Nghiên cứu điều chế mangosteen hỗn hợp các xanthon của vỏ quả măng cụt garcinia mangostana l và thử tác dụng kháng vi khuẩn của mangosteen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bộ và đồng bằng sông Cửu Long, một số ít được trồng ở miền Trung.. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học T

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TS PHAN QUỐC KINH

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2012

Trang 2

Bộ và đồng bằng sông Cửu Long, một số ít được trồng ở miền Trung Măng cụt hiện được trồng nhiều tại Thái Lan, Campuchia, Myanmar, Sri Lanka và Philippin

Từ lâu nền y học cổ truyền Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ đã sử dụng vỏ quả măng cụt để chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ, đau bụng, bệnh vàng da,

…[1], [3], [6] Nhiều nghiên cứu cho thấy quả măng cụt chứa các hydroxy, prenyl xanthon, flavonoid, triterpenoid Các hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, kháng virut, chống ôxy hoá, giảm đau [8] … Những nghiên cứu mới nhất cho thấy hoạt chất chứa trong vỏ quả măng cụt gây độc rất mạnh cho dòng tế bào ung thư gan, ung thư vú, ức chế

tế bào ung thư máu HL60 của người [29], kháng được vi khuẩn Helicobacter pylori (Hp) gây viêm loét dạ dày và kháng virut HIV Khi được sử dụng với

liều cao để đắp ngoài da của chuột, không gây phản ứng phụ, trị được mụn

và vết thương lành rất nhanh [42] Nhiều nghiên cứu cho thấy có rất nhiều chất chống lão hoá, trong đó có khoảng 200 loại mạnh nhất được gọi là xanthon, và các nhà nghiên cứu y khoa đã tìm thấy khoảng 40 dẫn xuất xanthon tồn tại trong vỏ quả măng cụt Trong đó, hoạt chất được nghiên cứu nhiều nhất là mangosteen (có chứa α–mangostin; β–mangostin và γ–mangostin) Hiện nay trên thế giới các hoạt chất của vỏ quả măng cụt được

sử dụng rộng rãi với nhiều sản phẩm có chứa mangosteen ở dạng thực phẩm

Trang 3

chức năng như: mangosteen capsules, xanthon juice (nước ép) … Ở Việt Nam công ty dược phẩm Kingphar cũng đã sản xuất ra sản phẩm Kingphar Phyma, Kingphar Codanbe, …

Từ trước tới nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình công bố về nghiên cứu chiết xuất xác định các xanthon từ vỏ quả măng cụt như các nhóm tác giả: Đào Hùng Cường, Đỗ Thuý Vân (2010), nghiên cứu chiết tách

và xác định xanthon [2]; Hà Diệu Ly và cộng sự (2009), cô lập xanthon có hoạt tính kháng khuẩn [5]; Nguyễn Văn Đậu (2009), phân lập 6 xanthon từ

vỏ quả măng cụt [8]; Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2012), nghiên cứu quy trình tách chiết α-mangostin từ vỏ quả măng cụt quy mô phòng thí nghiệm [4]; Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2003), tác dụng của dịch chiết vỏ quả

măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans” [7], … Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu là các nghiên cứu

trong phòng thí nghiệm, chưa thấy có tài liệu nào ở Việt Nam công bố về nghiên cứu chiết xuất mangosteen (có chứa các xanthon) ở quy mô công nghiệp, để phục vụ cho việc sản xuất các thực phẩm chức năng, trong hoàn cảnh trang thiết bị chiết xuất ở các nhà máy của Việt Nam vẫn đang ở quy

mô thủ công, chưa được hiện đại hoá Luận văn này nhằm góp phần nghiên cứu quy trình sản xuất mangosteen “hỗn hợp các xanthon” dựa vào các dung môi có sẵn ở Việt Nam, rẻ tiền và không dễ cháy nổ Quy trình chiết xuất bằng ngâm kiệt, an toàn hơn quy trình chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ

dễ cháy khi gia nhiệt và giá thành các dung môi hữu cơ này rất đắt Luận văn này chủ yếu tập trung nghiên cứu phương pháp chiết xuất bằng soxhlet để nghiên cứu hàm lượng mangosteen có trong vỏ quả măng cụt và chiết tách xác định các xanthon chính có trong mangosteen và thử hoạt tính kháng sinh

với vi khuẩn thường gặp ở Việt Nam là Staphylococus aureus Trên cơ sở đó

Trang 4

mangosteen ở Việt Nam với giá thành rẻ và với quy trình tương đối an toàn Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu điều chế

mangosteen “hỗn hợp các xanthon” của vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) và thử tác dụng kháng vi khuẩn của mangosteen” với mục

tiêu:

- Nghiên cứu phương pháp chiết xuất mangosteen từ vỏ quả măng cụt bằng phương pháp đơn giản nhất để có thể dễ dàng đưa vào sản xuất trên quy mô lớn

- Thử tác dụng kháng khuẩn của mangosteen và α-mangostin đối với

loại vi khuẩn thường gặp ở Việt Nam là Staphylococus aureus ở các

nồng độ mangosteen và α-mangostin khác nhau

Trang 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về măng cụt

1.1.1 Giới thiệu tổng quan về măng cụt

Măng cụt có tên khoa học: Garcinia mangostana L., thuộc họ Bứa Clusiaceae (Guttiferae) Tuỳ theo từng quốc gia măng cụt cũng có nhiều tên

gọi khác nhau: mangosteen (Anh, Mỹ), mangoustanier (Pháp), Sơn trúc tử (Trung Quốc), mangostán (Tây Ban Nha), manggis (Indonesia, Malaysia),

mangkhut (Thái Lan, Lào), … Tên La - tinh: Garcinia mangostana, tên

“Garcinia” để ghi nhớ nhà thực vật học Laurence Garcia, người đã sưu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18, “mangostana” và tên tiếng Anh là mangosteen đều xuất phát từ tên Mã lai là “mangustan”

1.1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Cây măng cụt có nguồn gốc từ Mã Lai và Indonesia, được trồng từ hàng chục thế kỷ Ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanma cũng như ở Sri Lanka, Philippine, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam, như ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định Hiện nay măng cụt chủ yếu được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Cần Thơ, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Dương, Cà Mau, Trà Vinh, …) với tổng diện tích lên tới gần 5000 ha, cho sản lượng khoảng 4500 tấn/năm Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn/năm Cây măng cụt đòi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắc khe, khí hậu nóng và ẩm, vì vậy cây măng cụt chủ yếu được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam, không tiến

xa ra vùng khí hậu lạnh ở miền Bắc mà chỉ dừng lại ở Huế [3]

Trang 6

Hình 1 Vùng trồng nhiều măng cụt ở Việt Nam

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Măng cụt là loại cây to, cao trung bình 7 – 12m, nhưng cũng có thể cao đến 20 – 25m Thân có vỏ màu nâu đen sậm, có nhựa màu vàng Lá dày, dai và cứng, bóng, mọc đối, màu lục sẫm, mặt trên của lá có màu sậm hơn mặt dưới, hình thuôn dài 15 – 25cm, rộng 6 – 11cm, cuống dài 1 – 2cm Hoa

đa tính thường là hoa cái và hoa lưỡng tính Hoa mọc đơn hay từng đôi Quả hình cầu tròn, đường kính khoảng 4 – 7cm, vỏ quả màu đỏ tím, dày và xốp, trong đỏ tươi như rượu vang, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhuỵ Quả chứa 5 – 8 hạt, quanh hạt có lớp áo bọc màu trắng, ăn ngọt, thơm ngon Mỗi quả trung bình nặng 60 – 80g [3], [6]

Trang 7

Theo kinh nghiệm của những người trồng măng cụt thì sau khi trồng 5 năm, măng cụt mới ra hoa và kết quả Năm đầu chỉ được 15 – 20 quả/cây, sau 10 năm thu được từ 350 – 500 quả/cây, sau 15 năm có thể thu được 1000 – 1500 quả/cây Cây trổ hoa vào tháng 2 – 5, ra quả trong các tháng 5 – 8

Hình 2 Hình ảnh quả măng cụt 1.1.1.3 Thành phần hoá học

Lá cây chứa protein (7,8%), tanin (11,2%), các xanthon (1,6– dihydroxy–3–methoxy–2–isoprenyl xanthon; gartanin; 1,5,8–trihydroxy–3–methoxy–2-isoprenyl xanthon), ethyl methyl maleimid glucopyranosid [16], cùng những triterpenoid như cycloartenol, friedlin, α–sitosterol, betulin,

Trang 8

cyclolanostenon [35]

Vỏ quả là phần được nghiên cứu nhiều nhất, nó chứa khoảng 40 xanthon (Phụ lục 2) [25] Thành phần chính là những xanthon như α–mangostin, β–mangostin, γ–mangostin, isomangostin, trioxyxanthon, pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydrroxy methyl, butenyl xanthon, pyrano xanthenon [18], [23], [41] Những garcinon A, B,

C, D, E; mangostinon; garcimangoson A, B, C; gartanin; egonol; epicatechin; procyanidin từ măng cụt nguồn gốc Việt Nam, benzophenon glucosid với hàm lượng ít và vỏ quả chứa 7 – 13% tanin [3]

Một vài nghiên cứu xác định thành phần hoá học của ruột thân cây của măng cụt gồm tetrahydroxy xanthon và dẫn xuất O-glucosid, pentahydroxy xanthon, maclurin [17] Vỏ cây cũng là bộ phận chứa nhiều xanthon khác nhau (Phụ lục 3) [25] Ngoài ra trong thịt quả măng cụt có nhiều thành phần dinh dưỡng khác (Bảng 1) [25]

Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả măng cụt

Trang 9

Trang 10

nguyên tử C5 – C8 đánh ở vòng bên trái Hệ thống đánh số được dựa trên khung cơ bản xanthen-9 [10] Các xanthon được phân loại thành 5 nhóm chính: xanthon oxy hoá đơn giản, xanthon glycosid, prenyl xanthon, xanthonolignoid và các loại khác [28]

Khung xanthon có cấu trúc tương tự khung acridon, alkakoid có nhiều

trong họ cam (Rutaceae), nhưng chúng khác nhau ở chỗ nguyên tử nitơ

trong nhân acridon được thay thế bằng nguyên tử oxy Các acridon cũng có màu vàng như xanthon

Trang 11

1.1.2.2 Tính chất lý hóa của α-mangostin, β- mangostin, γ-mangostin

Xanthon trong vỏ quả măng cụt được nghiên cứu nhiều là mangostin, β-mangostin, γ-mangostin và gartanin:

α-* α-mangostin [11], [43]:

Tên khoa học: butenyl)-9H-xanthen-9-one; 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-di(3-methyl-2-butenyl) xanthon

Trang 12

Đặc điểm của các xanthon này là tinh thể màu vàng, dễ tan trong các dung môi hữu cơ (alcol, ether, aceton …), không tan trong nước [3], [43] Trong phân tử các xanthon có một tới nhiều nhóm – OH nên khi chuyển sang môi trường kiềm phổ hấp phụ tử ngoại ở vùng 318 – 321nm được chuyển dịch đến vùng 365 – 370nm (bathochrom)

Các xanthon có nhóm – OH tự do cũng dễ dàng bị methyl hoá bởi dimethyl sunfat như γ-mangostin được methyl hoá thành β-mangostin, mặt khác γ-mangostin cũng có thể điều chế được bằng phản ứng demethyl hoá α-mangostin sử dụng piperidin làm xúc tác [24]

1.1.3 Tác dụng và công dụng của măng cụt và xanthon

1.1.3.1 Theo y học cổ truyền

Quả măng cụt ngoài tính chất thơm ngon, nó còn được dùng nhiều để làm thuốc Từ lâu, ở Ấn Độ, măng cụt được kê vào nhiều thang thuốc cổ truyền, đặc biệt chống viêm, chữa tiêu chảy, ức chế dị ứng, làm giản phế quản trong bệnh hen suyễn [9] Ngoài ra quả măng cụt còn xem như là những thuốc chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật, chống suy giảm miễn dịch Người Thái Lan dùng nó để chữa vết thương ngoài da [35] Người Mã Lai dùng nước sắc từ vỏ quả măng cụt chữa lỵ, đau bụng, tiêu chảy, bệnh vàng da Ở Việt Nam theo Đông y, vỏ quả măng cụt

có vị chua chát, có tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng thu liễm, sáp trường, chỉ huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc thức ăn [1] Hiện nay ở Việt Nam, Bộ Y tế đã cho phép sử dụng hoạt chất xanthon được chiết

từ vỏ quả măng cụt vào sản xuất thuốc chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ

Trang 13

1.1.3.2 Theo y học hiện đại

Ngày nay, nền y học hiện đại đã có nhiều khám phá mới về công dụng của măng cụt và cũng như của các xanthon, sau đây là một số công dụng chính:

- Tác dụng chống oxy hoá: hoạt tính chống oxy hoá rất cao, chống các phần

tử gây lão hoá, giúp tinh thần thêm minh mẫn hơn [10], [13], [15], [16], [40]

- Tăng cường sinh lực

- Kháng vi khuẩn, kháng nấm: nhiều loại xanthon và những dẫn xuất của chúng đã được chứng minh có đặc tính kháng nấm và kháng vi khuẩn, kể cả

những vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh ( Staphylococcus aureus, Fusarium oxysporum vasinfectum, Dreschlera oryzae, Trichophyton mentagrophytes, Microporum gypseum, Epidermophyton floccosum, Mycobacterium tuberculosis…) Vì vậy, măng cụt được dùng làm thuốc

chống lại các bệnh truyền nhiễm, cải thiện được tình trạng dạ dày, tiết niệu…[13], [15], [40]

- Chống lại các chứng viêm: chứng viêm kinh niên có thể dẫn đến đái tháo đường type II, ung thư, thấp khớp, lãng trí, bệnh tim mạch và các căn bệnh nguy hiểm khác Các xanthon trong măng cụt chống lại chứng viêm ở tế bào qua sự ngăn chặn các nhiễm thể COX 2 [10], [40]

- Ức chế sự oxy hoá của LDL, vì thế có tác động làm giảm cholesterol [45]

- Ngăn ngừa bệnh tim mạch, giảm huyết áp: bệnh tim và xơ vữa động mạch xảy ra khi tính đàn hồi của các mạch máu quanh tim giảm đi Măng cụt giúp củng cố hệ thống tuần hoàn qua khả năng kháng khuẩn và chống lão hoá

Trang 14

Khi những mạch máu bền vững hơn, nguy cơ mắc bệnh tim cũng giảm theo [45]

- Có tác dụng bảo vệ tế bào gan, ức chế những tế bào ung bướu, vì vậy nó được xem là một chất có tác dụng chống ung thư Hiện nay tác dụng chống ung thư của măng cụt đang là vấn đề rất được quan tâm:

+ Nabandith và cộng sự (2004) - Bộ môn ung thư của Đại học y khoa Ryukyus, Okinawa Nhật Bản cho thấy α-mangostin có tác dụng phòng ngừa tiền ung thư ở ruột già [33]

+ Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh vật của Đại học Mahidol Bangkok, Thái Lan thử tính chống tăng sinh của 9 dược liệu ở dòng tế bào ung thư tuyến vú bằng dịch chiết ethanol cho thấy măng cụt có tiềm năng rất lớn về chống ung thư [32]

+ Sato và cộng sự (2004) - Bộ môn sinh học phân tử Đại học Tohoku, Nhật Bản nghiên cứu tác dụng làm tế bào tự huỷ (apoptosis) của 8 xanthon trên u

tế bào ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột lớn Trong số những xanthon này, α-mangostin chiết từ vỏ măng cụt, có tác dụng mạnh nhất với EC50 = 4µM α-mangostin tác dụng trên đường gây tự huỷ của ty lạp thể

- ATPase đáng kể [38] + Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh của Đại học Mahidol Bangkok, Thái Lan cũng chứng minh dịch chiết thô methanol của vỏ quả măng cụt có tác dụng trên dòng tế bào ung thư vú [31]

+ Mandal và cộng sự (1992) - Viện kỹ thuật sinh học quốc tế Gifu, Nhật Bản nghiên cứu tác dụng của 6 xanthon từ vỏ quả măng cụt lên sự tăng trưởng tế bào của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL60 ở người, α-mangostin ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10µM bằng cách cảm ứng tế bào tự huỷ [28]

Trang 15

+ Ho và cộng sự (2002) - Bộ môn nghiên cứu giáo dục bệnh viện cựu chiến binh Đài Bắc, Đài Loan, chiết và làm tinh khiết 6 xanthon từ vỏ quả măng cụt dùng sắc ký từng phần rồi thử tính độc hại tế bào qua 14 dòng tế bào ung thư người, kể cả 6 dòng tế bào ung thư gan Kết quả cho thấy garcinon-E có tính diệt tế bào ung thư người mạnh nhất cũng như tế bào ung thư dạ dày và phổi [22]

Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu trên đều thực hiện trong ống nghiệm, chưa có nghiên cứu nào thử lâm sàng để có thể chứng minh măng cụt chữa được bệnh ung thư trên người

- Tác dụng giảm đau: một số xanthon có khả năng ức chế hoạt động của enzyme cyclo-oxygenase, nên măng cụt được dùng điều trị những chứng đau, viêm, làm hạ nhiệt độ cơ thể khi bị sốt [10]

- Tác dụng chống dị ứng: các xanthon trong măng cụt ức chế sự tổng hợp histamin nên có tác dụng chống dị ứng [34]

1.1.4 Độc tính

Các xanthon của vỏ quả măng cụt không độc Priya và cộng sự [37] đã thử độc tính của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt trên chuột cống 6 tuần tuổi với liều lượng tương ứng 1,0g; 2,0g; 3,0g vỏ quả măng cụt/kg chuột (số lượng chuột mỗi nhóm 6 con) Kết quả:

và óc) vẫn bình thường và trọng lượng của các cơ quan cũng không khác

gì so với đối chứng

Trang 16

1.1.5 Nguyên tắc chiết xanthon

Để chiết các dẫn xuất xanthon từ vỏ quả măng cụt, từ trước đến nay

đã có nhiều tác giả nghiên cứu [17], [18], [20], [24], [31], [39], [43] Các dung môi thường dùng là: petrolether, toluen, benzen, hexan, ethylacetat, chloroform, aceton, methanol, ethanol, acetonitril … Theo khảo sát của Misra [30] thì dung môi để chiết xuất α-mangostin tốt nhất là methanol, sau

đó đến các dung môi khác theo thứ tự khả năng hoà tan giảm dần như sau:

methanol > chloroform > ethanol > aceton > ethylacetat

Ở đề tài này chúng tôi tiến hành chiết xuất các dẫn xuất xanthon bằng

chiết với số lượng lớn xanthon từ vỏ quả măng cụt để đưa vào sản xuất thì

1.1.6 Tinh chế xanthon

Để tinh chế các dẫn xuất xanthon từ cao măng cụt, nhiều tác giả đã áp dụng các phương pháp thông dụng như:

acid alumina grade III [18] Sau đó rửa giải bằng các hỗn hợp dung môi

từ ít phân cực đến phân cực hơn để tách các hợp chất

Trang 17

benzen – methanol (95:5); chloroform – hexan (90:10)

chloform – ethylacetat – methanol (80:10:5)

benzen – ethylacetat (75:5) hoặc (17:3)

+ Thuốc thử hiện màu:

- Xông hơi iod

- Phun dung dịch acid sulfuric trong ethanol, sau đó sấy ở nhiệt độ

- Phun dung dịch anisaldehyd trong acid sulfuric và sấy ở nhiệt độ

- Soi phát quang dưới đèn tử ngoại

♦ Phân tích α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng các phương pháp:

[43], [44]

1.2 Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn Staphylococus aureus

1.2.1 Vi khuẩn Staphylococus aureus

Staphylococus có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “staphyle” nghĩa là chùm nho Vi khuẩn Staphylococus là các cầu khuẩn Gram dương, không

tạo nha bào, có đường kính khoảng 1µm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm trông giống như chùm nho và được gọi

là tụ cầu khuẩn Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi tiếng nhất, được các nhà vi khuẩn học quan tâm nghiên cứu từ rất sớm Các nhà vi khuẩn học như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Trang 18

Tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: tụ cầu có enzyme

coagulase (Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng, Staphylococcus intermedius) và tụ cầu không có enzyme coagulase

Staphylococcus heamolyticus, Staphylococcus capitis,… ) Nhờ có enzyme

coagulase mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn

lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn Staphylococcus aureus được gọi là tụ cầu

vàng Còn nhóm vi khuẩn không có enzyme coagulase, trên môi trường nuôi cấy có máu, nhóm vi khuẩn này tạo thành khuẩn lạc màu trắng như sứ hoặc màu trắng ngà, nên thường gọi nhóm vi khuẩn này là tụ cầu trắng

Hình 3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Trang 19

1.2.2 Đặc tính và các yếu tố độc lực của vi khuẩn Staphylococus aureus

Năm 1926, Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa

sự hiện diện của hoạt động enzyme coagulase của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên, đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme coagulase Enzyme này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm (clumping factor) của một enzyme vách vi khuẩn, giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ quan trọng và yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán

Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn

polysaccharide Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn độc đáo này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch

có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa: chúng là các receptor cho các đại thực bào Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào

kết dính gian bào Nhờ chất này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh

Trang 20

học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhấy niêm mạc

Các yếu tố độc lực ngoại bào

Ngoài enzyme coagulase và yếu tố kết cụm, tụ cầu còn sản xuất một

số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này

chức tế bào vật chủ, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong tế bào vật chủ

các tế bào hạt cũng như đại thực bào

tổn thương da tạo các bọng nước Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell

do tụ cầu

tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng

(beta-lactamase) Enzyme này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, ampicilline và ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng

Trang 21

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên liệu và dụng cụ chiết xuất xanthon

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất

* Nguyên liệu: vỏ quả măng cụt được cung cấp từ công ty thuốc nam Đà Lạt, vỏ khô, độ ẩm 10 - 12%

nước cất, thuốc thử anisaldehyd (4-methoxy benzaldehyd), acid sulfuric

* Các dụng cụ cần thiết:

- Pipet các loại, bình cầu 2L, cốc có mỏ các loại 100ml, 200ml, 500ml, 5L

- Phễu lọc, đũa thuỷ tinh, giấy lọc

- Bình chạy sắc ký bản mỏng 20x20cm (Đức)

Trang 22

- Silicagel dùng cho sắc ký cột ( cỡ hạt 0,063-0,200mm)

- Cân kỹ thuật, cân tiểu ly, bình ngâm kiệt, nồi đun cách thuỷ, tủ sấy

2.2 Phương pháp nghiên cứu chiết xuất xanthon

Sau khi tham khảo nhiều tài liệu về các phương pháp chiết xuất, phân tích, thử tác dụng dược lý các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt của nhiều tác giả trên thế giới và ở Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu qua các bước như sau:

1 Chiết mangosteen từ vỏ quả măng cụt bằng phương pháp soxhlet với dung

C

- Loại tạp chất qua cột silicagel và than hoạt tính

- Phân lập α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế

- Xác định α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng các phương pháp:

Trang 23

- Chủng chỉ thị: Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Môi trường định lượng (pH sau khi tiệt khuẩn: 7,9 ± 0,1)

- Chuẩn bị đĩa petri: sử dụng đĩa petri đáy phẳng, đã diệt khuẩn, đặt trên mặt phẳng nằm ngang, đun chảy môi trường định lượng đã chuẩn bị ở trên để

lớp nền bằng phẳng, để đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng Thêm hỗn dịch vi

thích hợp để tạo được vòng vô khuẩn sắc nét, lắc đều, tránh tạo bọt Hút 10

ml môi trường đã cấy vi khuẩn vào mỗi đĩa petri, để đông tự nhiên ở nhiệt

Trang 24

lắc đều đến khi tan hết, thu được dung dịch 1/10 Pha loãng tiếp tục bằng dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu được 3 dung dịch với 3 nồng độ: + Nồng độ 1/50 (tương ứng với 2mg mẫu): lấy 0,2ml của dung dịch 1/10 thêm vào 0,8ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0

+ Nồng độ 1/100 (tương ứng với 1mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch 1/50 thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0

+ Nồng độ 1/200 (tương ứng với 0,5mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch 1/100 thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0

- Tương tự với mẫu α-mangostin, ta tiến hành giống mẫu mangosteen, cân 0,1g mẫu và cũng pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu được 3 dung dịch với 3 nồng độ: 1/50, 1/100, 1/200

- Các dung dịch chứng: pha dung dịch EtOH 20% (tương ứng với nồng độ EtOH trong dung dịch 1/50), pha dung dịch EtOH 10% (tương ứng với nồng

độ EtOH trong dung dịch 1/100), pha dung dịch EtOH 5% (tương ứng với nồng độ EtOH trong dung dịch 1/200)

- Tiến hành định lượng theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, với dung dịch chứng và dung dịch của mẫu thử vào mỗi lỗ thạch là 90µl Trên đĩa có

6 lỗ, trong đó 3 lỗ được nhỏ các dung dịch của mẫu thử lần lượt với nồng độ 1/50, 1/100, 1/200 và 3 lỗ thạch còn lại, ta nhỏ lần lượt các dung dịch EtOH

Trang 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất mangosteen bằng soxhlet

Sơ đồ tóm tắt quy trình

Hình 4 Sơ đồ chiết xuất mangosteen

Chiết bằng soxhlet trong 6 giờ, nhiệt độ 80 o

C

Bỏ bã

Dịch chiết

Cất thu hồi dung môi, sấy khô

Cao măng cụt thô

Mangosteen (chứa các xanthon)

- Hoà vào MeOH

- Tách mangosteen bằng sắc ký lớp mỏng điều chế, chất hấp phụ silicagel 60 F254 (Merck), dung môi: benzen-MeOH (tỷ lệ: 95:5), lọc

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,36 MB