Nghiên cứu xác định hàm lượng đồng trong máu và nước tiểu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Tuy nhiên cho đến nay tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu hệ thống về xết nghiệm và chẩn đoán bệnh Wilson, vì vậy trong đề tài của luận văn chúng tôi xác định mục tiêu là áp dụng phương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM NGỌC SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỒNG TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM NGỌC SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỒNG TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Đức Lợi

phó viện trưởng viện Hóa học - viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thầy là người đã trực tiếp giao đề tài và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài để tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Lan Anh, TS Phạm Gia Môn, các cô chú, các anh chị và các bạn trong phòng Khoa hoc và Kỹ thuật Phân tích viện Hóa học –viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp

đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Gia Bình- trưởng khoa Hóa sinh Bệnh viện Quân đội 108 đã giúp đỡ nhiệt tình trong khâu lấy mẫu và bảo quản mẫu

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Thiềng, GS.TS Trần Tứ Hiếu và các thầy cô giáo khoa Hóa – trường Đại học sư phạm Thái Nguyên

đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và cũng như thời gian làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, các bạn đồng nghiệp trong phòng Dạy văn hóa , các cô chú, anh chị trong trung tâm Kỹ thuật Tổng hợp Hướng nghiệp dạy nghề và Giáo dục thường xuyên tỉnh Lào Cai, nơi tôi công tác đã tạo điều kiện để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng tri ân đến những người thân yêu trong gia đình- chỗ dựa tinh thần quý giá giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 03 năm 2013

Tác giả

Phạm Ngọc Sơn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết của nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Phạm Ngọc Sơn

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, từ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vai trò của các nguyên tố vi lượng 3

1.2 Vai trò của nguyên tố đồng đối với cơ thể 4

1.3 Tổng quan về bệnh Wilson 5

1.3.1 Nguyên nhân dẫn đến bệnh Wilson 6

1.3.2 Biểu hiện bệnh Wilson 6

1.3.3 Ảnh hưởng của Đồng đến bệnh Wilson 8

1.3.4 Cách chẩn đoán bệnh Wilson 9

1.3.5 Chữa trị bệnh Wilson 10

1.3.5.1 Thuốc D-penicillamin 11

1.3.5.2 Thuốc Trientine 12

1.3.5.3 Thuốc BAL 13

1.4 Các phương pháp phân tích đồng trong các mẫu sinh học 14

1.4.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử 14

1.4.2 Phương pháp quang phổ phát xạ, phổ khối lượng kết hợp nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS) 15

1.4.3 Phương pháp kích hoạt nơtron 15

1.4.4 Phương pháp điện hóa 16

1.4.5 Phương pháp đo quang 17

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu sinh học 17

1.5.1 Kỹ thuật vô cơ hoá khô 18

1.5.2 Kỹ thuật vô cơ hoá ướt ở áp suất khí quyển 19

1.5.3 Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao 19

1.5.4 Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền 20

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Mẫu máu 21

2.1.2 Mẫu nước tiểu 22

2.1.3 Mẫu sinh thiết gan 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 23

2.3.1 Mẫu máu 23

2.3.2 Mẫu nước tiểu 24

2.3.3 Mẫu sinh thiết gan 24

2.4 Trang thiết bị và hoá chất phục vụ nghiên cứu 24

2.4.1 Trang thiết bị 24

2.4.2 Hoá chất và dụng cụ 24

2.4.2.1 Hóa chất 24

2.4.2.2 Dụng cụ 25

2.4.3 Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn 25

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Nguyên tắc của phép đo 28

2.5.2 Trang bị của phép đo 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

3.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 32

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 32

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Natri(Na) 32

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của Kali(K) 34

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Canxi(Ca) 35

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Magiê(Mg) 37

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của độ nhớt 38

3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng của pH 40

3.2.7 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của kali, natri, canxi, magiê và glyxerin 41

3.3 Xây dựng đường chuẩn 43

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn cho mẫu huyết thanh 43

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn để phân tích mẫu nước tiểu và sinh thiết gan 44

3.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp 45

3.5 Đánh giá phương pháp phân tích 47

3.5.1 Độ lặp lại 47

3.5.2 Độ chính xác 48

3.5.3 Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích 48

3.5.3.1 Hiệu suất thu hồi với mẫu huyết thanh 48

3.5.3.2 Hiệu suất thu hồi đối với mẫu nước tiểu 49

3.6 Xây dựng quy trình phân tích kim loại đồng trong máu và nước tiểu 50

3.7 Kết quả phân tích và đánh giá trên các mẫu thực 52

3.7.1 Kết quả nghiên cứu trên mẫu nhóm đối chứng 52

3.7.1.1 Mẫu huyết thanh 52

3.7.1.2 Mẫu nước tiểu 55

3.7.1.3 Mẫu sinh thiết gan 57

3.7.2 Kết quả nghiên cứu trên các bệnh nhân Wilson 58

3.7.2.1 Kết quả nghiên cứu trong quá trình chẩn đoán bệnh 58

3.7.2.2 Kết quả nghiên cứu trong quá trình điều trị bệnh Wilson 61

KẾT LUẬN 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AAS :Atomic Absorption Spectrometry

AES : Atomic Emission Spectrometry

BAL : British anti-Lewisite

CV-AAS : Could Vapour - Atomic Absorption Spectrometry

EDL : Electrodeless Discharge Lamp

HCL : Hollow Cathode Lamp

ICP-MS : Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry

ICP-OES : Inductively Coupled Plasma Emission Spectrometry

NAA : Neutron Activation Analysis

Trientine :Trientine hydrochloride

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố 27 Bảng 2.2: Phân tích phương sai một yếu tố 27 Bảng 3.1: Các thông số đo phổ của đồng 32 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của Na đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 33 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của K đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của Ca đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của Mg đến đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

của đồng 37 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của độ nhớt đến đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

của đồng 38 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

của đồng 40 Bảng 3.8: Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến phép đo phổ hấp thụ

nguyên tử của đồng 41 Bảng 3.9: Kết quả phân tích mẫu chuẩn đồng nồng độ 0,2mg/l trong nền

glyxerin 10% 46 Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu chuẩn đồng nồng độ 0,2mg/l trong nền

nước cất 46 Bảng 3.11: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 47 Bảng 3.12: Kết quả phân tích mẫu chuẩn 48 Bảng 3.13: Kết quả phân tích đánh giá hiệu suất thu hồi đồng trong

huyết thanh 48 Bảng 3.14: Kết quả phân tích đánh giá hiệu suất thu hồi đồng trong

nước tiểu 49 Bảng 3.15 : Kết quả phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh nhóm

đối chứng 54

Bảng 3.16: Kết quả phân tích hàm lượng đồng trong nước tiểu nhóm

đối chứng 56

Bảng 3.17: Kết quả phân tích hàm lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan nhóm đối chứng 57

Bảng 3.18: Hàm lượng đồng trong huyết thanh nhóm bệnh dưới 18 tuổi 59

Bảng 3.19: Hàm lượng đồng trong huyết thanh nhóm bệnh trên 18 tuổi 59

Bảng 3.20: Hàm lượng đồng trong nước tiểu nhóm bệnh 59

Bảng 3.21: Hàm lượng đồng trong mẫu sinh thiết gan nhóm bệnh và nhóm đối chứng 59

Bảng 3.22: Kết quả đào thải đồng của bệnh nhân 18 tuổi 62

Bảng 3.23: Kết quả đào thải đồng của bệnh nhân 12 tuổi 63

Bảng 3.24: Kết quả đào thải đồng của bệnh nhân 15 tuổi 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Chuyển hóa đồng bình thường 5

Hình 1.2.Tổn thương da trong bệnh wilson 6

Hình 1.3: Chuyển hóa đồng trong bệnh Wilson 8

Hình 1.4: Sơ đồ nguyên lý của máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử 30

Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của Na đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 34

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của K phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 35

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của Ca đến độ hấp thụ của đồng 36

Hình 3.4 : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của Mg đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 38

Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ glyxerin đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng 39

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến độ hấp thụ của đồng 41

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng đồng thời các yếu tố đến độ hấp thụ của đồng 42

Hình 3.8: Đường chuẩn xác định đồng trong huyết thanh 44

Hình 3.9: Đường chuẩn xác định đồng trong nước tiểu 45

Hình 3.10: Quy trình phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh 51

Hình 3.11: Quy trình phân tích hàm lượng đồng trong nước tiểu 52

Hình 3.12: Sự đào thải của đồng qua nước tiểu trong quá trình điều trị 63

Hình 3.13: Sự đào thải đồng qua nước tiểu trong quá trình điều trị bệnh nhân 12 tuổi 64

Hình 3.14: Sự đào thải của đồng qua nước tiểu trong quá trình điều trị của bệnh nhân 15 tuổi 65

MỞ ĐẦU

Các nguyên tố kim loại có vai trò rất lớn đến các hoạt động sống của con người, ngoài các nguyên tố đa lượng như natri, kali, canxi, magiê chiếm tới 99% các ion kim loại trong cơ thể còn có các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm, selen… tuy tồn tại với hàm lượng rất nhỏ nhưng các nguyên tố này lại là xúc tác cho hàng loạt phản ứng enzym như phản ứng oxi hóa khử sinh học, phản ứng thuỷ phân [2,8]…

Đồng là một nguyên tố quan trọng, nó tạo phức với nhiều protein Trung bình mỗi người mỗi ngày cần khoảng 2 – 5 gam đồng, ít nhất là 0,9 gam/ngày Đồng được hấp thụ qua đường ruột là chính, cụ thể là ở tá tràng

và thành ruột non Đồng được di chuyển nhờ kết hợp với albumin và aminoaxit tiết ra từ gan Khi vào gan, đồng kết hợp với một loại protein tạo ceruloplasmin và di chuyển đến các cơ quan khác của cơ thể, lượng đồng dư thừa được thải qua mật [15,16,]

Nếu vì một lý do nào đó mà tại gan không sản xuất được ra Ceruloplasmin thì đồng tồn tại ở dạng tự do và bị tích tụ ở gan Khi lượng đồng trong gan quá lớn thì đồng sẽ di chuyển vào máu dưới dạng tự do và đi đến các bộ phận như: não, mắt, cơ, các mô,… gây nên các triệu chứng như rối loạn thần kinh, co quắp chân tay, khó vận động, xuất hiện vòng màu xanh quanh mắt… Đó là triệu chứng của một loại bệnh mà thế giới gọi là bệnh Wilson [11,17]

Trên thế giới có trên 300 nghìn người mắc bệnh Wilson, tỉ lệ mắc bệnh Wilson trên dân số là 1/30000 đến 1/50000 người Theo tỉ lệ này, ước lượng hiện nước ta có khoảng 1600 người mắc bệnh Wilson nhưng cho đến nay mới chỉ chẩn đoán được hơn 100 người, số còn lại 1500 người vẫn chưa được phát hiện, bệnh có tỷ lệ tử vong là rất cao nếu không được chẩn đoán

và điều trị kịp thời Tuổi khởi bệnh trung bình ở nhiều nước từ 12 đến 16 tuổi; Ở Trung Quốc tuổi bệnh nhân nam là 20,9 tuổi, ở Hoa Kỳ là 23,2 tuổi cho cả hai giới, còn đối với Nhật Bản bệnh từ 6 tuổi 9 tháng đến 13 tuổi 11

tháng [16,19] Ở Việt Nam tuổi khởi bệnh từ 9 đến 13 tuổi, trong đó có 1 bệnh nhân phát hiện ở tuổi 37 [2]

Tại Việt Nam mới chỉ phát hiện được trên 100 bệnh nhân mắc bệnh Wilson trong đó 12 người đã tử vong, xảy ra chủ yếu đối với các bệnh nhân chẩn đoán muộn và không có thuốc điều trị đặc hiệu

Để có thể phát hiện và điều trị sớm bệnh Wilson thì việc xác định hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học bao gồm máu và nước tiểu là rất cần thiết, trên thế giới đây là chỉ số cận lâm sàng quan trọng nhất để chẩn đoán bệnh Wilson Tuy nhiên cho đến nay tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu hệ thống

về xết nghiệm và chẩn đoán bệnh Wilson, vì vậy trong đề tài của luận văn chúng tôi xác định mục tiêu là áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử để xác định hàm lượng đồng trong mẫu máu và nước tiểu để phục

vụ chẩn đoán và điều trị bệnh Wilson

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vai trò của các nguyên tố vi lượng

Người ta đã xác định được các chức năng cơ bản của các nguyên tố vi lượng đối với cơ thể là: tác dụng đặc hiệu, tạo cân bằng nội môi và có thanh tác qua lại [8]

Tác dụng đặc hiệu: Mỗi nguyên tố vi lượng đều mang tính đặc hiệu riêng trong việc thực hiện các chức năng sinh học của nó, không thể thay thế nguyên tố vi lượng này bằng một nguyên tố vi lượng khác thanh tự về bản chất hoá học Một số nguyên tố vi lượng bền ở trạng thái có nhiều hoá trị như: Fe,

Cu, Mo, Se cho phép thực hiện chức năng oxi hoá khử sinh học, trong khi đó một số nguyên tố chỉ bền ở trạng thái đơn trị như Zn và Ni

Tính đặc hiệu về chức năng của nguyên tố vi lượng còn được đặc trưng nhờ các chất mang, cũng như các protein đặc hiệu Những protein này chỉ nhận diện, liên kết chọn lọc, dự trữ hoặc vận chuyển kim loại này tới các cơ quan nhất định trong cơ thể

Tương tác qua lại: Một lượng dư nguyên tố vi lượng này có thể ngăn cản

sự chuyển hoá của một nguyên tố vi lượng khác ngay cả trong điều kiện bình thường Hơn nữa, độc tính của một nguyên tố vi lượng gây độc có thể tăng lên hoặc giảm đi khi có mặt của nguyên tố khác Nhiều nghiên cứu đã cho thấy chế

độ ăn giầu kẽm sẽ ngăn cản sự hấp thu đồng tại thành ruột dẫn tới thiếu đồng, mặc dù lượng thức ăn đó có hàm lượng đồng phù hợp vì thế kẽm đựoc coi là yếu tố đối kháng đối với sự hấp thu của đồng Mặt khác khi thiếu đồng lại gây

ra sự thiết hụt của sắt và dẫn tới hiện tượng thiếu máu Sự tương tác giữa các nguyên tố vi lượng còn thể hiện ở chỗ, khi có mặt nguyên tố selen thì độc tố của chì và thủy ngân sẽ giảm và nguyên tố này được gọi là nguyên tố bảo vệ kháng lại độc tính của các nguyên tố kim loại nặng [8,18]

1.2 Vai trò của nguyên tố đồng đối với cơ thể

Đồng có trong tất cả các cơ quan trong cơ thể, nhưng nhiều nhất là ở gan Đồng có nhiều chức năng sinh lý quan trọng chủ yếu cho sự phát triển của

cơ thể như: thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng sắt để tạo thành Hemoglobin của hồng cầu Nếu thiếu đồng trao đổi sắt cũng sẽ bị ảnh hưởng, nên sẽ bị thiếu máu và sinh trưởng chậm… Đồng tham gia vào thành phần của sắc tố màu đen, nếu thiếu đồng thì da sẽ bị nhợt nhạt, lông mất màu đen… Nhu cầu của

cơ thể với đồng ít hơn sắt nhưng không thể thiếu đồng tới hoạt động của hệ thần kinh và các hoạt động khác của cơ thể[2,7,8]

Đồng tham gia thành phần cấu tạo của nhiều loại enzim có liên quan chặt chẽ đến quá trình hô hấp của cơ thể như: Cytocromoxydase, Tysosinase.… Đồng còn hoạt động như là chất chống oxy hoá (antioxidant) các gốc tự do và làm giảm quá trình lão hoá Ceruloplasmin trong huyết thanh

là một hợp chất của -2 Globulin với đồng được tổng hợp ở gan, mỗi phân tử Ceruloplasmin chứa 6 nguyên tử đồng trong cấu trúc của nó, có chức năng là một peroxydase xúc tác phản ứng oxy hoá sắt hoá trị II thành sắt hoá trị III, dạng này kết hợp với Transferin trong huyết thanh để vận chuyển sắt hoá trị III trong quá trình hô hấp [11,13]

Sự hấp thu đồng xảy ra nhiều nhất ở dạ dày và tá tràng, có hai cơ chế hấp thu đồng Một cơ chế liên quan đến sự vận chuyển phức Aminoaxit – Cu qua màng niêm mạc Cơ chế thứ hai thông qua protein trung gian, đồng kết hợp với protein phân tử lượng thấp ở niêm mạc dạ dày là Metallothionein thông qua liên kêt SH Metallothionein liên kết với đồng để dự trữ và đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà hàm lượng đồng nội môi Đồng theo thức ăn đi vào cơ thể được hấp thu 40-60%, sau khi hấp thu sẽ được vận chuyển bởi Albumin tới gan và được dự trữ ở dạng Cuproprotein Một lượng nhỏ đồng được giải phóng ra

từ gan dưới dạng phức với axit amin, còn phần lớn dưới dạng Ceruloplasmin Ceruloplasmin mang lượng đồng mà cơ thể cần thiết (2-5mg/ngày) được chuyển

tới gan đi đến các cơ quan cần thiết của cơ thể, phần còn lại được tách ra dưới dạng tự do và thải qua mật là chính Một phần rất ít đồng tự do thải qua nước

tiểu [11,15,18,]

Cu/thức ăn

40-60% hấp thu

(2-5mg)

Cu-Albumin Cu-2Globulin Ceruloplasmin

(lỏng lẻo) (tế bào gan)

16 tuổi; ở Trung Quốc tuổi bệnh nhân nam là 20,9 tuổi, ở Hoa Kỳ là 23,2 tuổi cho cả hai giới, còn đối với Nhật Bản bệnh từ 6 tuổi 9 tháng đến 13 tuổi

11 tháng Ở Việt Nam bệnh nhân từ 9 đến 13 tuổi, trong đó có 1 bệnh nhân phát hiện ở tuổi 37 [2]

1.3.1 Nguyên nhân dẫn đến bệnh Wilson

Nguyên nhân gây bệnh là do sự khiếm khuyết của gan trong bài tiết đồng, gan không sản xuất ra Ceruloplasmin nên đồng bị tích luỹ phần lớn ở gan, khi hàm lượng đồng trong gan cao, đồng sẽ trực tiếp vào máu ở dạng tự

do và tích luỹ ở não, thận và đáy mắt… Sự tích luỹ của đồng sẽ gây ảnh hưởng đến chức năng của não, thận và dẫn đến tử vong nếu không được chữa trị kịp thời

1.3.2 Biểu hiện bệnh Wilson

Hình 1.2.Tổn thương da trong bệnh wilson

Triệu chứng thần kinh của bệnh Wilson thường khởi phát sau 10 tuổi, nhưng có khi xuất hiện sớm lúc 4 tuổi, hoặc rất muộn khi 50 tuổi Bệnh Wilson biểu hiện phức tạp với nhiều loại triệu chứng như sau:

- Về thần kinh: dấu hiệu nổi bật là rối loạn trương lực cơ và các động tác bất thường Trương lực cơ tăng lan tỏa kiểu ngoại tháp thấy rõ ở các cơ mặt, cơ phát âm, cơ vùng cổ và thắt lưng Cường độ và biên độ của tăng trương lực luôn thay đổi, có khuynh hướng tăng lên khi bệnh nhân gắng sức, đi, nói và đôi khi có thể có co thắt đối động Triệu chứng cổ điển mô tả bộ mặt Wilson có

đặc điểm bất động mặt - miệng - hầu Bệnh nhân thường khó nói, tốc độ nói chậm, âm thanh đơn điệu, loạn âm, khi đi và khi đứng thường thấy cứng đờ như tượng Những động tác bất thường bao gồm run, múa giật, múa vờn, co vặn, động tác định hình Đôi khi có thể thấy dấu hiệu thấp kín đáo rối loạn nuốt, rối loạn mắt như hạn chế liếc, đọc, quy tụ, rối loạn cơ tròn, rối loạn thần kinh thực vật như ra nhiều dãi, nhiều trứng cá, rối loạn vận mạch Đặc biệt có thể xảy ra những cơn kịch phát là các thể động kinh, có khi còn có thể gặp cơn đột quỵ[2,15,16]

- Về thần kinh: ở nhiều bệnh nhân sớm có biểu hiện rối loạn cảm xúc và khí sắc Nhiều trường hợp suy yếu trí tuệ có khuynh hướng tiến tới tâm thần sa sút, thay đổi nhân cách, lo âu…, có khi có các cơn loạn thần

- Rối loạn sắc tố: dấu hiệu này thấy rõ ở mắt và ngoài da Ở mắt xuất hiện vòng Kayser - Fleischer với kích thước 1-2 mm màu xanh nâu, quanh giác mạc ở vị trí mặt sau màng Descemet Đồng có thể lắng đọng ở võng mạc và thể thủy tinh gây đục nhân hình hoa hướng dương (theo Siemerling và Oloff) Tình trạng lắng đọng ở da thất thường, xảy ra chậm; nhìn da thấy màu nâu nhạt hoặc xám nhạt

- Các triệu chứng gan và tiêu hóa: các triệu chứng gan và tiêu hóa thường xuất hiện trước khi có biểu hiện thần kinh Tổn thương gan thấy ở 40% bệnh nhân Biểu hiện phổ biến là viêm gan mãn mà có thể nhầm với viêm gan

do virut, do rượu…, xơ gan mà lâm sàng không thể phát hiện được Bệnh cảnh của xơ gan diễn ra với gan to rồi teo, tăng áp lực tĩnh mạch cửa, giãn tĩnh mạch thực quản, lách to Một số triệu chứng tiêu hóa như đi lỏng kèm theo sốt, nôn, chán ăn, đau bụng, chảy máu mũi, chảy máu lợi

- Các rối loạn khác hay thấy như: biến đổi xương khớp, mất chất vôi kiểu nhuyễn xương, rỗ xương làm cho xương dễ gãy, ở khớp thấy đóng vôi ở các dây chằng và đầu sụn có thể bị mòn Rối loạn nội tiết như thiểu năng sinh

dục, kèm rối loạn thực vật vùng gian não như ngủ nhiều, hạ hoặc hơi tăng thân nhiệt, có thể bị đái tháo đường Một số bệnh nhân có thể gặp thiếu máu huyết tán, tổn thương thận gây protein niệu

- Một số bệnh nhân bị bệnh nhẹ chưa biểu hiện triệu chứng

1.3.3 Ảnh hưởng của Đồng đến bệnh Wilson

Nguyên nhân gây ra bệnh Wilson là do đồng (Cu) không được thải ra qua mật nên bị tích tụ trong cơ thể Bình thường, khi đồng theo thức ăn vào cơ thể sẽ để lại một lượng rất ít khoảng từ 2 đến 5mg/ngày cho một số hoạt động chuyển hóa cần thiết của cơ thể, lượng còn lại sẽ được thải theo đường mật ra ngoài là chính Do cơ thể bị rối loạn đột biến của gen nên ở người mắc bệnh Wilson, lẽ ra tại gan có quá trình kết hợp giữa Cu với α-2 Globulin tạo Ceruloplasmin thì quá trình này lại không xảy ra nữa, do đó đồng không được đưa vào cơ thể để phục vụ cho các hoạt động cần thiết đồng thời cũng không được thải ra qua đường mật mà bị tích tụ ở gan và thải qua nước tiểu

là chính Chuyển hóa đồng đối với bệnh wilson được đưa ra ở hình 1.3

40-60% hấp thu

(2-5mg)

(lỏng lẻo) (tế bào gan)

Ceruloplasmin Cu tự do/lysosome

Wilson’s disease Wilson’s disease

Hình 1.3: Chuyển hóa đồng trong bệnh Wilson

Khi lượng đồng trong gan quá lớn, đồng tự do sẽ bị tràn vào máu và theo máu đi đến và lắng đọng gây nhiễm độc cho các bộ phận như: gan, não,

máu, mắt, khớp

Khi lượng đồng tích tụ ở gan sẽ gây ra bệnh gan Có thể biểu hiện bằng kết quả bất thường men gan qua xét nghiệm sức khỏe thường quy hoặc giống viêm gan siêu vi, hay một bệnh gan mạn tính hoặc xơ gan cổ trướng

Còn khi đồng lắng đọng ở cơ quan thần kinh, trẻ sẽ có những biểu hiện như tự nhiên khó nói, chảy nước miếng, những vận động khéo léo của bàn tay

bị mất đi, viết chữ chậm, xấu, nặng hơn trẻ sẽ bị co cứng tay, chân hoặc có những biểu hiện tâm thần như trầm cảm, những rối loạn tâm thần, khó nuốt Ở mắt, sự tích tụ lượng đồng sẽ gây ra lắng vòng Keyer-Fleischer, ở tim gây bệnh

cơ tim và ở thận sẽ gây bệnh thận Đặc biệt, khi đồng giải phóng đột ngột vào máu sẽ gây tán huyết (vỡ hồng cầu dữ dội) Trong trường hợp này, nếu bệnh diễn tiến đến suy gan tối cấp mà không được ghép gan bệnh nhân sẽ

tử vong [15,16]

1.3.4 Cách chẩn đoán bệnh Wilson

Bệnh có những triệu chứng gần giống với những bệnh khác nên dễ bị chẩn đoán nhầm Trên thực tế, các triệu chứng của bệnh thường khiến người ta nhầm lẫn bệnh Wilson với bệnh thần kinh hoặc bệnh gan mà không rõ nguyên nhân Như vậy chìa khóa để chẩn đoán bệnh Wilson là đặt ra khả năng của nó đối với bệnh nhân có các triệu chứng trên (dù nhẹ), sau đó áp dụng các biện pháp lâm sàng và cận lâm sàng khác để xác định Từ đó nếu đã xác định được bệnh nhân mắc bệnh Wilson thì tuỳ vào mức độ nặng nhẹ của người bệnh mà

có hướng điều trị Cụ thể chẩn đoán sinh hóa bệnh Wilson dựa trên:

- Các triệu chứng của bệnh nhân như đã nêu ở trên

- Tăng luợng đồng bài tiết qua nước tiểu

- Tăng lượng đồng trong gan

- Giảm lượng Ceruloplasmin/huyết thanh

Wilson là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường nên có thể nhiều người trong cùng một gia đình sẽ mắc bệnh Vì vậy, chỉ cần phát hiện một người mắc bệnh thì gia đình nên đưa toàn bộ người thân đến bệnh viện để kiểm tra xem có bị mắc bệnh hay không

1.3.5 Chữa trị bệnh Wilson

Nguyên tắc điều trị khá đơn giản là không cho người bệnh ăn những thức ăn có chứa nhiều chất đồng như gan, sò, ốc, sô-cô-la và dùng thuốc để thải chất đồng ra ngoài cơ thể Ngược lại, nếu không được điều trị, tất cả người bệnh mắc bệnh Wilson đều dẫn đến xơ gan, tay chân co quắp , tử vong Bệnh Wilson có diễn tiến âm ỉ hoặc có thể trở nặng bất cứ lúc nào Đa số người mắc bệnh Wilson có biểu hiện vàng da như một bệnh viêm gan siêu vi B nhưng có đặc điểm khác là bị tán huyết quá nhiều

Về vấn đề thuốc điều trị bệnh Wilson, hiện có 2 nhóm thuốc, một nhóm dùng để thải đồng và một nhóm ngăn hấp thu đồng

Nhóm thuốc ngăn hấp thu đồng sẽ dùng sau khi bệnh nhân đã được điều trị thải đồng đủ thời gian và bước vào giai đoạn ổn định Nhóm này cũng dùng

để điều trị bệnh được phát hiện ở giai đoạn sớm lúc mà bệnh chưa có biểu hiện nhiều, thường là qua tầm soát những gia đình có người bệnh, người ta thường dùng là kẽm axetat [11,15,16]

Nhóm thuốc thải đồng có 3 loại: nhóm thuốc D-Penicilamin, Trientine

và BAL Nhóm D-Penicilamin và BAL là nhóm thuốc điều trị thải đồng mạnh nhất Tuy nhiên thuốc này có nhiều tác dụng phụ và có thể là không thích hợp trong điều trị những trường hợp bệnh thuộc thể thần kinh Nhóm Trientine thải đồng yếu hơn nhưng ít tác dụng phụ hơn và thường được bác sĩ chỉ định trong trường hợp bệnh ở thể thần kinh Những người bị bệnh nặng ban đầu dùng D – Penicilamin sau đó dùng Trientine [11,15,17,23]

1.3.5.1 Thuốc D-penicillamin

D-penicillamin có tên thương mại là Cuprimine, dạng Cuprimine viên

nang 125mg, 250mg và depen viên nén 250mg D-penicillamin là một thuốc chống thấp được dùng điều trị bệnh nhân viêm khớp dạng thấp hoạt động Thuốc cũng được phân loại là tác nhân tạo phức với kim loại dùng điều trị bệnh Wilson, một bệnh di truyền gây lắng đọng đồng quá nhiều trong các mô

cơ thể nên được dùng để thúc đẩy đào thải đồng ra khỏi cơ thể khi chất này lắng đọng trong các mô, não, mắt… Khi bệnh nhân uống thuốc D-penicilamine sẽ tạo thành phức sau:

Liều dùng: Từ 0,25g – 2g/ngày và uống thuốc lúc đói, ít nhất 1 giờ

trước bữa ǎn hoặc 2 giờ sau bữa ǎn

Thanh tác thuốc: Về mặt lý thuyết bệnh nhân dị ứng với penicillin thường

mẫn cảm với penicillamin, nhưng điều này không hay xảy ra Không dùng penicillamin cho những bệnh nhân đang uống muối vàng (myochrysine, ridaura, solganal), thuốc chống sốt rét (plaquenil), phenylbutazon (butazolidine) hoặc các thuốc gây độc tế bào (cytoxan, imuran, rheumatrex) vì những nguy cơ ở

D-tủy xương và thận Penicillamin có thể làm yếu protein collagen hình thành các

mô cơ thể Do đó, người ta khuyên nên giảm liều khi phẫu thuật và tǎng liều trở lại khi vết mổ đã lành D-Penicillamin có thể gây phát ban khi bắt đầu điều trị và thường biến mất sau khi ngừng thuốc một vài ngày Phát ban muộn, xảy

ra sau 6 tháng điều trị, có thể sau vài tuần mới biến mất Phát ban có thể gây ngứa, thường điều trị được bằng cách dùng thêm kháng histamin Phát ban gây sốt và đau khớp thường cần ngừng D-penicillamin Thuốc cũng có thể gây chán ǎn, buồn nôn, đau bụng và mất cảm nhận vị giác D-Penicillamin có thể gây suy tủy và bệnh thận nặng Tất cả những bệnh nhân dùng penicillamin đều cần xét nghiệm máu và nước tiểu thường xuyên để theo dõi Penicillamin có nguy cơ gây bệnh miễn dịch(hiếm gặp), như lupus ban đỏ hệ thống, viêm đa

cơ, hội chứng Goodpasture và bệnh suy nhược cơ thể nặng

Trientine là một hợp chất phức dùng để loại lượng đồng dư thừa ra khỏi

cơ thể Mỗi viên nang 250mg có thêm các thành phần không hoạt động là gelatin, oxit sắt, axit stearic và oxit titan Khi đi vào cơ thể Trientine kết hợp với đồng trong máu tạo thành hợp chất phức, phức này được bài tiết qua đường nước tiểu Tuy nhiên nếu so sánh độ bền phức thì phức của đồng với D-Penicilamine bền hơn phức của đồng với Trientine nên Trientine loại đồng kém hơn D-Penicilamine

Liều dùng: người lớn từ 750 – 1250 mg/ngày, trẻ em từ 500 – 750

mg/ngày Ngày uống từ 2 đến 4 lần Người lớn cũng chỉ được sử dụng tối đa là 2.000mg/ngày, trẻ em là tối đa 1.500mg/ngày Liều lượng Trientine chỉ tăng lên khi các phản ứng lâm sàng chưa đủ hoặc nồng độ đồng tự do trong huyết thanh liên tục lớn hơn 0,2mg/l Thuốc dùng khi đói trước khi ăn 1 giờ hoặc sau

khi ăn 2 giờ, uống cách nhau 1 giờ nếu dùng các thuốc khác

1.3.5.3 Thuốc BAL

Thuốc BAL là viết tắt của British anti-Lewisite được nghiên cứu bởi nhà sinh hóa người Anh trong chiến tranh thế giới thế hai là loại thuốc dùng để giải độc các hợp chất Lewisite là ký hiệu của các dạng hợp chất asen hữu cơ, đặc biệt là asen, đây là các chất độc được sử dụng trong các loại vũ khí hóa học, hiện nay BAL cũng được sử dụng nhiều để giải độc các kim loại nặng như

Hg, Pb và điều trị bệnh Wilson Hoạt chất của thuốc BAL là 2,3 dimercapto propanol có công thức hóa học là C3H8S2O, trong phân tử có chứa hai nhóm thiol (SH), nó liên kết với kim loại nặng thông qua cầu lưu huỳnh tạo ra các chất ít độc hơn BAL được dùng dưới dạng dung dịch dầu tiêm bắp, có hiệu quả sau 30 phút đến 1 giờ, trong vòng 4 giờ sẽ thải trừ hết qua thận, nên cứ 4 giờ tiêm một lần trong trường hợp ngộ độc cấp (với liều 3 - 5 mg/kg thể trọng) hay dùng hàng ngày trong 2 - 3 tuần (với liều 3mg/kg thể trọng) sẽ không sợ tích lũy Tuy nhiên ở liều cao hơn liều điều trị thì BAL có thể gây buồn nôn, nôn, nhức đầu, tăng huyết áp, liều cao hơn nữa có thể gây hôn mê Riêng trẻ

em có thể bị sốt, giảm bạch cầu trung tính tạm thời Phải hết sức cẩn thận với người có chức năng gan không bình thường Chỉ dùng cho phụ nữ có thai trong trường hợp ngộ độc cấp tính, có nguy cơ đe dọa tính mạng Sự kết hợp của nguyên tố đồng trong máu với BAL tạo thành phức sau:

1.4 Các phương pháp phân tích đồng trong các mẫu sinh học

Hiện nay có nhiều phương pháp nhạy và chọn lọc để phân tích hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học như: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phương pháp phổ phát xạ nguyên tử(AES), phương pháp kích hoạt nơtron(NAA), phương pháp phổ khối lượng kết hợp với nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS), phương pháp chiết trắc quang và phương pháp

điện hóa [1,8,9,10,14,24,25,26]

1.4.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp phổ biến nhất hiện nay để phân tích đồng trong các mẫu sinh học, phương pháp này có

ưu việt là quá trình xử lý mẫu đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao Các kĩ thuật nguyên tử hóa thường được sử dụng là kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa và lò graphit Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kĩ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa để phân tích đồng trong các mẫu huyết thanh, nước tiểu và sinh thiết gan [10,22,25,16]

1.4.2 Phương pháp quang phổ phát xạ, phổ khối lượng kết hợp nguồn

cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS)

Hiện nay việc xác định hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học đã được nhiều tác giả trên thế giới đề cập, phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử sử dụng nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-OES) được sử dụng tương đối phổ biến đối với các mẫu tóc và mô, tuy nhiên đối với mẫu huyết thanh và nước tiểu, phương pháp này có nhược điểm là sự ảnh hưởng của thành phần nền trong mẫu do độ nhớt của dung dịch lớn cũng như ảnh hưởng của các nguyên tố đi kèm, đặc biệt là ảnh hưởng của K và Na đến phép đo của đồng Để khắc phục ảnh hưởng trên, tác giả thường tiến hành

vô cơ hóa mẫu và chiết tách đồng ở dạng phức sau đó chiết bằng các dung môi hữu cơ để loại bỏ thành phần nền

Phương pháp phổ khối lượng sử dụng nguồn cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS) là phương pháp hiện đại nhất để xác định các nguyên tố vết trong các mẫu sinh học, tuy nhiên chỉ có một số ít công trình sử dụng phương pháp này để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu Nguyên nhân

là do sự ảnh hưởng của quá trình hình thành đa nguyên tử có số khối trùng với

số khối của nguyên tố phân tích Đối với 63Cu+ ¶nh h-ëng do sù h×nh thµnh cña (40

Ar23Na+), với 65Cu+ ( 48Ca17O+, 33S32S+, 32S17O16O+ ), với 75

As+ (40Ar35Cl+), với 56Fe+ (40Ar16O+ và 40Ca16O+), 57Fe+(40Ar16O1H+ và

40

Ca16O1H+), 64Zn+(40Ar24 Mg+ và 36Ar12C16O+) và 66Zn+(40Ar26Mg+ và 132Ba++), mặt khác thành phần mẫu huyết thanh và nước tiểu rất phức tạp, các nguyên tố

Ca, Mg, Na, K, S có nồng độ lớn hơn nhiều các nguyên tố cần phân tích nên ICP-MS mặc dù là phương pháp rất hiện đại nhưng không được sử dụng nhiều

để phân tích nguyên tố đồng trong các mẫu sinh học [13,25]

1.4.3 Phương pháp kích hoạt nơtron

Phương pháp kích hoạt nơtron đã được ứng dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học từ năm 1964, nguyên tắc của phương pháp là sử dụng

chùm nơtron kích hoạt vào mẫu, sau đó bức xạ gama được giải phóng bởi Cu , phương pháp này có độ nhạy cao tuy nhiên ảnh hưởng của Fe59

và Co60 là rất lớn nên phương pháp này ít được sử dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học[13,22]

1.4.4 Phương pháp điện hóa

Để xác định Cu trong các mẫu sinh học tác giả Alireza Mohadesi, Ashraf và cộng sự đã sử dụng phương pháp vol-ampe hòa tan xung vi phân anốt Mẫu được vô cơ hóa bằng phương pháp vô cơ hóa khô, sau đó tiến hành hòa tan trong axit nitric đặc Phép đo điện hóa dựa trên nguyên tắc tạo phức của đồng với Nitroso-R trên bề mặt điện cực Đầu tiên Pyrrole được polyme hóa trong sự có mặt của Nitroso-R Màng polypyrrole (OPPy) đã được biến tính với Nitroso-R phủ trên bề mặt điện cực nền platin phản ứng với Cu(II) trong môi trường pH trung tính để hình thành phức Quá trình tạo phức giữa Nitroso-R và Cu(II) cho phép làm giàu Cu(II) từ các dung dịch mẫu trên bề mặt điện cực Sau đó tiến hành đo von-ampe hòa tan anốt trong nền đệm axetat, pic hòa tan của đồng được đo tại thế +0,08 V Khoảng tuyến tính của phép đo được xác định trong khoảng từ 1,2 tới 243,9 ng mL-1

và giới hạn phát hiện là 0,7 ng.mL-1 Phương pháp này được sử dụng để xác định các ion Cu trong các sinh học Kết quả cho thấy khả năng áp dụng phương pháp để xác định các ion này trong các mẫu thực [9]

Tuy nhiên, phương pháp này có nhiều nhược điểm do sự có mặt của các chất ảnh hưởng Sự có mặt của các ion khác có khả năng tạo phức với Nitroso-

R có thể ảnh hưởng tới quá trình tạo phức của Cu(II) do sự cạnh tranh các vị trí tạo phức của Nitroso-R trên màng OPPy Khi quy trình trên được áp dụng với

sự có mặt của 500 µg L-1

Co(II), Hg(II), Ag(I), Ni(II), và Fe(III) làm suy giảm peak của Cu(II) lần lượt 10, 13, 17, 9 và 21%

1.4.5 Phương pháp đo quang

Phương pháp chiết trắc quang đã được tác giả Ramon E.Stoner đề xuất

từ năm 1963 để xác định đồng trong mẫu sinh học Mẫu được vô cơ hóa bằng hỗn hợp axit nitric và perchloric sau đó đồng được tạo phức với diphenylcarbazid trong môi trường kiềm và chiết trong benzen Mật độ quang của phức được đo tại bước sóng 450 nm Phương pháp này có thể xác định được hàm lượng đồng đến nồng độ ppm, tuy nhiên ảnh hưởng của các nguyên

tố đi kèm trong các mẫu sinh học như Fe, Mn và Hg sẽ cạnh tranh tạo phức và làm giảm hàm lượng của đồng, mặt khác thời gian phân tích mẫu kéo dài và độ lặp lại của phương pháp thấp hơn so với phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, nên hiện nay phương pháp này ít được sử dụng để phân tích đồng trong các mẫu sinh học [2,22]

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu sinh học

Để xác định hàm lượng đồng trong các mẫu sinh học, mẫu cần phải vô

cơ hoá mẫu trước khi phân tích Một số phương pháp ôxy hoá đã được nghiên cứu, phần lớn sử dụng các axit có tính ôxy hoá hoặc persulfat Tuy nhiên việc đánh giá hiệu quả của quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau [ 1,3,26]

Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: tro hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1,21 ] Quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá

là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau

Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: Vô cơ hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô

cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1 ]

1.5.1 Kỹ thuật vô cơ hoá khô

Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung

ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình

xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch Việc tro hoá thường được bổ sung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1,4]

Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:

- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu

- Tro hoá, đốt cháy các chất hữu cơ của mẫu

- Phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu

- Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của mẫu về dạng đơn giản (từ dạng hữu cơ sang vô cơ)

- Quá trình ôxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong mẫu

- Giải phóng ra một số khí như CO, CO2, SO2,

- Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với

chất phụ gia thêm vào, tạo thành các chất lúc đầu không có

Đối với phân tích hàm lượng các kim loại không bay hơi trong các mẫu

có hàm lượng hữu cơ cao, tro hoá khô là một phương pháp tương đối đơn giản

để phá vỡ các chất hữu cơ và không tốn nhiều thời gian Nhược điểm chính của

kỹ thuật này là khả năng mất một số nguyên tố phân tích do sự bay hơi hay nhiễm bẩn mẫu bởi bụi trong không khí và sự hấp phụ chất lên chén đựng mẫu

[3] Nhiều tác giả đã sử dụng kỹ thuật tro hoá khô để xử lý mẫu sinh học nhằm xác định hàm lượng đồng, kẽm, sắt trong mẫu tóc và máu người Mẫu được cho vào chén thạch anh và đun nhẹ ở nhiệt độ thấp Sau đó đặt vào lò nung ở 500oC trong 3 giờ Tro nung được làm ẩm với 0,5 ml nước, sau đó thêm lần lượt 0,5 ml HNO3 và 0,5 ml HClO4 đặc, tiếp tục đun ở 200oC Tro ẩm được xử lý tiếp với 0,5 ml HNO3 đặc và nước sau đó đun nhẹ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt Độ thu hồi khi phân tích các nguyên tố trong mẫu tóc nằm trong khoảng 94 – 108%

1.5.2 Kỹ thuật vô cơ hoá ƣớt ở áp suất khí quyển

Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh và có tính ôxy hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong cốc thuỷ tinh(hệ hở) Lượng axit thường gấp 10-15 lần lượng mẫu Thời gian xử lý mẫu thường từ vài giờ đến vài chục giờ [3] Axit nitric thường được sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu như HCl và H2SO4 Hydro peroxit H2O2 cũng có thể được thêm vào để tăng khả năng ôxy hoá [1,4] Các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc

và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lượng nhiệt khi đun sôi mẫu Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết

Tuy tương đối đơn giản và không đắt tiền, xử lý mẫu trong cốc hở hay bình Ken dan được sử dụng nhiều trong việc xử lý các mẫu sinh học, mặc dù thời gian phân hủy mẫu bị kéo dài

1.5.3 Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao

Phân huỷ mẫu trong hệ kín lò vi sóng có nhiều ưu điểm hơn hệ hở Các ống đựng mẫu được làm bằng vật liệu polyme chịu áp suất cao, bền với các tác động hoá học, ít chứa các kim loại gây nhiễm bẩn hơn các cốc thuỷ tinh hay

chén sứ Vì các ống đựng mẫu được đậy kín nên loại trừ được sự nhiễm bẩn từ không khí, giảm sự bay hơi nên tốn ít axit Các ống kín cũng loại trừ được sự mất các kim loại dễ bay hơi có thể xảy ra đối với các hệ hở, đặc biệt trong tro hoá khô Bộ phận điều khiển điện tử ở các lò vi sóng hiện đại giúp việc xử lý mẫu có độ lặp lại cao Hơn nữa áp suất cao cho phép phân huỷ

hoàn toàn mẫu tóc một cách nhanh chóng [3,22,26]

Trong lò vi sóng, ngoài hai tác nhân phân huỷ mẫu là tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axít đặc và của năng lượng nhiệt, còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài do các phân tử nước hấp thụ (>90%) năng lượng vi sóng, chúng có chuyển động nhiệt rất lớn làm căng và xé các hạt mẫu từ trong

ra Hơn nữa, việc vô cơ hoá được thực hiện trong hệ kín, áp suất cao nên nhiệt

độ sôi cao hơn thúc đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất Vì thế việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 – 70 phút) mà rất triệt để [26 ] Tuy nhiên rất ít công trình sử dụng kỹ thuật này để phân tích đồng trong huyết thanh và nước tiểu

1.5.4 Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền

Để phân tích hàm lượng đồng trong huyết thanh và nước tiểu, nhóm tác giả Felix WS [14] đã sử dụng kỹ thuật pha loãng mẫu và chuẩn bị thành phần nền của dung dịch chuẩn giống như thành phần nền của mẫu và xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thực hiện nhanh, có thể thực hiện phân tích mẫu hàng loạt Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng cho đối tượng là mẫu huyết thanh và nước tiểu, đối với mẫu máu tổng số và các loại dịch sinh học khác không thể áp dụng đựơc Mặt khác khi sử dụng các phương pháp phân tích khác như đo quang, điện hóa thì mẫu cần thiết phải vô cơ hóa theo các kỹ thuật vô cơ hóa khô hoặc vô cơ hóa ướt được đề cập ở các mục trên

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là mẫu sinh học mà cụ thể

là huyết thanh, nước tiểu và sinh thiết gan của người bao gồm hai nhóm đối chứng (người bình thường) và nhóm và các bệnh nhân mắc bệnh Wilson

2.1.1 Mẫu máu

Máu là một tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần, huyết thanh và các thành phần hữu hình Huyết thanh gồm nước và các chất hòa tan, trong đó chủ yếu là các loại protein, ngoài ra còn các chất điện giải, chất dinh dưỡng, enzim, hormone, khí và các chất thải Huyết thanh chiếm 55% - 57% tổng số máu Huyết thanh bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết tương Thành phần hữu hình là các tế bào, bao gồm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Khối lượng máu trong cơ thể chiếm 7% - 9% khối lượng cơ thể( khoảng 1/13 thể trọng).Trung bình người trưởng thành cứ 1kg trọng lượng có khoảng 75ml đến 80ml máu, tức là có khoảng 4 đến 5 lít máu Trẻ sơ sinh có 100ml máu/kg cân nặng, sau đó khối lượng máu giảm dần Từ 2 -3 tuổi trở đi khối lượng máu lại tăng dần lên, rồi giảm dần cho đến tuổi trưởng thành thì hằng định Ở nam giới máu nhiều hơn ở nữ giới Ở động vật, khối lượng máu thay đổi theo loài Tỷ lệ phần trăm máu so với khối lượng cơ thể ở cá là 3; ếch là 5,7; mèo là 6,6; thỏ là 5,5; chim bồ câu là 9,2; ngựa là 9,8; lợn là 4,6; bò là 8,0 và gà là 8,5 [1,2,18]

lên sau khi ăn, uống, khi mang thai, lượng máu giảm khi đói và khi cơ thể mất nước Trạng thái sinh lý bệnh thường có khoảng ½ lượng máu lưu thông trong mạch, còn ½ dự trữ trong các kho chứa(trong lách 16%, trong gan 20% và dưới da 10%) Khối lượng máu bị giảm đột ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì làm cho huyết áp giảm nhanh[18]

Việc phân tích hàm lượng đồng trong máu có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán lâm sàng nhiều bệnh như bệnh Gan, bệnh u sơ tuyến tiền liệt, nhồi máu cơ tim…, đặc biệt là bệnh Wilson Hàm lượng đồng trong máu phản ánh một cách trực tiếp lượng đồng đưa vào cơ thể

2.1.2 Mẫu nước tiểu

Nước tiểu là một thành phần được tạo ra bởi quá trình bài tiết với mục đích đào thải các chất cặn bã, các chất thừa… ra khỏi cơ thể, giúp cho cơ thể không bị nhiễm độc và cân bằng nội môi Nước tiểu được tạo thành từ Nephron – đơn vị chức năng của thận bao gồm quá trình lọc máu ở cầu thận (nang Bowman) tạo thành nước tiểu đầu, quá trình hấp thụ lại các chất cần thiết, quá trình bài tiết tiếp các chất không cần thiết, tạo thành nước tiểu chính thức Nước tiểu chính thức đổ vào bể thận, theo ống dẫn nước tiểu tích lũy ở bàng quang Khi đủ một lượng nhất định sẽ được thải ra ngoài, mỗi ngày cơ thể loại ra ngoài khoảng 1 đến 2 lít nước tiểu[1,12] Hàm lượng đồng trong nước tiểu phản ánh khả năng tự đào thải đồng của cơ thể và là chỉ số phân tích cận lâm sàng rất quan trọng trong quá trình điều trị các bệnh có liên quan đến hàm lượng đồng

2.1.3 Mẫu sinh thiết gan

Sinh thiết gan là một thủ thuật y khoa, trong đó bác sĩ dùng một mũi kim đặc biệt để lấy ra một mẫu mô nhỏ từ gan để kiểm tra các triệu chứng tổn thương gan Sinh thiết gan sẽ giúp chúng ta biết rõ hơn về tình trạng sức khỏe của lá gan Thủ thuật này là rất quan trọng cho người mắc bệnh viêm gan C hoặc bệnh gan khác và chúng ta đang cố gắng quyết định lựa chọn biện pháp điều trị thích hợp Sinh thiết gan cũng có thể hữu ích nếu bác sĩ không biết chắc chắn nguyên nhân gây bệnh gan của bệnh nhân

Khi làm sinh thiết gan người bệnh cần phải nằm ngửa trong thời gian làm thủ thuật Trước hết, bác sĩ phải tìm một nơi giữa xương sườn bên phải,

nơi có thể làm sinh thiết gan an toàn hơn Sau đó, lau sạch vùng da trên nơi này và chích thuốc gây tê cục bộ để làm tê vùng đó, khi vùng đó đã được làm

tê, một mũi kim sinh thiết được đưa vào để lấy ra một mẫu gan nhỏ Phần thủ thuật này được thực hiện nhanh chóng, sau khi làm sinh thiết người bệnh phải nằm nghiêng và giữ nguyên tư thế đó trong 1 hoặc 2 giờ đồng hồ Làm như vậy sẽ tạo sức ép lên vùng đã làm sinh thiết gan để không bị chảy máu khi gặp các vấn đề khác do ngồi dậy quá sớm[19,20,22]

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện mục tiêu của đề tài, nội dung nghiên cứu của luận văn bao

gồm những vấn đề sau:

- Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của đồng

- Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan

- Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng đồng trong máu và nước tiểu và sinh thiết gan bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

- Phân tích, đánh giá hàm lượng đồng trong máu, nước tiểu và sinh thiết gan của người bình thường và bệnh nhân mắc bệnh Wilson

2.3 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

2.3.1 Mẫu máu

Mẫu máu được lấy qua tĩnh mạch vào buổi sáng, lấy khoảng 2ml mẫu máu cho vào ống nghiệm, ly tâm để tách huyết thanh, cho vào các ống bằng polypropylen có đậy nắp kín Bảo quản lạnh ở -200C đến khi sử dụng, mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể đảm bảo ổn định trong vòng một tháng

Các mẫu huyết thanh lấy từ tủ lạnh và để chảy đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc đều

Lấy 0,5ml huyết thanh đã để rã đông, thêm 0,5ml nước cất, lắc đều sau

đó tiến hành xác định hàm lượng đồng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

2.3.2 Mẫu nước tiểu

Nước tiểu được lấy trong 24 giờ, trộn đều ghi lại thể tích mẫu tổng số Lấy khoảng 50ml mẫu cho vào bình teflon và bảo quản lạnh[2,13,14]

2.3.3 Mẫu sinh thiết gan

Mẫu sinh thiết gan được lấy bằng kim sinh thiết sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ -20oC, trước khi phân tích mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi Quy trình xử lý mẫu sinh thiết gan được tiến hành như sau:

Cân chính xác 0,1 gam mẫu cho vào bình vô cơ hóa, thêm 8ml hỗn hợp axit HNO3 – HClO4(tỷ lệ 1:1) đun ở 1500

C trong vòng 30 phút, sau đó định mức đến 25ml bằng nước cất Hàm lượng đồng trong mẫu được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật ngọn lửa

2.4 Trang thiết bị và hoá chất phục vụ nghiên cứu

- Máy ly tâm tốc độ tối đa 12.000 vòng/phút

- Tủ lạnh để bảo quản mẫu

2.4.2 Hoá chất và dụng cụ

Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo AAS nên nước cất, hoá chất phải

có độ tinh khiết cao, được kiểm tra nồng độ nguyên tố bằng phép đo AAS trước khi dùng Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại hóa chất và dụng cụ sau:

- NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2 tinh khiết

2.4.3 Chuẩn bị hóa chất và dung dịch chuẩn

1)Dung dịch Na 10g/l: Cân chính xác 2,543gam NaCl pha trong 100ml nước cất

2) Dung dịch K 10g/l: Cân chính xác 1,9102 gam KCl pha trong 100ml nước cất

3) Dung dịch Ca 10g/l: Cân chính xác 2,775gam CaCl2 pha trong 100ml nước cất

4) Dung dich chuẩn Mg 1000mg/l

5) Dung dịch glyxerin 50%: lấy 50ml glyxerin 100% pha với 50ml nước cất 6) Dung dịch HCl 6M: lấy 50ml HCl 36,5%(6M) pha với 50ml nước cất 7) Dung dịch chuẩn đồng nồng độ 10ppm: lấy 1ml Cu 1000ppm cho vào bình định mức 100ml, sau đó định mức với nước cất để được 100 ml dung dịch chuẩn Cu nồng độ 10ppm

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thực nghiệm thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý theo các quy luật thống kê để đánh giá sai số, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện…

Phân tích phương sai một yếu tố

Phân tích phương sai là phân tích tác động của các yếu tố qua tham số phương sai; nó được dùng nhiều trong các trắc nghiệm để đánh giá những

nguồn sai số khác nhau liên quan đến dãy kết quả thí nghiệm Mục đích của sự phân tích phương sai một yếu tố là đánh giá sự ảnh hưởng của một yếu tố nào

đó trên các giá trị quan sát, Yi (i = 1, 2,…, k) [6]

Trong bài toán phân tích phương sai một yếu tố A, k mức thí nghiệm, mỗi mức nghiên cứu làm lặp lại n lần, chuẩn F được dùng để so sánh sự sai khác giữa phương sai các giá trị nghiên cứu do sự thay đổi các mức nghiên cứu với phương sai của sai số nghiên cứu có khác nhau đáng tin cậy hay không Nếu khác nhau không đáng tin cậy, yếu tố A sẽ ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả thí nghiệm, ngược lại nếu khác nhau đáng tin cậy chứng tỏ yếu tố A có ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu

Trong nội dung nghiên cứu đề ra, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố để đánh giá ảnh hưởng của một yếu tố nào đó tới kết quả phân tích Nội dung của bài toán phân tích phương sai một yếu tố được biểu diễn tóm tắt trong bảng dưới đây:

y

1

Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố

phương

Bình phương trung bình

2





n k

y SS

A n

SS

1

2 2

A kn SS

Giả thuyết thống kê:

 Giả thuyết không H0 : 2 2

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Trong những thập niên gần đây, phương pháp AAS đã được sử dụng khá rộng rãi để xác định kim loại trong các mẫu quặng, đất đá, nước, các mẫu y học, sinh học, các sản phẩm công nghiệp, rau quả, thực phẩm, các nguyên tố vi lượng trong phân bón, thức ăn gia súc Trong ngành dược cũng đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này để xác định kim loại trong dược chất, tá dược

Để khai thác tính ưu việt về độ chính xác và độ nhạy cao, chúng tôi sẽ ứng dụng kỹ thuật này để xác định đồng trong máu, nước tiểu và sinh thiết gan

2.5.1 Nguyên tắc của phép đo

Ở điều kiện bình thường nguyên tử không thu và cũng không phát năng lượng Nhưng khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi tự do, bị kích thích bằng chùm tia đơn sắc có năng lượng và bước sóng phù hợp, (được tạo bởi một loại đèn riêng cho mỗi nguyên tố kim loại) thì chúng sẽ hấp thụ năng lượng của ánh sáng và sinh ra một loại phổ là phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của nguyên tố đó [3,5] Do đó muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần phải thực hiện các quá trình sau:

1 Chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do Đó chính là quá trình hoá hơi và nguyên tử hoá mẫu

2 Chiếu chùm tia bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử tự do vừa tạo ở trên Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó

3 Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích để đo cường độ của nó Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ Trong một giới hạn nồng độ nhất định của nồng độ C, giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích

Theo định luật Buger - Lamber - Beer: khi chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io được chiếu vào môi trường hấp thụ có độ dài l (cm) chứa No

nguyên tử, sau khi ra khỏi môi trường còn lại cường độ I, thì cường độ của một vạch phổ hấp thụ là: