NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT Học viên: Trần Văn Khiêm Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trường Đạ

TRẦN V

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này không thể hoàn thành nếu thiếu sự hướng dẫn, giúp đỡ, động viên

và hỗ trợ nhiệt tình của nhiều thầy, cô và bạn bè

Trước tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Minh, giảng viên BM Công nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa

Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và viết luận văn này Những nhận xét và đánh giá của Cô, đặc biệt là những gợi ý về hướng giải quyết vấn đề trong suốt quá trình nghiên cứu, thực sự là những bài học vô cùng quý giá đối với tôi, không chỉ trong quá trình viết luận văn mà cả trong hoạt động nghiên cứu chuyên môn sau này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Lý Thùy Trâm, Trưởng BM Công nghệ sinh học, Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Cô đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp đỡ những lúc tôi cảm thấy khó khăn nhất, tuyệt vọng nhất và giúp tôi vượt qua mọi trở ngại để đi trọn vẹn con đường cao học này

Tôi cũng xin gửi cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Đặng Minh Nhật, Phó trưởng Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, Thầy đã giúp đỡ tôi từ những bước đầu định hướng về đề tài nghiên cứu của mình và đặc biệt đã tạo điều kiện hết sức để tôi

có thể tiếp tục thực hiện đề tài luận văn và hoàn thành chương trình cao học

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu và tập thể giảng viên Khoa Hóa, Trường ĐH Bách Khoa Đà Nẵng đã dạy bảo, chia sẻ, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình tôi, đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ tôi cả về tinh thần lẫn vật chất trong suốt quá trình học cao học cũng như làm luận văn

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!

Học viên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân

từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease vi sinh vật” là công trình nghiên cứu của

riêng tôi Các số liệu và tài liệu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn và tham chiếu đầy đủ

Học viên

Trần Văn Khiêm

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ

NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT

Học viên: Trần Văn Khiêm Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt - Hiện nay có một mối quan tâm tăng cao hướng đến việc sản xuất lượng lớn enzyme

protease từ vi sinh vật để thủy phân thịt đỏ cá ngừ - nguồn phế phẩm được tạo ra hằng năm trong ngành chế biến thủy sản thành các axit amin giá trị Hướng đến mục tiêu này, gen

nprC10 mã hóa protease trung tính NPRC10 từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10 đã được biểu

hiện trong vi khuẩn Escherichia coli M15 sử dụng hệ vector biểu hiện pQE30 Trong nghiên

cứu này, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy như nguồn nitơ, nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng đã được khảo sát Kết quả cho thấy hoạt tính protease cao nhất (6,694 U/mL)

thu được khi E.coli M15 mang plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường LB cải tiến

tại 370C với thời gian nuôi cấy sau khi cảm ứng bằng 1mM IPTG ở giá trị OD600 đạt 2-3 là 19h Protease sau khi tủa bằng ammonium sulphate 70% độ bão hòa có hoạt tính 31,725 U/mL, gấp 4,6 lần so với trước khi tủa Quan trọng hơn cả, hiệu suất thu hồi nitơ đạt 86% khi

sử dụng protease NPRC10 để thủy phân thịt đỏ cá ngừ với các thông số tối ưu (5 giờ thủy phân thịt đỏ cá ngừ, tỷ lệ enzyme/cơ chất = 1,6/100 (v/w) và nhiệt độ phản ứng là 500

C)

Từ khóa - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; thịt đỏ cá ngừ; hiệu

suất thu hồi nitơ

STUDY OF THE PRODUCTION OF PROTEIN HYDROLYSATE FROM

TUNA RED USING MICROBIAL PROTEASE

Abstract - There is an increasing interest toward production of large amount of microbial

protease to degrade protein-rich byproducts such as tuna red meat from fish processing

industry into valuable amino acids For this aim, the coding region of nprC10 gene corresponding to mature neutral protease (NPRC10) from Bacillus subtilis C10 was heterologously expressed in Escherichia coli M15 by using pQE30 expression system In this

study, various factors related to cultivation such as nitrogen source, IPTG concentration, induction time were investigated The result indicated that the highest activity of protease NPRC10 (6,694 U/mL) was obtained after induction by 1 mM IPTG at OD600 of 2-3 for 19h

at 370C with pepton as nitrogen source The precipitation by ammonium sulfate (70% saturation) offered protease activity of 31,725 U/mL, 4,6 times higher than activity of protease in culture filtrate More importantly, nitrogen recovery in soluble fraction was approximately 86% when using the purified protease NPRC10 to hydrolyse tuna red meat under optimized conditions (hydrolysis time: 5 hours; ratio of enzyme/tuna red meat:1,6/100 (v/w); hydrolysis temperature: 500C)

Key - protease; Bacillus subtilis; E.coli M15; ammonium sulfate; tuna red meat; nitrogen

recovery

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ THỊT ĐỎ CÁ NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE VI SINH VẬT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Cấu trúc của luận văn 3

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về protease 1

1.1.1 Giới thiệu chung 1

1.1.2 Phân loại enzyme protease 1

1.1.3 Nguồn thu nhận protease 3

1.1.4 Thu nhận enzyme 4

1.1.5 Thủy phân protein bằng enzyme protease 6

1.1.6 Ứng dụng của protease 8

1.2 Tổng quan về cá ngừ 11

1.2.1 Giới thiệu về cá ngừ 11

1.2.2 Thành phần hóa học của cá ngừ 12

1.3 Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp 14

1.3.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp 14

1.3.2 Hệ thống biểu hiện E coli 15

1.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp 17

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Chủng vi sinh vật 21

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị sử dụng 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp bảo quản giống 22

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy E.coli M15 22

2.2.3 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của E.coli M15 23

2.2.4 Phương pháp định tính protease 23

2.2.5 Khảo sát sự biểu hiện của vi khuẩn E coli M15 tái tổ hợp 23

2.2.6 Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu được từ quá trình nuôi cấy E.coli M15 24

2.2.7 Phương pháp kết tủa enzyme protease 25

2.2.8 Xác định các thông số phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp 25

2.2.9 Xử lý thống kê 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh enzyme protease của chủng vi khuẩn E.coli M15 28

3.1.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E.coli M15 28

3.1.2 Xác định khả năng sinh enzyme protease của vi khuẩn E.coli M15 29

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 của vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp 30

3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 của E coli M15 tái tổ hợp 30

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 của E coli M15 sau khi cảm ứng 31

3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 của E coli M15 32

3.3 Kết quả nghiên cứu quá trình kết tủa protease E.coli M15 34

3.4 Xác định các thông số của phản ứng ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp 36

3.4.1 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hiệu quả thủy phân bằng enzyme protease NPRC10 36

3.4.2 Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân bằng enzyme protease NPRC10 37

3.4.3 Xác định nhiệt độ phản ứng enzyme phù hợp 38

3.4.4 Kết luận khảo sát đơn biến 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

OD : Optical density – mật độ quang

U : Unit – Đơn vị hoạt độ protease

UV-Vis : Ultraviolet–visible spectroscopy – quang phổ tử ngoại khả kiến

v/w : volume/weigh – thể tích/khối lượng

MTTUCB : Môi trường tối ưu cơ bản

LB : Luria Bertani

B subtilis : Bacillus subtilis

E.coli : Escherichia coli

TCA : Trichloroacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật 2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số cá ngừ đại dương 12 Bảng 1.3 Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100 g thịt đỏ cá ngừ 13 Bảng 1.4 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ 13 Bảng 1.5 Hàm lượng các chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ 13

Bảng 3.2 Thông số phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng của E.coli M15 28

Hình 3.3 Ảnh hưởng của môi trường lên hoạt độ protease 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng lên hoạt độ protease 31 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng lên hoạt độ protease 33 Hình 3.6 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme protease 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng nitơ tổng số

trong dịch đạm và hiệu suất thu hồi nitơ từ thịt đỏ cá ngừ

36

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ 37

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ

(%) khi thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease

NPRC10

38

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cá ngừ (tuna) là nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học và giá trị kinh tế cao Theo Báo cáo xuất khẩu thủy sản Việt nam Quý II, năm 2011, Việt Nam xuất khẩu gần 31 nghìn tấn cá ngừ, trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% về khối lượng và 36,5% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái Hiện nay, có 87 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu cá ngừ sang 73 thị trường thế giới Trong công nghiệp chế biến cá ngừ, thành phần khối lượng của thịt cá ngừ chiếm khoảng 60%, phần còn lại là phế phẩm như đầu, xương, vây, thịt vụn… Phần thịt thu nhận được sau quá trình chế biến bao gồm phần thịt trắng được dùng để chế biến thành các mặt hàng như fillet, đồ hộp

và xông khói, còn phần thịt đỏ được loại bỏ do có chứa thành phần gây dị ứng Tùy theo loài, khối lượng phần thịt đỏ bị loại bỏ có thể lên tới 6,4% [13] Ước tính lượng thịt đỏ cá ngừ này ở Việt Nam khoảng 1.000 tấn/năm Quan trọng hơn nữa, phần thịt

đỏ này có chứa hàm lượng protein tương đối cao (14%) Nếu lượng thịt đỏ này không được xử lý hết trước khi thải ra môi trường ngoài thì sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường [41] Do đó, để giải quyết vấn đề nêu trên, hiện nay rất nhiều nhà nghiên cứu đang quan tâm đến giải pháp sử dụng enzyme protease để biến đổi nguồn protein trong thịt đỏ cá ngừ thành các axit amin Đây là giải pháp không chỉ giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường nêu trên, mà còn góp phần tạo ra sản phẩm dinh dưỡng giá trị cao

Enzyme Protease là enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, dược, nông nghiệp…Trong công nghiệp thịt, protease từ lâu đã được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn… Hiện nay, có nhiều nghiên cứu sử dụng enzyme protease

(-CO-để thủy phân các nguồn nguyên liệu giàu protein tạo ra axit amin hướng đến muc tiêu sản xuất dịch đạm thủy phân So với phương pháp sử dụng axit hay bazơ cho mục đích này, phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm vượt trội hơn Bởi lẽ, quá trình thuỷ phân bằng axit sẽ làm mất đi hoàn toàn các acid amin chứa lưu huỳnh, và quá trình thủy phân bằng bazơ thường tạo ra các sản phẩm kém giá trị do quá trình raxemic hoá (chuyển axit amin dạng L sang axit amin dạng D làm giảm giá trị sinh học của acid amin) Ưu điểm của việc thuỷ phân protein bởi enzyme protease là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân [12]

Hiện nay, trên thế giới và tại Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ, đặc biệt là việc tìm cách sử dụng nguồn phế phẩm này để phục vụ cho cuộc sống con người Các nghiên cứu này phát triển theo hướng sử dụng chính enzyme protease nội tại trong con cá ngừ hoặc enzyme thương mại để thủy phân thịt đỏ cá ngừ nhằm thu hồi protein [10, 13, 20, 38, 43] Tuy nhiên, khi sử dụng enzyme nội tại thì khả năng thủy phân không cao, còn với enzyme thương mại thì không hiệu quả về mặt kinh tế

Chính vì vậy, đề tài này đặt ra mục tiêu nghiên cứu khả năng thủy phân protein trong thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất cũng như nâng cao khả năng thủy phân thịt đỏ cá ngừ

2 Mục đích nghiên cứu

- Biểu hiện gen nprC10 mã hóa protease từ Bacillus subtilis C10 trong chủng E

coli M15 nhờ hệ thống vector pQE 30 nhằm thu nhận enzyme protease tái tổ hợp

- Xác định hoạt độ enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus subtilis C10

trên cơ chất thịt đỏ cá ngừ

- Thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Sản xuất chế phẩm enzyme protease npr C10 từ Bacillus subtilis C10 bằng vi khuẩn E coli M15 tái tổ hợp

- Khảo sát các thông số thực hiện phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ thu mua trên địa bàn Đà Nẵng bằng enzyme protease tái tổ hợp

- Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vi sinh

- Nuôi cấy tế bào E coli M15

Phương pháp hóa sinh

- Xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp Anson cải tiến [12]

- Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford (1976) [29]

- Xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô theo phương pháp Kjeldahl [57]

Phương pháp th ng ê v s i u

- Phương pháp xử lý số liệu: Tất cả số liệu được xử lý bằng excel

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa hoa học

Cung cấp quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme

protease tái tổ hợp dựa trên các thông số ảnh hưởng đến quá trình thủy phân được khảo sát trong nghiên cứu (tỉ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng)

- Thịt đỏ cá ngừ giàu protein nếu thải ra môi trường là điều kiện thích hợp cho

vi sinh vật có hại phát triển Việc nghiên cứu chế biến thịt đỏ cá ngừ nếu thành công

có thể góp phần ngăn ngừa nguy cơ gây ô nhiễm môi trường

6 Cấu trúc của luận văn

Luận văn gồm có những chương mục sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về protease

1.1.1 Giới thi u chung

Nhóm enzyme protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit NH) trong phân tử protein và polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là axit amin Ngoài

(CO-ra nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptit

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, quá trình đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormone và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng [6]

1.1.2 Phân oại enzyme protease

Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất

Việc phân loại enzyme protease có thể căn cứ vào các tiêu chí như sau [23]:

- Cơ chế phản ứng của enzyme protease tham gia

- pH tối thích cho hoạt động của enzyme gồm protease acid, protease kiềm hay protease trung tính

- Những vị trí khu trú của enzyme như enzyme protease nội tạng, enzyme protease cơ thịt

Theo Barett và Donald (1956), protease được chia ra thành hai nhóm lớn là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase

- Nhóm 1: Endopeptidase là các enzyme protease phân cắt các liên kết peptide nằm trong mạch polypeptide Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn phân nhóm:

+ Phân nhóm 1: Protease - Serin là những protease mà trong trung tâm hoạt

động của nhóm enzyme này có nhóm (- OH) của acid amin Serin Phân nhóm này gồm các enzyme như Trypsin, Chymotrypsin

+ Phân nhóm 2: Protease - Cystein là những protein mà trong trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này có nhóm thiol (- SH) của acid amin Cystein Phân nhóm này gồm các enzyme Cathepsin

+ Phân nhóm 3: Protease - Aspartic là những protease mà trong trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này có nhóm carboxyl (- COOH) của acid amin Aspartic như Pepsin

+ Phân nhóm 4: Protease - kim loại là những protease trong trung tâm hoạt động của nhóm này có ion kim loại Nhóm enzyme này hoạt động trong môi trường trung tính

- Nhóm 2: Exopeptidase là nhóm enzyme protease có khả năng thủy phân liên kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu amine hoặc đầu carboxyl, tuần

tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

- Aminopeptidase: Là những protease xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu nitơ tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một tripeptide

- Carboxypeptidase: Là những protease xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu cacbon của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một tripeptide

Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật

TTHĐ

pH tối thích

Nhóm Nguồn gốc E Chất kìm hãm Đặc điểm

TTHĐ

pH tối thích

Cystein Clostridium histoly-ticum

octa-Kim loại hóa trị hai

Trung tính

1.1.3 Nguồn thu nhận protease

Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng chủ yếu vẫn là ba nguồn chính: động vật (có nhiều ở gan, dạ dày bê ), thực vật (đu đủ, dứa ) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus)

- Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và sử dựng từ hàng ngàn năm trước để phục vụ đời sống hằng ngày Nhưng hiện nay, lượng enzyme protease thu nhận từ động vật và thực vật được thay thế từ vi sinh vật Do, nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật, như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống

- Mặt khác, enzyme có nguồn từ vi sinh vật có những ưu điểm hơn như sau:

o Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần

o Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

o Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu nhận được lượng lớn sinh khối, giúp trong thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc các sản phẩm trao đổi chất cao

o Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều

o Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài

o Nguồn nguyên liệu dùng cho việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật thường rẻ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống Bên cạnh đó, vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme từ nhiều nguồn khác nhau

o Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [7]

1.1.4 Thu nhận enzyme

Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó, để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chưa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator)

Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…và chất detergent Các hóa chất

có tác dụng cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường có chứa mỡ

Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính để tách enzyme

ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên Dịch chiết thu đươc, người ta gọi là chế phẩm enzyme thô Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này, ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme, các thành của tế bào

Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều protein và

các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp

Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây tủa protein enzyme để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hòa tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp

Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dung môi hữu

cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein Nồng độ của các dung môi gây kết tủa protein thường từ 80% (v/v) trở lên Sự kết tủa có thể chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi Dung môi hữu cơ sau đó có thể được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không, hay thậm chí trong không khí

Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thô, người ta cũng có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfate, do muối này có mức độ hòa tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme Một số ưu điểm nữa của muối này là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó

sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất đi tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số enzyme kém bền Hạn chế của phương pháp sử dụng muối ammonium sulfate chính là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của dung môi lớn, để kết tủa được các protein cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo

- Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường…là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sphadex

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tính có chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hập phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng) Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy

vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình công nghệ

sau này (ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da) Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học

Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài, do đó khi tách và tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein ảnh hưởng lớn đén hoạt tính enzyme, cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp, không có mặt các chất gây biến tính enzyme [6]

1.1.5 Thủy phân protein bằng enzyme protease

Để thủy phân protein có thể dùng phương pháp hóa học như dùng acid HCl hoặc NaOH Tuy nhiên, quá trình thủy phân bằng phương pháp hóa học làm phá hủy một phần hoặc phá hủy hoàn toàn các acid amin thiết yếu Do vậy trong công nghiệp thực phẩm thường dùng phương pháp thủy phân bằng enzyme Việc sử dụng enzyme

có nhiều ưu điểm như không có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ thấp nên ít ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và tiêu tốn năng lượng ít

Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương (dispositive bonds)trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn giản dưới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của các yếu tố nước trong phản ứng [22] Dưới sự xúc tác của enzyme protease, quá trình thủy phân protein diễn ra như sau:

Protein → polypeptide → peptone → peptide → acid amin Như vậy, sản phẩm thủy phân protein gồm các polypeptide, peptone, peptide và acid amin Tùy thuộc vào từng loại enzyme protease khác nhau cũng như chế độ thủy phân khác nhau mà sản phẩm thủy phân thu được các thành phần có tỷ lệ cũng khác nhau

a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme

Quá trình thủy phân chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất và enzyme, sự có mặt hay không có mặt của chất hoạt hóa và chất kìm hãm, lượng nước thêm vào

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc sự nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme Ở nhiệt độ thấp hơn 100C sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme nhưng nếu thấp quá thì enzyme sẽ mất hoạt động Nhiệt

độ từ 600C trở lên đa số enzyme sẽ giảm hoặc ngừng hoạt động Đa số enzyme mất hoạt tính xúc tác ở nhiệt độ cao hơn 800C, trừ Papain, Myokinase có thể tồn tại ở

1000C Nhiệt độ thích hợp của enzyme thông thường từ 30 – 500C Trong vùng nhiệt

độ thích hợp nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân tăng 1,5÷2 lần Nhiệt độ thích hợp của enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH, cơ chất [23]

- Ảnh hưởng của pH: Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị

pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân

tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Như vậy enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất

ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích pH tối thích của mỗi enzyme không cố định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ pH tối thích của

đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ có một số enzyme hoạt động tối thích nằm trong vùng acid mạnh hay kiềm mạnh Cùng một loại enzyme nhưng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau [23]

- Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme: Khi môi trường có đầy đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với lượng enzyme Khi nồng độ cơ chất thấp, không đủ để lôi kéo tất cả lượng enzyme vào phản ứng thì tốc độ phản ứng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng đạt tối đa khi tất cả enzyme đều kết hợp vào cơ chất [23]

- Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm enzyme: Những chất nào có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme thì được gọi là chất hoạt hóa enzyme Các chất đó thường là các ion kim loại như: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, Co 2+, Zn2+, Mn2+, …

Sự hoạt động của các enzyme đều có thể bị kìm hãm bởi các tác động gây biến tính protein [23]

Đối với muối ăn (NaCl) khi cho vào hỗn hợp thủy phân thì sẽ làm thay đổi hoạt

độ của nước (aw), dẫn đến ảnh hưởng hoạt động sống của vi sinh vật Vì vậy trong thủy phân người ta thường dùng NaCl để khống chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa

Do khả năng chịu muối của enzyme thủy phân tốt hơn vi sinh vật cho nên trong phạm vi

độ mặn nhất định enzyme vẫn có tác dụng thủy phân protein, thậm chí trong môi trường muối bão hòa enzyme vẫn hoạt động được nhưng tác dụng thủy phân rất chậm [11]

- Ảnh hưởng của tỷ lệ nước: Đối với phản ứng thủy phân bởi enzyme, nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng Nước không những có ảnh hưởng đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Việc bổ sung thêm nước là tạo môi trường lỏng giúp cho enzyme hoạt động được dễ dàng, làm tăng khả năng thủy phân Nếu lượng nước cho vào quá ít, tác dụng thủy phân của enzyme kém, nếu lượng nước bổ sung

thêm quá nhiều không khống chế được quá trình thối rữa Như vậy có thể dùng nước làm nhân tố để tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thủy phân có xúc tác enzyme [5] Lượng nước bổ sung vào cho quá trình thủy phân là tùy thuộc vào đặc điểm của nguyên liệu

- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân, thời gian thuỷ phân càng dài thì protease càng có điều kiện thuỷ phân cơ chất càng triệt để Nhưng nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ dẫn tới vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra càng nhiều các sản phẩm thứ cấp như:

NH3, H2S, CO2, indol, … Nếu thời gian thủy phân rút ngắn, quá trình thuỷ phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu Trong quá trình thủy phân, tốc độ của quá trình xảy ra mạnh mẽ trong thời gian đầu, càng về sau

do nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản phẩm tạo thành tăng, đồng thời do độ bền của enzyme giảm theo thời gian nên tốc độ của phản ứng thủy phân giảm dần [23]

- Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Trong quá trình thủy phân yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là diện tích tiếp xúc Để tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra tốt hơn bằng cách làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân [23]

1.1.6 Ứng dụng của protease

1.1.6.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Protease được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau

để tạo nên sự thay đổi về mùi vị, kết cấu và hình dạng của sản phẩm [14], ví dụ như

sản xuất phomát, sản xuất bia, làm bánh nướng, chế biến cá, sản xuất và làm mềm thịt

- Chế biến phomat

Với mức độ tăng trưởng nhanh của ngành công nghiệp sản xuất phomát, lượng

rennin thu nhận từ dạ dày bê và các protease từ các chủng vi sinh vật như Mucor miehi,

B subtilis và Endothia parasitica được đưa vào sản xuất, tuy nhiên vẫn không đáp ứng

đủ nhu cầu sử dụng Do đó, công nghiệp sản xuất rennin đã thu hút sự chú ý của công nghệ gen để tạo ra nguồn enzyme thay thế Gen mã hóa prochymosin (chymosin B) đã

được chuyển vào một số cơ thể vật chủ là vi sinh vật như E coli, Saccharomyces

cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei… Hiện nay, có nhiều loại chymosin

tái tổ hợp đã được sản xuất ở qui mô thương mại bao gồm Maxiren (Hãng Gist

Brocades, Hà Lan sử dụng A niger làm vật chủ) và Chymax (Pfizer, Mỹ sử dụng E

coli làm vật chủ) [16] Vai trò chủ yếu của các enzyme này trong sản xuất phomát là

thủy phân liên kết peptide đặc hiệu (Phe 105-Met 106) tạo ra para-k-casein và các

macropeptide, dẫn đến đông tụ sữa [25]

- Sản xuất bia

Bia là sản phẩm lên men từ lúa mạch với hàm lượng tinh bột và protein cao Trong quá trình đường hóa, ngoài tác dụng của amylase chuyển hóa tinh bột thành đường, tham gia vào quá trình lên men còn có sự hiện diện của protease thủy phân protein đại mạch thành dạng hòa tan ổn định vào dịch đường và bia nhằm nâng cao giá trị sinh học của bia thành phẩm Vì vậy, người ta thường sử dụng phối hợp các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật như: α-amylase, protease, enzyme chuyển hóa diacetyl thành acetoin… [3]

Sản xuất dịch đạm: Keratin-thành phần protein trong da, lông vũ được dùng để sản xuất dịch đạm nhờ chế phẩm keratinease thu nhận được từ quá trình nuôi cấy

Streptomyces fradiae - Nếu dùng axit để thuỷ phân sẽ làm mất đi hoàn toàn các axit

amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm sẽ làm giảm giá trị sinh học của các axit amin do quá trình raxemic hoá gây ra (chuyển axit amin từ dạng L sang dạng D) Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme protease là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân Trong nghên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế, để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và phổ tác dụng rộng Do vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân [12]

- Sản xuất các sản phẩm đậu

Giá trị dinh dưỡng của bột đậu nành thường bị hạn chế do các yếu tố phản dinh dưỡng như chất ức chế trypsin và lectin, các chất này có tác dụng ngăn cản sự tiêu hóa

protein [56] Do đó, khi bổ sung protease từ B subtilis đã làm tăng hàm lượng chất hòa

tan và giảm mức độ ức chế trysin trong bột đậu nành Marsman và cộng sự (1997) nhận thấy rằng enzyme neutrase có thể thủy phân được β-conglycinin [3]

thêm về công nghệ [14]

1.1.6.2 Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Các enzyme dùng trong công nghiệp tẩy rửa chiếm khoảng 40% thị trường enzyme công nghiệp trên thế giới, trong đó protease chiếm khoảng 25% Nhiều protease kiềm thích hợp với sản xuất bột giặt đã được tìm thấy như subtilisin

(E.C.3.4.21.14) ở các chủng Bacillus được sử dụng những năm 1960, acalase và

savinase (Novozymes), maxacal và purafect (Genencor), KAP (Kao) và blap (Henkel) Hiện nay, tất cả protease dùng để sản xuất bột giặt được sử dụng trên thị trường là

serine protease của các chủng Bacillus [25]

1.1.6.3 Trong công nghiệp thuộc da

Các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như sodium sulfide, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường Protease được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da [28] Trước đây, để làm mềm da người ta thường dùng protease có trong cơ

quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease của vi khuẩn (B

mesentericus, B subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (Streptomyces griceus, S rimosus) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần

chiếm một vị trí quan trọng [12]

1.1.6.4 Trong y học

Protease được sử dụng làm thuốc chống tắc nghẽn mạch máu, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm làm tăng tiêu hóa protein, là thành phần của các loại thuốc dùng điều trị các bệnh da liễu và mỹ phẩm, ngoài ra protein còn được dùng để sản xuất môi trường để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… và cô đặc tinh chế thành các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh [2]

1.1.6.5 Trong xử lý ô nhiễm môi trường

Chất thải từ các khu công nghiệp và chất thải sinh hoạt là nguyên nhân chính góp phần gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Trong thành phần của các chất thải này chứa một lượng lớn protein là nguyên nhân gây ra các hiện tượng phú dưỡng, ảnh hưởng đến các loài động thực vật sống ở các sông hồ mà chất thải này đổ vào Sử dụng biện pháp sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường, và giúp phân hủy những loại chất thải có hại thành vô hại

1.1.6.6 Trong công nghiệp dệt

Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được làm bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm

Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng [12]

1.2 Tổng quan về cá ngừ

1.2.1 Giới thi u về cá ngừ

Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở biển

Việt Nam Cá ngừ phân bố ở khắp các vùng biển Việt Nam, kích thước cá tương đối lớn (6 loài có kích thước từ 20 - 70 cm, khối lượng từ 0,5 - 4 kg Riêng hai loài cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to có kích thước lớn 70 - 200 cm, khối lượng 1,6 - 64 kg) [17]

Cá ngừ (tuna) là nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dưỡng, giá trị sinh học và giá trị kinh tế cao Theo Báo cáo xuất khẩu thủy sản Việt nam Quý II, năm 2011, Việt Nam xuất khẩu gần 31 nghìn tấn cá ngừ, trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% về khối lượng và 36,5% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái Hiện nay, có 87 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu cá ngừ sang 73 thị trường thế giới [1] Tuy nhiên, ở thị trường Châu Âu chủ yếu ưa chuộng cá thịt trắng (cá tra), trong khi cá thịt đỏ như cá ngừ chỉ chiếm số lượng ít [1] Vì vậy, cá ngừ cần được qua công đoạn chế biến thành các thành phẩm khác phục vụ cho nhu cầu của con người

Hình 1.2 Một số loại cá ngừ

Trong công nghiệp chế biến cá ngừ, thành phần khối lượng của thịt cá ngừ chiếm khoảng 60%, phần còn lại là phế phẩm loại ra trong quá trình chế biến, gồm: đầu, xương, vây, thịt vụn… Phần khối lượng thịt được chế biến bao gồm cả phần thịt trắng và thịt đỏ, tuy nhiên, người ta chủ yếu sử dụng phần thịt trắng hay sáng màu để

chế biến thành các mặt hàng như fillet, đồ hộp và xông khói, còn phần thịt đỏ được loại bỏ Tùy theo loài, kích thước mà phần thịt đỏ bị loại bỏ có thể lên tới 6,4% [13] Ước tính lượng thịt đỏ cá ngừ này ở Việt Nam khoảng 1.000 tấn/năm Nếu lượng thịt

đỏ này không được xử lý hết trước khi thải ra môi trường ngoài thì sẽ gây ảnh hưởng tới môi trường, đây là một trong các vấn đề nghiêm trọng đòi hỏi tất cả các nhà máy chế biến thủy hải sản quan tâm giải quyết Thêm vào đó, phần thịt đỏ này có chứa hàm lượng protein cao (14%) [42]

1.2.2 Th nh phần hóa học của cá ngừ

Năm 2006, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản do Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam chủ trì đã công bố thành phần hóa học của một

số loài cá ngừ đại dương như mô tả trong bảng 1.2 [4]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số cá ngừ đại dương

Loài Nước (%) Protein (%) Lipid (%) Tro (%)

xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não do máu đóng cục EPA có tác dụng chống lại cholesterol và loại bỏ ra khỏi máu [4]

Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, acid amine tự do, carbohydrate và một số chất khoáng Bên cạnh đó, màu sắc của thịt đỏ là do các hợp chất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng của chúng trong thịt đỏ cá ngừ cao hơn gấp 5 lần so với thịt trắng [34] Thịt đỏ dễ bị biến

đổi màu sắc do sự oxi hóa nguyên tử sắt trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc với không khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+

Hàm lƣợng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ đƣợc trình bày trong bảng 1.4 sau:

Bảng 1.4 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ [50]

Hàm lƣợng một số chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ đƣợc thể hiện trong bảng 1.5 sau:

Bảng 1.5 Hàm lượng các chất khoáng có trong thịt đỏ cá ngừ [50]

Việc sử dụng nguồn protein thịt đỏ để tạo ra dịch đạm với hàm lượng axit amin cao, dễ hấp thu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sẽ vừa làm tăng giá trị dinh dưỡng, vừa làm tăng giá trị kinh tế cho sản phẩm

1.3 Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp

1.3.1 Công ngh DNA tái tổ hợp

Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân

tử Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA [9]

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp bắt đầu bằng sự khám phá ra các enzyme hạn chế trong những năm đầu 1970 Đây là sự phát triển then chốt, không chỉ cho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình mà ngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning) Phương thức tạo dòng này đã báo hiệu một kỷ nguyên

mới trong thao tác, phân tích và khai thác các phân tử nucleic acid [8]

Năm 1980, chủ tịch của Novo Nordisk’s Bioindustrial Group (BIG) (Bagsvaerd, Denmark) đã công bố trong vòng 5 năm hầu hết các enzyme công nghiệp

sẽ được sản xuất bằng việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Bốn năm sau, hơn 50% enzyme công nghiệp trên thị trường được cung cấp bởi các quá trình tái tổ hợp [40] với doanh thu đạt 140 triệu USD [63]

Vào những năm 1990, nhiều enzyme đã được sản xuất bởi công nghệ DNA tái

tổ hợp Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chủ động về nguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu; nâng cao hiệu suất sản xuất, chất lượng của enzyme; dễ dàng công nghệ hóa quá trình sản xuất và nhờ đó làm giảm giá thành sản phẩm Để sản xuất enzyme tái tổ hợp, các nhà nghiên cứu phải tạo dòng được gen mã hóa cho enzyme quan tâm, thiết lập hệ thống biểu hiện và tiếp theo là cải tiến hệ thống biểu hiện để enzyme được sản xuất nhiều hơn theo một cơ chế điều hòa đơn giản [15] Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Năm 2002, có khoảng 140 protein được dùng để chữa bệnh có nguồn gốc từ các quá trình tạo dòng và biểu hiện gen được thừa nhận ở Mỹ và Châu Âu, trong đó chủ yếu là các enzyme [33] Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm

và tinh bột là các sản phẩm tái tổ hợp [32] Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp mà việc

sản xuất phytase từ nấm A niger được sử dụng như một loại thức ăn cho khoảng 50%

tổng số lợn ở Hà Lan, tăng 1.000 lần so với phương pháp sản xuất truyền thống [36]

Chính sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực DNA tái tổ hợp giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn về cấu trúc và hoạt động của các gen, các bộ gen của prokaryote và eukaryote trở thành kỹ thuật sản xuất trực tiếp tạo ra hàng loạt chế phẩm y-sinh học hữu ích từ các tế bào vi khuẩn, nấm men và tạo ra các giống sinh vật mới góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn đặt ra trong y học và trong công tác chọn tạo giống [8]

1.3.2 H th ng biểu hi n E co i

1.3.2.1 Hệ thống vật chủ E coli

Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy mật độ cao, nhiều protein tái tổ hợp được sản xuất với lượng thích hợp để nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống Việc sản xuất các protein tái tổ hợp có thể được thực hiện bằng nhiều hệ thống vật chủ biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và các tế bào động vật có

vú, trong đó, hệ thống biểu hiện sử dụng tế bào vi khuẩn E coli được ưa chuộng nhất Một trong những lý do là vì thao tác kỹ thuật với E coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở

mọi phòng thí nghiệm Mặt khác, vi khuẩn này có tốc độ sản xuất nhanh, sinh khối lớn

và dễ dàng nuôi cấy trên các môi trường đơn giản [31] Genome của chúng có thể được cải tiến một cách nhanh chóng và chính xác Sử dụng hệ thống này có thể tránh được sự

kết hợp của các amino acid hình thành liên kết disulfide nội bào E coli có thể tích lũy

protein tái tổ hợp lên đến 80% khối lượng khô của chúng và sống được trong nhiều điều

kiện môi trường khác nhau [66]

Bên cạnh những ưu điểm, hệ thống vật chủ E coli cũng tồn tại một vài khó

- Sự sản xuất protein tái tổ hợp trong E coli thường gặp trở ngại rất lớn là sự

phân hủy protein tái tổ hợp bởi các protease tồn tại trong tế bào

- Sản sinh độc tố và sự phân chia plasmid không ổn định

Hiện nay có rất nhiều chủng E.coli đã được tiêu chuẩn hóa cho quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp và có sẵn trên thị trường như E coli BL21, E coli K12, E coli M15 Chủng E coli M15 [pREP4] cho phép mức độ biểu hiện protein cao, điều hòa chặt chẽ và dễ dàng thực hiện bằng hệ thống vector pQE Đây là biến chủng của E

coli K12 và có kiểu hình NalS, StrS, RiS, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, RecA+, Uvr+,

Lon+ Chủng này chứa vector pREP4 mang gen lac I mã hóa cho repressor Lac I có vai

trò ức chế sự phiên mã của gen đích nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm tính khi không có chất cảm ứng [62]

1.3.2.2 Họ vector pQE

Quá trình biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào E coli M15 sử dụng hệ vector pQE đƣợc thực hiện dựa trên hoạt động điều hòa của promoter T5 Các plasmid này có các đặc điểm sau:

- Chứa vùng gắn ribosome (RBS) nhân tạo làm tăng tốc độ dịch mã

- Có trình tự mã hóa cho đuôi 6xHis ở đầu 5’ hoặc 3’ của vùng tạo dòng

- Có vùng đa nối và các trình tự kết thúc trong tất cả các vùng đọc mở thuận lợi cho quá trình thiết kế cấu trúc vector biểu hiện

- Chứa hai nhân tố phiên mã mạnh (to và T1) giúp đảm bảo độ bền của cấu trúc biểu hiện

- Chứa gen beta-lactamase (bla) mã hóa cho yếu tố kháng ampicilline ở nồng độ

100 µg/ml

- Chứa điểm khởi đầu sao chép ColE1 [62]

Quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp sử dụng hệ vector pQE đƣợc cảm ứng bởi IPTG IPTG gắn lên protein ức chế và bất hoạt nó Một khi chất ức chế bị bất hoạt, enzyme RNA polymerase của vật chủ biểu hiện có thể phiên mã trình tự đích Các đoạn phiên mã đƣợc tạo ra sẽ đƣợc dịch mã thành các protein tái tổ hợp Hệ thống operator kép trong hệ vector pQE kết hợp với chất ức chế đảm bảo điều hòa chặt chẽ mức độ phiên mã [62]

Hệ thống vector biểu hiện pQE đang ngày càng đƣợc nghiên cứu rộng rãi và sử

dụng phổ biến với vật chủ E coli M15

Trong nghiên cứu này, vector pQE30 đƣợc lựa chọn cho mục đích biểu hiện

enzyme protease nprC10 trong hệ vật chủ E coli M15

Hình 1.3 Vector pQE

1.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng enzyme protease để thủy phân protein từ các nguồn cơ chất khác nhau, nhằm sản xuất ra các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và dễ hấp thụ

Quá trình thủy phân phụ phẩm cá tra bằng việc sử dụng enzyme protease từ

Bacillus subtilis, một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, có thể tổng hợp được

nhiều loại enzyme cần thiết (amylase, hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…) trong quá trình sống để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện môi trường (E.El Mayday và cộng sự, 1989) đang được quan tâm nghiên cứu và có nhiều triển vọng để ứng dụng trong sản xuất trên thực tế [46]

Herpandi và cộng sự (2012) đã tiến hành thủy phân protein cá ngừ vằn

(Katsuwonus pelamis) bằng các enzyme protease thương mại khác nhau

(Alcalase®2.4L FG, Protamex®, Neutrase® 1.5MG và Flavourzyme® 500MG) nhằm đánh giá mức độ thủy phân và hàm lượng tryptophan tự do trong dịch thủy phân Tác giả đã thực hiện quá trình thủy phân ở thời gian 60, 120, 180 và 240 phút với tỷ lệ enzyme/nguyên liệu lần lượt là 0.5, 1, 1.5 và 2% Kết quả cho thấy thời gian lâu hơn với nồng độ enzyme cao hơn đã làm tăng mức độ thủy phân Alcalase®2.4L FG có mức thủy phân cao nhất trong số các protease, sau đó là Protamex®, Flavourzyme® 500MG và Neutrase® 1.5MG Hàm lượng tryptophan tự do tăng tuyến tính theo mức gia tăng hàm lượng enzym protease Thời gian thủy phân càng lâu, hàm lượng của tryptophan càng cao [39]

Năm 2002, Guerard và cộng sự đã sử dụng protease thương mại "Umamizyme"

để tạo dịch thủy phân từ phế phẩm trong công nghiệp sản xuất cá hộp Sự thủy phân enzyme được tiến hành trong bình lên men 1 L ở pH 7 và 450C Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất (từ 0,1 đến 1,5% (w/w)) liên quan đến mức độ thủy phân, hàm lượng nitơ tạo ra và trọng lượng phân tử của các peptide đã được khảo sát Kết quả cho thấy,

độ thủy phân lên đến 22,5% khi tỷ lệ enzyme/cơ chất là 1,5% đạt được sau 4 giờ thuỷ phân Một mối tương quan tuyến tính giữa mức độ thủy phân và sự thu hồi nitơ đã được ghi nhận Kết quả cho thấy enzyme protease "Umamizyme" thủy phân phế thải

từ quá trình chế biến cá ngừ có tính hiệu quả tương đương Alcalase® 2,4L Tuy nhiên,

độ ổn định của Umamizyme thấp hơn Alcalase® 2,4L [35]

Ovissipour cùng các cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân chất

thải nội tạng của cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) vào năm 2010 Tác giả đã chỉ

ra rằng điều kiện tối ưu để đạt đến mức thủy phân cao nhất là: nhiệt độ 60,40C, thời gian 90,25 phút và hoạt tính protease (Alcalase 2.4 L) là 70.22 AU/kg protein Protein

nội tạng của cá ngừ đã sấy khô có hàm lượng protein tương đối cao (72,34%) và hàm lượng lipid thấp (1,43%) Ngoài ra, tỷ lệ hiệu suất protein của thủy phân nội tạng cá ngừ là 2,85-5,35 [58]

Ở Mỹ, Le Blanc và cộng sự (2005) đã thủy phân cá ngừ (Katsuobushi

oligopeptide – KO) làm tăng hương vị của bột gia vị và có thể được sử dụng để thay

thế muối trong thực phẩm và đồ uống Đây là một trong những ứng dụng của Mỹ để sản xuất bột gia vị có hàm lượng dinh dưỡng cao [43]

Ở Malaysia, Herpandi và cộng sự (2011) cho rằng trong quá trình chế biến cá ngừ hộp, chỉ khoảng một phần ba cá được sử dụng, tạo ra khoảng 70% chất thải rắn Chất thải này bao gồm cơ bắp (sau thắt lưng), nội tạng, mang, thịt đỏ, đầu, xương và

da Nhóm đã nghiên cứu tận dụng các phế phẩm này để sản xuất thực phẩm chức năng cũng sử dụng chính các enzyme nội tại trong ruột cá để thủy phân [38]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về khả năng thủy phân của enzyme protease đã được tiến hành

từ những năm đầu thế kỷ 21 Năm 2006, Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt đã thu nhận

được enzyme protease từ ruột cá ba sa (Pangasius bocourti) với hoạt tính cao nhất là

15,79 UI/g CKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1 (w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút [18]

Sau đó, Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân phụ

phẩm cá tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) Tác giả đã thu được

dịch thủy phân đạt chất lượng tương đối tốt cấp 1 theo tiêu chuẩn chất lượng nước mắm Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease

từ Bacilus subtilis là ở nhiệt độ 500C; pH 7,6; hàm lượng nước 30%; nồng độ muối 2%, 50UI enzyme và thời gian thủy phân 18 giờ [21]

Người tiên phong trong việc ứng dụng DNA tái tổ hợp liên quan đến enzyme protease là Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự (2011) Tác giả đã biểu hiện thành công gen

nprC10 mã hóa cho enzyme protease trung tính (NPRC10) từ Bacillus subtilis C10

trong hệ thống tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng

của một số yếu tố như mật độ tế bào (OD600) trước khi bắt đầu cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), thời gian cảm ứng, nhiệt độ ủ sau cảm ứng, tinh bột hòa tan và nồng

độ Ca2+ ion đối với biểu hiện và tính ổn định NPRC10 ngoại bào đã được khảo sát Kết quả cho thấy hoạt tính của protease trong dịch enzym thô thu được cao nhất là 331,97 IU/mg khi canh trường nuôi cấy được cảm ứng bằng 0,1 mM IPTG tại OC600 =2 trong

19 giờ ở 200C, bổ sung 1.5% nồng độ tinh bột hòa tan và 10 mM nồng độ Ca2+

[52] Sau đó, cũng chính tác giả Nguyễn Hoàng Lộc (2012) đã sản xuất protease trung tính (NPRC10) thông qua nuôi cấy chìm trong thùng lên men 14-L Kết quả cho

thấy sản xuất NPRC10 tối đa đạt được sau 44 giờ lên men theo chu kỳ: sục khí 4L/phút, khuấy 500 vòng/phút và tỷ lệ giống 1% Hoạt tính protease cao nhất trong quá trình lên men thời gian là 103 đơn vị/mL [54]

Để nâng cao độ tinh sạch protease (NPRC10), vào năm 2013, Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tách và tinh sạch protease trong hệ thống hai pha lỏng polyethylene glycol (PEG)/potassium phosphate Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân chia enzyme trong các hệ thống này, bao gồm trọng lượng và khối lượng phân tử PEG, nồng độ kali phốt phát, thời gian ủ và nhiệt độ, và pH đã được khảo sát Điều kiện tối ưu của việc chiết xuất enzyme bằng hệ thống hai pha chính là 35% PEG 6000/30% Kali phốt phát (pH 6,5) ở 300C trong 25 phút Hệ số phân chia của protease (Kprotease) là 4.69 với hiệu suất phân chia (Y) là 94.93%, độ tinh sạch (PF) là 1.7, và hoạt độ riêng của protease (SAprotease T) thu được là 694.61 đơn vị/mg protein trong giai đoạn đầu Protease, được tập trung ở pha trên, được pha trộn thêm với 35% kali phosphate kết hợp với 3% kali clorua ở nhiệt độ phòng để làm sạch pha đáy (pha giàu muối) Sử dụng bước này, độ tinh sạch của enzyme đạt được giá trị cao hơn 2,38 với hiệu suất thu hồi là 76,17% và SAprotease B là 983,04 đơn vị/mg protein [51]

Trên quy mô pilot, enzyme protease (NPRC10) cũng được tác giả Nguyễn Hoàng Lộc sản xuất và ứng dụng để sản xuất thành công nước chấm (2012) Đề tài cấp tỉnh này đã xây dựng thành công quy trình sản xuất nước chấm từ bột đậu nành và sản phẩm đã đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm [24]

Nghiên cứu theo hướng sử dụng enzyme protease thương mại đã được Nguyễn Thị Mỹ Hương thực hiện trên phụ phẩm đầu cá ngừ vây vàng vào năm 2012 Kết quả thu được sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein 88,2%, lipid1,4% và tro 8,3% cũng như hàm lượng acid amin không thay thế cao (chiếm 56,31% tổng lượng acid amin) khi sử dụng enzyme Protamex có hoạt độ 1,5 AU (Anson Units)/g [10]

Enzyme Protamex, một enzyme thương mại phổ quát, đã được tác giả Trần Thị

Bích Thủy sử dụng để thủy phân cá trích (Sardinella Gibbosa) trong một nghiên cứu

tiến hành vào năm 2016 Điều kiện thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu axit amine từ protein của cá trích bằng enzyme Protamex là ở nhiệt độ thủy phân 500C, tỷ

lệ enzyme/cơ chất 0,5% và thời gian phản ứng 6 giờ Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đạt 70,87%, hiệu suất thu hồi đạt 60,66% Sản phẩm thủy phân có giá trị dinh dưỡng cao, giàu acid amin không thay thế (chiếm 64,6% tổng lượng acid amin) [20]

Việc sử dụng enzyme protease nội bào cũng được nghiên cứu bởi Trần Thanh Trúc và cộng sự (2014) trên đối tượng thịt đầu tôm sú Việc kích hoạt protease nội bào

ở nhiệt độ và thời gian lần lượt 50,730C và 4,43 phút là điều kiện tiền xử lý thích hợp nhất giúp gia tăng hiệu quả trích ly protein Dịch thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú

bằng protease nội bào đạt hiệu suất cao nhất khi tiến hành thủy phân ở nhiệt độ phòng (300C), thời gian thủy phân 8 giờ và điều chỉnh pH của dung môi sử dụng để thủy phân đến giá trị pH 9 [19]

Năm 2012, Nguyễn Thị Mỹ Hương và cộng sự đã nghiên cứu “Ảnh hưởng của khẩu phần có chứa thuỷ phân đầu cá ngừ đến sự sống còn và tăng trưởng của tôm thẻ

chân trắng Penaeus vannamei” Tác giả đã phân tích thành phần axit amin cho thấy

sản phẩm thủy phân protein đầu cá ngừ có giá trị dinh dưỡng cao, giàu axit amin không thay thế và có thể được sử dụng trong việc sản xuất thức ăn cho tôm [55] Một

số nghiên cứu khác về sự thủy phân đầu cá trích (Sathivel và cộng sự, 2003) và sự thủy phân đầu cá hồi (Sathivel và cộng sự, 2005) cũng đã cho thấy các sản phẩm thủy phân này có hàm lượng axit amin không thay thế cao [60, 59] Các công trình nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng hàm lượng DHA trong các loài cá ngừ cao hơn trong hầu hết các loài cá khác và cao hơn nhiều EPA (Shimada và cộng sự, 1997) [61]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

- Chủng E.coli M15 có chứa vector pQE 30 đã được gắn gen npr C10 mã hóa cho protease NprC10 phân lập từ Bacillus subtilis C10, được cung cấp bởi Bộ môn

Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

- Bacillus subtilis C10 đã được phân lập từ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Đại học Khoa Học – Huế Sau khi được chuyển về phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, chúng tôi tiến hành giữ giống trong glycerol 50% với tỷ lệ thể tích thích hợp sao cho nồng độ cuối glycerol đạt 17,5% và bảo quản ở -20o

C

- Chủng E coli hoang dại (đối chứng âm) được cung cấp bởi Khoa Sinh - Môi

trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng

2.1.2 Nguyên i u v hóa chất

* Thịt đỏ cá ngừ: được thu mua tại khu vực Đà Nẵng

- Quy cách lấy mẫu và bảo quản mẫu: Thịt đỏ cá ngừ được vận chuyển về

phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng, sau đó xay nhuyễn cho vào các túi PE Các mẫu này có thể trực tiếp đem đi làm thí nghiệm hoặc bảo quản trong tủ lạnh – 200C, những lần thí nghiệm tiếp theo mẫu sẽ được rã đông ở nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khối thịt từ 0 ÷ 40C rồi mang đi xử lý và khảo sát

- Theo nghiên cứu của TS Bùi Xuân Đông [30], thành phần hóa học trong thịt

đỏ cá ngừ như sau:

Hình 2.1 Thành phần cơ bản của thịt đỏ cá ngừ

Từ hình 2.1 ta thấy hàm lượng protein trong thịt đỏ cá ngừ là 27%, chiếm tỷ lệ khá cao

- Môi trường LB (mỗi lít chứa 10g tryptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl)

- Môi trường LB cải tiến (mỗi lít chứa 10g peptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl)

- Hóa chất sử dụng cho quá trình giữ giống và phân tích hóa sinh như: glycerol, casein, HCl, Na2CO3, Tricloroacetic acid (TCA), Folin-ciocalteu, ampicillin, kanamycin, IPTG (Invitrogen)

2.1.3 Thiết bị s dụng

Quá trình nghiên cứu sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại Học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng gồm:

- Nồi hấp tiệt trùng ALP, Model

CL-40S, Nhật

- Cân phân tích SHIMADZU AUY

220 – Nhật Bản

- Máy ly tâm Rotanta 460R – Đức - Tủ lạnh ALASSKA – Việt Nam

- Máy lắc khô STUART SI500 - Anh - Máy đo độ hấp thụ quang (OD)

Smartspec -BioRad

- Máy đo pH Hanna – HI5221 - Tủ lạnh âm SANYO – Nhật Bản

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bảo quản gi ng

Giống được tiến hành bảo quản trong dung dịch glycerol dựa trên nguyên tắc: glycerol là dung dịch có khả năng bảo vệ màng tế bào của vi sinh vật tránh hiện tượng

vỡ tế bào làm chết mẫu khi bảo quản ở nhiệt độ - 20°C Phương pháp bảo quản này có

ưu điểm là giống có thể bảo quản được trong thời gian dài, ít nguy cơ nhiễm các nguồn

vi sinh vật khác

Dung dịch glycerol 50% đem đi khử trùng ở 121°C, lấy ra làm nguội Tiến hành cho khoảng 1 ml dịch giống nuôi cấy qua đêm (16 ÷ 18 giờ) vào các ống eppendoff trước khi hòa trộn với 0,5 ml dung dịch glycerol 50% để đạt nồng độ cuối 17,5% Ống giống được bảo quản ở tủ lạnh sâu - 20°C

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy E.co i M15

2.2.2.1 Phương pháp hoạt hóa giống

Tiến hành cấy ria khuẩn lạc từ ống giống lên các đĩa thạch chứa môi trường LB

có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) và Kanamycin (50µg/ml) Các đĩa thạch này được đặt trong tủ ấm ở 370C, sau 15 ÷ 16 giờ các khuẩn lạc đơn có thể được quan sát trên mặt đĩa thạch

2.2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh

Tiến hành lấy một khuẩn lạc đơn E.coli M15 đã được hoạt hóa như đã trình bày

ở trên nuôi cấy tăng sinh trong 5 ml môi trường LB Canh trường thu được sau 16-18 giờ nuôi cấy ở 370C với tốc độ lắc 250 vòng/phút Mật độ tế bào được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm

2.2.2.3 Phương pháp nuôi cấy thu nhận dịch enzyme protease thô từ vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp

Để thu nhận enzyme protease thô, canh trường nuôi cấy tăng sinh được pha loãng trong 50 ml môi trường LB (mỗi lít chứa 10g tryptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl) có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) và Kananmycin (50µg/ml) để đạt mật độ tế bào có độ hấp thụ tại bước sóng 600 nm là 0.1 Quá trình lên men được thực hiện ở 370C, tốc độ lắc 250 vòng/phút Khi canh trường có mật độ tế bào đạt đến giá trị 2,5, tiến hành bổ sung isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) với nồng

độ 1 mM để cảm ứng quá trình sinh tổng hợp protease Sau 19 giờ nuôi cấy, dịch enzyme thô thu được bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút

2.2.3 Phương pháp ây dựng đường cong tăng trưởng của E.coli M15

Chủng vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp sau khi nuôi cấy tăng sinh trong 5 ml môi

trường LB được pha loãng trong 50 ml môi trường LB để đạt mật độ tế bào có độ hấp

thụ tại bước sóng 600 nm là 0,1 Để khảo sát sự tăng trưởng của E.coli M15, sau mỗi

giờ nuôi cấy, 1 ml canh trường được thu nhận và giá trị mật độ tế bào vi khuẩn tại

Blue) khoảng 30 phút [05] Đối chứng dương (+) là vi khuẩn Bacillus subtilis C10

được nuôi trên môi trường NB (1% peptone, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl) trong 24 giờ,

35°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút Đối chứng âm (-) là E coli hoang dại được nuôi cùng điều kiện với E coli M15 tái tổ hợp mang gen nprC10

2.2.5 Khảo sát sự biểu hi n của vi huẩn E co i M15 tái tổ hợp

2.2.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Để khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp

protease tái tổ hợp của chủng E coli M15, môi trường LB (mỗi lít chứa: 10g tryptone,

5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl, pH 7.0) và môi trường LB cải tiến (mỗi lít chứa:

10g peptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl, pH 7.0) đã được sử dụng Quá trình nuôi cấy thu dịch enzyme thô được thực hiện tương tự như phần phương pháp 2.2.2.3 Hoạt độ enzyme của dịch enzyme thô được xác định bằng phương pháp Anson cải tiến (Phụ lục 2, mục 2.1)

2.2.5.2 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng

Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian cảm ứng, chủng E coli M15 tái tổ hợp

được nuôi cấy trong môi trường LB cải tiến (mỗi lít chứa: 10g peptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCl, pH 7.0) bằng cách bổ sung 1 mM IPTG tại thời điểm OD600 = 2,5 Thu mẫu nuôi cấy tại các thời điểm 2, 4, 6, 17, 19, 21h sau khi bổ sung IPTG để xác định hoạt độ enzyme ngoại bào theo thời gian Các thí nghiệm đánh giá sự biểu hiện của protease được thiết kế dựa trên kết quả khảo sát thời gian cảm ứng

2.2.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng

Để khảo sát nồng độ IPTG thích hợp cho quá trình cảm ứng sinh tổng hợp protease, tiến hành bổ sung các nồng độ khác nhau của IPTG từ 0,05 đến 2 mM vào canh trường khi mật độ tế bào đạt giá trị OD600 = 2,5 Dịch enzyme thô thu nhận sau khoảng thời gian đã được xác định ở thí nghiệm 2.2.5.2 được sử dụng để xác định hoạt

độ bằng phương pháp Anson cải tiến

2.2.6 Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu được từ quá trình nuôi cấy E.co i M15

2.2.6.1 Xác định hoạt độ chung của protease

Hoạt độ chung protease của enzyme NPRC10 được xác định theo phương pháp Anson cải tiến [12]

Nguyên tắc của phương pháp là định lượng sản phẩm tạo thành do quá trình thủy phân cơ chất casein của protease Dưới tác dụng của protease, casein bị phân giải thành các đoạn peptide ngắn và các acid amin trong đó có tyrosine Xác định lượng tyrosine tạo thành bởi thuốc thử Folin, phản ứng của tyrosine làm Folin chuyển thành màu xanh và hấp thụ quang mạnh nhất ở bước sóng 750 nm Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme

Một đơn vị hoạt độ protease (U) được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút cần để giải phóng 1 µg tyrosine ở điều kiện thí nghiệm

2.2.6.2 Xác định hoạt độ riêng của protease

Protein tổng số của dịch chiết được xác định theo phương pháp Bradford (1976) [29] Đo mật độ quang của dung dịch màu thu được sau phản ứng với thuốc thử Bradford ở bước sóng 595 nm Hàm lượng protein được xác định dựa trên đường

chuẩn BSA (Phụ lục 2, mục 2.3)

Hoạt độ riêng (unit/mg) protease của enzyme NPRC10 bằng hoạt độ chung của

nó chia cho hàm lượng protein tổng số

2.2.7 Phương pháp ết tủa enzyme protease

2.2.7.1 Kết tủa enzyme bằng muối amoni sunfat (NH 4 ) 2 SO 4

Dịch chiết protease thu nhận từ canh trường được giữ lạnh ở 0 ÷ 4°C Muối (NH4)2SO4 (dạng hạt) được bổ sung vào dịch enzyme thô đã được làm lạnh cho đến khi đạt nồng độ muối đạt các mức độ bão hòa khác nhau (50, 60, 70, 80%) Khuấy tan

và giữ yên trong thời gian 60 phút Protease sau khi kết tủa được ly tâm 6000 vòng/phút ở 40C, trong 10 phút Để khô tự nhiên và hòa tan tủa trong một thể tích nước cất bằng 1/10 thể tích dịch enzyme ban đầu

2.2.7.2 Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ

Dịch enzyme protease thô thu nhận từ canh trường và dung môi hữu cơ (acetone, ethanol) được giữ lạnh ở 0 ÷ 40C trước khi phối trộn với nhau Sau khi phối trộn VddE/Vdm ở tỷ lệ xác định, giữ lạnh hỗn hợp ở nhiệt độ 0 ÷ 40C trong thời gian 60 phút rồi tiến hành tách kết tủa ra khỏi hỗn hợp bằng phương pháp ly tâm lạnh (6000 vòng/phút, 40C, trong 10 phút) Để khô tự nhiên và hòa tan tủa trong một thể tích nước cất bằng 1/10 thể tích dịch enzyme ban đầu

2.2.8 Xác định các thông s phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp

500C, thời gian = 4 giờ, chế độ khuấy trộn trong quá trình ủ 150 vòng/phút, tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1/1 Sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 950C-

1000C trong 15 phút sau đó tiến hành ly tâm để tách riêng phần bã và phần dịch Phần

bã cùng với nguyên liệu ban đầu được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

- Thí nghiệm đánh giá: Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ (%) sau phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ

Trong đó:

- Nnguyên liệu : Hàm lượng Nitơ tổng số có trong nguyên liệu ban đầu (%)

C-1000C trong 15 phút sau đó tiến hành ly tâm để tách riêng phần bã và phần dịch Phần bã cùng với nguyên liệu ban đầu được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

- Thí nghiệm đánh giá: Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ (%) sau phản ứng thủy phân thịt đỏ cá ngừ

C, 400C, 500C,

và 600C Sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 950C-1000C trong 15 phút sau đó tiến hành ly tâm để tách riêng phần bã và phần dịch Phần bã cùng với nguyên liệu ban đầu được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

- Thí nghiệm đánh giá: Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ (%) sau phản ứng thủy