NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN THỊT ĐỎ CÁ NGỪ LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Trong khi đó, trong nước chưa có công trình nào nghiên cứu một cách bài bản và có hệ thống giải quyết vấn đề này tận thu được lượng protein giá trị từ thịt đỏ trong sản xuất cá ngừ để tạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS BÙI XUÂN ĐÔNG

Đà Nẵng – Năm 2018

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến thầy cô cán bộ phòng thí nghiệm là ThS Võ Công Tuấn và ThS Phạm Thị Kim Thảo đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong khoảng thời gian thí nghiệm tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học Bên cạnh đó em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng đã dạy

dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích và giúp đỡ em trong suốt quãng thời gian học tập tại trường

Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn chân thành đến những người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường

Công việc nghiên cứu không tránh khỏi những bỡ ngỡ và sai sót, em kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô phản biện để đề tài em được hoàn thiện hơn

Đà Nẵng, ngày 01 tháng 10 năm 2018

Học viên thực hiện

Trần Trung Thanh Bình

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Trần Trung Thanh Bình

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN (AUTOLYSIS) PROTEIN

THỊT ĐỎ CÁ NGỪ

Học viên: Trần Trung Thanh Bình Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 107160267 Khóa: 32 - Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt – Cá ngừ (Thunuss spp.) và họ cá ngừ là nguồn thực phẩm đóng vai trò

rất quan trọng đối với nền kinh tế Việt Nam Cá ngừ thường được sử dụng tươi, chế biến phi-lê/thăn thịt hoặc chế biến đồ hộp Quá trình chế biến đồ hộp chỉ sử dụng một phần ba khối lượng cá nguyên liệu Do đó, ngành công nghiệp đồ hộp loại bỏ tới 70% phụ phẩm so với nguyên liệu ban đầu, cơ thịt đỏ là một trong nguồn phế liệu rắn đó Dịch đạm thủy phân (FPH) được chế biến từ phụ phẩm cá ngừ, có thể được ứng dụng như một loại gia vị trong công nghiệp chế biến thực phẩm nhằm tạo các hiệu ứng chức năng Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu quá trình tự phân cơ thịt đỏ cá ngừ

để thu dịch đạm thủy phân Đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình tự phân protein cơ thịt đỏ cá ngừ là thời gian phản ứng là 6,0, tỷ lệ phối trộn nước : nguyên liệu là 2:1, nhiệt độ t=450C và pH của phản ứng là pH=5,0

Từ khóa – tự phân; phế phẩm cá ngừ; cơ thịt đỏ cá ngừ; cathepsin; calpain;

collagenase; dịch đạm thủy phân;

STUDY OF AUTOLYSIS OF THE TUNA’S RED MUSCLE PROTEIN

Abstract – Tuna (Thunnus spp.) and tuna-like species are significant sources of

food and thus play a very important role in the economy of Vietmam Tuna generally

is processed as raw fish flesh and marketed as loins/steaks or as a canned food In the tuna canning process, only about one-third of the whole fish is used Thus, the canning industry generates as much as 70% solid wastes from original fish materials, red muscle is solid waste too Fish protein hydrolysate (FPH), which is obtained through hydrolysis of tuna waste, can be used as an ingredient in food industries to provide functional effects The purpose of this research is to autolysis of tuna’s red muscle to obtain protein hydrolyzate The optimal parameters for autolysis reaction were reaction time of 6 h, ratio of water to red meat of 2:1, reaction temperature of 45°C and pH of reaction – pH=5,0

Key words – autolysis; tuna waste; tuna’s red muscle; cathepsin; calpain;

collagenase; protein hydrolysate;

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Phương pháp nghiên cứu 3

1.4.1 Phương pháp vật lý 3

1.4.2 Phương pháp hóa lý 3

1.4.3 Phương pháp hóa sinh 3

1.4.4 Phương pháp vi sinh 3

1.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 3

1.5 ngh a khoa học và thực ti n của đề tài nghiên cứu 3

1.5.1 ngh a khoa học của đề tài 3

1.5.2 ngh a thực ti n của đề tài 4

1.6 Bố cục của luận văn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về dịch thủy phân protein 5

1.2 Giới thiệu về nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ 6

1.2.1 Thành phần của thịt đỏ cá ngừ 6

1.3 Tổng quan về enzyme nội tại 7

1.3.1 Các loại enzyme nội tại thủy phân ở hải sản 7

1.3.2 Các phương pháp thủy phân protein thủy sản 12

1.3.3 Ứng dụng của dịch thủy phân protein cá, thủy hải sản 14

1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân 15

1.4.1 Nhiệt độ 15

1.4.2 pH 15

1.4.3 ượng muối 15

1.4.4 Diện tích tiếp xúc 15

1.4.5 Bản thân nguyên liệu 16

1.5 Lịch sử vấn đề nghiên cứu 16

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 16

1.5.2 Nghiên cứu nước ngoài 19

1.5.3 Mô hình nghiên cứu tổng quan và thực nghiệm 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Dụng cụ và máy móc thiết bị 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp vật lý 24

2.3.2 Phương pháp hóa lý 24

2.3.3 Phương pháp hóa sinh 24

2.3.4 Phương pháp vi sinh 26

2.3.5 Phương pháp cảm quan 27

2.4 Khảo sát thực nghiệm 27

2.4.1 Xác định thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngử ồ 27

2.4.2 Xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được thu gom từ nhà máy 27

2.4.3 Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học 28

2.4.4 Khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase trong nguyên liệu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ 28

2.4.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsin 30

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 ết quả xác định thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ ở khu vực Đà Nẵng 33

3.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ thu gom từ nhà máy chế biến thủy sản 33

3.3 Kết quả nghiên cứu bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học 34

3.4 Kết quả khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của

các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase 35

3.5 ết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tự thủy phân (autolysis) thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của enzyme cathepsin 39

3.5.1 nh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước 39

3.5.2 nh hưởng của pH môi trường 40

3.5.3 nh hưởng của thời gian phản ứng 41

3 ết quả thí nghiệm kiếm chứng sản xuất thử dịch đạm 42

3.7 Đề xuất quy trình công nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cở sở kích hoạt hệ enzyme nội tại 43

3.7.1 Nguyên vật liệu 43

3.7.2 Sơ đồ quy trình công nghệ 43

3.7.3 Thuyết minh quy trình công nghệ 44

3.8 Đánh giá chất lượng dịch đạm thu hồi từ thịt đỏ cá ngừ theo quy trình công nghệ đề xuất 45

3.8.1 Các chỉ tiêu lý-hóa của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ 45

3.8.2 Các chỉ vi sinh của dịch thủy phân thịt đỏ cá ngừ 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

FHP Fish protein hydrolysate – Dịch đạm thủy phân từ cá

ATP Adenosine triphotphate – dạng năng lượng sinh học

w/w Weigh/Weigh – khối lượng/khối lượng

SD Độ lệch chuẩn

Hb Hemoglobin

KLPT hối lượng phân tử

HPLC High performance lipuid chromatography - Sắc ký lỏng cao áp kDa Đơn vị khối lượng phân tử

pH Power of Hydrogen - Độ hoạt động của các ion H+

µM Micro mol

mM Mili mol

ACE Angiotensin-I-converting enzyme

STPP Sodium Tripolyphosphate

DHA Docosahexaenoic acid

EPA Eicosapentaenoic acid

XLD agar Thạch Xylose Lysine Desoxycholate

TSA Tryptone casein soy agar

2.1 Tỷ lệ bổ sung chất bảo quản vào mẫu nguyên liệu và phân bố

thời gian lấy mẫu phân tích vi sinh vật 28 3.1 Thành phần khối lượng các cơ quan của một số loại cá ngừ 33 3.2 Tính cảm quan của các mẫu dịch đạm ở các mức pH khác nhau 41 3.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học dịch thủy phân 46 3.4 Kết quả phân tích thành phần acid amin của dịch thủy phân 46 3.5 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật trong dịch thủy phân thịt

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

1.4 Mô hình cấu tạo của enzyme collagenase 121.5 Mô hình nghiên cứu tổng quát và thực nghiệm 22

2.2 Thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngừ 272.3 Sơ đồ khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme nội tại 292.4 Sơ đồ khảo sát tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước 30

2.5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên quá trình tự

3.2 nh hưởng của các tác nhân vật lí và hóa học lên số lượng vi

3.3

Độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thu được sau quá trình

tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin,

calpain và collagenase

36

3.4

Mức độ thủy phân protein trong dịch đạm thu được sau quá

trình tự thủy phân dưới tác dụng của các hệ enzyme cathepsin,

calpain và collagenase

36

3.5 nh hưởng của pH môi trường lên hoạt độ hệ enzyme protease

3.6 Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy

phân vào tỷ lệ phối trộn nguyên liệu nước 39

3.7 Sự thay đổi độ tích tụ nitơ acid amin của dịch đạm thủy phân ở

các mức pH môi trường phản ứng khác nhau 40 3.8 Sự phụ thuộc của độ tích tụ nitơ acid amin trong dịch đạm thủy

Số hiệu

3.9 Mẫu dịch sản phẩm đạm thủy phân (a –mẫu chưa ly tâm b-mẫu

3.10 Quy trình công nghệ thu nhận dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ bằng

3.11 Sắc kí đồ HP C thu được khi phân tích thành phần acid amin

3.12 Kết quả phân tích hàm lượng histamine trong dịch thủy phân

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là quốc gia có thế mạnh về xuất khẩu thủy sản, sản lượng thủy sản năm

2 12 đạt ,13 tỷ USD, trong năm 2 13 – khảng 5,9 triệu tấn, … trong đó cá ngừ là một trong những mặt hàng chủ lực Hiện nay, cả nước có hơn 1 doanh nghiệp chế biến cá ngừ với sản lượng nguyên liệu ước tính khoảng 91.35 tấn (số liệu tính tới tháng 6 của năm 2 15) Theo ước tính của Hiệp hội chế biến cá ngừ (Vinatuna) sản lượng chế biến và tiêu thụ cá ngừ hàng năm có thể đạt 2 tấn, với kim ngạch xuất khẩu đạt trên 4 triệu USD/năm, là một trong những mặt hàng hải sản xuất khẩu chính của Việt Nam chỉ sau cá Tra và tôm [4] Các sản phẩm xuất khẩu chủ lực là cá ngừ đông lạnh (sashima), cá ngừ đóng hộp dầm dầu, cá ngừ xông khói, xúc xích cá ngừ,

Các phụ phẩm từ quy trình chế biến cá ngừ (đầu cá, xương cá, da cá, ruột cá, thịt

đỏ, ) đã được xác định là nguồn protein quan trọng để sản xuất các mặt hàng có giá trị gia tăng Nguồn phụ phẩm thịt đỏ cá ngừ bị loại bỏ chiếm 7-12% trọng lượng cá ngừ nguyên con, hiện nay chưa được quan tâm nghiên cứu để chế biến [3] Trong khi

đó, trong nước chưa có công trình nào nghiên cứu một cách bài bản và có hệ thống giải quyết vấn đề này tận thu được lượng protein giá trị từ thịt đỏ trong sản xuất cá ngừ

để tạo ra các sản phẩm thực phẩm giá trị gia tăng

Trong nhiều năm qua, các k thuật đã được phát triển trong việc khai thác và thu hồi những sản phẩm có giá trị sinh học cao [21] như phân bón, thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản Ngoài ra, dịch thủy phân protein được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp [21] Gần đây, dịch thủy phân protein từ các nguyên liệu thủy sản đã trở nên phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm do hàm lượng protein cao [34] Việc thủy phân protein làm giảm kích thước các peptide, dịch thủy phân là nguồn acid amin

tự do, được sử dụng trực tiếp cho sinh tổng hợp protein [26] Trong phương pháp hóa học, một số hóa chất được áp dụng để thủy phân phụ thủy sản, ví dụ HCl 1M, sodium sulfite, NaOH và KOH [26] Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh hoặc base mạnh để thủy phân protein là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại với môi trường

Vì vậy, thực hiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ theo phương pháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình thủy phân và do đó giảm thiểu các phản

ứng không mong muốn, giảm ô nhi m môi trường, tuy nhiên việc dùng enzyme thương mại hiện nay còn khá đắt đỏ dẫn tới chi phí sản xuất cao Bên cạnh đó, quá trình này thủy phân protein có thể thực hiện bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động của protease/proteinase nội tại có trong thịt đỏ cá ngừ [10] Bởi vì, người ta đã chứng minh, trong thịt đỏ cá ngừ, cathepsin – là một proteinase hoạt động trong môi trường acid, hoạt độ mạnh nhất đạt được ở pH=2, -5,0 Cathepsin là một enzyme nội bào, có vai trò quan trọng trong quá trình tự phân hủy thịt và thủy hải sản, quá trình tự thủy phân di n ra rất mạnh mẽ ở điều kiện thích hợp[14]

Từ những luận giải khoa học trên đây, mục tiêu của luận văn được đưa ra là nghiên cứu khả năng thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease nội tại để thu dịch đạm và tinh chế Từ đó, tìm giải pháp k thuật để chế biến thịt đỏ cá ngừ để tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế, có thể góp phần làm giảm hao tổn nguyên liệu cá ngừ sau thu hoạch

1.2 Mục đích nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nhằm các mục đích sau đây

- Xác định được khối lượng và thành phần hóa học thịt đỏ cá ngừ

- Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học

- Khảo sát mức độ thủy phân protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase

- Đề xuất quy trình công nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ cá ngừ trên cơ sở kích hoạt hệ enzyme protease nội tại

- Đánh giá chất lượng dịch đạm từ cơ thịt đỏ cá ngừ để định hướng sử dụng

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to được thu mua từ Cảng Cá Thọ Quang, TP Đà Nẵng được dùng để xác định khối lượng thịt đỏ

- Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ ong, Đà Nẵng Nguyên liệu được xay nhỏ bằng máy xay (Luxta, Việt Nam) và lựa chọn bằng sàng phân loại có đường kính lỗ sàng 3,0 - 3,5 mm Sau đó, nguyên liệu được chia nhỏ thành từng khối (100 gram/khối) và lưu trữ ở -20°C ± 2°C phục vụ nghiên cứu

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Sử dụng thịt đỏ cá ngừ thu mua ở thành phố Đà Nẵng làm cơ chất để nghiên cứu phản ứng tự thủy phân dưới xúc tác của enzyme protease nội tại

- Nghiên cứu sẽ được thực hiện ở quy mô PTN

1.4 Phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp vật lý

Xác định nhiệt độ bảo quản, rã đông nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ Xác định nhiệt

độ tiến hành phản ứng tự thủy phân và nhiệt độ bất hoạt enzyme và vi sinh vật sau phản ứng

1.4.2 Phương pháp hóa lý

Xác định độ pH hỗn hợp nguyên liệu trước phản ứng, pH của hỗn hợp phản ứng

và pH của dịch đạm thu được sau phản ứng tự thủy phân protein

1.4.3 Phương pháp hóa sinh

- Xác định hàm lượng protein

- Xác định hàm lượng lipid

- Xác định hàm lượng nước

- Xác định hàm lượng tro

- Xác định hàm lượng ni-tơ amin

- Xác định thành phần và hàm lượng acid amin của dịch đạm thủy phân

1.5 ngh a hoa học và th c ti n của đề tài nghiên cứu

1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- àm cơ sở khoa học cho việc định hướng khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn thịt đỏ cá ngừ để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng như dịch đạm, bột đạm dinh dưỡng tại địa bàn Quảng Nam - Đà Nẵng

- Xác định điều kiện thích hợp để thu nhận được dịch thủy phân protein từ thịt đỏ

cá ngừ đạt yêu cầu về chất lượng

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Tận dụng nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ từ các nhà máy, công ty chế biến thủy sản trên địa bàn thành phố Đà Nẵng để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng, nhằm tăng doanh thu cho các doanh nghiệp chế biến cá ngừ

- Quy trình thu hồi dịch thủy phân protein từ thịt đỏ cá ngừ d áp dụng trong thực

ti n để chuyển giao cho các công ty hoạt động trong l nh vực chế biến cá ngừ có nhu cầu

1.6 Bố cục của luận văn

Luận văn gồm những chương mục sau:

Mở đầu

Chương 1 Tổng quan

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 ết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về dịch thủy phân protein

Protein là chất dinh dưỡng thiết yếu cho con người ở mọi lứa tuổi, protein cần được cung cấp cho cơ thể hàng ngày Cá và các loại hải sản là một trong những loại thực phẩm quan trọng của con người, là nguồn cung cấp protein nguồn gốc động vật quý giá Nhiều quốc gia trên thế giới đã phát triển ngành công nghiệp sản xuất protein (dịch thủy phân và bột protein dinh dưỡng) từ thủy sản từ những năm của thế kỉ XX

để bổ sung protein vào các sản phẩm thực phẩm nghèo protein

Ngoài những vai trò thiết yếu trong quá trình cung cấp thực phẩm, thì dịch thủy phân protein từ thủy hải sản còn là một nguồn cung cấp các chất chống oxi hóa có thể

sử dụng trong bảo quản thực phẩm

Trong mấy năm gần đây, dịch thuỷ phân protein từ nhiều nguồn động vật và thực vật đã tìm thấy sở hữu hoạt động chống oxi hoá, trong đó có các nguồn từ sản phẩm thủy sản và phế phẩm từ cá Một số peptide chống oxi hoá bao gồm 3 đến 16 acid amin đã được xác định từ dịch thủy phân protein này Hơn nữa, một vài acid amin, như tyrosine, methionine, histidine, lysine, và tryptophan, thường được xem là chất chống oxi hoá Ở nghiên cứu gần đây, sản phẩm thuỷ phân khác nhau được tạo ra bởi protease khác và hoạt động chống oxi hóa của chúng được đánh giá rất cao [26]

Dịch thủy phân protein, đặc biệt từ cá đến nay đã có những công trình nghiên cứu chứng minh có tác dụng đối với khả năng chống tăng huyết áp, và là nguồn hợp chất kháng sự tăng sinh, có khả năng chống lại sự tăng sinh bất bình thường của các dòng

tế bào sinh dưỡng trong cơ thể [26; 37]

Dịch thủy phân protein thường được sản xuất từ nguyên liệu thủy hải sản bằng cách chiết tách protein trong acid, trong kiềm (phương pháp hóa học), hoặc sử dụng enzyme nội tại của nguyên liệu (quá trình tự thủy phân), hoặc sử dụng các chế phẩm enzyme protease thương mại, ví dụ, Flavourzyme, Corolase, Alcalase, Protamex, Umamizyme, Kojizyme, Orientase, có nguồn gốc khác nhau [26] Ưu thế của k thuật thủy phân protein bằng enzyme là điều kiện phản ứng “mềm”, ngh a là enzyme xúc tác thủy phân protein trong điều kiện êm dịu, ít khắc nghiệt hơn so với phương pháp hóa học, giữ được các acid amin toàn vẹn và không sinh các sản phẩm thứ cấp Nhờ những

điều kiện thuận lợi của phản ứng thủy phân protein bằng enzyme protease, nên sản phẩm dịch thủy phân chứa thành phần acid amin tương tự như trong nguyên liệu ban đầu.

1.2 Giới thiệu về nguồn nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ

Cá ngừ là một loại thủy sản có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Trong cá ngừ có hai loại thịt là thịt trắng và thịt đỏ Phần thịt đỏ có vị trí nằm sát và dọc theo xương sống, có màu đỏ hoặc sậm

Hình 1.1 Thịt đỏ cá ngừ (Herpandi, 2011)

Trong công nghệ chế biến cá, phần thịt đỏ thường là phế phẩm được vứt bỏ do có mùi tanh và hương vị ít thơm ngon như phần thịt trắng, phần thịt này thường chiếm đến 12% tổng trọng lượng của thịt cá [20]

Hiện tại, lượng thịt này thường được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi với giá thành khá rẻ

1.2.1 Thành phần của thịt đỏ cá ngừ

Trong thịt đỏ cá ngừ có chứa một lượng lớn protein, acid amin tự do, carbohydrate và một số chất khoáng Bên cạnh đó, màu sắc của thịt đỏ là do các hợp chất mang màu mà chủ yếu là myoglobin (Mb) và hemoglobin (Hb), hàm lượng của chúng trong thịt đỏ cá ngừ cao hơn gấp 5 lần so với thịt trắng [20] Thịt đỏ d bị biến đổi màu sắc do sự oxi hóa nguyên tử sắt trong nhóm hem của protein khi tiếp xúc với không khí để hình thành dạng metMb (Mb-Fe3+) có màu nâu [18]

Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn protein, nước và chất béo Hàm lượng các chất có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100g thịt đỏ cá ngừ [33]

Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ được trình bày trong bảng 1.2 sau:

Bảng 1.2 Hàm lượng một số acid amin có trong thịt đỏ cá ngừ [33]

1.3 Tổng quan về enzyme nội tại

1.3.1 Các loại enzyme nội tại thủy phân ở hải sản

giải phóng vào trong cơ thể của động vật sau khi chết

Lysosome chứa ít nhất 13 loại cathepsin bao gồm cathepsin A, B, C, D, H và L Trong số này enzyme cathepsin quan trọng nhất là cathepsin D tham gia vào quá trình thủy phân protein nội tại của tế bào tạo thành peptide

Hoạt tính của cathepsin trong cơ sau khi chết tăng đáng kể, vì những enzyme này thường hoạt động mạnh ở pH acid Khi cá chết quá trình phân hủy glycogen tạo ra acid latic trong điều kiện yếm khí xảy ra bằng con đường phosphoryl với sự tham gia của ATP làm cho pH của cơ thịt giảm, hạn chế được phần nào sự phát triển của vi sinh vật Khi pH hạ thấp còn tạo điều kiện cho enzyme capthepsin hoạt động thúc đẩy quá trình

tự phân của cơ thịt Các enzyme cathepsin có thể hoạt động đồng bộ hoặc đơn lẻ để thủy phân cá sau khi chết

Cathepsin D là một protease lysosomal aspartic của họ pepsin Trọng lượng phân

tử cơ bản (ước tính trong cơ xương của cá trích (Clupea harengus) là 38-39 kDa) thay đổi trong các loài và các mô Một số báo cáo chỉ ra rằng cá chép (Cyprinus carpio) là

41 kDa và ở cá hồi (Oncorhynchus keta) là 50 kDa [13] Không giống như họ

lysosome Protease cysteine, cathepsin D thể hiện một giới hạn hoạt động mạnh và có thể bị ức chế bởi pepstatin Vùng xúc tác của nó bao gồm Asp33 và Asp231 và có tới 40-48% tương đồng với các protease aspartic khác như pepsin, renin, và chymosin [13] Các acid amin kỵ nước là vùng hoạt động ưa thích của cathepsin D Sau khi giết mổ

pH và nhiệt độ đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động thủy phân của Cathepsin

D Enzyme thường hoạt động trong khoảng pH acid (3.0-5.0) Những điều kiện cuối cùng sau khi giết mổ có trong cơ khi bị lão hóa bình thường của thịt từ các mô động vật có vú có thể không tương tự như các mô trong cá với hoạt tính cathepsin D chủ yếu với các thành phần là thịt cơ Trong cơ bắp động vật sau giết mổ, cathepsin D hoạt động thủy phân mạnh cá tổ chức mô cở ở pH acid (5,0) và ở nhiệt độ tối ưu là 45°C Enzyme cathepsin giảm dần hoạt động khi nhiệt độ hạ thấp hơn và gần như bất hoạt ở nhiệt độ dưới 5°C [23] Cathepsin D đã được phát hiện sau khi giết mổ trong tổ chức

cơ của cá chép, cá hồi cầu vồng, cá chình, và cá cơm [23] Một số nghiên cứu chỉ ra rằng việc các cơ thể cá sau khi chết đạt được pH khoảng xấp xỉ từ 6,3-6,6 và có thể không đạt được độ pH thấp cho Cathepsin D hoạt động Do đó, cathepsin D ít có khả năng tham gia vào các tự phân hủy các tổ chức cơ cá Các kết quả được báo cáo bởi

Godiksen và cộng sự (2 9) đã chứng minh rằng khả năng Cathepsin D gây ra sự thay đổi cấu trúc của cơ bắp ở pH thấp sau khi chết, có thể là do sự hiện diện của các cathepsin khác quan trọng và đó là tiền đề cho sự kích hoạt của cathepsin D [23]

Hình 1.2 Mô hình cấu tạo của enzyme cathepsin

Sau đó peptide tiếp tục bị phân hủy dưới tác dụng của cathepsin A, B và C

Enzyme cathepsin có vai trò chính trong quá trình tự chín của cá ở pH thấp và nồng độ muối thấp Đều này giải thích lí do tại sao khi cá chết thịt cá co cứng sau đó mềm nhũn, nguyên chính là do khi cá chết do oxi không còn cung cấp cho cơ thể làm cho các cơ thịt hô hấp yếm khí sinh ra acid lactic từ đó pH giảm, tạo điều kiện cho cathepsin hoạt động phân giải protein cơ thể làm cho thịt cá trở nên mềm lại, nhưng enzyme cathepsin bị ức chế hoạt động ở nồng độ muối 5%

1.3.1.2 Enzyme Calpain[13]

Hệ enzyme protease calpain bao gồm µ-calpain, m-calpain và chất ức chế nội sinh calpastatin Cảm hai loại calpain đều tương tự nhau về tính chất hóa sinh, ngoại trừ nhu cầu canxi của mỗi loại là khác nhau Việc kích hoạt µ-calpain trong ống nghiệm chỉ cần một lượng nồng độ canxi nhỏ tính bằng micro-mol (µM), ngược lại việc kích hoạt m-calpain lại đòi hỏi một nồng độ canxi cao được đo bằng millimol (mM) [39]

Hai dạng của calpains là dị phân tử gồm một tiểu đơn vị nhỏ (28kDa) và một tiểu đơn vị lớn (80 kDa) Tiểu đơn vị nhỏ của cả hai dạng calpains bao gồm hai miền (V và VI) kéo dài từ đầu N và đâu cuối C Trên miền V của tiểu đơn vị nhỏ giàu glycine và cũng được xác định là vị trí liên kết của phospholipid Trên miền VI của tiểu đơn vị

28 kDa chứa năm địa điểm liên kết Ca2+ Tiểu đơn vị lớn của cả dạng calpain có bốn vùng chính (Domain I-IV) Vùng II được xác định là nơi protease xúc tác được tạo

thành từ các tên vùng phụ (IIa và IIb) có chứa cysteine và histidine Vùng III liên kết với Ca2+ và phospholipid Vùng IV giống như vùng VI chứa 5 vị trí liên kết canxi Bốn

vị trí liên kết đầu tiên trong miền IV của tiểu đơn vị 8 kDa cũng chứa các vị trí liên kết Ca2+ Tuy nhiên, phân tử vị trí thứ năm ở cuối carboxyl ở các vùng IV và VI không thể liên kết Ca2+ nhưng liên kết được với nhau và hình thành một dị phân tử gồm hai tiểu đơn vị của calpain [39]

Hình 1.3 Mô hình cấu tạo của enzyme calpain

Vai trò của calpain trong quá trình tự thủy phân của thịt cơ giống như các loại protease khác, calpain có khả năng phân cắt các protein cả trong ống nghiệm lẫn trong

cơ thể sống Calpain ưu tiên quá trình tự phân đối với các acid amin kỵ nước đặc biệt như leucine, isoleucine, valine Sự hoạt động của calpains trong quá trình thủy phân proteins có giới hạn trong quá trình trao đổi protein ở điều kiện sinh lý và trong cơ thể sau khi chết Trong cơ thể , calpains giải phóng ra sẽ phân giải các sợi cơ từ các tổ chức mô cơ Như vậy, calpains hoạt động trong cơ sau chết dẫn đến sự suy yếu và làm mất ổn định cấu trúc tổ chức cơ bằng cách tạo ra một số thay đổi cấu trúc Chính điều

đó làm giảm độ phức tạp các chuỗi polypeptides tạo điều kiện để các protease khác tiếp tục thủy phân [39]

tế bào, lão hóa cho cơ thể

Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng poly- như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất không biến tính Trong khi đó, các protein khác có thủy phân hạn chế collagen tự nhiên nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có ở ngoài vùng xoắn đặc trưng của collagen, không có khả năng tấn công các liên kết trong vùng xoắn của collagen [16]

Đặc điểm cấu tạo của collagenase và một số tính chất cơ bản, các collagenase là các protein có khối lượng phân tử lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau Những năm về sau, phương pháp xác định kích thước phân tử của enzyme chủ yếu là phương pháp điện di trên gel polyarcylamide khi có mặt SDS hoặc phương pháp lọc gel được tiến hành với enzyme ở trạng thái tinh khiết Phân tử collagenase có thể được tạo nên bởi các dưới – đơn vị Collagenase A với PT 1 kDa được phát hiện bao gồm 4 dưới – đơn vị không có hoạt tính enzyme với trọng lượng mỗi phần là 25 kDa, Vibrio B- 30 bao gồm 2 dưới – đơn vị có KLPT không giống nhau 24 kDa và 28 kDa [16]

Đa số các enzyme đã được công bố có pH hoạt động trong khoảng trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7-8) Tuy thế, khả năng hoạt động của chúng cũng không vượt quá

mức pH trung tính Collagenase từ B.alvei DC – 1 được phát hiện là hoạt động trong

vùng pH acid yếu cho tới trung tính (4,5 -7) Đây là enzyme đầu tiên trong số các collagenase đã biết có khả năng hoạt đông trong vùng acid yếu Nhiệt độ hoạt động thích hợp cùa các collagenase thường là dưới 40 – 42,40C Các enzyme này hầu như bị giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ lên trên 450C Đặc biệt trong trường hợp của

collagenase từ Vibrio B -30, enzyme này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới

caseinase luôn đi kèm

Hình 1.4 Mô hình cấu tạo của enzyme collagenase

Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt tích cực hơn so với các enzyme của mô Clostridiopeptidase A có thể tác dụng tại 2 điểm trên một chuỗi xoắn α trong khi colagenase của nòng nọc cóc chỉ có khả năng phân cắt chuỗi xoắn tại một điểm duy nhất

Các enzyme này gây ra các “vết nứt” hoặc bẻ gãy các myotome khi bảo quản cá bằng đá trong một thời gian dài hoặc khi bảo quản chỉ trong thời gian ngắn nhưng ở nhiệt độ cao

1.3.2 Các phương pháp thủy phân protein thủy sản

Sự thủy phân protein là sự phân cắt đại phân tử protein thành những chuỗi peptide có kích thước khác nhau và những đơn phân Sự thủy phân có thể thực hiện bằng phương pháp hóa học (sử dụng acid hoặc base) và phương pháp sinh học (sử dụng enzyme)

1.3.2.1 Phương pháp hóa học

Sử dụng acid hoặc base để thủy phân các liên kết peptide của protein Mặc dù phương pháp này tạo ra sản phẩm có thành phần hóa học và tính chất có thể bị thay đổi nhưng vẫn được ưa chuộng trong ngành công nghiệp vì đơn giản và ít tốn kém Tuy nhiên việc chất lượng dinh dưỡng và chức năng kém trong sản xuất bằng phương pháp hóa học làm cho sản phẩm ít được sử dụng trong các thành phần của thực phẩm và hạn chế do phải sử dụng chất tăng cường hương liệu [26]

Trong quá trình thủy phân cá, người ta thường sử dụng acid hơn base Pasupuleti

và Braun (2008) đã báo cáo rằng việc sử dụng acid trong quá trình thủy phân thường phá vỡ các protein thành các acid amin riêng lẻ và các chuỗi ngắn peptide, nhưng một

số các acid amin cần thiết như cystine, cysteine, methionine và trypstophan cũng bị phá hủy [37] Ovissipour và cộng sự (2 9) đã sử dụng HCl và H2SO4 để thủy phân protein của cá quá trình được tiến hành ở nhiệt độ và áp suất cao, sau đó trung hòa acid về pH 6,0 đến 7,0 và sản phẩm tạo thành là bột nhão hoặc sau đó tiếp tục sấy khô [42] Theo Kristinsson và Rasco (2000), thủy phân hoàn toan protein của các cần dùng HCl 6M ở 118oC trong 18 giờ [29] Tuy nhiên, sau đó phải trung hòa sản phẩm nên tạo

ra một lượng muối lớn không mong muốn trong sản phẩm, làm cho sản phẩm không phù hợp với mục đích làm thực phẩm [26]

Sự thủy phân protein bằng base là một quá trình chuyển tiếp và đơn giản Trong quá trình này, calci, natri, kali được bổ sung hòa tan vào protein đang được gia nhiệt, phản ứng được tiến hành ở nhiệt mong muốn (8 đến 130oF) trong một vài giờ đến khi đạt được mức độ thủy phân mong muốn, sau đó sản phẩm được làm bay hơi, tiệt trùng

và sấy khô Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy trong quá trình này nhưng tryptophan vẫn còn [37] Kết quả từ các quá trình thủy phân bằng phương pháp hóa học ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của protein, và trong quá trình thủy phân có thể hình thành nên những chất không mong muốn trong thực phẩm [28]

1.3.2.2 Phương pháp sinh học:

Sử dụng enzyme để thủy phân protein là một hướng phát triển bền vững cho tương lai bởi kết quả tạo ra những sản phẩm có chức năng và giá trị dinh dưỡng cao Việc sử dụng enzyme mang lại những lợi ích đáng kể so với sử dụng phương pháp hóa học khi cần một lượng enzyme nhỏ nhưng xử lý được nguồn nguyên liệu lớn và có thể

d dàng vô hiệu hóa hoạt động của enzyme làm ngưng quá trình thủy phân bằng các tác nhân đơn giản như pH và nhiệt độ [37] Sự có sẵn của các loại enzyme khác nhau đưa đến những sự lựa chọn tốt cho sản phẩm mong muốn cuối cùng Hơn nữa, việc thủy phân bằng enzyme không phá hủy các acid amin và không tạo ra các sản phẩm không mong muốn Từ quan điểm kỹ thuật và kinh tế, enzyme từ vi khuẩn như alcalase hoạt dộng ở pH kiềm đã được báo cáo là có hiệu quả nhất trong sự thủy phân protein ở cá Các chế phẩm enzyme khác cho thấy tiềm năng thủy phân protein của cá

để tạo ra FPH có chức năng sinh học cao, như protamex, flavourzyme, corolase, umamizyme , kojizyme và orientase [26]

1.3.3 Ứng dụng của dịch thủy phân protein cá, thủy hải sản

Nguồn acid amin cân bằng và hàm lượng protein cao trong dịch thủy phân protein cá (FPH-Fish Protein Hydrolysate) là một sản phẩm protein có giá trị sinh học tuyệt vời đối với nguồn thức ăn cho ngành chăn nuôi và đã được sử dụng rộng rãi như một nguồn thức ăn nuôi trồng thủy sản cho một số loài cá và các loài mảnh vỏ Và nó

là một nguồn tiềm năng đầy hứa hẹn trong l nh vực dinh dưỡng nuôi ấu trùng Trong suốt quá trình thủy phân các enzyme nội sinh trong các mô cơ đã thủy phân protein và nitơ trở nên hòa tan hơn giải phóng các acid amin, đó chính là nguồn acid amin cần thiết và có sẵn để tổng hợp protein trong thức ăn chăn nuôi [26]

Dịch chiết từ dung dịch thủy phân protein đã được biết và sử dụng trong cuộc sống hàng ngày của con người, đó là những gia vị truyền thống như nước mắm Nước mắm được sản xuất thông qua phản ứng tự thủy phân bởi các enzyme nội sinh hoặc bổ sung thêm các enzyme thương mại trong quá trình lên men Rất nhiều nguyên liệu có thể sử dụng làm nước mắm với điều kiện là hàm lượng enzyme phân giải protein đủ để gây ra sự hòa tan mô có hiệu quả và thủy phân được protein Tuy nhiên chủ yếu là các nguyên liệu có nguồn gốc từ thủy hải sản là được sử dụng nhiều nhất Thông thường, nước mắm được làm từ cá nhỏ như cá cơm và cá mòi Các phụ phẩm của cá ngừ như mắt cá ngừ và các sản phẩm chế biến từ mực Nước mắm chứa tất cả các acid amin thiết yếu và đặc biệt chứa lysine và glutamate cao, ngoài ra nước mắm là một nguồn rất tố chứa vitamin B12 và các khoáng chất như natri, calci, Magie, Sắt, Mangan và phospho Mặc dù nước mắm chứa nhiều chất dnh dưỡng, tuy nhiên giá trị dinh dưỡng

bị giảm do nồng độ muối cao [26]

Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein thủy phân từ cá có hoạt tính chống oxy hóa, do đó dịch thủy phân protein có thể là một nguồn tiềm năng của thuốc chống tăng huyết áp, chống ung thư, thuốc chống trầm cảm Cũng như, sự oxy hóa lipid là mối quan tâm lớn của ngành công nghệ thực phẩm và người tiêu dùng và nó dẫn đến sự phát triển của các hương vị và phản ứng tiềm ẩn sự độc hại không môn muốn cho sản phẩm, chính vì vậy việc sử dụng chất chống ôi hóa là cần thiết Trong các nghiên cứu gần đây, các sản phẩm thủy phân từ cá bằng các enzyme protease đã được chứng minh

là nguồn hợp chất tự nhiên chống oxy hóa tốt [37]

Nguồn peptide có thể làm hạ huyết áp, các peptide có hoạt tính cao ức chế ACE

đã được tách chiết và sử dụng từ nguồn thực phẩm tự nhiên Một số peptide có nguồn gốc từ FPH được thủy phân từ Alaska pollock, cá mập, yellowfin sole, bigeye tuna, và gan của skipjack tuna được biết là có chất ức chế hoạt động của ACE và có sự biểu hiện hoạt động hạ huyết áp trong thử nghiệm ở động vật [26]

1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình t phân

1.4.1 hiệt độ

Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng với sự tăng của nhiệt độ Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme Kết quả này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản ứng enzyme đạt cực đại Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau Sự khác nhau này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc từng sự khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme [8]

Nhiệt độ 3 -450C thích hợp cho quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ [8]

1.4.2 pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme Dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Như vậy enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng

pH xác định, gọi là pH tối thích pH tối thích của mỗi enzyme không cố định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất hay nhiệt độ [8]

môi trường nước làm cho nồng độ enzyme loãng ra [10]

- Phương pháp siêu âm sử dụng biện pháp siêu âm để phá vỡ enzyme trong nội bào của cơ thịt đỏ, từ đó cho enzyme tiếp xúc với cơ chất để phản ứng xảy ra [10] Trong nghiên cứu này nghiên cứu tiến hành xay cá trước rồi tiến hành siêu âm cho hiệu quả tốt nhất

1.4.5 ản thân nguyên liệu

Cá tươi chế biến chất lượng tốt hơn cá ươn [10] Cá ươn chứa nhiều vi sinh vật gây thối hơn cá tươi, khi phản ứng thủy phân xảy ra vi sinh vật gây thối hoạt động nhiều làm cho dịch thủy phân có màu đen, mùi hôi không mong muốn [10]

1.5 Lịch sử vấn đề nghiên cứu

1.5.1 ghiên cứu trong nước

Một số nghiên cứu liên quan tới vấn đề đặt ra của luận văn được thực hiện ở điều kiện trong nước như sau

Theo Nguy n Trọng Cẩn thì có thể sản xuất dịch đạm thủy phân từ nguyên liệu

cá bằng cách sử dụng Aspergillus Orizae hoặc vi khuẩn Khi sử dụng nấm mốc Aspergillus Orizae để thủy phân thịt cá thì trong nấm mốc này có chứa hệ enzyme

protease như innulase, imetase, asparaginase, glutaminase, proteolytic Những enzyme này có tác dụng thủy phân trong điều kiện thích hợp là:

- Nhiệt độ 37 - 410C

- pH = 6-8

- Tỉ lệ nấm mốc thường sử dụng là 3-4% so với nguyên liệu

Thời gian thủy phân tùy thuộc vào mức độ hoạt động của nấm mốc và yêu cầu hàm lượng đạm của sản phẩm Đối với sản xuất nước mắm, thời gian thủy phân từ 10-

15 ngày thì thu được chượp chín

ượng muối bổ sung vào quá trình thủy phân thường từ 4- % để tránh thối rữa Nếu bổ sung một lượng muối cao hơn thì protease của nấm mốc bị ức chế, không hoạt động

Dịch thủy phân xong đem đi lọc Dịch lọc để riêng Bã lọc dùng nước rửa từ 2-3 lần, nước rửa có thể cho chung vào dịch lọc, hỗn hợp này đem đun sôi, vớt bọt thì thu được dịch đạm thủy phân

Sản xuất dịch đạm thủy phân từ nấm mốc có thể có những nhược điểm sau:

- Dịch đạm không có hương thơm, d bị đắng, có thể là do xác vi sinh vật còn tồn tại, hoặc do các loại muối canxi, ma-giê có trong muối ăn

- Dịch đạm d bị chua, có nhiều nguyên nhân: có thể do lượng tinh bột mà nấm mốc sử dụng không hết trong quá trình chế biến lên men lactic, có thể do các acid bay hơi hình thành khi cá bị ươn [1]

Năm 1997, Vũ Xuân Dũng đã thực hiện nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính protease cao và thăm dò khả năng ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày” ết quả đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn có đầy đủ những đặc tính trên và xác định đó chính là Bacillus và kí hiệu là Bacillus D15 Sử dụng chủng Bacillus D15 vào sản xuất nước mắm với nồng

độ bổ sung 5% dịch nuôi cấy vào chượp cá Sau 30 ngày thủy phân thì hàm lượng

ni-tơ toàn phần nước mắm đạt 22,6g/kg, ni-ni-tơ formol đạt 12,7 g/kg, ni-ni-tơ amin đạt 7,5 g/kg Dịch lọc từ chượp sau 3 ngày đạt những tiêu chuẩn của chượp chín và đạt những chỉ tiêu chất lượng về cảm quan của nước mắm [2]

Trong công trình “Nghiên cứu tách chiết protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ bằng phương pháp điều chỉnh pH” (2012) của Phạm Thị Hiền đã đưa ra được ảnh hưởng

của pH, nhiệt độ, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi và nguyên liệu lên hiệu quả tách chiết protein từ cơ thịt đỏ cá ngừ Hiệu suất thu hồi protein cao nhất tại pH = 13, thời gian chiết 1h, nhiệt độ dung môi chiết 30oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết = 1/10 [3]

Cũng trong năm 2 12 công trình “Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu

cá ngừ vây vàng bằng protease thương mại” của Nguy n Thị Mỹ Hương đưa ra sản

phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 0,5% ở nhiệt

độ 45o

C và pH tự nhiên trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ nước/nguyên liệu là 1:1 Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra độ thủy phân và tỉ lệ thu hồi nitơ trong sản phẩm thủy phân tăng lên cùng với sự tăng thời gian thủy phân Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đã đạt được 30,1% và tỉ lệ thu hồi nitơ là 85,1% Sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng có hàm lượng protein 88,2%, lipid 1,4% và tro 8,3% Sản phẩm thủy phân protein này có hàm lượng axít amin không thay thế cao [5]

Năm 2013, Lý Thị Minh Phương trong công trình “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủy phân từ thịt hàu biển dùng trong thực phẩm” đã sử dụng enzyme Allzyme FD thu từ nấm mốc Aspergillus niger và các điều kiện khác như nhiệt độ,

thời gian, chất phòng thối với các tỷ lệ khác nhau để thủy phân thịt hàu Kết quả tối ưu đạt được tỷ lệ enzyme bổ sung: 0,32%, muối 1,5%, ethanol %, nước:20%, nhiệt độ:

560C, thời gian: 8 giờ thì dịch thủy phân có hàm lượng Naa cao nhất 3,236 mg/g Chất lượng của chế phẩm này đạt tiêu chuẩn về giá trị cảm quan và mang đầy đủ các thành phần hóa học cần thiết, có nhiều khả năng ứng dụng trong y tế hoặc bổ sung vào những mặt hàng thực phẩm khác làm tăng giá trị dinh dưỡng tác dụng tốt đối với sức khỏe người tiêu dùng [9]

Năm 2 14, Trần Thanh Trúc và cộng sự đã thực hiện công trình “Nghiên cứu khả năng thủy phân dịch protein của thịt đầu tôm sú bằng enzyme protease nội tại” Thông

qua nội dung nghiên cứu, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự thủy phân protein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của pH đến môi trường thủy phân Đặc biệt, điều kiện tiền xử lý nhiệt nhằm kích hoạt hệ enzyme protease nội bào Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, thời gian thủy phân protein tốt nhất, dịch thủy phân không có mùi lạ là 8 giờ, đồng thời, quá trình thủy phân protein đạt tốt nhất khi điều chỉnh pH môi trường là 9, kết hợp với thông số tối ưu của điều kiện tiền xử lý nhiệt nguyên liệu là 50,73 0C và thời gian là 4,43 phút [12]

Cũng trong năm 2 14, Nguy n Thị Mỹ Hương trong nghiên cứu “Thành phần dinh dưỡng của các sản phẩm thủy phân từ đầu và xương cá chẽm (Lates calcarifer) bằng enzyme Flavourzyme” đã tiến hành thủy phân đầu và xương cá chẽm (Lates calcarifer) bằng enzyme Flavourzyme với tỉ lệ enzyme 0,5% so với nguyên liệu, tỉ lệ

nước : nguyên liệu là 1:1, quá trình thủy phân được thực hiện ở nhiệt độ 50°C, pH tự nhiên (6,5) trong thời gian 6 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy bột thủy phân protein

có hàm lượng protein cao (81,5%), hàm lượng lipid thấp (1,8 %) và hàm lượng tro 7,40% Bột protein không tan có hàm lượng protein 7,3%, hàm lượng lipid 16,5% và hàm lượng tro 6,90% Bột thủy phân protein và bột protein không tan có giá trị dinh dưỡng cao với các acid amin không thay thế Dầu cá từ đầu và xương cá chẽm giàu acid béo omega 3 (2 ,18%), đặc biệt là acid docosahexaenoic (DHA) và acid eicosapentaenoic (EPA) [6]

Năm 2 16, công trình “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protamex để thủy phân cá trích (Sardinella Gibbosa) thu dịch đạm” của Trần Thị Bích Thủy đưa ra điều kiện

thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu acid amine từ protein của cá trích bằng

enzyme Protamex: nhiệt độ thủy phân 500C , tỷ lệ enzyme so với cơ chất 0,5% và thời gian phản ứng là 6 giờ Sau 6 giờ thủy phân, độ thủy phân đạt 70,87%, hiệu suất thu hồi đạt 60,66% Sản phẩm thủy phân có giá trị dinh dưỡng cao, giàu acid amine không thay thế (chiếm 64,6% tổng lượng acid amine) [11]

Hiện nay, các công trình nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ vẫn còn ít, chưa toàn diện Nghiên cứu quá trình thủy phân cơ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease nội tại vẫn chưa có

1.5.2 ghiên cứu nước ngoài

Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của con người về “thực phẩm phân tử”, nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme thủy phân protein, dựa trên tính năng của các protease, để sản xuất ra một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và d hấp thụ, đó là dịch protein thủy phân

Ling Lin Liu và cộng sự (1979) đã sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá bằng enzyme pepsin, nhưng các tác giả lại không sử dụng chế phẩm enzyme có sẵn trên thị trường mà chỉ chiết lấy dịch thô enzyme từ dạ dày lợn để giảm chi phí sản xuất Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm chưa cao vì enzyme có chứa nhiều tạp chất [32]

Ở Anh, J.Y.Imm và C.M ee (1999) đã nghiên cứu sản xuất bột gia vị thủy sản

từ cá tuyết Urophycis chuss bằng enzyme thủy phân Tại điều kiện pH tự nhiên của cá

(6,8) và tỷ lệ nước/cá là 2/5, tác giả còn bổ sung thêm 1,5% NaCl và 0,4% Sodium Tripolyphosphate (STPP) để cải thiện chất lượng của gia vị bằng cách loại bỏ vị đắng

và mùi tanh đặc trưng của cá [27]

Để thủy phân protein có hiệu suất cao thì trước tiên phải lựa chọn nguồn enzyme một thành phần, đồng thời lại có thể thu hồi được một lượng đáng kể enzyme đã sử dụng Chervan, Munir và cộng sự cũng đã sử dụng enzyme một thành phần là enzyme alkaline Sử dụng enzyme một thành phần vừa không làm giảm hiệu suất thủy phân, đồng thời sau quá trình thủy phân có thể thu hồi lại enzyme mà hoạt tính của nó không

bị ảnh hưởng [19]

Ở Pháp, Guerard F (2 2) đã ứng dụng công nghệ enzyme trong sản xuất dịch đạm thủy phân từ phế thải của nhà máy sản xuất cá hộp Theo tác giả, dịch thủy phân protein cá đang ngày càng thu hút sự quan tâm vì khả năng ứng dụng của chúng như một nguồn peptit có hoạt tính sinh học hoặc như nguồn cơ chất nitơ để chuẩn bị môi

trường lên men vi sinh vật Các phế thải của nhà máy chế biến cá hộp được thủy phân với enzyme protease thương phẩm “Umamizyme” Quá trình thủy phân enzyme được tiến hành trong bình lên men 1 lít, ở pH 7 nhiệt độ 45°C Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân được nghiên cứu (tỷ lệ enzyme/cơ chất protein thay đổi trong khoảng từ ,1 đến 1,5% (w/w), mức độ thủy phân protein, hàm lượng nitơ giải phóng

ra, trọng lượng phân tử của peptit Mức độ thủy phân trên 22,5% nhận được khi tỷ lệ enzyme/cơ chất là 1,5%, sau 4 giờ thủy phân Đã xác định được đường thẳng tuyến tính giữa mức độ thủy phân và hàm lượng nitơ thu hồi Nhân tố giới hạn quá trình thủy phân được rút ra từ kết quả thí nghiệm là nhiệt độ 45°C và pH 7 Các kết quả thí nghiệm cũng cho thấy khi thủy phân phế thải của quá trình chế biến cá hồi, enzyme

“Umamizyme” có hiệu quả thủy phân tương đương với enzyme Alcalase® 2,4L Tuy nhiên, tính ổn định của enzyme Umamizyme thấp hơn enzyme Alcalase® 2,4L [24] Sofiane Ghorbel và cộng sự (2004) tạo môi trường cung cấp nitơ cho quá trình

nuôi Rhizopus oryzae đã sử dụng dịch thủy phân từ cá mòi bằng cách cho thủy phân

nguyên liệu cá mòi bằng enzyme Alcalase ở pH 8.0 và 60oC, thời gian phản ứng thủy

phân là 3 giờ Kết quả chỉ ra rằng nguồn nitơ từ cá tạo điều kiện cho R.oryzae phát

triển tốt và tạo ra sản phẩm lipase tốt hơn so với peptone, từ đó chỉ ra rằng dịch thủy phân từ cá có thể ứng dụng trong quá trình công nghiệp lên men [22]

Ở Mỹ, e Blanc và cs (2 5) đã thủy phân cá ngừ (Katsuobushi oligopeptide – O) làm tăng hương vị của bột gia vị và có thể được sử dụng để thay thế muối trong thực phẩm và đồ uống Đây là một trong những ứng dụng của Mỹ để sản xuất bột gia

vị có hàm lượng dinh dưỡng cao [31]

Anusha G.P và cộng sự (2 7) cũng đã tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch thủy phân từ cá Mecluc Thái Bình Dương Các điều kiện thủy phân khác nhau đã được thực hiện bao gồm tự thủy phân (1 giờ ở 52oC và pH 5,5), hoặc bằng bổ sung các enzyme thương mại như Validase ® BNP hay Flavourzyme 500® L Dịch thủy phân thu được

từ loài cá này được chứng minh là có hoạt tính kháng ôxy hóa [40]

Ở Malaysia, S.Y.YU, Tan đã sử dụng enzyme alkalase 1 để sản xuất dịch

đạm thủy phân từ cá rô phi Oreochromis mossambicus Điều kiện thủy phân cho hiệu

suất cao là ở nhiệt độ 500C, pH là 8,0, với tỷ lệ một phần nước và một phần thịt cá; tỷ

lệ enzyme và cơ chất là 1 5 Sau khi đã trung hòa, dịch thuỷ phân được thu hồi và

làm nguyên liệu sản xuất bánh quy “ eropok” [45]

Năm 2 1 , Mahmoudreza Ovissipour và cộng sự, đã tạo dịch thủy phân từ nội

tạng cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares) đạt được tỷ lệ protein tương đối cao

(72,34%) và lipid thấp (1,43%) với tỷ lệ hiệu quả trong phân giải protein từ nội tạng cá ngừ là 2,85-5,35 Bằng cách thủy phân trong điều kiện tối ưu (hoạt độ enzyme, nhiệt

độ và thời gian thủy phân), đã nghiên cứu là ở nhiệt độ 60,40

C, thời gian 90,25 phút và hoạt độ của protease (Alcalase 2,2L) là 70,22 AU/kg protein [43]

Trong báo cáo năm 2 12 của Faouzi Ben Rebah và Nabil Miled đã chỉ ra rằng các sản phẩm loại bỏ trong quá trình sản xuất chế biến thủy sản là một nguồn cung cấp dinh dưỡng tuyệt vời cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong quá trình sản xuất enzyme, có thể thay thế những môi trường nuôi cấy có giá thành cao do phải

bổ sung các yếu tố tăng trưởng vào môi trường nuôi cấy Chính vì vậy việc sử dụng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến thủy sản vừa giải quyết được vấn đề về ô nhi m môi trường vừa là nguồn cung cấp môi trường nuôi cấy cho các vi sinh vật Các phụ phẩm (đầu, nội tạng, nước thải,…) đã được thử nghiệm sử dụng làm môi trường nuôi cấy phát triển cho các vi sinh vật sản xuất enzyme như protease, lipase, chitinolytic và enzyme ligninolytic đã bước đầu cho thấy có nhiều lợi thế trong quá trình sản xuất enzyme như năng suất cao, kỹ thuật đơn giản, giảm nhu cầu năng lượng và chi phí sản xuất [38]

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, công nghệ enzyme có thể xúc tác cho quá trình chuyển hóa các nguyên liệu giá trị thấp (cá tạp kém giá trị, phế phụ phẩm tôm, cá, .) thành một loại thực phẩm chức năng có giá trị cao gấp nhiều lần Ứng dụng enzyme để thủy phân protein sẽ triệt để hơn, thu được dịch đạm thuỷ phân có chất lượng cao do tạo ra được nhiều các peptit và acid amin có thành phần, tỷ lệ cân đối để bổ sung vào các thực phẩm khác cho người Dịch đạm thuỷ phân được xem là nguyên liệu đầu vào cho phát triển và sản xuất một số sản phẩm giá trị gia tăng như bột dinh dưỡng, bột gia vị, tạo nước sốt, súp đặc trưng cho các sản phẩm từ thủy sản

1.5.3 Mô hình nghiên cứu tổng quan và thực nghiệm

Phân tích tổng quan tài liệu

Giới thiệu thịt

đỏ cá ngừ

Giới thiệu enzyme nội tại

Giới thiệu quá trình tự thủy phân

Tình hình nghiên cứu và thành tựu

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật lí và hóa học

Đưa ra những kết luận

Khảo sát mức độ

protein trong nguyên liệu dưới tác dụng của các

calpain, cathepsin và collagenase

Đề xuất quy trình công nghệ thu hồi dịch đạm từ thịt đỏ

cá ngừ trên cơ

sở kích hoạt hệ enzyme

protease nội tại

Đánh giá chất lượng dịch đạm

từ cơ thịt

đỏ cá ngừ

để định hướng sử dụng

Hình 1.5 Mô hình nghiên cứu tổng quát và thực nghiệm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa và cá ngừ mắt to tươi, nguyên con được thu mua từ

Cảng Cá Thọ Quang, TP Đà Nẵng được dùng để xác định khối lượng thịt đỏ

Hình 2.1 Mẫu thịt đỏ cá ngừ

- Hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được lấy mẫu từ nhà máy đồ hộp Hạ ong, Đà Nẵng, nguyên liệu được giữ lạnh và vận chuyển trong thùng xốp cách nhiệt về phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Trường ĐH Bách khoa, ĐH Đà Nẵng Tại phòng thí nghiệm, nguyên liệu được xay nhỏ bằng máy xay (Luxta, Việt Nam) với mắt lưới xây

có đường kính lỗ 3,0 - 3,5 mm và bổ sung chất bảo quản Sau đó, nguyên liệu được chia nhỏ thành từng túi (25 gram/túi) và lưu trữ ở -20°C ± 2°C phục vụ nghiên cứu

2.2 Dụng cụ và máy móc thiết bị

Sử dụng các thiết bị có trong phòng thí nghệm Công nghệ sinh học của trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng:

Cân kỹ thuật OHAUS - Mỹ

Cân phân tích SHIMADZU AUY 220 - Nhật Bản

Máy đo pH TO EDO MP22 - Thụy S

Máy xay PANASONIC MX-SM 1031 - Malaysia

Máy lắc khô STUART SI500 - Anh

Máy ly tâm ROTANTA 460R - Đức

Tủ lạnh ALASSKA - Việt Nam

Tủ lạnh âm SANYO - Nhật Bản

Bếp điện

Thiết bị UV-vis, Biorad (Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp vật lý

Xác định nhiệt độ: sử dụng nhiệt kế kiểm tra nhiệt độ trong quá trình thực hiện phản ứng enzyme và bất hoạt enzyme

2.3.2 Phương pháp hóa lý

Xác định độ pH: Sử dụng máy đo pH để bàn TOLEDO MP220 - Thụy S thông

qua điện cực đầu thủy tinh để xác định độ pH của nguyên liệu và dung dịch enzyme

2.3.3 Phương pháp hóa sinh

2.3.3.1 Xác định hàm lượng protein

- Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp Kjeldahl (NMKL No.6, 4th 2003)

- Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hóa bằng acid H2SO4 đậm đặc với xúc tác K2SO4

và CuSO4 K2SO4 làm tăng nhiệt độ sôi còn CuSO4 là chất xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng Hỗn hợp phản ứng được kiềm hóa bởi NaOH và lượng NH3 giải phóng ra sẽ được chưng cất và thu hồi trong dung dịch acid boric Hàm lượng Nitrogen của mẫu được xác định bằng cách chuẩn độ acid boric với acid HCl Hàm lượng protein thô được tính bằng cách nhân hàm lượng Nitrogen với 6,25

Hợp chất hữu cơ C,H,N  CO2 + H2O + NH4+

OH- + NH4+ NH3 (g) + H2O

NH3 (g) + H3BO3 NH4+ + H2BO3

-H+ + H2BO3- H3BO3 Chỉ tiêu protein của nguyên liệu và thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2 (Nafiqad Branch 2) - Phương pháp thử theo NMKL No.6, 4th Ed 2003

2.3.3.2 Xác định hàm lượng lipid

- Phương pháp xác định hàm lượng chất béo tổng số trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp chiết Soxhlet (NMKL số 131, 1989)

- Nguyên tắc: Mẫu được xử lý với acid HCl 8M và sau đó thêm ethanol 95% vào, chất béo giải phóng được trích ly bởi hỗn hợp Diethyl eter và Petroleum ether Dung môi làm bay hơi và lượng chất béo còn lại được xác định bằng cách cân

Chỉ tiêu lipid của nguyên liệu và thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2 (Nafiqad Branch 2) - Phương pháp thử theo NMKL No.131-1989

2.3.3.3 Xác định hàm lượng nước

- Phương pháp xác định hàm lượng ẩm theo tiêu chuẩn NMKL số 23 - 1991

- Nguyên tắc: Mẫu được làm khô trong tủ sấy ở 1050C trong thời gian ít nhất 16 giờ Hàm lượng ẩm được xác định từ khối lượng mất đi sau khi sấy khô

Chỉ tiêu nước của nguyên liệu và thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2 (Nafiqad Branch 2) - Phương pháp thử theo NMKL No.23 - 1991

2.3.3.4 Xác định hàm lượng tro

- Phương pháp kiểm tra hàm lượng tro theo tiêu chuẩn NMKL số 173-2005

- Mô tả nguyên tắc: Mẫu được tro hóa trong lò nung ở 5500C cho đến khi tro xuất hiện màu xám trắng Hàm lượng tro được xác định từ khối lượng tro còn lại sau khi tro hóa

Tiến hành: Chỉ tiêu tro của nguyên liệu và thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2 (Nafiqad Branch 2) - Phương pháp thử theo NMKL No.173-2005

Tiến hành: Chỉ tiêu histamin của nguyên liệu và thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 2 (Nafiqad Branch 2) - Phương pháp thử theo tiêu chuẩn AOAC 977.13-2007

2.3.3.6 Xác định hàm lượng ni-tơ acid amin

- Phương pháp xác định hàm lượng nitơ acid amin đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp chuẩn độ foocmon theo tiêu chuẩn TCVN 3707-90

- Mô tả nguyên tắc: Cho foocmon tác dụng với nhóm amin (của acid amin, peptit…) và với muối amon có trong mẫu thử Chuẩn độ nhóm COOH được giải phóng ra trong phản ứng bằng dung dịch natri hydroxyt ,1N cho đến khi dung dịch đạt pH=9,2 Dựa vào lượng kiềm tiêu tốn khi chuẩn độ để tính hàm lượng nitơ acid amin-amoniac

2.3.3.7 Xác định mức độ thủy phân H

Trong đó

hàm lượng nitơ amino acid trong dịch đạm thủy phân (%)

hàm lượng nitơ amino acid trong nguyên liệu trước khi thủy phân (%); hàm lượng nitơ tổng trong nguyên liệu ban đầu (%) [46]

2.3.4 Phương pháp vi sinh

2.3.4.1 Định lượng tổng số vi sinh vật

- Phương pháp đếm khuẩn lạc theo tiêu chuẩn TCVN 4884 : 2005

- Nguyên tắc Đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy, các đ a môi trường sau khi cấy mẫu được ủ 20 – 220C hoặc 300C trong 3 ngày Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đ a, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy

để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm

sinh hóa phù hợp đặc trưng cho Salmonella spp

2.3.4.3 Định lượng Staphylococus

Phương pháp NM 66 4th ed 2003

Mô tả nguyên tắc: Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trưng và không

đặc trưng của Staphyloccocus aureus Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng

coagulase và các phản ứng đặc trưng khác ết quả được xác định bằng số lượng khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, độ pha loãng và hệ số xác nhận

2.3.5 Phương pháp cảm quan

Dùng các phép thử cảm quan để đánh giá chất lượng của dịch thủy phân

2.4 Khảo sát th c nghiệm

2.4.1 ác định thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngử

Cá ngừ ồ, cá ngừ sọc dưa, cá ngừ mắt to sau khi thu mua về được tách fillet và các thành phần khác như hình 2.2 đem đi cân để xác định tỷ lệ các thành phần

Hình 2.2 Thành phần khối lượng các cơ quan của cá ngừ

2.4.2 ác định thành phần hóa học của hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ được thu gom từ nhà máy

Mẫu thịt đỏ cá ngừ là hỗn hợp thịt đỏ các loại cá ngừ được thu gom từ Công ty

CP Đồ hộp Hạ ong (Đà Nẵng) được phân tích thành phần hóa học thông qua các chỉ tiêu hàm lượng protein, lipid, nước, tro và histamin

Cá ngừ

Tách các thành phần

Xương cá

Ruột Đầu cá

Cơ thịt

đỏ

fillet Da+ vây

2.4.3 ghiên cứu quá trình bất hoạt vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu bằng phương pháp vật l và hóa học

- Mục đích oạt thí nghiệm được thực hiện để bất hoạt vi sinh vật có trong mẫu nguyên liệu, để khẳng định quá trình tự thủy phân chỉ di n ra dưới tác dụng của enzyme nội tại, không chịu ảnh hưởng của vi sinh vật

- Tiến hành: Mẫu nguyên liệu thịt đỏ được chia ra thành các bao ni lông có khối lượng mẫu là 250 gr/một bao Và được bổ sung các chất bảo quản lần lượt là Kali Sorbat, Natri benzoat, Muối ăn, xử lý bằng tia UV, và mẫu đối chứng (không sử dụng các yếu tố để bảo quản) như trong bảng 2.1 Sau đó được bảo quản ở điều kiện -20±20C

Các mẫu được tiến hành khảo sát theo các khoảng thời gian như trong bảng 2.1 Các mẫu đã được bổ sung các chất bảo quản theo tỷ lệ cho phép của QCVN 4-12:2010/BYT về phụ gia thực phẩm - chất bảo quản

Bảng 2.1 Tỷ lệ bổ sung chất bảo quản vào mẫu nguyên liệu và phân bố thời gian lấy

mẫu phân tích vi sinh vật

Thời gian bảo quản

(tuần)

Tỷ lệ chất bảo quản /mẫu 1 2 3 4 5 6 7

Mẫu chứa Kali Sorbate 3%

Mẫu chứa Natri benzoat 2%

Mẫu xử lý tia UV Trong 2 giờ

2.4.4 Khảo sát mức độ hoạt động của các hệ enzyme calpain, cathepsin và collagenase trong nguyên liệu hỗn hợp thịt đỏ cá ngừ

- Mục đích Xác định được mức độ thủy phân protein của hỗn hợp nguyên liệu thịt đỏ cá ngừ dưới tác dụng của 3 hệ enzyme Calpain, Cathepsin, Collagenase

- Tiến hành: Sau khi xác định được việc sử dụng chất bảo quản có tác dụng tốt trong quá trình ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu về khả năng tự phân (autolysis) của các mẫu thịt đỏ cá ngừ trong điều kiện tối thích của các hệ enzyme nội tại là Cathepsin, Calpain, Collagenase [13; 38; 45] Nguyên liệu được rã đông, phối trộn với nước theo tỷ lệ 1 1, sau đó mẫu được xử

lý siêu âm trong 15 phút/mẫu để phá vỡ tế bào và bất hoạt vi sinh vật có trong mẫu