

Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ học như bệnh lây lan nhanh, gia cầm mọi lứa tuổi, nhiều loại gia cầm mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc bệnh, những vùng có ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phòng vaccine cúm hoặc tiêm phòng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phòng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp

2.4.8.2 Chẩn đoán dựa vào triệu chứng và bệnh tích

Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đoán Lưu ý các đặc điểm chính như gia cầm bệnh chảy nhiều nước mắt, viên xoang mũi, mào tích tím tái, phù đầu và mí mắt, có triệu chứng thần kinh, da chân vùng không lông xuất huyết

Căn cứ những bệnh tích điển hình như phổi, gan, thận, lách sưng to Xuất huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata, xuất huyết Xuất huyết dạ dày cơ, dạ dày tuyến giống bệnh Newcastle Túi fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết… (Alexander, 1993; Baigent và Mc Cauley, 2001)

2.4.8.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Chẩn đoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên rứng gà có phôi ấp 9 -

10 ngày tuổi hoặc trên môi trường tế bào xơ phôi gà hoặc tế bào thận chó MDCK Giám định virus trong dịch nuôi cấy bằng các phản ứng HA, HI Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR: cho phép xác định virus