Nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá f ab’ 2 từ huyết tương ngựa đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị 2% dân số [40], ngoài máu toàn phần và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, cò

ĐH Y Hà Nội

Thái Danh Tuyên

Nghiên cứu sản xuất Huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất

lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

2013

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (2% dân số) [40], ngoài máu toàn phần và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152] trong đó, huyết thanh kháng

nọc rắn (antivenom) là một loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae

Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển Mặt khác, phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền

≈ 46 lít máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174]

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải

sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]

Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn

hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,

điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;

đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong

các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc

họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây

tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14]

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam

(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây là hai

loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15]

Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn trong cả nước Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối

ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9]

Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá

F(ab’) 2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng

thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’) 2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia

2 Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MÁU VÀ HUYẾT TƯƠNG

1.1.1 Máu:

- Khái niệm: máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước

- Đặc điểm: máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31]

- Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC và huyết tương, với chức năng cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể, tương tự ở người

- Protein huyết tương gồm: các globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận chuyển Các thành phần này thay đổi trong bệnh lý Điện di protein, điện di

miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein Mỗi protein huyết tương đều

có điểm đẳng điện tương ứng với pH Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính hòa tan trong dung dịch muối Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan thay đổi, tính chất sinh học cũng mất đi; các yếu tố gây biến tính protein gồm: nhiệt độ, độ acid hoặc base, tia cực tím làm đứt gãy liên kết peptid, sóng siêu âm gây oxy hóa [31],[163]

1.2 CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG 1.2.1 Máu toàn phần:

- Lấy từ mạch máu người cho, hoặc động vật cho máu, bảo quản trong túi (chai) có chất chống đông và bảo quản máu Dung dịch bảo quản máu thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin Mỗi đơn vị

250 ml máu người cho khỏe mạnh có 30-40 gam hemoglobin [31],[170]

- Bảo quản máu toàn phần ở 2-6oC, thời gian bảo quản tối đa là 42 ngày (với dung dịch bảo quản là CPDA) Máu toàn phần lưu trữ chứa thành phần chính

là hồng cầu, nếu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một số yếu tố đông máu Bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các chất trung gian; ngoài

ra còn chứa các tế bào lympho và các yếu tố huyết tương

- Khi sản xuất HTKNR, lấy máu túi 450 ml, túi đôi để dễ sản xuất, đảm bảo

vô trùng và an toàn, không gây vỡ HC khi vận chuyển

1.2.2 Khối hồng cầu [31],[170]:

- Là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương ở trên sang một túi khác Tuỳ cách sản xuất mà có các loại khối hồng cầu sau:

+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit khoảng 75%

Thành phần có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương Bảo quản: 6°C Chế phẩm có tính chất đậm đặc nên phải truyền chậm

2-+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: sau khi tách huyết tương khỏi hồng

cầu, trả lại dung dịch bảo quản Thành phần: hồng cầu và dung dịch bảo quản, còn ít bạch cầu Lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần Bảo quản: 2-6°C thời gian 42 ngày

+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: máu toàn phần được tách huyết tương và

phần Buffy coast Thành phần: hồng cầu + bạch cầu đã được loại bỏ còn

khoảng 10% so với khối hồng cầu thông thường Ưu điểm: giảm phản ứng do bạch cầu, giảm nguy cơ lây bệnh mà tác nhân cư trú trong bạch cầu

+ Khối hồng cầu rửa: máu toàn phần hoặc khối hồng cầu, ly tâm bỏ hết huyết

tương rồi thay thế bằng nước muối sinh lý, trộn đều ly tâm tiếp để rửa ba lần Thành phần: hồng cầu + nước muối sinhh lý

Bảo quản: 2o

C-6°C dưới 24 giờ, 22°C dưới 6 giờ

+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: khối hồng cầu đã

được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai Bảo quản: 2-6°C dưới hai tuần từ khi chiếu xạ, nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24 giờ Thành phần: hồng cầu, bạch cầu còn lại rất ít, bạch cầu bị bất hoạt

* Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả khối

HC ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi dưỡng HC và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên đường đến nơi truyền trả khối HC ngựa Nếu lấy máu ngựa vào túi 450ml, việc truyền khối HC trở lên đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít)

1.2.3 Khối tiểu cầu:

+ Khối tiểu cầu tách từ máu toàn phần: ly tâm các túi máu toàn phần, gạn lấy

lớp Buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu Thường từ 3-4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được một đơn vị pool tiểu cầu

Bảo quản: nếu chưa pool, để 22°C, lắc liên tục 3-5 ngày

Nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ

Số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011

+ Khối tiểu cầu tách chiết: dùng máy tách tế bào với bộ kit chuyên dụng để

lấy tiểu cầu từ một người cho Thành phần: có ≥ 3,0 x 1011

tiểu cầu/ đơn vị, có

ít bạch cầu

+ Bảo quản: 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày

1.2.4 Huyết tương tươi đông lạnh:

- Huyết tương tách từ máu toàn phần trong 6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản

đông lạnh gọi là huyết tương tươi đông lạnh

- Thành phần: albumin, globulin miễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững, yếu tố VIII còn khoảng 70% Lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) có khoảng 125-150ml Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùng nhóm, dung tích khoảng 250-300ml

Bảo quản: - 25°C/năm, ≤ - 25°C trong hai năm [31],[170]

- Khi sản xuất HTKNR, không cần sử dụng huyết tương tươi đông lạnh máu ngựa vì không cần sử dụng các yếu tố đông máu Nếu cần bảo quản để sản xuất nhiều đợt trong thời điểm khác nhau, cần bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C

1.2.5 Tủa VIII (cryo):

- Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần tủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là cryo Thành phần: tủa VIII khoảng 2 - 3 đơn vị/ml, yếu tố V, fibrinogen

- Trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tử IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I, loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng

1.2.6 Huyết tương tươi đã tách tủa:

- Phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa ở huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản ở -25°C Thành phần gồm có: albumin, globulin, một số yếu tố đông máu Nếu sản xuất HTKNR theo phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ lại để sản xuất do có γ -globulin

- Bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh

1.2.7 Huyết tương đông lạnh:

- Thành phần: các yếu tố huyết tương, các yếu tố đông máu không bền vững còn lại ít Đây là huyết tương tách từ máu toàn phần sau 6 giờ kể từ khi lấy máu và bảo quản ở - 25°C Bảo quản: như huyết tương tươi đông lạnh

- Chủ yếu tách huyết tương để sản xuất HTKNR theo dạng chế phẩm này

1.2.8 Khối bạch cầu hạt:

- Tách từ phần Buffy-coast và pool của nhiều người cho máu Thành phần: chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tế bào lympho, các chất bạch cầu giải phóng Khối bạch cầu hạt tập hợp từ nhiều người cho nên nguy cơ nhiễm virus rất cao

- Bảo quản: 22°C ≤ 24 giờ

- Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vì vậy cần để lại phần bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối HC Chú ý truyền lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục

1.2.9 Albumin:

- Albumin là protein hình cầu, tính hòa tan cao, trọng lượng phân tử 66.500

Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70 - 80%

áp lực keo trong huyết tương và liên kết, vận chuyển các chất có phân tử nhỏ như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc Dung dịch albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 - 20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa 5% protein [163]

- Do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm này theo phương pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa Cohn cuối cùng

- Khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ Theo tiêu chuẩn tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉ được phép còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7]

1.2.10 Gamma globulin:

Hình 1.1 Hình ảnh điện di protein huyết thanh

- Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin, xác định được khi điện di protein huyết thanh Có năm lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong

đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít

- Năm 1940, -globulin được tách chiết lần đầu tiên; không lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IMIG) được đưa vào sử dụng, tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -globulin huyết (1950)

- Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IVIG) được sản xuất và đưa vào sử dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IMIG

- Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IVIG đầu tiên được đăng ký ở

Mỹ, Sandoglobulin hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984 Gamimune được chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986 và sản phẩm này được đổi tên thành Gamimuner N Sau đó, một số IVIG khác được đăng ký ở Mỹ: Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam bởi Immuno, Venoglobulin-I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor và GammaRaas của RAAS (Mỹ) [167]

- Năm 1991, IVIG sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấp nhận (Venoglobulin-S) Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đến

Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột không hoà tan Gammagard và Polygam bị đình chỉ

- Năm 1980, bệnh nhân dùng IVIG điều trị giảm -globulin huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy tăng số lượng tiểu cầu Tiếp theo phát hiện ngẫu nhiên này, việc sử dụng IVIG cho ITP được nghiên cứu và hiện nay nó được dùng cho chỉ định này Kể từ khi IVIG có hiệu quả đối với ITP, chúng tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnh khác với giả định cơ chế tự miễn Hầu hết sử dụng IVIG đối với bệnh tự miễn đều có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy giảm miễn dịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện ghép tuỷ xương

- Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IVIG) là chế phẩm có trên 95% IgG từ

huyết tương người hiến máu được tinh chế IGIM chứa 15-18% protein, trong

đó IgG chiếm trên 90% IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, có thể có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn, không chứa chất gây sốt, gồm các globin chứa nhiều loại kháng thể có mặt trong máu người bình thường,pH 6,4 - 7,2 với thimerosal là chất bảo quản

- Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong 2 ngày IgG

có trong IGIM được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và ngoài mạch máu Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy của IgG khoảng 23 ngày Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải chia ra thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm làm giảm đau tại chỗ và bớt khó chịu Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không được vượt quá 20 ml (ngay cả đối với người lớn) Bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 2-8oC và không được để đông băng Thời hạn dùng của IGIM không được quá 3 năm kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123]

Bảng 1.1 Các thành phần của protein huyết tương:

Globulins

α-globulins

α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin

α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin, haptoglobin

β-globulins

hormone, binding globulin, transferrin,

angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor

H, plasminogen, properdin

-globulin Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)

Loại khác Fibronectin, macroglobulin/microglobulin,

- Một số KHT nghiên cứu, sử dụng trong Huyết học-Truyền máu:

+ Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173]

+ Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn (sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109]

+ Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương thỏ gây mẫn cảm) [132]

+ Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh, dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] và điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119]

+ Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) [99]

+ Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất

từ huyết tương thỏ) [127]

+ Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111]

+ Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu, do rắn độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa)

+ Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ huyết tương thỏ, ngựa [22]

- Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất chỉ

sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ ngựa tinh chế hai bước, an toàn hơn nhưng giá thành tăng lên gấp nhiều lần Bên cạnh đó nguy cơ phải đóng cửa các trang trại nuôi ngựa sản xuất KHT vì không đem lại lợi nhuận, giá đắt

và thị trường eo hẹp; những đạo luật bảo vệ động vật không cho dùng ngựa để lấy máu, là những điều khiến sản xuất KHT trở lên kém hấp dẫn; kết quả là

sự khan hiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên người bệnh Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số người nghèo như hiện nay, chính phủ một số nước miễn thuế cho sản xuất và lưu hành KHT [77]; các tổ chức xã hội đứng ra sản xuất và hỗ trợ KHT miễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148] Các nhà sản xuất KHT luôn mong đợi sự hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, chính phủ và các tổ chức từ thiện để duy trì số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149]

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƯƠNG:

1.3.1 Phương pháp tủa lạnh bằng Ethanol:

- Phương pháp tủa Cohn: là phương pháp tách các thành phần máu và huyết

tương bằng thay đổi nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion Quy trình này còn được gọi là: quy trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa biết trong huyết tương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn (1892-1953), người Mỹ [169] Phát minh của ông lúc đó đã góp phần cứu sống hàng vạn người trong Chiến tranh thế giới thứ II Phương pháp của Cohn đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trong tách chiết các chế phẩm máu và huyết tương tại các Trung tâm Huyết học-Truyền máu trên thế giới [31]

Cohn đã bắt đầu phòng thí nghiệm phân đoạn plasma sau khi được tài trợ lớn từ các cơ quan chính phủ và các công ty dược tư nhân Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn đã thu được albumin huyết thanh, -globulin, fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu Fibrinogen và các phần phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn, chế tạo thành các sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin Các -globulin tìm thấy trong Fraction Cohn II, III được chứng minh có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừa bệnh viêm gan truyền nhiễm cho những người lính trong chiến tranh thế giới thứ hai Fibrin keo lỏng, fibrin bọt

và màng fibrin đã được sử dụng điều trị nạn nhân bỏng, trong đó có một số nạn nhân từ cuộc tấn công tại Trân Châu Cảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công tăng cao Fibrinogen keo lỏng rất hữu ích trong kết nối dây thần kinh bị cắt đứt Fibrin bọt và thrombin được sử dụng để kiểm soát chảy máu, đặc biệt là trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểu chảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng như đối phó với dị tật mạch máu trong não Màng fibrin được sử dụng để cầm máu trong các ứng dụng phẫu thuật khác nhau, bao gồm cả phẫu thuật thần

kinh, tuy nhiên, không hữu ích trong việc kiểm soát chảy máu động mạch

Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm 90, đã thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ; đây là loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch

Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sử dụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ ethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương, như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),

Mulford , Kistler và Nitschmann, William N Drohan

- Phương pháp Cohn cải tiến bởi Van Aken (1996) [31]:

Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14

Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein) Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9 Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein) Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2

Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor

Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8 Thu được tủa IV- 4 có haptoglobin transferrin, -globulin

Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 4) bằng ethanol 40%, pH 5,8 Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein)

Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong

đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn

Như vậy, để sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn, ta chú ý vào sản phẩm F-II (cho chúng ta IgG)

- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40% trong

Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợp hai Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu

- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử

dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV

- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol (William N Drohan): kết hợp

tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phần huyết tương có giá trị: tủa lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố Von-Willebrand; IgG (F-II); albumin Phương pháp này hiện nay các nước như Mỹ, Đức, Pháp, Italy và nhiều nước đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sản phẩm đạt độ tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủa ethanol

- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi xử

lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết)

- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,

tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độ ethanol thấp hơn 19%, pH 5,8 Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol 40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, được tinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3o

C

Như vậy, globulin miễn dịch có mặt trong F-II Sản phẩm này có thể sử dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IMIG; để đảm bảo an toàn và hiệu quả cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IVIG Có nhiều phương pháp sản xuất IVIG, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn loại bỏ Fc của IgG được nhiều nước sử dụng có kết quả Có thể tóm tắt phương pháp này như sau: F-II thu được bằng phương pháp Cohn cho tác dụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu được đem thẩm tích loại bỏ Fc và pepsin, cho sản phẩm an toàn hơn, giảm phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch Sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất các sản phẩm máu và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh

ở các nước tiên tiến Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập trung vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin, globulin miễn dịch, các yếu tố đông máu

1.3.2 Phương pháp tủa bằng muối:

- Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2

- Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc các hoá chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân

tử protein đó, giúp cho protein kết tủa Thường sử dụng dung môi (acetone, ethanol) hoặc muối trung tính để kết tủa protein Sự kết tủa có tính chọn lọc: các protein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau

- Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammonium sulfate (NH4)2SO4, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme; ưu điểm nữa là khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong huyết tương Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vào huyết tương một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số protein kém bền Hạn chế của phương pháp là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao, tỷ trọng của dung môi lớn, để kết tủa được các protein, phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo

- Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex

- Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở

25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độ

bão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất Thu IgG qua ly tâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tích đối với đệm trước khi dùng

- Để loại bỏ những thành phần protein không cần thiết, có thể gây biến tính chọn lọc bằng nhiệt độ, pH Phương pháp này thích hợp với protein chịu acid

và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50-70oC và pH ≤ 5; những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, được loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc

- Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng các enzyme pepsin hoặc papain Đây là các protease thủy phân protein, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nào enzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60-70o

C, enzyme mất hẳn hoạt tính Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp dưới 40o

C, để hạn chế sự biến tính enzyme Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

1.3.3 Phương pháp sắc ký (chromatography):

- Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM (Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S-200, bằng phương pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99% Tuy nhiên giá rất cao, sử dụng một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phương pháp Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao Mất mát trong quá trình sắc ký

nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều nước kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký Theo phương pháp này, sau ly tâm huyết tương tươi đông lạnh có 3 nhóm nguyên liệu cần tinh khiết

1.3.4 Phương pháp miễn dịch hấp thụ:

Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch ra khỏi hỗn hợp chung Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nên chỉ dùng trong phòng thí nghiệm

1.3.5 Phương pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:

Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp này sản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giá thành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới

Tóm lại: sản xuất  - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác Vậy nên, chỉ có thể tạo nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động

1.4 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:

1.4.1 Khái niệm:

HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn có khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từ người đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9]

Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từ gốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison” Năm 1895, thuật ngữ antivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu Từ 2003, thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:

“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau

1.4.2 Lịch sử phát minh:

Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa

học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh

thỏ Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR

rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trị cứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả

trên người (Barbara J Hawgood, 1999)[43] Việc gây miễn dịch cho động vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh

năm 1890 đã được A Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành công HTKNR [64] Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳ mới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất Từ đó, các nghiên cứu về HTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an toàn HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc

nọc rắn và đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn

phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79] Hàng

nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳng định: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu, giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6]

1.4.3 Cơ sở miễn dịch học:

1.4.3.1 Kháng nguyên nọc rắn:

Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an toàn cho động vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính kháng nguyên gọi là KN nọc rắn Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc

điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có thành phần và tính không thuần nhất về phương diện hoá học, có khả năng giáng hoá Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch

phụ thuộc vào mức độ lạ Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về kháng nguyên giữa hai cơ thể càng nhiều Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứ nhất là hoàn toàn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm Các kháng nguyên

có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễn dịch yếu Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh

miễn dịch rất yếu [16],[34] Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong

cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng nguyên lại khó khăn do

có tính sinh miễn dịch yếu Các phân tử không hoà tan có tính sinh miễn dịch lớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý Vì vậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏ bằng nhiệt, làm tăng tính không hoà tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi cho đại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu còn phụ thuộc tính chất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ

và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các

tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28] Cấu trúc di truyền của túc chủ ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối

ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đáp ứng miễn dịch với cường độ cao nhất Liều kháng nguyên quá thấp và liều quá lớn kháng nguyên cũng không kích thích được đáp ứng miễn dịch vì chúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng Đưa kháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độ thấp Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài tuần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25]

Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm

gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Sử dụng tá dược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịch thấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên Tá dược kéo dài sự tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm Khi tiêm kháng nguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào

cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16]

Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn Tá dược Freund

là một tá dược hay được sử dụng Tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hoà trong nhũ tương dầu, có hiệu lực cao hơn tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete

adjuvant) Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm

tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tế bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết

ra, là đồng kích thích tố hoạt hoá các tế bào lympho TH Cả hoạt động trình diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tăng lên khi có tá chất Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạn tính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có kháng nguyên Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thành các u hạt Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoá lympho TH Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, kháng nguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phương pháp khác nhau, theo từng tác giả, miễn sao hiệu quả nhất [16],[25]

1.4.3.2 Kháng thể chống nọc rắn:

Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,

đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạt động đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc, được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắn

tương ứng, đặc hiệu

Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một

kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên Trong phản ứng chống

độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hòa, làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên lên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn do các độc tố đó gây ra Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể Khi hệ thống bổ thể được hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanh lọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động được diễn ra Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có

thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Các tế bào NK có thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởi các kháng thể Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đến việc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực), tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hoà độc tố hiệu quả hơn [16],[25] Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bào lymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể

(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể Tế bào plasma

chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh

ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ Các tế bào lymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưu hành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng nguyên tái xuất hiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng

thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].

1.4.4 Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:

1.4.4.1 Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:

Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫn cảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh Để chế tạo được kháng nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc cần sản xuất HTKNR Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại đúng loài rắn cần nghiên cứu Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽ không có tác dụng Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc tính di truyền từng loài rắn Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao Thí

dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR

cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W., Thorpe R.S, 1996) [20],[60] Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn

thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn máu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC Chế tạo kháng nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương

pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc

Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ có thể gây hủy hoại hoàn toàn những kháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp

Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động

vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test), kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng nguyên vô khuẩn (Sterility test) Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,

thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảm trên thỏ trước khi làm chính thức

Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony, ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể [12],[15],[22],[26][73]

1.4.4.2 Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:

- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà [126],[129] Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ trước, nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do ngựa cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều đặn một khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang đến hiệu quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát triển, nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp Thường

dùng ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350

kg Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai

thác huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159] Cừu có đáp ứng

miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá

dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A et al., 1997) [84]

Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệu tối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành

- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tính đặc hiệu và mức cô đặc Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá kháng thể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt ra cho tất cả các nhà sản xuất Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịch trình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăng theo mỗi lần miễn dịch Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa các lần tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4 tuần Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo kháng nguyên để qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp Tá dược tạo

sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bào lympho, hỗ trợ hiệu quả quá trình sinh kháng thể Huyền dịch kháng nguyên nọc rắn trong tá dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải phóng từ từ vào

cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972) [20]

- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi

sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tán hai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN -

KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa Điện di miễn dịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xác định tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên

1.4.4.3 Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:

Sau khi ngựa đã có kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn với hiệu giá cao sẽ

lấy máu, thu huyết tương hoặc huyết thanh để sản xuất HTKNR Theo Warrell D.A, Theakston R.D.G (1971) tuy một số nhà sản xuất vẫn dùng huyết thanh

để sản xuất, song ngày nay đa số nhà sản xuất dùng huyết tương thu được từ máu chống đông [20]

Dùng huyết tương có lợi điểm sớm hoàn trả được khối hồng cầu cho ngựa, đảm bảo sức khỏe ngựa hồi phục sớm, giúp cho đáp ứng sinh kháng thể chống nọc rắn được mạnh hơn Ly tâm hoặc để lắng, tách khối hồng cầu để truyền trả cho ngựa càng sớm càng tốt Thường lấy máu vào bình thủy tinh hoặc bình nhựa vô khuẩn chuyên dùng với thể tích lớn trên 10 lít Hệ thống lấy máu được thiết kế theo vòng kín để đảm bảo vô trùng, dễ khử khuẩn Máu lấy không được để vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh Lượng máu lấy cần tính toán cân nhắc trước, tùy theo trọng lượng, sức khỏe

ngựa Theo Lê Văn Hiệp (2010) thường lấy số lượng máu không quá 1,5%

trọng lượng cơ thể ngựa, trung bình một tháng/lần; cứ 1 lít máu ngựa cho được ≈ 100ml HTKNR [159]

Cần chú ý an toàn cho người lấy máu khi làm việc với ngựa Phải có các dụng cụ chuyên dùng cố định thân mình và cổ ngựa, vừa dễ lấy máu, an toàn cho người lấy máu

1.4.4.4 Tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn:

Đến nay, việc tinh chế HTKNR có thể thực hiện theo một trong ba kỹ thuật chế tạo là IgG, F(ab’)2 và Fab [136] Tùy điều kiện và kinh nghiệm của nhà sản xuất, nhu cầu điều trị của từng quốc gia, từng địa phương và từng loại nọc rắn; có thể sản xuất HTKNR ở một trong ba dạng sản phẩm trên, sau đó tinh chế loại bỏ các thành phần khác, chỉ để lại phần đặc hiệu tác dụng với

độc tố nọc rắn là phần IgG, F(ab’)2 hoặc Fab, với mức độ cô đặc cao nhất Để giảm thiểu phản ứng quá mẫn khi sử dụng HTKNR, dùng pepsin cắt bỏ phần

Fc của γ-globulin miễn dịch, tạo ra mảnh F(ab’)2 (Latifi, 1978) [20], sau đó

tinh chế, cô đặc mảnh F(ab’)2 Phần Fc là nơi có nhiều thụ thể kết dính tế bào,

là trung gian của các phản ứng quá mẫn được loại bỏ Mảnh F(ab’)2 vẫn còn khả năng kết hợp hai kháng nguyên được giữ lại

Một phương pháp khác tinh chế HTKNR là dùng papain cắt Fc của IgG, thu hồi hai mảnh Fab, mỗi mảnh có một vị trí kết hợp kháng nguyên Trọng lượng Fab khoảng 50.000

Hình 1.2 Vị trí tác động của pepsin và papain

Mảnh Fab có ưu điểm: chỉ có một vị trí kết hợp kháng nguyên, Fab không hình thành phức hợp miễn dịch, không gây phản ứng quá mẫn type - III [11]; phần Fc đã mất nên không kết hợp bổ thể, hoặc macrophages, loại bỏ quá trình giải phóng amin hoạt mạch; mảnh Fab không gây shock phản vệ

hoặc phản ứng dạng phản vệ; do kích thước nhỏ, Fab thấm vào khoang nội bào nhanh hơn Tuy nhiên, do thời gian bán hủy F(ab’)2 là 36 giờ, dài hơn bán

hủy F(ab) (khoảng 4 giờ), dẫn đến hiệu quả điều trị thấp (Dart R.C, McNally

J., 2001) [61]

Tại Hội nghị độc học thế giới tại Mexico lần thứ 12 (1997), các nhà khoa học đã thống nhất quan điểm cho rằng hiệu quả điều trị của HTKNR F(ab’)2

phù hợp hơn F(ab) Hàng chục năm nay, ba vấn đề lớn của sản xuất HTKNR

từ ngựa vẫn là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu là: hiệu lực chưa đủ mạnh, phản ứng không mong muốn còn cao và giá thành đắt

1.4.4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm:

Bất kỳ nhà sản xuất HTKNR nào cũng đều có hệ thống kiểm tra chất lượng của mình, bao trùm tất cả quy trình sản xuất, quản lý chất lượng toàn

diện (Total quality management - TQM) [18] Kiểm soát, làm chủ được quy

trình sản xuất thể hiện ở chất lượng sản phẩm có đạt Tiêu chuẩn Quốc gia và Quốc tế hay không Trong từng giai đoạn sản xuất, công tác kiểm tra, giám sát và đánh giá chất lượng được thực hiện thường xuyên, chặt chẽ Giai đoạn nào cũng hoàn thành mục tiêu, yêu cầu chất lượng của giai đoạn đó, đây là nền tảng thành công của sản phẩm cuối cùng Không hoàn thành tốt kết quả giai đoạn trước sẽ làm hỏng toàn bộ công việc của giai đoạn sau

Sau khi HTKNR ra đời, sản phẩm sẽ được đánh giá chất lượng với hai bước độc lập với nhau là Kiểm định cơ sở và Kiểm định Quốc gia [7],[9] Kiểm định cơ sở thực hiện tại cơ sở sản xuất HTKNR, với những thử nghiệm cơ bản: an toàn chung, vô khuẩn, không có chí nhiệt tố và hiệu lực; nếu đạt, sẽ được tiếp tục kiểm tra tiếp bước sau, đó là kiểm định Quốc gia tại Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế Cơ quan này có trách nhiệm đánh giá, kiểm định chất lượng độc lập, khách quan, khoa học cho các sinh phẩm y tế đã được nhà sản xuất đánh giá chất lượng Tiêu chuẩn

chất lượng của huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) được quy định thống

nhất trong Dược điển Việt Nam, có tính chất pháp lý và trọng tài, có giá trị tiêu chuẩn hóa chất lượng, giúp quản lý và nâng cao chất lượng dược phẩm sản xuất và lưu hành trong nước

Tóm lại: quy trình sản xuất HTKNR cho thấy: bản chất HTKNR là các IgG chống nọc rắn đặc hiệu, do đó các cơ sở Huyết học - Truyền máu có điều kiện tách chiết và tinh chế được gamma globulin, đều có thể sản xuất được chế phẩm HTKNR

1.5 TAI NẠN DO RẮN CẠP NIA VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN-RCN TẠI VIỆT NAM

1.5.1 Tình hình tai nạn do rắn cạp nia tại Việt Nam:

Việt Nam có địa hình và khí hậu rất thuận lợi cho rắn độc phát triển, trong đó có các loài rắn cạp nia Cho đến nay, Việt Nam hiện biết là nơi cư ngụ của 193 loài rắn thuộc 69 giống, 8 họ Trong số đó ghi nhận tổng số 53

loài rắn độc gồm 35 loài (15 giống) thuộc họ Rắn hổ Elapidae và 18 loài (8 giống) thuộc họ Rắn lục Viperidae Bên cạnh đó, sự phân bố theo vùng địa lý

của các loài rắn độc cũng khác nhau: 12 loài chỉ ghi nhận ở miền Bắc, 19 loài chỉ ghi nhận ở miền Nam và 22 loài ghi nhận ở cả hai miền đất nước

Với hệ thống kênh rạch chằng chịt và mùa nước nổi hàng năm, cùng thời tiết ấm áp phù hợp với sự phát triển của rắn, số nạn nhân rắn độc hàng năm ở miền Nam nhiều hơn miền Bắc Các loài rắn nguy hiểm nhất ở miền

Nam là rắn cạp nia nam (Bungarus candidus), rắn choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma), rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) Rắn cạp nia nam (Bungarus

candidus) gây tử vong tại bệnh viện tới > 80% (Trịnh Xuân Kiếm, 2010)

[6],[89]; trong khi tỷ lệ tử vong do rắn choàm quạp (Agkistrodon rhodostoma)

khoảng 22% (WHO, 1999) [147], tử vong do rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) xấp xỉ 40% (Lê Khắc Quyến, 2010) [6],[33] Ở các tỉnh miền Bắc

và miền Trung, thường gặp nhất là rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), rắn hổ mang phì (Naja naja atra), rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

và một số loài rắn lục, trong đó nhiều nhất và nguy hiểm hàng đầu là rắn cạp

nia bắc (Bungarus multicinctus) [71],[72]

Như vậy, rắn cạp nia bắc và cạp nia nam là hai loài rắn nguy hiểm nhất Việt Nam, độc tính nọc rắn ức chế rất mạnh cả màng trước và màng sau sinap thần kinh-cơ, gây liệt cơ vân, trong đó có cơ hô hấp, gây tử vong nhanh nếu không được cấp cứu kịp thời Khi điều trị không đặc hiệu (không có HTKNR), bệnh nhân phải thở máy dài ngày, trung bình 4-6 tuần, rất vất vả, tốn kém, nhiều biến chứng và vẫn có thể tử vong Đến nay, chúng ta vẫn chưa

có số liệu đầy đủ về số lượng nạn nhân rắn cạp nia trong cả nước

Theo Trịnh Xuân Kiếm (2001), tại bệnh viện Chợ Rẫy, từ năm 1990 đến

tháng 4/1996, có 23 trường hợp nhập viện, chiếm 2,6% tổng số nạn nhân rắn độc cắn vào viện Chợ Rẫy điều trị [6], tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân này

tại viện lên tới trên 80% Cũng theo tác giả và cộng sự (2010), từ 1998 đến

2007, bệnh viện Chợ Rẫy tiếp nhận 42 trường hợp rắn cạp nia nam cắn, chiếm

2,1% [88] Theo Phạm Ngọc Thảo (2010) [35], trung bình mỗi năm bệnh viện

Chợ Rẫy tiếp nhận 2500 trường hợp nhập viện, trong đó do rắn độc chiếm 34,7%, xấp xỉ hàng ngàn người mỗi năm Như vậy, số nạn nhân rắn cạp nia ước chừng hơn 20 người/năm, bằng khoảng 1/3 so với bệnh viện Bạch Mai

Theo Nguyễn Thị Dụ, Hà Trần Hưng (2010), tại ICU-Trung tâm chống

độc bệnh viện Bạch Mai, có 81 bệnh nhân bị rắn cạp nia bắc cắn trong ba năm 2004-2006, trong đó 27 trường hợp nhập viện trong năm 2006 Tỷ lệ tử vong tại viện dù được cấp cứu với đầy đủ điều kiện tốt nhất vẫn tới ≈ 7%.[72]

Nhiều nơi khác trong cả nước rải rác thông báo về việc cấp cứu điều trị bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn, đa số là rất nặng, điều trị rất vất vả do thở máy dài ngày và biến chứng, các trường hợp này đa số được báo chí đăng tải vì mức độ bức xúc và sự đặc biệt trong cấp cứu điều trị Xin đơn cử một số ví dụ: Báo mới online, ngày 23/8/2013 [171]: “Xin về chờ chết vì không có tiền chữa rắn cắn”, nói về trường hợp bệnh nhân Nguyễn Thị Khay (50 tuổi ở thôn Hoàng Lý I, xã Hoàng Đông, huyện Duy Tiên, tỉnh Hà Nam) bị rắn cạp nia bắc cắn; Citi News, ngày 22/5/203 [172]: “Đi thể dục, thiếu nữ suýt tử vong

vì rắn cắn”; Soha New online, ngày 22/5/2013: “Đầu hè, trúng độc do rắn độc cắn gia tăng đột biến”[176]; Sài gòn giải phóng online 29/7/2007: “Bệnh nhân

“ôm” máy thở… bác sĩ đứng canh”, nói về tình trạng cấp cứu điều trị vất vả của bác sĩ và nhân viên y tế tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai do không có HTKN-RCN[165]; Báo mới online, 27/6/2008: “Chữa ngộ độc rắn cắn: vất vả do thiếu huyết thanh”[166], phản ánh tình trạng bức xúc trong cứu chữa rắn độc cắn mà không có HTKNR hiện nay, dẫn lời của lãnh đạo Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai ý kiến với Bộ y tế về giải pháp giải quyết vấn đề: “ để đảm bảo đủ HTKNR trong tình hình số người bị ngộ độc do rắn cắn đang tăng cao, giải pháp hiệu quả nhất là Bộ y tế cần đầu tư và có cơ chế

cụ thể xây dựng một trung tâm chuyên nghiên cứu và sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn” vv

Như vậy, đây là mặt bệnh có tỷ lệ tử vong cao, gây nhiều khó khăn cho công tác cấp cứu điều trị; bệnh nhân phải thở máy dài ngày, rất vất vả cho gia đình và nhân viên y tế, nhiều biến chứng do thở máy và nằm lâu, như viêm phổi, viêm đường tiết niệu, suy kiệt và ngoài ra còn gây nhiều tổn thất về kinh tế Các vấn đề này có thể giải quyết được dễ dàng nếu có HTKN-RCN đa giá đặc hiệu Trong khi, về kỹ thuật, chúng ta có đủ điều kiện nhân lực và cơ

sở vật chất để sản xuất được loại HTKNR này

1.5.2 Chi “rắn cạp nia” Việt Nam:

- Việt Nam có 5 loài rắn độc thuộc chi Rắn cạp nia (chi Bungarus), trong đó

ba loài có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm với nhau nhất

+ Rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus):

Tên khác: rắn mai gầm, rắn mai gầm bạc

Phân bố: miền Bắc Việt Nam, Thái Lan; Đài Loan, Trung Quốc, Mianma, bắc

và trung Lào

Hình 1.3 Khu vực cƣ trú của rắn cạp nia bắc (B multicinctus) [156]

Loài này có thể tìm thấy ở độ cao tới 1.300 m, sinh sống chủ yếu ở các khu vực thấp, trong các bụi cây, rừng, bờ ruộng, ao hồ, đầm và rừng ngập mặn Rắn hoạt động về ban đêm, ban ngày ẩn trong các hang, hốc Xuất hiện nhiều từ cuối mùa xuân và ngủ đông trong tháng mười một Thức ăn là các loài rắn khác, lươn, chạch, ếch nhái, chột và thỉnh thoảng ăn cả thằn lằn Rắn

đẻ 3 - 15 trứng, nở thành con sau một tháng rưỡi, thường vào tháng 6,7 trong năm Loài rắn này nhút nhát dưới ánh sáng ban ngày nhưng rất hoạt động vào

ban đêm Dễ bị chúng cắn nếu bị khiêu khích hoặc bị đụng phải Lượng nọc độc trung bình khoảng 4,6 mg -18,4 mg mỗi vết cắn Nọc rắn cạp nia bắc có

LD50 khoảng 0,15µg/g (Steven D., Aird Glen C., et al., 1999) [131]

+ Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus):

Tên khác: Malayan kraid, Common krait, Blue krait, Javan krait

Phân bố: Việt Nam, Campuchia, Indonexia, Lào, Malaysia [136], Myanmar, Singapore, Thái Lan [157],[24] Đây là loài rắn phổ biến nhất đồng bằng và trung du Việt Nam

Hình 1.4 Khu vực cƣ trú của rắn cạp nia nam (B.candidus) [155]

Về hình thái, loài này thoáng nhìn giống hệt rắn cạp nia bắc Rắn cạp nia nam chỉ có tối đa 32 khoang đen trên toàn bộ cơ thể Khoang trắng rộng hơn khoang đen, bao toàn bộ mặt bụng liên tiếp đến mặt bên thân rắn

Rắn cạp nia nam sống chủ yếu ở đồng bằng, đồi, rừng, đôi khi gặp ở độ cao tới 1600 mét Đặc tính loài giống rắn cạp nia bắc: thích sống gần nước, bên bờ ruộng, ao hồ, đầm; hoạt động về đêm, thích ăn lươn, chạch Rắn cạp

nia nam thường gặp nhiều nhất ở miền đông Nam Bộ đến Trung Bộ Đây là loài rắn độc vào loại nhất Việt Nam và là một loài rắn độc nhất thế giới, với

LD50 ≈ 0,1 µg/g (Tan N.H et al., 2004) [135], tỷ lệ gây tử vong rất cao [117]

+ Rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) [10],[24]:

Loài rắn này có 24 - 27 khoang đen, khoang vàng xen kẽ nhau, khoang đen bao quanh thân rắn Rắn có ở khắp mọi miền ba nước Đông Dương Ở Việt Nam, loài rắn này thường gặp ở vùng đồng bằng và trung du Rắn hay ở

bờ ruộng, bờ đê, bụi tre, gò đống Hoạt động về đêm Thức ăn là các loại rắn khác, ếch, rắn mối, chuột, thậm chí cả cá Nọc rắn cạp nong có độc tính mạnh

(Pe T., Myint T., et al., 1997)[113] Loài rắn này chậm chạp, ít cắn người

+ Rắn cạp nong đầu đỏ (Bungarus flaviceps) [24],[39]:

Đầu và phần chót đuôi rắn có mầu đỏ Loài rắn này hiếm gặp Ở Việt

Nam đến nay mới chỉ phát hiện thấy ở Núi Dinh, tỉnh Đồng Nai, với độ cao trên 914 mét so với mực nước biển Tại các nước như Thái Lan, Malaysia cũng chỉ tìm thầy loài rắn này ở vùng núi cao Rắn cạp nong đầu đỏ là loài rắn

độc họ rắn hổ, cùng chi rắn cạp nia (Bungarus) nhưng khá hiếm gặp Nọc độc

loài này chủ yếu tác động màng trước sinapse và có khả năng gây rối loạn

đông máu (Ang Swe Siang, et al., (2010)[42]

+ Rắn khoang sông Hồng (RKSH) - Bungarus slowinskii:

RKSH (Red River Krait), mang tên nhà sinh học Mỹ chuyên nghiên cứu

về bò sát Joseph Bruno Slowinskii (1965 - 2001), người đã chết do bị rắn cạp

nia bắc cắn, khi đang nghiên cứu về loài rắn này tại Mianma [158] Năm

2005, Kuch, Kizirian, Lawson, Donnelly, Nguyễn Quang Trường và Mebs, đã

phát hiện loài rắn này tại tỉnh Yên Bái, huyện Văn Yên, Na Hầu và lưu vực sông Hồng Sau đó còn phát hiện thấy loài rắn này tại Quảng Nam, Quảng Trị, Thừa Thiên – Huế và Lào [93] Đây cũng là loài rắn khúc đen, khúc trắng

như rắn cạp nia bắc, cạp nia nam Loài rắn này có khoang đen rộng, khoanh trắng rất hẹp Đây là loài rắn độc mới phát hiện trên thế giới, thuộc chi rắn

cạp nia (Bungarus), và là một trong 5 loài rắn đặc hữu có ở Việt Nam [39]

Các hiểu biết về độc tố nọc loài rắn này chưa nhiều

1.5.3 Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh:

- Thành phần: nọc rắn khô có trên 90% là protein, trong đó 25-70% là enzym,

còn lại là các độc tố polypeptide không enzyme, polypeptide không phải độc

tố và một số chất vô cơ

+ Các enzym: thường gặp nhất là phospholipase A2, hyaluronidase,

phosphoesterases, peptidase [48],[50],[66],[78],[90],[124],[133] tác dụng phá hủy các tế bào máu, các dây thần kinh ngoại vi, cơ vân, nội mạc mạch máu, tác động vào hoạt động màng trước synapse

, Na+, gây ngưng trệ dẫn truyền thần kinh-cơ, dẫn đến liệt cơ không hồi phục [48],[49],[91],[110]

Theo Middlebrook J.L., Kaiser II (1989) [102]; Manjunatha Kini (2003)

nia nam (Bungarus candidus) đều chứa hai loại độc tố thần kinh là

α-neurotoxin và β,γ-α-neurotoxins nhưng số lượng, thành phần khác nhau [59]

Theo Khow O., et al., (2003) [87], Inn-Ho Tsai et al., (2002) [78], trọng

lượng phân tử độc tố nọc hai loài rắn này này từ 25-25,5 kDa, cấu tạo bởi các polypeptide 16-16,5 kDa và 7-8,5 kDa, nhỏ hơn nhiều loài rắn khác [44],[50]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của độc tố nọc rắn cạp nia [6]

- Bệnh cảnh lâm sàng của bệnh nhân rắn cạp nia nam cắn thường nặng nề hơn cạp nia bắc do khác biệt về thành phần nọc và vị trí tác động tại synapse thần kinh-cơ của hai loài rắn độc khác nhau Cũng chính vì vậy, HTKN-RCN đơn đặc hiệu của từng loài rắn cạp nia không có tác dụng trung hòa chéo nhau

hoặc tác dụng rất hạn chế (Warell D.A và cs, 1983) [146]

- Nọc rắn cạp nia là loại độc tố thần kinh có trọng lượng phân tử thấp, hấp thu và lan tỏa rất nhanh trong cơ thể, tác động cả màng trước và sau sinapse,

ức chế rất mạnh dẫn truyền thần kinh-cơ Các dấu hiệu nhiễm độc tại chỗ rắn cắn thường mờ nhạt, nạn nhân thường không đau, không chảy máu, khiến phát hiện không kịp thời hoặc chủ quan coi thường Khi triệu chứng yếu, bại, liệt cơ xuất hiện, nạn nhân trở tay không kịp, tử vong

Hướng dẫn truyền thần kinh

Màng trước sinapse Màng sau

sinapse

1.5.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất HTKN rắn cạp nia:

1.3.1 Trên thế giới:

- Năm 1983, David Warrell khi thông báo kết quả nghiên cứu về các tai nạn

do Bungarus candidus (Malayan kraid) gây ra tại miền đông Thái Lan và tây bắc Malaysia, tác giả đã dẫn nghiên cứu của Kuo T.P., Wu C.S trên tạp chí The Snake (1972) về 925 trường hợp bị rắn Bungarus multicinctus cắn tại Đài

Loan với tỷ lệ tử vong tới 23% Đây là những cảnh báo đầu tiên về sự nguy hiểm do rắn cạp nia gây ra [146]

- Năm 1995, Chan J.C., Cockram C.S., Buckley T (Hongkong) [47], thông báo về hai trường hợp bị rắn cạp nia bắc cắn (Bungarus multicinctus), với đầy

đủ triệu chứng nhiễm độc nọc rắn cạp nia, có liệt cơ hô hấp, sụp mi, sau khi

được điều trị với HTKNR đơn giá chống nọc Bungarus fasciatus và thở máy

hỗ trợ, đã hồi phục sau tám ngày Thời điểm này chưa có nước nào sản xuất

được HTKN-RCN cho hai loài rắn cạp nia bắc (B.multicinctus) và rắn cạp nia nam (B.candidus)

- Năm 1999, Chanhome L., Wongtongkam et al., 1999 (Thái Lan) dùng HTKN rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) trung hòa nọc rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) trong in - vivo, thấy có hiệu quả tương tự như với nọc rắn Bungarus flavicep [51], tuy nhiên nghiên cứu không nói rõ mức độ thành

công đến đâu Như vậy, tới thời gian này Thái Lan chưa sản xuất được

HTKN-RCN, trong khi ở Việt Nam, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) tại Đơn vị nghiên cứu huyết thanh kháng nọc, bệnh viện Chợ Rẫy [88]

- Năm 2002, với nghiên cứu dùng nọc rắn cạp nia nam không khử độc để gây

miễn dịch cho thỏ, các tác giả Thái Lan cho biết, thỏ nghiên cứu đã chịu được liều tiêm dưới da với nồng độ nọc 150 – 200 µg/kg ở lần gây mẫn cảm thứ 5,

trong vòng 6 tháng nghiên cứu Khi tăng liều trên mức này ở các lần miễn

dịch sau, thỏ đều tử vong (Chanhome L et al., 2002) [52] Đây là nghiên cứu

tạo nền tảng cho sản xuất HTKN rắn cạp nia nam ở Thái Lan sau này

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm, Nguyễn Thị Dụ, Hà Trần Hưng và cộng sự

sản xuất và thử lâm sàng thành công HTKN-RCN bắc trên 27 bệnh nhân bị

Bungarus multicinctus cắn, hiệu quả rất cao [71]

- Năm 2007, Leeprasert W., Kaojarern S., (Thái Lan) [95] đã sử dụng

HTKNR của Viện QSMI, sản xuất 2004, điều trị cho ba bệnh nhân nhiễm độc nọc rắn cạp nia nam, vào viện và được dùng HTKNR đặc hiệu rất sớm Kết quả có so sánh với một trường hợp vào viện cùng thời điểm, không được điều

trị bằng B.candidus antivenom Các tác giả cho biết, ở cả ba bệnh nhân,

HTKNR đều có hiệu lực, triệu chứng liệt được cải thiện trong vòng 40 giờ sau khi dùng thuốc Tuy nhiên, lượng antivenom được sử dụng quá nhiều: 80, 88,

87 lọ trong thời gian 90 giờ Điều này cho thấy, công hiệu của HTKNR

Bungarus candidus của họ không cao, nhiều nguy cơ bệnh huyết thanh sau

điều trị Các bệnh nhân này nhiễm độc nặng (khó thở, khó nói, sụp mi mắt trong 30 – 60 phút; được đặt nội khí quản trong 2 - 3 giờ sau khi bị rắn cắn)

Như vậy, sau Việt Nam 5 năm, Thái Lan đã sản xuất thành công B.candidus antivenom [160], nhưng chất lượng còn phải bàn

- Năm 2009, theo Chieh-Fan C et al., (Đài Loan) [53], Trung tâm Vacxin và

Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Đài Loan - đã sản xuất được nhiều loại HTKNR phục vụ cho cứu chữa sáu loài rắn độc nguy hiểm thường gặp nhất

Đài Loan, trong đó có loài rắn cạp nia bắc Bungarus multicinctus, loài rắn độc

gây tử vong cao nhất Đài Loan hiện nay: khi các loài rắn độc khác chỉ gây tử

vong 2,4% thì loài rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) vẫn gây tử vong

đến 24% Hiện nay Đài Loan đã sản xuất được bốn loại HTKNR, trong đó có

HTKNR đa giá cho hai loài: rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) và rắn

hổ mang phì (Naja atra) (Chi - Wen Juan, 2012) [56]

- Malaysia là một nước ASEAN hiện đang phát triển rất mạnh các nghiên cứu

về nọc độc của rắn cũng như sản xuất các loại HTKNR ứng dụng điều trị các

loài rắn của Malaysia, trong đó có rắn cạp nia nam Năm 2012, Tan N.H., Leon P.K., Phung S.Y (Malaysia) [137], đã thí nghiệm đánh giá tác dụng trung hòa độc tính nọc của rắn cạp nia nam Bungarus candidus (Malayan kraid) bằng hai loại HTKN rắn hổ đa giá thường dùng nhất ở Ấn Độ là Vins polyvalent antivenom (VPAV) và Bharat polyvalent antivenom (BPAV), kết quả: các loại HTKNR này đều không có tác dụng Như vậy, cho đến nay, với nhiều thành công trong nghiên cứu, Malaysia vẫn chưa sản xuất được loại

HTKN rắn cạp nia nào, đây quả là một vấn đề không đơn giản

- Trung Quốc cũng là nước đang phát triển mạnh các cơ sở nghiên cứu sản xuất HTKNR, việc ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào sản xuất HTKNR diễn ra rất nhanh chóng, làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do tai nạn rắn độc trong những năm gần đây Hiện nay, Trung Quốc đã sản xuất được HTKNR đa giá

cho rắn hổ mang (Naja atra) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Tuy

nhiên, ít có thông báo của các tác giả Trung Quốc về vấn đề này

- Theo Warrell D.A (2010), chuyên gia hàng đầu của WHO về rắn độc [147], hiện nay thế giới mới chỉ có hai loại sản phẩm HTKN-RCN trên thị trường là:

“Bungarus candidus antivenom”, “Malayan Krait antivenin” do Viện Queen

Saovabha Memorial Institute, Thái Lan sản xuất, liều dùng 50 ml (10ml/ống),

trung hòa được 0.4 mg/ml nọc rắn cạp nia nam; và “Bungarus multicinctus and Naja atra antivenom”do Chinese Shanghai Vaccine & Serum Institute sản xuất, “Taipei Naja-Bungarus antivenin” do Đài Loan sản xuất [147]

1.3.2 Tại Việt Nam:

- Trước 1990, chúng ta vẫn chưa có một loại HTKNR nào Việc điều trị rắn độc cắn chỉ duy nhất bằng các phương pháp không đặc hiệu Rất nhiều bệnh nhân tử vong, tàn phế [6]

- Năm 1991, Đơn vị nghiên cứu chế tạo HTKN được thành lập tại bệnh viện Chợ Rẫy, đơn vị đã nghiên cứu chế tạo được HTKNR hổ đất (Naja kaothia antivenom) ứng dụng lâm sàng hiệu quả, làm giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% còn

3,1% [5],[6]

- Từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nọc rắn và sản xuất HTKNR ở Việt Nam

đã có nhiều tiến bộ Đã thử nghiệm thành công nhiều loại HTKNR, đáp ứng một phần nhu cầu của bệnh nhân bị rắn độc cắn, như: HTKN rắn hổ chúa

(King cobra antivenom)[21], HTKNR choàm quoạp (Agkistrodon rhodostoma antivenom), HTKNR lục tre (Trimeresurus albolabris antivenom), HTKNR

hổ đất (Naja kaothia antivenom), HTKNR hổ mang (Naja atra) [6],[23]

- Năm 1999, Trịnh Xuân Kiếm đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia nam (Bungarus candidus antivenom), trước Thái Lan 5 năm [88]

- Năm 2004, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus), kết quả đã được Hà Trần Hưng, Höjer J., Nguyễn Thị Dụ, Trịnh Xuân Kiếm đăng trên J Med Toxicol, Dec, 6, pp 393-7[71],[72]

- Với các thành công trên, Việt Nam là nước nghiên cứu, chế tạo thành công HTKN rắn cạp nia đơn giá của hai loài rắn cạp nia bắc, rắn cạp nia nam tương đối sớm hơn so với các nước khác trong khu vực Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân, cho đến nay, trong khi Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc đã cho ra thị trường sản phẩm thương mại, chúng ta vẫn chưa có HTKN rắn cạp nia đơn

giá (Monospecific) trên thị trường