Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung neo polynut

Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu dưới các điều kiện pH ban đầu khác nhau Bảng 3.14: Đánh giá sự phát triển của B.subtilis B1 Bảng 3.15: Điều kiện lên men tối ưu cho 2 chủng probi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG

Hà Nội - 2010

Mở đầu 1

Chương I: Tổng quan tài liệu 3

1 Giới thiệu sơ lược về beta – glucan 3

1.1 Tình hình nghiên cứu beta-glucan trong và ngoài nước 3

1.2 Nguồn nguyên liệu chứa -glucan 4

1.3 Ứng dụng của -glucan 4

1.3.1 Ứng dụng trong thực phẩm 4

1.3.2 Ứng dụng  -glucan trong y dược, mỹ phẩm 5

1.3.3 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 6

2 Probiotics 7

2.1 Định nghĩa probiotics 7

2.2 Cơ chế tác động của probiotics 8

2.2.1 Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn 8

2.2.2 Cạnh tranh vị trí gắn kết 10

2.2.3 Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng 11

2.2.4 Kích thích miễn dịch 11

2.3 Vi sinh vật probiotics 12

2.3.1 Vi khuẩn lactic 12

2.3.2 Bacillus spp 13

2.4 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics 14

2.5 Ứng dụng của probiotics … 15

2.5.1 Trong thực phẩm và dược phẩm 15

2.5.2 Nông nghiệp 19

2.5.2.1 Nuôi trồng thủy hải sản 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

Chương III: Kết quả 31

3.1 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng saccharomyces cerevisiae 1 31

3.1.1 Lựa chọn môi trường tối ưu 31

3.1.2 Khảo sát các điều kiện tăng trưởng tối ưu 32

3.2 Hoàn thiện lên men các chủng probiotics bổ sung 35

3.2.1 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng 35

3.2.1.1 Kết quả xác định đường cong sinh trưởng vi khuẩn l acidophilus trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 35

3.2.1.2 Kết quả xác định sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 36

3.2.1.3 Kết quả xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu 37

3.2.1.4 Kết quả so sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy l acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 39

3.2.1.5 Nghiên cứu trạng thái nuôi cấy 42

3.2.2 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng bacillus subtilis B1 43

3.2.2.1 Xác định đường cong sinh trưởng của chủng bacillus subtilis B1 trên 2 loại môi trường 43

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn bacillus subtilis 46

3.2.3 Hoàn thiện công nghệ tách chiết thu hồi thành tế bào

3.2.5 Hoàn thiện công nghệ thủy phân nấm men

thu hồi acid amin tự do và protein 55 3.2.5.1 Tách thu hồi protein từ dịch tế bào nấm men 56 3.2.5.2 Thủy phân protein tách axit amin tự do 57 3.2.6 Hoàn thiện và ổn định công nghệ sản xuất chế phẩm thức ăn

bổ sung phục vụ chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản 58

Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm chức năng

cho chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản 62

Chương IV Kết luận 67 Tài liệu tham khảo 68

cứu

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh khối S.cerevisiae1 sau 30 giờ

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng S cerevisiae1

Bảng 3.4: Mật độ tế bào của chủng S.cerevisiae1 sau khoảng thời gian lên men

Bảng 3.5: Các thông số tối ưu lên men thu hồi sinh khối chủng S.cerevisiae1

Bảng 3.6: Tính toán giá thành cho 1 lít môi trường dịch chiết dứa tối ưu (2009)

Bảng 3.7: Xác định mật độ L.acidophilus VN1 dưới các trạng thái nuôi khác nhau

Bảng 3.8 Mật độ chủng vi khuẩn nghiên cứu trong các loại môi trường khác nhau theo thời gian

Bảng 3.9 Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian

Bảng 3.10 Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu với các nguồn cacbon khác nhau Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của B.subtilis

Bảng 3.13 Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu dưới các điều kiện pH ban đầu khác nhau

Bảng 3.14: Đánh giá sự phát triển của B.subtilis B1

Bảng 3.15: Điều kiện lên men tối ưu cho 2 chủng probiotics

Bảng 3.16: Thực hiện thu hồi và sản xuất nguyên liệu bột probiotic

Bảng 3.17: Hàm lượng protein và hexose trong sản phẩm glucan tách chiết từ thành tế

bào của chủng nấm men nghiên cứu

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein thu được trong dịch thủy phân Bảng 3.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình thủy phân thu nhận axit amin Bảng 3.20: Thông số lên men của các chủng vi sinh vật probiotic

Bảng 3.21: Đánh giá khả năng sấy phun

Hình 3.1: Mối tương quan giữa pH ban đầu của môi trường đến sinh khối chủng

S.cerevisiae1 Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng S cerevisiae1 Hình 3.3: Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae1

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng của vi khuẩn L acidophilus nuôi

trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường tổng thay đổi theo thời gian lên men của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu

Hình 3.8: Môi trường dịch chiết dứa tối ưu không sinh H2O2

Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuôi cấy L acidophilus trên môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu

Hình 3.10 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis B1 trong MT1 Hình 3.11 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis B1 trong MT2

Hình 3.12 Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau tới sinh khối

MỞ ĐẦU

Việc kết hợp giữa các chất có hoạt tính sinh học và các chủng probiotic trong các công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ đời sống nói chung và trong sản xuất nông nghiệp nói riêng hiện đang là hướng đi tích cực và có tính khả quan

Các chất có hoạt tính sinh học đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như trong nước quan tâm trong đó có polysaccharide Polysaccharide là thành phần quan trọng trong phần lớn các chất trùng hợp sinh học (biopolymer), chúng

có vai trò chính trong việc tạo cấu trúc và tính toàn vẹn của vi khuẩn và nấm (Bohn & Bemiller, 1995, Sakurai et al., 1996, Vetvika et al., 1997)  -glucan là một polysaccharide cũng rất được chú ý bởi những đặc tính sinh học của nó có, như hiệu quả mạnh trong việc củng cố hoạt động của miễn dịch không đặc hiệu, có đặc điểm kháng khối u mạnh, có hiệu ứng kháng virut và kháng khuẩn, và cuối cùng chúng giúp cho vết thương mau lành và chống nhiễm sau khi bị thương hoặc sau khi phẫu thuật

Bên cạnh đó việc sử dụng các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện năng suất, thay thế kháng sinh , hóa dược và nâng cao chất lượng sản phẩm chăn nuôi đang là một su hướng tất yếu của các nước trong khu vực và trên thế giới (Hill, 1990; Charteris và cs,1998; Chang và cs, 2001) Trong nước đã có những nghiên cứu sản xuất probiotic bổ sung vào thức ăn để giảm tiêu chảy, cải thiện khả năng tiêu hóa (Phạm Văn Toản,1996; Đỗ Trung Cứ và cs, 2000; Phan Ngọc Kính, 2001; Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy, 2003; Võ Thị Hạnh, 2003) Nhưng các nghiên cứu này mới là bước đầu, chưa có sự hợp tác triệt để giữa các chuyên gia công nghệ vi sinh và dinh dưỡng thức ăn để tạo ra sản phẩm có tính ổn định cao và sử dụng hiệu quả cho vật nuôi [7]

Hiện nay ở Việt nam việc kết hợp giữa các nhóm vi khuẩn probiotic và -glucan

để tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn là một hướng nghiên cứu còn nhiều

mới mẻ Do đó chúng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bổ sung NEO-POLYNUT”, nhằm hướng tới mục đích tạo ra một chế

phẩm sinh học chức năng, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi giúp tăng khả năng chuyển hóa thức ăn, tăng cường hệ thống miễn dịch cho vật nuôi, hạn chế các nguy cơ gây

bệnh, và giảm chi phí chăn nuôi thông qua việc giảm hệ số tiêu thụ thức ăn

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu sơ lược về Beta - Glucan

1.1 Tình hình nghiên cứu beta-glucan trong và ngoài nước

Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử tách chiết

-glucan từ nấm lớn và nó trở thành hướng chính ở Nhật Bản

Những năm gần đây, beta-glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày càng được chú ý Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch, kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch (Bohn & Bemiller 1995, Sakurai et al 1996, Vetvika et al 1997) Theo Paulsen et al (2001, 2003) sử dụng -glucan nấm men cho cá hồi Atlantic và cá hồi cầu vồng sẽ làm tăng hoạt tính lysozym huyết thanh của chúng

Khoa Công nghệ Sinh học, trường tổng hợp Hàn Quốc đã tách chiết được

glucan tan trong kiềm từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae chủng dại và chủng đột

biến có độ tinh sạch cao (Ha et al.,2002) Thái Lan, cũng như Australia, beta-glucan cũng đã được chiết từ nấm men và sử dụng như một chất kích thích miễn dịch tiềm

năng cho Penaeus monodon và Salmo salar L (Suphantharika et al., 2003, Paulsen et

al., 2000) Ngoài ra, ở nhiều nước khác như Nhật Bản, Mỹ, Canađa, Tiệp Khắc, Nga cũng tiến hành khá nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này phục vụ nuôi trồng thuỷ sản

Trong giai đoạn 2004-2005 của chương trình công nghệ sinh học, với sự tài trợ của đề tài KC-04-28, lần đầu tiên ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học đã bắt tay nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết -glucan từ thành tế bào

Sacchromyces cerevisiae, bước đầu đã thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao Sản phẩm beta-glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 1 chỉ có một loại mạch bêta-1,6 Sản phẩm beta - glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 3 có hai loại mạch bêta-1,6 và bêta- 1,3 Chế phẩm Bêta glucan từ chủng S.cerevisiae 1 có trên 80% hexoza và 0.99% protein Chế phẩm beta - glucan từ chủng S.cerevisiae 2 và S.cerevisiae 3 có hàm lượng protein khoảng 1,2% và hơn 50% hexoza

Chế phẩm -glucan được thử nghiệm trên chuột có tác dụng phục hồi số lượng

tế bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng của động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng chiếu xạ Chế phẩm  - glucan từ chủng

S.cerevisiae 1 có tác dụng tốt đối với hệ thống miễn dịch không đặc hiệu ở nồng độ

nghiên cứu

Hiện nay, Liên hiệp Khoa học sản xuất Công nghệ sinh học và Môi trường đã sử dụng beta - glucan trong chế phẩm Neo-Polynut phục vụ chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Chế phẩm Neo-Polynut đã được Bộ thủy sản công nhận chất lượng và cho phép sản xuất lưu hành

1.2 Nguồn nguyên liệu chứa -glucan

Glucan thu được từ các nguồn khác nhau như: thực vật, tế bào nấm men, nấm nói chung được miêu tả như polymer của glucoza Glucan có một số hoạt tính sinh học như hoạt hóa hệ miễn dịch, chống ung thư, kích thích sinh trưởng

-glucan tìm thấy trong nấm lớn có phân nhánh chỉ với một phân tử glucoza và chỉ tăng cường miễn dịch đến một mức nào đó Bên cạnh đó, - glucan chiết từ thành

tế bào nấm men bánh mỳ phân nhánh rất mạnh và nó có khả năng tăng hoạt tính miễn dịch mạnh nhất trong tất cả các loại - glucan

-1,3-D-Glucan đã được chiết từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae và được đặt tên vào đầu năm 1960 bởi nhóm nghiên cứu ở Mỹ (trường Tổng

hợp Tulane, khoa Y học, chuyên ngành sinh lý học) -Glucan đã được tách chiết từ

các chủng nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces delbrueckii, Candida albicans, Candida cloacae, Candida tropicalis, Hansenula henricii Đặc biệt

- Glucan đã được tách từ xác nấm men lên men bia với nồng độ Glucan lên tới 92%

1.3 Ứng dụng của -glucan

1.3.1 Ứng dụng trong thực phẩm

- Cung cấp nguồn xơ thực phẩm

và 10% dầu dừa), sau 7 tuần lượng cholesterol trong máu của chúng dao động từ 279mg/dl Sáu tuần tiếp theo, chuột thí nghiệm được nuôi với thức ăn có bổ sung 5% cám yến mạch, cám lúa mỳ hoặc Glucan từ thành tế bào nấm men Kết quả nhận được cho thấy Glucan giảm lượng cholesterol tổng (42%), LDL cholesterol (69%) và tăng đáng kể lượng HDL cholesterol (16%) Glucan cũng có hiệu quả giảm lượng cholesterol trong huyết thanh Khi chuột được nuôi ở chế độ dinh dưỡng giàu cholesterol đồng thời với 5% Glucan hoặc cám yến mạch, sau 4 tuần, Glucan giảm lượng cholesterol tổng xuống 13% so với 6% của cám yến mạch LDL đã giảm 15% trong nhóm ăn thêm Glucan và 4% trong nhóm ăn thêm cám [3] Những kết quả trên cho thấy -Glucan là nguồn phụ gia có giá trị trong công nghiệp thực phẩm

267-1.3.2 Ứng dụng  -Glucan trong y dƣợc, mỹ phẩm

Từ những nghiên cứu cơ sở tác dụng của -Glucan lên hệ thống miễn dịch của chuột, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu trên rất nhiều loài động vật khác nhau như tôm, cá, gà, thỏ, -Glucan đều có hoạt tính gây kích thích miễn dịch và 4 cơ chế miễn dịch chính là:

- Tạo ra các bạch cầu (hematopoiesis) để phá hủy nguồn bệnh

- Huy động tế bào, là khả năng của các bạch cầu chuyển đến chỗ bị thương

- Năng lực thực bào hay khả năng nhấn chìm tế bào lạ

- Tạo ra các chất trung gian hoạt hóa oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ

Cơ chế -Glucan thể hiện hiệu quả có lợi là kết hợp với thụ quan glucan đặc hiệu nằm trên tế bào đại thực bào, như vậy, nó sẽ hoạt hóa tế bào này Một khi đại thực

bào đã được hoạt hóa, chúng sinh ra cytokine có nhiệm vụ chuyển thông tin cần thiết đến các tế bào miễn dịch khác và cuối cùng hoạt hóa hoặc hiệu chỉnh chức năng của hệ thống miễn dịch

1.3.3 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

-glucan được biết như một chất tăng cường hệ thống miễn dịch và có hiệu lực tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ (Yadomae T và Ohno N.,1996) Đã có một

số nghiên cứu sử dụng -glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịch tiềm năng trong nuôi trồng thuỷ sản

Hệ thống prophenoloxidaza (proPO) được đánh giá giữ vai trò quan trọng trong

hệ bảo vệ của các loài giáp xác Vì vậy hoạt tính PO trong hemocyte của P.monodon

được sử dụng như chỉ thị cho đặc tính kích thích miễn dịch của  - glucan Kết quả thí

nghiệm in vitro của Suphantharika et al.(2003) cho thấy,  - glucan tăng hoạt tính PO trong tất cả hemocyte được xử lý Chế phẩm -glucan từ nấm men bánh mì (YGT) có thành phần -glucan cao hơn 40% so với -glucan từ bã men bia (BYG) và YGT tăng hoạt tính PO cao hơn gấp 2 lần so với BYG Như vậy hoạt tính PO không những phụ thuộc vào hàm lượng -glucan mà có lẽ còn phụ thuộc vào các tính chất lý học khác như trọng lượng phân tử và cấu trúc hoá học của -glucan

Thí nghiệm in vivo khi cho tôm ăn thêm 0,2% -glucan cũng nhận được những

kết quả khả quan như trong thí nghiệm in vitro Nhưng trong thí nghiệm này, YGT cho

đáp ứng thấp hơn so với BYG Điều này có thể giải thích do sự khác biệt thời gian xử

lý: ở thí nghiệm in vitro, hemocyte tiếp xúc trực tiếp với -glucan trong 30 phút, còn

trong thí nghiệm in vivo, -glucan được cho ăn trong 3 ngày Nhưng -glucan và các sản phẩm phân huỷ của nó làm thế nào được hấp thu vào hệ tiêu hoá và nó kích thích hemocyte thế nào để hoạt hoá hoạt tính PO vẫn còn chưa rõ

Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs (1995) cho thấy, khi bổ sung

glucan vào thức ăn hàng ngày của Salmo salar với hàm lượng 1g/kg thức ăn trong 12

tuần trước khi cho nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sống sót tăng lên rất nhiều Cụ thể đối

với Vibrio salmonicida subsp salmonicida gây bệnh furuncolusis, lô thí nghiệm cá

được ăn thức ăn bổ sung M-glucan sẽ chết ít hơn 33% so với đối chứng Kết quả tương

tự đối với Vibrio anguillarum serotype 1, cá non trong lô thí nghiệm chết 15%, trong

khi ở lô đối chứng, cá chết đến 85% Với thí nghiệm tiêm 0,2 ml dung dịch chứa 2mg M-glucan trực tiếp dưới bụng cá, sau 3 tuần tiêm một lượng vi khuẩn gây bệnh cho cá, M-glucan cũng làm giảm đáng kể tỉ lệ cá bị chết M-glucan còn là một tá dược với

vaccine tăng sức đề kháng của cá lớp Osteichthyes, đặc biệt là cá hồi Atlantic (Salmo salar) Kết quả thí nghiệm cho thấy khi Salmo salar non (30g/con) được tiêm dưới

bụng một lượng dung dịch vaccine và 0,5mg M-glucan, hoặc chỉ có M-glucan hoặc vaccine, tỉ lệ cá chết sẽ tương ứng 20 %, 28%, 38% Riêng ở lô đối chứng khi cá chỉ được tiêm dung dịch muối sinh lý, sau khi bị xử lý với nguồn bệnh, tỉ lệ cá chết cuối cùng là 42% Như vậy, sự kết hợp giữa M-glucan và vaccine furunculosis là phương

pháp hiệu quả nhất để tăng sức đề kháng của Salmo salar đối với furunculosis Kết quả tương tự cũng nhận được đối với bệnh vibriosis do các loại vi khuẩn chi Vibrio khác

nhau gây nên

Hiệu quả của Beta-glucan như một dược phẩm phòng bệnh để tăng sức đề kháng

của tôm hùm lớn (Penaeus monodon) cũng đã được các tác giả nghiên cứu Tôm non

được bổ sung 5g glucan/kg thức ăn hàng ngày, sau 5 tuần chúng bị nhiễm bởi nguồn

bệnh virut và hỗn hợp Vibrio harenggii và Vibrio parahemolytiens Bảy tuần sau khi bị

nhiễm, lượng tôm bị chết trong lô đối chứng là 80%, trong khi ở lô thí nghiệm tôm được nuôi với thức ăn có bổ sung M-glucan lượng tôm chết giảm xuống 50%

2 Probiotics

2.1 Định nghĩa Probiotics

Probiotics là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro” có ý nghĩa là vì, “biosis” có nghĩa là sự sống Probiotics được định nghĩa đầu tiên là do Parker(1974): “ những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật đường ruột”

Nhưng 1989, Fuller đã định nghĩa lại Probiotics:” những vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn mà chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật chủ bằng cách tạo cân

bằng hệ sinh vật đường ruột” [33] Bifidobacteria và lactobacilli là chi được sử dụng rộng rãi nhất Nấm men (Saccharomyces cerevisiae), một vài chủng E coli và Bacilllus spp cũng được sử dụng như một probiotics [32]

Havenaar và Huis Int Veld, 1992 định nghĩa:” probiotics là một hoặc sự kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột [34]

Theo viện khoa học quốc tế ( International Life Sciences Institute), nhóm làm việc tại châu Âu (1998) định nghĩa probiotics: “ là vi sinh vật sống bổ sung vào thức ăn tác động có lợi đến vật chủ” [34]

Theo tổ chức thực phẩm, nông nghiệp và sức khỏe thế giới “ probiotics là những

vi sinh vật sống, khi mà sử dụng một lượng đầy đủ như là thức ăn, sẽ mang lại sức khỏe tốt cho vật chủ ” [37]

Theo FAO:” Những vi sinh vật khi sử dụng với một lượng đủ sẽ tác động có lợi đến vật chủ” Hầu hết probiotics là vi khuẩn, sinh vật đơn bào [36]

2.2 Cơ chế tác động của probiotics

Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong các yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián đoạn có thể dẫn đến một số bệnh lý do mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột làm tăng nhanh số lượng vi khuẩn gây bệnh Probiotics được chứng minh là có khả năng chống lại một số

tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, và rotavirus Cơ chế tác động của probiotics như sau:

2.2.1 Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocins, acid hữu cơ, và

hydrogen peroxide

Bacteriocins là một chất kháng khuẩn, được chia làm 4 lớp:

 Lớp thứ nhất là những phân tử peptid nhỏ (< 5 kDa)

 Lớp thứ hai là những phân tử peptid nhỏ (< 10 kDa), thường là những phân

tử peptid hoạt động ở màng tế bào

 Lớp thứ 3 là những phân tử protein lớn (>30 kDa), bền về nhiệt, gồm các enzyme ngoại bào

 Lớp thứ tư là những bacteriocins phức tạp, ngoài protein còn có các thành phần khác như lipid và cacbohyrate [37]

Bacteriocins được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, khi tiến hành phân tích gen cuả các

vi khuẩn lactobacilus gồm L plantarum, L acidophilus NCFM, L johnsonii NCC 533,

và L sakei đều thấy chúng là các loài có khả năng sinh bacteriocins và chúng thường độc đối vi khuẩn gram dương như Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, và Mycobacteria Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocins chủ yếu tạo nên

những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá

trình trao đồi chất của vi khuẩn gây bệnh Một vài vi khuẩn thuộc chi Bifidobacteria

cũng có khả năng sản xuất ra bacteriocins gây độc cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương Đặc biệt probiotics còn kích thích các tế bào biểu mô ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [37]

Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản

xuất bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, acid propionic làm pH môi trường hạ thấp

xuống ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh Một vài vi khuẩn chi

Lactobacillus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica bằng cách sản xuất ra

acid lactic [37]

Hydrogen Peroxide cũng là chất kháng khuẩn, một vài vi khuẩn Lactobacillus

trong cơ quan âm đạo phụ nữ được tìm thấy chúng có khả năng sản sinh ra hydrogen

peroxide ngăn cản sự phát triển vi khuẩn gây bệnh gonococci trong cơ quan sinh dục

nữ Ngoài ra vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát triển của Gardnerella vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, lactic acid, và bacteriocins [37]

2.2.2 Cạnh tranh vị trí gắn kết

Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật cư trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của qu trình xm nhiễm Probiotics trong hệ tiêu hóa có chức năng ngăn chặn khả năng bám dính của tác nhân gây bệnh và giảm

lượng chất độc của chúng trên biểu mô ruột Một vài vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh bao gồm S enterica, Yersinia enterocolitica và bám dính trên tế bào biểu mô ruột Một vài trường

hợp, vi khuẩn probiotics có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn gây bệnh này đã bám chặt trên tế bào biểu mô nếu được xử lý với

probiotics [37] Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V cạnh tranh vị trí bám với Escherichia coli 0157H7 và HT-29, Lactobacilli fermentum RC-14 cạnh tranh

vị trí bám dính với Staphylococcus aureus do đó làm giảm sự bám dính của các tác

nhân gây bệnh [37]

Ngoài ra probiotics còn có các cơ chế khác tác động lên các vi khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn probiotics như Treptococcus thermophilus và Lactobacillus acidophilus enha

hoạt hóa tạo ra protein bịt kín vùng bị tổn thương của ruột Thứ hai, các vi khuẩn

probiotics khác như Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng ngăn ngừa bệnh viêm

ruột và các tế bào chết bám trên biểu mô ruột Cuối cùng là chức năng ngăn chặn,

lactobacillus được chứng minh rằng là chủng có khả năng làm giảm độ thẩm thấu vào

màng nhầy, hạn chế được sự xâm nhập của vi sinh vật có kích thước nhỏ ở chuột [26]

Sinh tổng hợp chất nhày là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân gây bệnh, chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh MUC2 và MUC3 là hai mRNA làm tăng kích thích sản sinh ra chất nhầy, bảo vệ tế bào biểu mô chống lại sự

bám dính của vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus plantarum 299v được chứng minh rằng

có khả năng làm giảm tác động của E coli trên tế bào biểu mô ruột

2.2.3 Cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng

Probiotics còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dữơng để phát triển, chẳng hạn sự phát triển vi khuẩn probiotics sử dụng đường đơn (glucose, fructose) làm giảm

sự phát triển của Clostridium difficile (sử dụng đường đơn ) [26]

Sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các tế bào sống ngoại trừ Lactobacillus plantarum và Borrelia burgdorferi, nó cần thiết trong các quá trình sinh hóa trong tế

bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao Sự hấp thu và lưu trữ sắt được điều chỉnh bởi tế bào [38] Siderophore lá chất có khối lượng phân tử thấp, có khả năng gắn kết các ion sắt Siderophore có thề hòa tan sắt tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật Do đó tận ứng yếu tố này, có thể chọn các vi sinh vật vô hại có khả năng sản xuất siderophore làm vi khuẩn probiotic, nó sẽ cạnh tranh ion sắt với vi khuẩn gây bệnh [9]

Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và cạnh tranh ion sắt trong ruột già như E coli [38]

Ngoài ra probiotics còn tác động đến hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây độc, quorum sensing có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc của vi

khuẩn đặc biệt là Virio Vi khuẩn probiotics sẽ phá vỡ hệ thống này, đây cũng là một

biện pháp mới để chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản

2.2.4 Kích thích miễn dịch

Mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, việc sử dụng probiotics có tác dụng làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên Spanhaak et al thí nghiệm sử dụng

Lactobacillus casei Shirota ở 20 người đàn ông Những ngừơi đàn ông này được ăn

theo chế độ trong 8 tuần, 10 người đàn ông được uống sữa lên men bổ sung 1x1012

cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 người còn lại uống sữa lên men Kết quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng sữa chua có bổ sung Lactobacillus casei Shirota [39] Nhiều chủng Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích

hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bèo tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma

2.3 Vi sinh vật probiotics:

2.3.1 Vi khuẩn lactic:

Lactobacillus spp: Hầu hết các vi sinh vật probiotics đều là các vi khuẩn sản

sinh ra acid lactic Từ xưa con người đã biết cách sử dụng các vi khuẩn có lợi bổ sung

vào các sản phẩm lên men, chủ yếu thuộc loài L casein và một vài chủng L acidophilus Cách đây khoảng 40 năm và 30 năm ở Đức vi khuẩn lactic đã được ứng dụng bổ sung vào trong các sản phẩm sữa lên men Hai loài “Lactobacillus acidophilus” và “Bifidobacterium bifidum” được giới thiệu rất phổ biến ở Đức vào

cuối 1960 trong các sản phẩm bơ sữa bởi vì nó có thể giúp ổn định vi khuẩn đường ruột và tạo một cảm giác chua nhẹ gây cảm hứng cho người tiêu dùng trong các sản phẩm sữa chua Ở Đức sản phẩm có tên thương mại là “mild yogurts” hoặc “bio-yogurts“ Ở Mỹ sữa acidophilus lại được phát triển và điều quan trọng đối với các loài

này là phải được chứng minh là an toàn với người sử dụng L casei/paracasei, L rhamnosus, L acidophilus, và L johnsonii đây là những loài được sử dụng nhiều nhất

và đã được chứng minh là an toàn cho người sử dụng [38]

Lactobacillus có khoảng 60 loài bao gồm L acidophilus, L plantarum, L casei,

và L rhamnosus… Cách đây hơn 100 năm con người đã sử dụng các vi khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng vị ngon, tạo

ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm Hương vị của sản phẩm là do các sản phẩm

trao đổi chất của Lactobacillus Chẳng hạn acetaldehyde có trong yogurt, diacety có

trong có trong các sản phẩm sữa lên men [38]

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của lactobacillus đã được nghiên cứu trong điều kiện in vitro, đặc biệt khả năng bám dính và cạnh tranh vị trí bám dính của lactobacillus với các vi khuẩn gây bệnh Coconnier et al, chứng minh được L acidophilus ngăn cản sự bám dính của E coli O157:H7, Salmonella enterica, Yersinia

pseudotuberculosis và Listeria monocytogenes trên tế bào Caco-2 cells Tương tự như vậy, Forestier et al cũng chứng minh được khả năng ngăn cản bám dính của L casei

và L rhamnosus Lcr35 đối với E coli và Klebsiella pneumoniae trên tế bào Caco-2 cells Ngoài cớ chế cản trở sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh thì Lactobacillus còn

ức chê vi khuẩn gây bệnh bằng sinh acid làm pH môi trường giảm xuống và bacteriocins Theo nghiên cứu của Vescovo et al, ông tiến hành thử nghiệm khả năng

kháng khuẩn của năm chủng L casei trên Aeromonas hydrophila, L monoytogenes, S typhimurium,và S aureus trong điều kiện invitro Tuy nhiên ở nghiên cứu này, L casei IMPCLC34 là chủng có tác động mạnh nhất đối với Aeromonas hydrophila, S typhimurium, và S aureus, tuy nhiên nó không có tác động kháng đối với L monocytogenes Nhưng ngược lại Lactobacillus spp phân lập từ gà lại có khả năng kháng lại Campylobacter spp trong điều kiện invitro [38]

Dựa vào khả năng sinh bacteriocins của Lactobacillus, mà Lactobacillus được

sử dụng rất nhiều trong các sản phẩm rau quả, thịt, và cá lên men Khả năng sinh

bacteriocins của lactobacillus được khám phá vào 1975, và nhiều loại bacteriocins khác đã được biết đến Hiện nay lactobacillus được ứng dụng rộng rãi trong các sản

phẩm cá, bơ sữa, và thịt trong vấn đề bảo quản và nâng cao chất lượng sản phẩm Hầu

hết các chủng sinh bacteriocins đều đã được biết, như Lactocin 705 bởi L casei CRL705 kháng S aureus, L monocytogenes, S pyogenes, Acidocin CH5 bởi L acidophilus CH5 kháng vi khuẩn gram âm, acidophilin 801 bởi L acidophilus IBB 801

kháng một số vi khuẩn gram âm và gram dương… [38]

2.3.2 Bacillus spp

Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, Gram dương, hô hấp hiếu khí, sinh rất

nhiều enzyme, đặc biệt là enzyme endo--1,4-glucanase có giá trị ứng dụng trong thực

tế cao Kích thước của vi khuẩn là (3 - 5) m x 0,6 m

Vi khuẩn Bacillus subtilis có bao nhày (giác mạc), bao nhày cấu tạo từ

polypeptit, chủ yếu là axit polyglutamic Việc hình thành giác mạc giúp cho vi khuẩn

Bacillus subtilis có khả năng chịu được điều kiện môi trường khắc nghiệt do giác mạc

có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi bị khô hạn Quan sát dưới kính hiển vi tiêu bản nhuộm màu, có thể nhìn thấy màng nhày của vi

khuẩn Bacillus subtilis không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên

nền tiêu bản xanh hoặc đen

Bacillus subtilis là loài vi khuẩn có khả năng di động Điều đó được thể hiện khi quan sát khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường đặc: vi khuẩn Bacillus subtilis có

khuẩn lạc mỏng, mầu trắng, bề mặt nhăn nheo, mép có răng cưa Một phương pháp có thể xác định khả năng di động của vi khuẩn trên môi trường đặc: nếu khuẩn lạc mỏng, lan nhanh, mép không đều, hình không tròn thì chứng tỏ đó là vi khuẩn có tiêm mao và

có khả năng chuyển động Ngược lại, nếu khuẩn lạc tròn, mép phẳng, khá dày thì thường là khuẩn lạc của vi khuẩn không có khả năng di động

Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus subtilis là sinh bào tử Vào cuối thời kỳ

sinh trưởng, phát triển, bên trong tế bào sẽ sinh ra một thể nghỉ có dạng hình cầu hoặc hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra một loại bào

tử cho nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sôi nảy nở như ở nấm

Khác với Clostridium, Bacillus subtilis khi sinh ra bào tử vẫn giữ được hình dạng tế

bào là hình que, không bị biến đổi hình thái tế bào Bào tử có thể giữ sức sống trong vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống trong 200 -

300 năm của bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Khi gặp điều kiện thuận lợi, những bào

tử này lại được tái phục hồi và chúng lại tiếp tục chu kỳ sống của mình

2.4 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics:

Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau:

- Không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ

- Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mật)

- Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ

- Sản xuất các kháng sinh chống lại các mầm bệnh: acid, bacteriocin, H2O2….

- Duy trì tốt khả năng sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá vật chủ

- Dễ nuôi cấy

- Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư

- Tăng cường khả năng hấp thụ lactose

- Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp

- Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy

- On định cấu trúc gen trong quá trình tạo chế phẩm

2.5 Ứng dụng của probiotics

2.5.1 Trong thực phẩm và dƣợc phẩm

Trong cơ thể người tồn tại khoảng 1014

tế bào vi sinh vật với sự đa dạng của các loài, có khoảng 400 loài Các vi sinh vật tồn tại trong đường ruột tác động qua lại giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột Sự tồn tại của các vi sinh vật trong hệ tiêu hoá còn phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng trong cơ thể Trong cơ thể luôn tồn tại các vi khuẩn cơ hội, khi gặp điểu kiện thuận lợi nó sẽ phát triển đủ số lượng và gây độc cho cơ thể

Vi khuẩn probiotics được rộng rãi trong các sản phẩm khác nhau trên khắp thế giới, chúng được bổ sung vào thực phẩm, tạo ra các chế phẩm thuốc và bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi

Thực phẩm probiotics là thực phẩm chứa các vi khuẩn sống có lợi và không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Chẳng hạn, trong các sản phẩm sữa lên men bổ

sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người không có khả năng hấp

thu sữa có thể hấp thụ tốt hơn Một số thực phẩm probiotics như là phomat, sữa chua, kifer, dưa cải, giấm… [40]

Thực phẩm probiotics hiện nay được bán rất phổ biển ở Mỹ phần lớn là yogurt

Yogurt được làm từ sữa kết hợp với các loài Streptococcus thermophilus và Lactobacillus acidophilus hoặc Lactobacillus bulgaricus Sữa có nguồn gốc từ bò, dê,

cừu…

Kefir cũng là một sản phẩm lên men, có thể được làm từ nhiều nguồn gốc khác nhau: sữa bò, sữa cừu, sữa dê Ngoài ra có thể làm từ sữa đậu nành, sữa gạo và nước dừa Khi chọn được vi khuẩn probiotics thích hợp sẽ cấy vào sữa, những loài có thể

dùng là Lactobacillus kefiri, một số chi Leuconostoc, Lactococcus

Thức uống probiotics được giới thiệu đầu tiên vào 2007 bởi New Food, được

khám phá bởi Steve Demos, đây là loại đồ uống chứa Lactobacillus plantarum 299v

Ngoài ra còn nhiều sản phẩm lên men khác mang tính chất truyền thống: món dưa cải bắp ở Đức, kim chi ở Hàn quốc, choucroute ở pháp[51]

Probiotics được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh, hiện nay trên thị trường ngoài các sản phẩm đa dạng về probiotics ở dạng thực phẩm, còn có các dạng viên nén, dạng dịch, dạng bột dùng điều trị một số bệnh đường tiêu hóa:

- Tiêu chảy do kháng sinh: khoảng 20% người dùng thuốc kháng sinh, đặc

biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy Nguyên nhân

là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân bằng hệ vi sinh đường

ruột Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là hai tác nhân gây bệnh chính, khi hệ vi

sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lượng ít trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố là A và B gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh và

kết quả cho thấy S boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt Chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh [39] Một nghiên cứu sử dụng L acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng

sinh erythromycin, nghiên cứu này tiến hành trên 16 người, một nữa cho sử dụng

125ml sữa chua chứa L acidophilus mỗi ngày, nữa nhóm còn lại cho sử dụng sữa chua không có L acidophilus Kết quả nghiên cứu, nhóm sử dụng sữa chua có chứa L acidophilus bệnh hồi phục trong 2 ngày, nhóm còn lại 8 ngày [39]

- Tiêu chảy cấp : Nguyên nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở các nước đang

phát triển Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lactobacillus rhamnosus GG,

Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng rotavirus

trong hệ tiêu hóa [39] Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em ở châu Á, cho

thấy rằng khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus GG có thể rút ngắn một nữa thời gian chữa trị Ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L rhamnosus đã bị bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L rhamnosus sống [9] Bin và Boulloche đã thực hiện nghiên cứu sử dụng Lactocbacillus acidophilus để điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em

Bin tiến hành nghiên cứu 50 trẻ en bị tiêu chảy cấp ở Trung Quốc Ông lấy ngẫu nhiên

30 người điều trị bằng cách sử dụng L acidophilus, còn 20 bé còn lại thì điều trị bằng

phương pháp bình thường Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa hai cách chữa trị, thời gian khỏi bệnh của hai phương pháp chữa bệnh là như nhau Nghiên cứu của Boulloche et al ở 103 bé còn bú sữa mẹ và trẻ em bị tiêu chảy cấp sử dụng L

acidophilus đã bất hoạt bằng cách sử dụng nhiệt Kết quả cũng cho thấy không có sự

khác biệt giữa hai nhóm điều trị Thời gian phục hồi bệnh như nhau [39]

- Viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút, kí sinh

trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và Helicobacter pylori gây

viêm loét và ung thư dạ dày Chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nứơc nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi

và trẻ suy dinh dưỡng [9]

- Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra

các enzyme như glycosidase, azoreductase, nitroreductase và - glucoronidase, chúng

sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư hoạt hóa Những nghiên cứu

trên người sử dụng L acidophilus hoặc Lactobacillus casei làm giảm đáng kể hoạt

động của các enzyme trên [36]

- Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất

cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật Khi

lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi máu cơ tim, đột quỵ Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C có trọng lượng phân tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C có trọng lượng phân tử cao(hay còn gọi là cholesterol có lợi) HDL vận chuyển cholesterol đến các cơ quan, vì vậy nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành Ngược lại LDL-C vận chuyển cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên nếu nồng

độ LDL-C trong máu cao là có nguy cơ mắc bệnh cao LDL-C luôn tạo ra các mảng

xơ vữa trên thành các động mạch nói chung và động mạch vành tim nói riêng Các mảng xơ vữa này làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có thể bít tắc, từ

đó gây nên tình trạng thiếu máu đến nuôi dưỡng tế bào cơ tim, gây ra các cơn đau thắt ngực và nhồi máu cơ tim Nghiên cứu của Gilliland SE, Nelson CR, Maxwell C trong

điều kiện in vitro vi khuẩn có thể làm giảm lượng colesterol trong môi trường nuôi cấy

Một nghiên cứu của Lin et al về khả năng làm giảm cholesterol trong máu của

Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus Ông tiến hành trên 23 người

cho sử dụng thuốc dạng viên nén chứa 3x107 CFU Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus trong 16 tuần, và 15 người không sử dụng thuốc Kết quả ở

nhóm cho sử dụng thuốc thì hàm lượng cholesterol trong máu giảm xuống từ 5.7 xuống

5.4 sau 16 tuần [39] Nghiên cứu ở Ấn Độ, sử dụng sữa trâu lên men bằng loài L acidophilus làm giảm lượng cholesterol trong máu 12 - 20% sau một tháng sử dụng [39] Hai nghiên cứu khác sử dụng E faecium và S thermophilus, các nhà nghiên cứu

tiến hành thử nghiệm trên 29 người đàn ông, cho sử dụng sữa lên men chứa 108 - 1011

cfu/ml E faecium và S thermophilus và 28 người đàn ông sử dụng sữa bình thường

Kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol trong máu giảm 0.37 - 0.41 mmol/L sau 6 tuần

sử dụng, nhóm sử dụng sữa bình thường thì hàm lượng cholesterol không đổi Sau đó tác giả tiến hành nghiên cứu lần hai ở phậm vi rộng hơn, ông tiến hành tương tự ở 87 người đàn ông và phụ nữ kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol giảm nhiều sau 4 -12

tuần và thí nghiệm cuối cùng 24 tuần và 30 tuần thì thấy không có sự thay đổi nhiều

Ông đưa ra kết luận E faecium có khả năng làm giảm Cholesterol trong máu nhanh

[39]

- Tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme khác:

Hiện tượng không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose Enzyme này được giải phóng khi vi khuẩn

bị dung giải do tác dụng của acid mật [9] Triệu chứng của bệnh thường gây phìn bụng,

đầy hơi, tiêu chảy Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal et al 2000 vi khuẩn latobacii

và bifidobacteria làm tăng enzyme lactase trong ruột non [33] Ở trẻ sơ sinh thường

mắc chứng kém tiêu hóa đường saccarose, khắc phục bằng cách cho uống

saccharomycess cerevisiae, trong nấm men có chứa enzyme saccarase

2.5.2 Nông nghiệp

2.5.2.1 Nuôi trồng thủy hải sản

UN FAO ước tính tới năm 2020 một nữa lượng thủy sản cung cấp cho tòan thế giới sẽ được cung cấp nhờ nuôi trồng thủy sản do các nguồn cá khai thác tự nhiện bị khai thác quá mức Ở Việt Nam nuôi trồng thủy sản cũng đang trên đà phát triển, năm

2002 chính phủ đã quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó nuôi tôm là ngành mũi nhọn nhằm tăng kinh ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao việc sử dụng đất và tạo việc làm cho người dân Năm 2002 Việt Nam đã xuất khẩu trên 2 tỉ USD thủy sản, trong đó tôm chiếm 50% đứng hàng thứ 5 trên thế giới Hiện nay phổ biến nhất là nuôi tôm sú và cá ba sa, tuy nhiên hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đang mắc phải khó khăn chủ yếu là dịch bệnh do vi khuẩn, virút, nấm, ký sinh trùng gây ra Khi phát hiện bệnh nông dân thường sử dụng kháng sinh đổ xuống hồ hoặc bổ sung thêm vào thức ăn Kháng sinh

có thể điều trị tức thời đối với các vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi sử dụng nhiều lần

vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc ( khó trị hơn), mặc khác khi sử dụng thường xuyên sẽ

để lại dư lượng kháng sinh trong tôm, cá nuôi gây ảnh hưởng đến con người dẫn đến

nguy cơ khó dùng kháng sinh trị bệnh cho con ngươi và không thể nhập khẩu sang các nước khác gây thiệt hại lớn Nhiều nông dân sử dụng kháng sinh như một tác nhân phòng bệnh ngay khi vật nuôi chưa phát bệnh

Virút là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa hàng đầu đối với ngành nuôi trồng thủy sản Hiện nay người ta phát hiện khoảng 20 virut gây

bệnh trên tôm, hầu hết là thành viên họ Pavoviridae, Baculoviridae, Piconaviridae, Togaviridae cùng một số họ khác Bệnh đầu vàng ở tôm được phát hiện đầu tiên ở Thái

vào 1990 tại một hồ nuôi tôm sú do Yellow Head Virus gây ra Bệnh đốm trắng do

virut thuộc chủng Baculoviru được phát hiện đầu tiên tại Đài Loan tỷ lệ chết rất cao có

thể 100% sau 3 - 5 ngày nhiễm bệnh [10]

Vi khuẩn cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đặc biệt là Virio làm tôm chết rất

nhanh Ngoài ra nấm và kí sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên tôm Tôm thường

nhiễm nấm là lagenidium calinectes và Sirolpidium spp ở giai đọan ấu trùng nên tỷ lệ

chết rất cao Kí sinh trùng là động vật nguyên sinh có thể lây nhiễm tất cả các giai đoạn

phát triển của tôm như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, anophrys, Acineta ssp, Lagenophrys, Ephelota là các tác nhân kí sinh bên ngoài [10]

Ngoài yêu tố dịch bệnh Ngoài yếu tố dịch bệnh ô nhiễm môi trường nuôi trồng cũng là vấn đề khó khăn Với mục đích tăng sản lượng, người dân nuôi với mật độ cao

và không có biện pháp xử lý thích hợp gây hiện tượng thiếu oxy trong ao dẫn đến tôm

bị ngạt Thức ăn dư thừa dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa làm tảo phát triển, các chất hữu cơ trong ao trích lũy ngày một tăng sẽ làm giảm lượng oxy hòa tan Lớp bùn lắng động lâu ngày tạo điều kiện cho các vi khuẩn kị khí phát triển sinh khí H2S và

CH4 Amoni tồn tại dưới dạng NH3 hoặc NH4+ tùy thuộc vào pH của môi trường NH3 độc tính cao hơn NH4+

do NH3 không mang điện tích dễ thấm qua màng tế bào mang

cá và hòa tan tốt trong chất béo, NH4+ có kích thước lớn hơn, mang điện và kết hợp với nước nên khó thấm qua tế bào mang cá Khi nồng độ NH3 cao tôm sẽ bị ngộ độc cấp

tính và chết nhanh Các hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite và nitrate khi vượt qua nồng độ 0.3mg/l sẽ gây ngộ độc cho tôm [9]

Cơ chế tác động của probiotics trong thủy sản: cạnh tranh vị trí gắn kết với vi khuẩn, sản xuất ra các chất ức chế, cạnh tranh nguồn năng lượng, tăng cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nâng cao đáp ứng miễn dịch, can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh, nâng cao chất lượng nước ao

Hiện nay có một số biện pháp khắc phục như dùng kháng sinh đổ trực tiếp hoặc bổ sung vào thức ăn cho tôm, phương pháp này hiện nay không được chấp nhân Ở tôm hệ miễn dịch không đặc hiệu, nó không có khả năng ghi nhớ được các bệnh nên sử dụng vacine một mặt không đạt được kết quả cao, mặc khác chi phí cao, tốn nhiều thời gian

Do đó biện pháp tốt nhất là sử dụng probiotics trong phòng và chữa bệnh ở tôm Probiotics được dùng với nhiều hình thức như tiêm trực tiếp, bom vào đường ruột, nhúng vào dung dịch probiotics, bổ sung vào thức ăn Phương pháp hữu hiệu nhất là nhúng tôm vào dung dich probiotics ( tôm ở giai đoạn ấu trung hoặc bổ sung vào thức

ăn hàng ngày cho tôm)

- Vi khuẩn và nấm được sử dụng nhiều nhất có vai trò như probiotics Bacillus spp là vi khuẩn gram dương được sự dụng phổ biến trong cải tạo môi trường nước

trong các ao nuôi, chúng chuyển hóa các chất hữu cơ thành CO2 và sinh khối, giảm vi khuẩn gây bệnh trong ao [40] Một nghiên cứu của Watchariya Purivirojkul, Nontawith

Areechon, Prapansak Srisapoome và Monchan Maketon phân lập Bacillus spp từ ruột của tôm gồm 3 chủng B pumilus NW01, B sphaericus NW02 và B subtilis NW03, sau đo sử dụng ba chủng trên kiểm tra khả năng kháng với V harveyi trong điều kiện

in vitro với mật độ 102 CFU/ml, kết quả lượng vi khuẩn V harveyi từ mức 4.23x10 2

ở 0 giờ sau đó tăng 1.40±0.21 × 10 7

cfu/ml ở 24 giờ rồi tiếp tục giảm 7.80±1.90 × 10 5cfu/ml ở 120 giờ [31]

- Các vi khuẩn sinh acid lactic cũng được sử dụng rộng rãi, Gatesoupe(1991) chứng

minh được Lactobacillus giúp loài cá bơn phát triển nhanh [48] Một thí nghiệm khả

năng kháng của vi khuẩn dị dưỡng đường tiêu hóa của cá hồi và cá bơn với tác nhân

gây bệnh là A samodicida, kết quả cho thấy vi khuẩn tạo vòng kháng và bao phủ lên

A samodicida [48] J Brunt and B Austin tiến hành thí nghiệm trên cá hồi, ông tiến hành phân lập vi khuẩn trong ruột cá hồi và test với hai chủng Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 Vi khuẩn được phân lập trên môi trường MRS và định danh bằng sinh hoc phân tử, tên là Aeromonas sobria GC2 Khi tiến hành test hai Aeromonas sobria GC2 với Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 kết quả cho thấy Aeromonas sobria GC2 có khả năng kháng Lactococcus garvieae 29-

99 và Streptococcus iniae 00-318 ( là hai chủng gây bệnh chết ở cá hồi và được phân

lập Viện Nghiên Cứu Thủy Sản ) Sau đó tiến hành thực nghiệm, bổ sung thức ăn cá hồi bị bệnh với liều lượng 5x10-7 tế bào/ gam thức ăn, kết quả thiệt hại 75% đến 100% khi không bổ sung probiotics vào thức ăn, nhóm điều trị thì thiệt hại từ 0- 6% [13] Một

nghiên cứu về khả năng sống sót của tôm Litopenaeus vannamei sau khi bị nhiễm Virio harveyi, tác giả phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm trưởng thành tại trường đại học

Santa Catarina, Brazil, chọn các khuẩn lạc hình cầu và xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm gram Các vi khuẩn phân lập được trãi trên môi trường MRS ủ 24h và

350C, sau đó đục lỗ thạch đường kính 1cm, V harveyi được trãi trên môi trường

Marine Agar, đặt thạch lên ủ cùng môi trường Marine Agar ủ 24h ở 300

C Kết quả cho

thấy vòng kháng của hai chủng C2 và B6 có vòng phân giải lớn nhất là 8.0 ± 0.5mm

và 6.0 ± 0.6 [13].Theo nghiên cứu của Lara-Flores et al (2003), ông sử dụng hai chủng

probiotics là nấm ( Saccharomyces cerevisiae) bổ sung vào thức ăn cho cá bột Nile

tilapia (Oreochromis niloticus), kết quả nghiên cứu giảm tỷ lệ chết ở cá bột, cá tăng trưởng nhanh hơn [15]

2.5.2.2 Chăn nuôi

Sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã cải biến di truyền tăng năng suất gia cầm Khi điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, con người bắt đầu tăng mật độ nuôi, làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh nguy hiễm cho vật nuôi, đặc biệt là vi

khuẩn như E coli, Salmone spp, Clostridium perfringens và Campylobacter spp Một

thời gian rất dài con người đã sử kháng sinh trong điều trị các loại bệnh này Nhiều quốc gia đã nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bởi vì chúng sẽ tạo ra các vi khuẩn kháng thuốc sẽ khó chữa trị cho con người hơn khi bị nhiễm Do đó một biện pháp thay thế tốt nhất và kinh tế nhất là sử dụng các chế phẩm probiotics bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi

Probiotics được sử dụng trị các bệnh rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tăng khả năng thẩm thấu của ruột Trong hệ tiêu hóa vi khuẩn di chuyển qua dạ dày đến ruột non

và bám chặt vào biểu mô, chúng giúp tăng tốc độ phát triển và khả năng chuyển hóa

thức ăn ở heo, gà và thú con Probiotics giúp trung hòa lượng độc tố trong ruột do E coli gây ra ( đây là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở heo)

Vi khuẩn probiotics cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh như

Clostridium perfringens, giảm khả năng hoạt động của vi khuẩn phân hủy urê, tổng

hợp vitamin, kích thích hệ thống miễn dịch, duy trì hệ vi sinh đường ruột, hòan thiện

hệ tiêu hóa [43]

Những sản phẩm probiotics đã được biệt đến rất nhiều qua các sản phẩm sữa lên men và sản phẩm bơ sữa Các sản phẩm probiotics được ứng dụng trong chăn nuôi ở các nộng trại chỉ được giới thiệu cách nay khoảng hai thập niên với mong đợi là giúp nâng cao hệ thống miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh Việc sử dụng probiotics

đã được quan tâm rất nhiều đặc biệt ở các quốc gia phát triển như châu Âu đã ngăn cấm sử dụng kháng sinh ngăn ngừa và trị bệnh cho động vật nuôi [43]

Gia cầm: Sản xuất gia cầm thu lãi rất cao, do lợi nhuận mà các chủ trang trại

không quan tâm đến sức khỏe con người mà sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, do

đó việc cấm sử dụng thưốc kháng sinh ở châu Âu vào ngày 1 tháng 1 năm 2006 ở các trang trại chăng nuôi gia cầm đã được ban hành Một trong những thành công của chế

phẩm probiotics sử dụng trong chăn nuôi gia cầm là Bacillus subtilis với tên thương

mại là CloSTATM Chế phẩm này giúp hoàn thiện khả năng phát triển của vật nuôi B

subtilis còn được biết đến có khả năng ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong hệ tiêu hóa của gà B subtilis PB6, Streptococcus pneumonia đã được chứng minh rằng có khả năng giết Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Các chế phẫm của B subtilis thường được bảo quản ở các dạng viên nén Các chế phẩm probiotics có thể chỉ chứa một loài như Enterococcus faecium với tên thương mại là

Protexin® , nhưng đồng thời cũng có thể là sự kết hợp của nhiều loài thuộc các chi

như Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus Cơ chế bảo vệ của probiotics ở gia

cầm chủ yếu cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh Sự bám dính của vi khuẩn probiotics trên ruột của gia cầm là một trong những đặc điểm quan trọng cho việc tuyển chọn các vi khuẩn probiotics Các nghiên cứu được biết đến rộng rãi như vi

khuẩn latic, B subtilis, Enterocuccus faecium là những loài có sức sống tốt nhất trong

hệ tiêu hóa của động vật Nhiều tác động có lợi của probiotics như hoàn thiện hệ thống miễn dịch, hòan thiện hệ vi sinh đường ruột, giảm các tác nhân gây viêm, giảm lượng amoniac và urê thải ra, giảm lượng cholesterol, tăng khả năng bám dính Hiện nay có nhiều nghiên cứu xa hơn sử dụng probiotics nâng cao khả năng phát triển và tăng chất

lượng trứng gà [43] Salmonella là tác nhân chính gây bệnh thương hàn, phó thương

hàn, bạch lỵ ở gia cầm, chúng thừơng tồn tại trong đường tiêu hóa của gà và có thể gây bệnh cho con người qua thức ăn Nghiên cứu của J Vicente, S Higgins, L Bielke, G

Tellez,D Donoghue, A Donoghue, and B Hargis ở gà tây bị nhiễm salmonela, tiến

hành hai thí nghiệm với bảy loài, chia làm hai nhóm: nhóm thứ nhất năm loài:

:Escherichia coli, Kluyvera ascorbata, Klebsiella travesanii, Lactobacillus casei, và Lactobacillu cellobiosus, nhóm thứ hai hai loài: L casei và L cellobiosus Ơ thí

nghiệm thứ nhất sử dụng probiotics ở mật độ 108 và 106 đồng thời kết hợp với phun acid hữu cơ Kết quả cho thấy sử dụng probiotics ở nồng mật độ cao(108) thì

salmonella giảm tới 90% Trong khi đó khi xử lý với mật độ probiotics thấp( 106) có

sự kết hợp với xử lý với acid hữu cơ thì hiệu quả xử lý đến 100%, không còn sự xuất

hiện của Salmonella Ơ thí nghiệm thứ hai chỉ sử dụng probiotics riêng lẻ với mật độ

tương tự thí nghiệm thứ nhất hoặc sử dụng acid hữu cơ Kết quả thí nghiệm đạt kết quả không cao, chỉ đạt từ 75 - 85% [41] Do đó việc vệ sinh chuồng trại cũng không kém phần quan trọng trong chăn nuôi

Heo: Heo ở giai đoạn cho bú, rất dễ bị xâm nhiễm bởi các vi khuẩn gây bệnh do

hệ vi sinh vật đường tiêu hóa của heo chua hoàn chỉnh, do đó việc sử dụng kháng sinh trong trị bệnh và phòng bệnh heo con rất phổ biến, tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người Cấm sử dụng thuốc kháng sinh trong chữa bệnh hoặc đưa ra những quy định nghiêm ngặc trong sử sụng kháng sinh để trị bệnh cho động vật nuôi ở châu Âu đã được ban hành Sử dụng probiotics giúp hoàn thiện sự phát triển và tăng khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh ở heo đã được nghiên cứu rộng rãi và khuyến khích sử dụng Kế hoạch HEALTHYPIGUT của EU đề ra vào giữa 2001

và 2004, trong nghiên cứu này có sự kết hợp giữa nấm và Pediococccus acidilactici bổ

sung vào trong chế độ ăn của heo con, kết quả giúp hòan thiện chức năng mô cơ trong

hệ tiêu hóa heo con [43] Baird (1977) đã nghiên cứu thành công bổ sung lactobacillus

vào thức ăn giúp tăng trọng lượng trung bình của heo, tương tự Pollman (1986) cũng

đã thành công trong nghiên cứu của mình giúp tăng trọng lượng heo bằng bổ sung

lactobacillus [16]

Động vật nhai lại: Trong dạ cỏ của động vật nhai lại xảy ra quá trình phân hủy

cabohydrat và protein Trong dạ cỏ pH từ 5.8 - 6.5, thiếu oxy, đây là điều kiện thuận lợi cho động vật nguyên sinh, vi khuẩn kị khí và nấm Một trong những ứng dụng sớm nhất của probiotics trong xử lý tăng acid trong dạ cỏ động vật nhai lại bằng nấm Tăng acid trong dạ cỏ là do sản xuất thừa lượng acid hữu cơ dễ bay hơi như acid probionic, acetates trong thức ăn của chúng Nếu không chữa trị dẫn đến giảm sự ngon miệng, tiêu chảy, giảm thành phần chất béo trong sữa Do đó việc bổ sung nấm vào trong thức

ăn sẽ làm giảm vấn đề tăng acid trong dạ dày, tạo điều kiện cho các vi khuẩn phân hủy cellulose phát triển, hòan thiện hệ tiêu hóa [43]

Một phần sử sụng nấm để giảm bớt hàm lượng acid trong dạ cỏ, ngoài ra còn sử sụng vi khuẩn cũng được sử dụng với nhiều thành công từ những năm 1970 làm tăng khả năng sản xuất sữa và trọng lượng, hoàn thiện sức khỏe và tăng khả năng kháng bệnh

Trong dạ cỏ của động vật nhai lại khi trưởng thành sẽ chứa một lượng lớn các vi khuẫn, nấm, chúng có khả năng ngăn cản sự xâm nhập các vi sinh vật bênh ngoài Hệ

vi sinh vật trong ruột non và ruột già của những động vật nhai lại còn non thì vắng mặt các động vật nguyên sinh, và sự rối loạn hệ tiêu hóa ở thú con có thể sử dụng probiotics để chữa trị Hệ vi sinh dạ cỏ của thú con ban đầu chủ yếu là vi khuẩn cellulose và vi khuẩn lên men metan và vi khuẩn lên men lactate và mật độ vi khuẩn lên men lactate sẽ giảm dần đến tuần thứ 13, sau đó hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của bê sẽ giống với hệ vi sinh của các động vật nhai lại trưởng thành Động vật nguyên sinh cũng được tìm thấy trong dạ cỏ sau tuần thứ 13

Mục đích chủ yếu của việc sử dụng thức ăn bổ sung probiotics là giảm bớt tỷ lệ chết và những nguyên nhân gây chết với bệnh đường tiêu hóa và hô hấp Sử dụng S

cerevisiae và A oryzae được sử dụng trộn lẫn vơi nhau trong thức ăn làm tăng lượng

sữa tiết ra ở bò cái Một số nghiên cứu sử dụng probiotics bổ sung vào thức ăn làm tăng lượng chất khô, năng suất sữa và một số thành phần quan trọng trong sữa Tuy nhiên một khuynh hướng tốt để hòan thiện khả năng phát triển và tiết nhiều sữa bằng cách kết hợp giữa probiotics và prebiotic, chẳng hạn kết hợp giữa các vi khuẩn lactic và mannanoligosaccharide ở bò [43]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hệ thống lên men, box cấy vô trùng, máy đo OD, tủ ấm, máy lắc, máy ly tâm, nồi khử trùng, cân điện tử và những máy móc cần khác

Môi trường nuôi cấy:

Môi trường YPD (g/l): Cao men 20; Pepton 40; Glucose 40;

Môi trường Hansen (g/l): Saccaroza 50; Pepton 5; cao men 2; K2HPO4 3; MgSO4 3;

Môi trường MRS (g/l): pepton 10; cao men 4; glucose 20; tween 80 1 ml;

K2HPO4 2; CH3COONa.3H2O 5; NH4NO3 2; MgSO4.7H2O 0,2; MnSO4 0,05;

Môi trường MPA (g/l): pepton 10; cao men 5; NaCl 5; pH 7

Khi chuẩn bị lượng lớn môi trường, dùng 40ml NaOH 1N cho 20 lít môi trường MPA để chỉnh pH

Môi trường MT1(g/l): Peptone: 10; Cao thịt bò (Beef extract): 03; NaCl: 05;

pH = 7

Môi trường MT2(g/l):Dextrin: 20; Cao nấm men: 20; KH2PO4: 01;

MgSO4.7H2O: 0,1 ; CaCl2: 0,1 ; pH = 7

 Môi trường thích hợp hóa chủng VN1

 Môi trường BHI: nuôi cấy E.coli

Môi trường thử hoạt tính enzim (%): CMC: 0,2 ; KNO3: 0,5; KH2PO4: 0,35;

MgSO4: 0,0625; Cao nấm men: 0,025;Agar: 2

Môi trường MPA agar: g/l

Môi trường CMC g/l

-KNO3 5 -KH2PO4 3,5 -MgSO4 0,625 -Cao men 0,25 -CMC 2 -Agar 16 -pH 7

Môi trường LB g/l

-pepton 10 -Cao Thịt 5 -NaCl 5 -pH 7

Môi trường tối thiểu g/l

-(NH4)2SO4 2 -K2HPO4 14 -KH2PO4 6 -Natrixitrat 1 -MgSO4.7H2O 0,2 -MnCl2 (0,001M) 10ml -Agar 10

-Acid Citric monohydrate 35g

-Natri citrat dihydrat 98g

 Môi trường dịch chiết dứa:

Dịch chiết dứa đun sôi 5 phút, lọc

100ml dịch chiết dứa + 0.5 g cao nấm men

Hấp khử trùng 1210

C, 15 phút Cấy giống 5%, ủ 370

C, sau 16 giờ đo quang bước sóng 610 nm

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp bảo quản giống: Các chủng nấm men nghiên cứu được giữ trong

các ống môi trường Hansen thạch ngiêng, ở 40C Cấy chuyển thực hiện trên các ống thạch nghiêng 3 tháng một lần Để giữ giống lâu hơn có thể bảo quản trong dung dịch 40% glyxerin vô trùng và giữ trong các ống effpendorf vô trùng ở -200

Phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng:

* Phương pháp xác định độ đục: đo mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy (Vũ thị Minh

Đức-2001), ở OD600nm Mẫu đối chứng là môi trường không chứa tế bào vi sinh vật Dựa vào số liệu đo được xây dựng đường cong để xác định tốc độ sinh trưởng và xác định thời gian nấm men đạt đến giai đoạn cuối pha logarit

* Phương pháp xác định số lượng tế bào sống

Chuẩn bị mẫu: pha loãng dịch nuôi cấy bằng nước cất vô trùng Cấy trải dịch pha loãng lên đĩa có môi trường thạch thích hợp Thí nghiệm nhắc lại 3 lần dưới điều kiện vô trùng Nuôi ở điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của nấm men Sau 2 ngày đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa

Phương pháp xác định nồng độ protein hòa tan: Phương pháp Bradford, hàm

lượng protein tổng số được xác định theo Kelldal

Phương pháp thu thành tế bào:

*Phương pháp 1: cho dịch lên men (15% w/v) tự phân huỷ ở nhiệt độ 500C trong

24 giờ (Suphanthasika et all, 1997) Ly tâm 4500 vòng trong 10 phút, sau đó thu lượng

chất rắn, chất rắn này có trọng lượng khoảng 35% (w/w) đó là thành tế bào nấm men bia, giữ thành tế bào ở 40C cho đến khi sử dụng

*Phương pháp 2: cho dịch lên men ly tâm 8000v/phút, trong 20 phút, rửa 2 lần

bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5 Hoà cặn tế bào trong 1 lít 4% NaOH, đun nóng đến

1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 1 lít nước lạnh để dừng phản ứng Ly tâm 4000 v/phút trong 15 phút Thu cặn (thành tế bào) và bảo quản

ở 40C cho đến khi sử dụng

Phương pháp tách chiết bêta-glucan tổng số

- Dùng lượng thành tế bào thu được như ở trên chiết tiếp với NaOH 3,5%, ở 75OC trong 19 tiếng Để nguội đến nhiệt độ phòng Bổ sung nước cất với thể tích tương đương thể tích dịch chiết Ly tâm thu cặn

- Chiết cặn thu được với NaOH 3%, (chỉnh pH4,5 bằng HCl đặc), ở 100OC trong 1,5 tiếng Ly tâm thu cặn

- Rửa cặn 2 lần với cồn 96O, ly tâm thu cặn, rửa tiếp 1 lần nữa với dietyl ete

- Để khô sản phẩm trong tủ hút khoảng 48 giờ đến khối lượng không đổi

- Bảo quản sản phẩm trong tủ lạnh cho các phân tích tiếp theo

Phương pháp xác định gốc axit amin tự do trên hệ HP-Amino Quant series II:

theo phương pháp của phòng Hoá -Sinh protein, viện CNSH

Phương pháp xác định hàm lượng hexose tổng số trong mẫu glucan:

Hàm lượng hexose tổng số được xác định dựa vào đường cong chuẩn glucose Chuẩn bị dung dịch glucose ở nồng độ dao động từ 10-100àg/ml Hút 1ml dịch ở các nồng độ khác nhau này vào mỗi ống nghiệm khô, sạch, bổ sung 1ml phenol 5% sau đó

bổ sung tiếp 5ml H2SO4 đặc Với mẫu glucan cũng tiến hành tương tự và lựa chọn nồng độ sao cho thích hợp

Vortex đều sau đó ủ ở 37O

C, trong khoảng 15-20 phút

Xác định mật độ hấp phụ tối đa (OD) của mẫu ở bước sóng 488nm

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ

3.1 Hoàn thiện công nghệ lên men thu nhận sinh khối chủng Saccharomyces cerevisiae 1

3.1.1 Lựa chọn môi trường thích hợp

Chủng S cerevisiae 1 được nuôi trong 2 môi trường Hansen và YPD lỏng ở

300C, lắc 200v/ph với tỉ lệ giống bổ sung 10% Đã tiến hành xác định tốc độ sinh trưởng chủng theo phương pháp đã được mô tả Kết quả được trình bày trên bảng 3.1

Bảng 3.1: Mật độ tế bào của chủng nấm men S cerevisae 1

trên hai môi trường nghiên cứu

Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy, sinh khối tế bào của chủng nấm men nghiên cứu tăng dần theo thời gian và đạt 109

sau 24 giờ nuôi cấy Bảng 3.1 cho thấy

Saccharomyces cerevisiae 1 đạt sinh khối cực đại sau 48 giờ khi lên men ở môi trường

YPD; phù hợp với các kết quả nghiên cứu trong giai đoạn trước, do đó, chủng

Saccharomyces cerevisiae 1 và môi trường YPD đã được lựa chọn cho lên men, thu hồi

sinh khối phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm chức năng

Thời gian (h) Mật độ tế bào (CFU/ml)

3.1.2 Khảo sát các điều kiện tăng trưởng thích hợp

pH môi trường: pH ban đầu của môi trường YPD được điều chỉnh bằng NaOH 1N hoặc HCl 1% đến giá trị thích hợp, tiến hành khử trùng môi trường, hoạt hóa và nhân giống trên các bình chứa môi trường với pH khác nhau, với các giá trị từ 6 – 6,5 – 7,2 – 7,3 – 7,5 Lên men trong cùng 1 điều kiện (300C, lắc 200rpm), lượng môi trường

500 ml mỗi bình, sau 30 giờ nuôi cấy, kiểm tra mật độ quang tại bước sóng 600nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (bảng 5):

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh khối S cerevisiae1 sau 30 giờ

Nhiệt độ nuôi cấy: Chủng S cerevisiae1 được nuôi trong môi trường YPD, pH

7,2, lắc 200 rpm dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau 300

C và 350C Tỉ lệ bổ sung giống ban đầu đã được hoạt hóa 10% Kết quả nhận được trên bảng 3.3

6 6,5 7,2 7,3 7,5

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng S cerevisiae1

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng

của chủng S cerevisiae1 Qua hình 3.2 dễ dàng nhận thấy rằng, chủng S cerevisiae1 luôn đạt mức sinh

khối cao nhất với nhiệt độ nuôi cấy 300C tại các thời điểm khác nhau, mật độ quang đo được đạt chỉ số cực đại tại thời điểm 43 giờ là 2,773 ở nhiệt độ 300C, và ở nhiệt độ

350C thấp hơn, OD600 chỉ đạt 2,002

Thời gian lên men: đã xác định tốc độ sinh trưởng của chủng S cerevisiae1 theo

biểu đồ thời gian (lấy mẫu và kiểm tra 5 h một lần bắt đầu từ giờ thứ 15) Chủng nấm

0 15 20 24 38 43 48 (giờ)

300c

350c

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

men nghiên cứu được nuôi trong môi trường YPD, lắc tròn 200 v/ph, độ thoáng khí 1/3 (v/v) với tỷ lệ nhân giống 10%, nhiệt độ nuôi cấy 300

3.5 x10 6

0.3 x10 8

4.8 x10 8

1.3 x10 9

6.1 x10 9

6.8 x10 9

5.4 x10 9

5.1 x10 9

8.2 x10 8

6.2 x10 8

4.8 x10 8

3.0 x10 8

8.1 x10 6

ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

TIMES(h)

x Log (x)

Hình 3.3: Đường cong sinh trưởng của S cerevisiae1 Bảng 3.4 và hình 3.3 cho thấy sau 15 h nuôi cấy, chủng S cerevisiae1 bắt đầu

giai đoạn phát triển nhanh, số lượng tế bào tăng từ 104

lên 106 đến 24 h, sinh khối tế bào bước vào giai đoạn cân bằng, giai đoạn này kéo dài tới thời điểm 68 h lên men, lượng tế bào bắt đầu giảm xuống 108

tại thời điểm 73 h Tại điểm này sinh khối tế bào