Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ identifiler từ quần thể người dân tộc khmer ứng dụng trong giám định adn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THANH CỪ KH

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THANH CỪ

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC KHMER ỨNG DỤNG

TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2014

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC KHMER ỨNG DỤNG

TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

Học viên: Lê Thanh Cừ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14 Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà

NĂM 2014

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn cao học này tôi xin được bày tỏ lời cảm

ơn đến:

- PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc trung tâm giám định Sinh học

pháp lý, Viện Khoa học hình sự, đã chỉ bảo đã cho tôi nhiều kinh nghiệm trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong quá trình công tác

- Tập thể Lãnh đạo Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo và cán bộ trong

Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý - Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình đi học và làm nghiên cứu đề tài

- Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy, cô đã giảng dạy tại

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí giá

về lĩnh vực Công nghệ Sinh học làm cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này

Sau cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Lê Thanh Cừ

Trang 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU……….……… …4

MỞ ĐẦU 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Giám định gen (ADN): 9

1.1.1 Sự ra đời của sinh học phân tử: 9

1.1.2 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen: 13

1.1.3 Khái niệm về locus và alen 19

1.1.4 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN 19

1.1.5 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR 20

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN 21

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước: 23

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nội dung nghiên cứu: 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 26

2.2.1 Thu mẫu: 26

2.2.2 Phân tích mẫu: 27

2.2.2.1 Quy trình phân tích ADN……….27

Trang 5

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ: 28

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN 28

b Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN 28

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di 28

2.2.3 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen 29

2.2.3.1 Cơ sở lý thuyết 29

2.2.3.2 Phương pháp xử lý thống kê 29

2.2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định: 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết AND 31

3.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen 31

3.3 Kết quả xử lý số liệu thống kê 32

3.3.1 Kết quả tính toán tần suất các alen 32

3.3.2 Kết quả quan sát kiểu gen từng locus và tính toán chỉ số kiểm định Khi bình phương……….……….35

3.4 Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an 54

KẾT LUẬN……… ……….56

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN - Axit Deoxyribo Nucleic

ARN - Axít ribonucleic

VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

STR - Short Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

ID - Identifiler/Identify definition

PCR - Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

FTA - Tên riêng của một vật mang thu mẫu máu (dạng thẻ) trong khoa học

hình sự

bp - Base pair

Trang 7

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu KM100

Bảng 1.1 Các locus gen hệ Identifiler

Bảng 3.1 Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus gen hệ Identifiler Bảng 3.3 đến 3.17 Xử lý số liệu thống kê ở 15 locus gen hệ Identifiler Bảng 3.18 So sánh 2

tt và 2

lt Bảng 3.19 So sánh tần xuất alen với một số quần thể

Trang 8

MỞ ĐẦU

Viện Khoa học hình sự là một đơn vị đầu ngành của lực lượng kỹ thuật hình sự, một trung tâm khoa học của ngành Công an Việt Nam Một trong những nhiệm vụ quan trọng của Viện Khoa học hình sự là công tác giám định phục vụ tố tụng hình sự, tố tụng dân sự và các yêu cầu cá nhân, trong đó nổi bật

là lĩnh vực giám định ADN

Từ tháng 4 năm 1999, Viện Khoa học hình sự đã triển khai lĩnh vực giám định ADN với toàn bộ quy trình được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc, sử dụng hệ NinePlex II (gồm 09 locus)

Năm 2006 Viện Khoa học hình sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler (gồm 15 locus) trong giám định ADN Với bộ kit này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus NinePlex II

Trong giám định ADN hình sự đòi hỏi bắt buộc phải tính xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể có cấu trúc di truyền trùng lặp với ADN của các mẫu vật giám định Để tính toán được xác suất này thì phải có dữ liệu tần suất của từng alen [7]

Theo lý thuyết di truyền học, mỗi quần thể người (dân tộc) khác nhau có những đặc điểm di truyền đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quần thể này cho một quần thể khác Do đó, bắt buộc phải tiến hành khảo sát tần suất các alen của các locus dùng trong giám định ADN hình sự đối với mỗi dân tộc

để đảm bảo tính khoa học, chính xác và khách quan trong kết luận giám định Việc khảo sát tần suất các alen của các locus đang sử dụng trong giám định ADN đối với các dân tộc trên toàn lãnh thổ Việt Nam là một việc làm mang tính cấp bách

Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần 90%) [1] và đã có đề tài khoa học cấp Bộ khảo sát tần suất alen gen người Việt

Trang 9

(Kinh) theo hệ Identifiler [12] Còn lại là các dân tộc thiểu số, do điều kiện về cơ sở vật chất cũng như con người chưa đáp ứng được nên chưa thể tiến hành khảo sát tần suất alen cho tất cả các dân tộc

Trong nhóm các dân tộc thiểu số đông dân nhất (Tày, Thái, Mường, Khmer, Hoa, Nùng, Hmông, người Dao, Giarai, Êđê, Chăm, Sán Dìu, người Raglay) có một số dân tộc cư trú chủ yếu tại các tỉnh biên giới, là các điểm nóng

về An ninh và Trật tự an toàn xã hội

Theo Tổng điều tra dân số và nhà ở năm 2009, người Khmer ở Việt Nam

có dân số 1.260.640 người, có mặt ở tất cả các tỉnh, thành phố Người Khmer cư trú tập trung tại các tỉnh: Sóc Trăng (397.014 người, chiếm 30,7 % dân số toàn tỉnh và 31,5 % tổng số người Khmer tại Việt Nam), Trà Vinh (317.203 người, chiếm 31,6 % dân số toàn tỉnh và 25,2 % tổng số người Khmer tại Việt Nam), Kiên Giang (210.899 người, chiếm 12,5 % dân số toàn tỉnh và 16,7 % tổng số người Khmer tại Việt Nam), An Giang (90.271 người), Bạc Liêu (70.667 người), Cà Mau (29.845 người), thành phố Hồ Chí Minh (24.268 người), Vĩnh Long (21.820 người), Cần Thơ (21.414 người), Hậu Giang (21.169 người), Bình Phước (15.578 người), Bình Dương (15.435 người) 1

Tết: Người Khơ Me có 2 lễ lớn trong năm, Tết Chuôn chnam Thmây tổ chức từ ngày 1 đến ngày 3 đầu tháng Chét (theo Phật lịch) vào khoảng tháng 4 dương lịch và Lễ chào mặt trăng (ok ang bok) tổ chức vào rằm tháng 10 âm lịch, trong

lễ này có đua thuyền Ngo giữa các phum - sóc

Lịch sử: Người Khơ Me từ Tây Khương xuống Trung Lào vào khoảng giữa thiên kỷ 1 trước Tây lịch, cùng lúc với người Việt tộc từ Giang Nam di cư xuống Bắc bộ (2), từ Tây Khương (hay Tây Khang) đi Trung Lào không xa lắm, chỉ vượt qua Vân Nam là đến, lại có sẵn một “đường” rất tiện là con sông Cửu Long Đến trước thế kỉ XII người Khơ Me và văn hoá của họ giữ vai trò chủ thể

ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Trang 10

Văn hóa: Người Khơ Me đã có những cống hiến to lớn vào kho tàng văn hóa

chung của các dân tộc ở Việt Nam Về văn học dân gian, người Khơ Me là chủ nhân di sản của một nền văn hóa phong phú gồm nhiều thể loại: dân ca, truyển

cổ, những câu châm ngôn, tục ngữ thường như một lời khuyên răn, một kinh nghiệm sống Gắn liền với những sinh hoạt khác nhau, dân ca Khơ Me cũng có nhiều loại: hát ru con, hát trong lao động… những bài hát không chỉ phản ánh không kinh nghiệm nông nghiệp mà còn phản ánh đời sống xã hội nhiều tình cảm của người Khơ Me

Hoạt động sản xuất: Bên cạnh việc trồng lúa nước là ngành sản xuất chủ yếu,

nông dân Khơ Me còn trồng hoa mầu trên đất rẫy Có hai loại đất rẫy: rẫy chuyên dùng và rẫy vốn là ruộng ven làng Giữa hai vụ mùa lớn, người dân Khơ

Me canh tác thêm một vụ hoa màu phụ ngắn ngày Trên đất rẫy, phổ biến các loại đậu, khoai, ngô, rau, mía, hành, ngò… Có nhiều địa phương chuyên trồng các đặc sản như dưa hấu, hành đỏ, nhãn, trầu vàng, xoài… Ngoài công việc chăn nuôi, người Khơ Me ở vùng ven sông rạch hay biển cũng sử dụng các kỹ thuật đánh bắt cá nước ngọc và nước mặn Rất ít người Khơ Me sống chuyên bằng chài lưới trên biển, tuy cũng có một số gia đình chung vốn vào việc mua thuyền, mua lưới đánh cá ven biển

Như vậy, người Khmer tuy là dân tộc thiểu số nhưng phân bố rộng rãi khắp các tỉnh thành và tập trung chủ yếu theo tuyến biên giới phía Tây Nam Bộ [1] Đây là những khu vực có thời tiết khí hậu khắc nghiệt, giao thông đi lại khó khăn và lại là địa bàn nhạy cảm, thường xuyên phải đấu tranh với những âm mưu thủ đoạn, hoạt động chống phá của các thế lực thù địch, các loại tội phạm (tội phạm xâm phạm an ninh quốc gia, tội phạm ma túy, buôn lậu, buôn bán phụ

nữ trẻ em, giết người, hiếp dâm, vận chuyển, buôn bán tiền giả, chất nổ, chất cháy ) Giám định ADN là một công cụ đắc lực phục vụ cho công tác điều tra, xét xử nói chung và góp phần bảo vệ chủ quyền an ninh biên giới, giữ vững an

Trang 11

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8

ninh trật tự xó hội khu vực phớa Tõy Nam Bộ núi riờng Hàng năm số lượng các vụ án hình sự nghiêm trọng liên quan đến ng-ười dân tộc Khmer và được trưng cầu giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự có xu hướng gia tăng Cụ thể năm

2004 có 10 vụ, năm 2005 có 11 vụ, năm 2006 có 7 vụ, năm 2007 có 9 vụ, năm 2008 có 16 vụ, năm 2009 có 21

vụ và năm 2010 có 18 vụ

Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào được công bố về khảo sát sự phân bố các alen của 15 locus gen hệ Identifiler đối với quần thể người dân tộc Khmer Vỡ vậy, việc tiến hành triển

khai đề tài nghiờn cứu: “Khảo sỏt và xõy dựng cơ sở dữ liệu tần suất cỏc alen của

15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dõn tộc Khmer ứng dụng trong giỏm định ADN” là một yờu cầu cấp thiết Đề tài này được hoàn thành sẽ

đáp ứng yêu cầu cấp thiết của giám định gen và đóng góp tài liệu vào hệ thống gen hình sự quốc tế Kết quả của đề tài là cơ sở pháp lý vững chắc để phân tích,

đánh giá và kết luận giám định đối với những vụ án liên quan đến người thuộc dân tộc Khmer

Mục tiờu của đề tài

Khảo sỏt và xõy dựng cơ sở dữ liệu tần suất cỏc alen của 15 locus gen (ADN) hệ Identifiler từ dõn tộc Khmer phục vụ cho cụng tỏc giỏm định ADN ở cỏc vụ ỏn liờn quan đến người dõn tộc Khmer Trờn cơ sở đú, tớnh tần suất xuất hiện của mỗi alen trong từng locus của dõn tộc Khmer, làm cơ sở khoa học để phõn tớch, đỏnh giỏ và rỳt ra kết luận giỏm định truy nguyờn huyết thống hoặc truy nguyờn cỏ thể Đồng thời đúng gúp vào nhiệm vụ giỏm định ADN cho cỏc

Trang 12

lực lượng thực thi pháp luật trên toàn cầu, nhất là trong bối cảnh toàn cầu hóa giữa cảnh sát các nước thông qua Interpol

1.1.1 Sự ra đời của sinh học phân tử

Theo F Jacob thì sinh học hiện đại có mục đích là giải thích các đặc tính của cơ thể sống thông qua nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các phân tử vật chất thành phần

Sinh học phân tử là một ngành sinh học hiện đại quan tâm đến việc giải thích những hiện tượng và quy luật sinh học ở mức phân tử Các nhà sinh học phân tử thường sử dụng những kỹ thuật hóa sinh để nghiên cứu những vấn đề di truyền Lịch sử ra đời và phát triển của sinh học phân tử chính là sự hội tụ và phát triển của nhiều ngành khoa học khác nhau như: Sinh học tế bào, Di truyền học, Hóa sinh học và Vi sinh vật học

Ngành di truyền học ra đời vào thế kỷ thứ XX: Đầu tiên những công trình của Mendel (1822-1884) được nghiên cứu trở lại, đến năm 1900, thuyết

di truyền do nhiễm sắc thể ra đời

Trang 13

Vào đầu thế kỷ XX người ta khám phá ra ADN như một chất sinh hóa mang thông tin di truyền và làm sáng tỏ cấu trúc ADN

Những năm 70 ngành sinh hóa phân tử bùng nổ

Sự xuất hiện ngành di truyền học: Ngành di truyền học hiện đại này có từ các công trình của Mendel, người đầu tiên thực hiện các lý thuyết về di truyền Ông in ra các kết quả năm 1866, nhưng lúc bấy giờ ít được chú ý Cho đến năm

1900 thì người ta mới nghiên cúu và khám phá trở lại

Sự phát triển của thuyết nhiễm sắc thể về tính di truyền Các gene nằm trong nhiễm sắc thể và theo Sturtevant thì các gene có thể có một trật tự trong nhiễm sắc thể, và thành lập bản đồ gene đầu tiên Cũng trong phòng thí nghiệm của Morgan mà các thủ tục về thí nghiệm biến đổi được Muller phát triển

Sự hội tụ của ngành sinh hóa và di truyền: Lúc bấy giờ người ta biết sự hiện diện các gene trong nhiễm sắc thể nhưng chưa biết tính chất sinh hóa các gene hay cách hành động của chúng

Garrod thiết lập sự liên hệ đầu tiên giữa gene và enzym từ sự quan sát căn bệnh di truyền

Beadle và Tatum đào sâu liên hệ này nhờ một hệ thống dẫn tới thực nghiệm: nấm Neurospora crassa

Tổng hợp các công trình này đưa đến một kết luận là các gene kiểm soát

sự tổng hợp các enzym, và mỗi protein được mã hóa (code) bởi một loại gene riêng biệt

ADN chất sinh hóa mang thông tin di truyền: Năm 1928 hiện tượng đầu tiên cho phép phát triển về sự nhận diện chất di truyền là sự biến đổi vi khuẩn do Griffith, người Anh tìm ra

Hiện tượng này lúc bấy giờ được xem là một thử nghiệm về hoạt động sinh học mà nhờ đó người ta có thể xác định được bản chất của chất di truyền Thử nghiệm này lại được Avery dùng để làm sáng tỏ bản chất sinh hóa đó là ADN Tuy nhiên sự khám phá này cũng được đón chào bởi nhiều người hoài

Trang 14

nghi Phải đợi có nhiều công trình khác kế tiếp mà thực tế này mới được chấp nhận: Đặc biệt là công trình của Chargaff hay Hershey Sự chấp nhận toàn toàn

và vĩnh viễn có được khi Watson và Crick làm sáng tỏ của cấu trúc ADN

Ảnh hưởng của các nhà vật lý học: Ảnh huởng các nhà vật lý học sẽ đánh dấu ngành sinh học phân tử Có những người, như Schrödinger đóng vai trò như một nhà quan sát Những người khác cống hiến tất cả sự nghiệp của họ cho ngành này vì họ nhận biết rằng khoa học này là một biên giới (lãnh vực) mới của sự hiểu biết khoa học

Pauling và Delbrück đóng một vai trò xác định sự tiến triển của khoa học này

Delbrück đặc biệt là người sáng lập ra nhóm phage với Luria và Hershey

Cấu trúc ADN: Cuối cùng, đó là nhờ sự sáng tỏ của cấu trúc ADN mà ngành sinh hóa phân tử biết thành công rực rỡ Sự thành công này không những

là công trình của Watson và Crick; mà cũng là của các nhà nghiên cứu Franklin

và Wilkins

Mô hình của Watson và Crick và tổng quan về cấu trúc ADN

Trong quá trình nghiên cứu của mình Watson và Crick đã bắt đầu suy nghĩ về mô hình xoắn kép, nhưng vẫn thiếu thông tin về bước xoắn và khoảng cách ngang giữa 2 mạch Khi đó, Rosalind Franklin gửi một số phát hiện của bà cho Trung tâm nghiên cứu y học và Crick đọc được các tài liệu này nhờ một trong các đường dẫn của Max Perutz's Công trình của Franklin xác nhận về câu trúc xoắn kép và còn ghi nhận về tính đối xứng của phân tử, đặc biệt là cho rằng

2 mạch chạy theo hướng ngược nhau dạng đối song

Giữa tháng 3 năm 1953, Watson và Crick đã suy luận ra cấu trúc xoắn kép của ADN, nhờ sử dụng kết quả nghiên cứu thực nghiệm của Rosalind Franklin và Maurice Wilkins, (điều này từng gây tranh cãi vì hai ông xem các mẫu nhiễu xạ tia X quan trọng của Franklin mà chưa được sự đồng ý của bà (bà thậm chí không biết đến).) Sau khi xem kết quả của Franklin, Watson có đề nghị

Trang 15

Franklin hợp tác để thắng nhóm của Pauling trong cuộc chạy đua tìm ra cấu trúc nhưng bà từ chối Ngay sau đó, Maurice Wilkins cho Watson xem bức ảnh nổi tiếng - Bức ảnh 51 Từ bức ảnh này, Watson và Crick nhanh chóng nhận ra rằng không chỉ khoảng cách giữa 2 mạch không đổi mà còn có thể đo đạc chính xác con số là 2 nanomet, và cũng từ đây, họ xác định được bước sóng 3,4 nm mỗi 10bp của cấu trúc xoắn kép

Cuối cùng, Watson và Crick cho rằng việc bắt cặp bổ sung của các base (Nucleobase) giải thích cho phát hiện của Chargaff Tuy nhiên, khi ấy các sách giáo khoa đã tiên đoán sai rằng các Nucleobase tồn tại dạng enol (thực chất chúng tồn tại dạng keto) Khi Jerry Donohue chỉ ra lỗi sai này cho Watson, ông nhanh chóng nhận ra cặp A-T, G-X gần như y hệt nhau về hình dạng và do vậy,

sẽ tạo ra các cấu trúc như những bậc thang giữa 2 mạch Hai ông nhanh chóng hoàn thành mô hình và công bố trước khi Franklin xuất bản bất kỳ công trình nào của bà Ngày 25 tháng 6 năm 1953, Watson và Crick đã đăng nghiên cứu của các ông trong bài báo trên tạp chí khoa học Nature với tiêu đề: A structure for deoxyribose nucleic acids (Cấu trúc của Axit Deoxyribo Nucleic (ADN)

Phân tử ADN được coi là "cơ sở vật chất của tính di truyền ở cấp độ phân tử" (molecule of heredity) Tuy nhiên, thực chất về mặt cấu tạo, các ADN không phải một phân tử đơn thuần mà nó được tạo thành từ hai chuỗi polynucleotide, chúng liên kết với nhau và uốn quanh 1 trục tương tự 1 chiếc thang dây xoắn Cấu trúc này được gọi là cấu trúc xoắn kép

Mỗi chuỗi polynucleotide chính là do các phân tử nucleotide liên kết với nhau thông qua liên kết phosphodieste giữa gốc đường của nucleotide này với gốc phosphate của nucleotide tiếp theo Tóm lại, ADN là các đại phân tử (polymer) mà các đơn phân (monomer) là các nucleotide

Mỗi nucleotide được tạo thành từ một phân tử đường ribose, một gốc phosphate và một bazơ nitơ (nucleobase) Trong ADN chỉ có 4 loại nucleotide

và những loại này khác nhau ở thành phần nucleobase Do đó tên gọi của các loại

Trang 16

nucleotide xuất phát từ gốc nucleobase mà nó mang: adenine (A), thymine (T), Cytosine (C), và guanine (G) Trong đó, Avà G là các purine (có kích thước lớn) còn T và C (tiếng Việt gọi là X ), có kích thước nhỏ hơn (pyrimidine)

Trong môi trường dịch thể, 2 chuỗi polynucleotide của 1 phân tử ADN liên kết với nhau bằng liên kết hiđrô Liên kết này được tạo ra giữa 2 gốc nucleobase của 2 nucleotide đối diện nhau trên 2 chuỗi, tương tự như những bậc thang trên 1 chiếc thang dây

Do cấu tạo hoá học của các nucleobase mà liên kết hydro chỉ hình thành giữa 2 loại nucleobase nhất định là A với T (qua 2 liên kết hydro)

và C với G (bằng 3 liên kết hydro) Đó thực chất là liên kết giữa một purine và 1 pyrimidine nên khoảng cách tương đối giữa 2 chuỗi polynucleotide được giữ vững Nguyên tắc hình thành liên kết trên được gọi lànguyên tắc bổ sung và nó phổ biến trên mọi loài sinh vật

Trong tế bào, dưới tác dụng của một số protein đặc hiệu, 2 chuỗi của phân

tử ADN có thể tách nhau ra (còn gọi là biến tính ADN) do các liên kết hydro bị cắt đứt Khi đó, các nucleotide trên mỗi chuỗi có thể tạo thành liên kết với các nucleotide tự do trong môi trường nội bào Kết quả của quá trình này là tạo thành 2 phân tử ADN giống hệt nhau từ 1 phân tử ADN ban đầu Đây cũng chính là nguồn gốc của đặc tính di truyền của sinh vật Các nhà khoa học có thể thực hiện quá trình tự nhân đôi này trong ống nghiệm gọi là kỹ thuật PCR Nếu

sự bắt cặp giữa nucleotide chuỗi gốc với nucleotide không tuân theo nguyên tắc

bổ sung thì sẽ tạo thành đột biến là nguồn gốc của hiện tượng biến dị

1.1.2 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen

Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn

Trang 17

bội) Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46 Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho người [26, 28]

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận biết qua vân tay, tiếng nói, nhận biết các yếu tố di truyền như: xác định các nhóm kháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố protein trong huyết thanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt còn thấp Phải đến những năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trong xác định tội phạm Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người đã phát hiện

ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ

10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (minisattelite) Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm mẫu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable region) ở các vật liệu di truyền khác nhau [26] Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch

sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này

ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan

trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định gen cho mục đích tư pháp ra đời từ đây Giám định gen ra đời không chỉ khắc

phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học mà còn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN là bằng chứng duy nhất Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người, xác định quan hệ huyết thống cha con, xác định hài cốt Ban đầu, giám định gen

Trang 18

được gọi là giám định vân tay di truyền (DNA-"fingerprinting"), về sau để tránh

sự hiểu lầm giữa giám định đường vân và giám định gen, Uỷ ban nghiên cứu quốc gia Mỹ (NRC) đề nghị đổi là truy nguyên ADN (DNA-profiling) [16, 28]

Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) chính thức được bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP

và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiện trọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu gen người nói riêng Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng

35 000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [26]

Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồm những trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (các intron) [14, 15] Leder, năm 1977 đã phát hiện ra hiện tượng này Tuỳ mức độ hiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại:

- Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc trưng cho từng gen

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25- 40% bộ gen người, chúng có kích thước từ 100-1000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc cũng

có thể là những trình tự mã hoá (các gen mã hoá cho ARN riboxom, ARN vận chuyển )

- Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen Đó là những trình

tự ADN ngắn (10-200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể)

Các gen được sử dụng trong giám định hình sự là các gen nằm ở vùng không mã hoá (intron) của ADN Ở giai đoạn phát triển đầu tiên của giám định gen, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các gen có đoạn lặp trung bình

Trang 19

(Variable Number of TADNem Repeat-VNTR hay Minisatellite) Nhưng những

kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định nên dễ xảy ra sai sót Từ năm 1990 tới nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short TADNem Repeat-STR hay Microsatellite) vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác

kỹ thuật của người giám định Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể Đó là nền tảng khoa học cho giám định gen Các gen này thường có tính đa hình cao,

ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứng nhân gen của nhiều gen khác nhau [24]

Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình tự các nucleotid và đa hình về chiều dài

- Đa hình về trình tự: các gốc nucleotid ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào Ví dụ: tại locus A,

Cá thể thứ nhất: GATA GATA GATA  7 đoạn lặp GATA

Cá thể thứ hai: GATA GATA GATA GATA 12 đoạn lặp GATA Xuất phát từ thực tế của giám định ADN và cùng với sự tiến bộ của kỹ thuật, ngày nay các nhà khoa học hình sự đang áp dụng kỹ thuật phân tích các

Trang 20

gen có trình tự siêu ngắn Mini STR (Mini Short TADNem Repeat) Về thực chất của Mini STR vẫn là những đoạn STR nhưng khi phân tích, mồi (primer) được thiết kế với mục đích sao chép đoạn STR ngắn hơn những đoạn STR thông thường nhằm thu được sản phẩm từ những đoạn STR của mẫu ít nhiều đã bị biến tính hoặc phân huỷ phần nào, tức những mẫu có hàm lượng ADN ít Đây là sự cải tiến của các nhà khoa học, bởi lẽ dấu vết hình sự nói chung, đặc biệt là dấu vết sinh học nói riêng không phải lúc nào cũng tồn tại ở dạng nguyên vẹn cho nên cần phải có những biện pháp kỹ thuật hợp lý để hạn chế sự biến tính của dấu vết đồng thời khai thác triệt để khả năng của dấu vết [21, 26]

Để phân tích Mini STR các hãng sản xuất trên thế giới cũng chế tạo ra những bộ kit tương tự như những bộ kit phân tích thông thường khác, chẳng hạn như bộ kit Minifiler

Các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kít phân tích tổ hợp các gen có trình tự lặp lại ngắn: kít 2 gen (như TPOX/CSF1PO), kít 3 gen (như THO1/F13A1/FES), kít 9 gen (D3S1358/FGA/vWA/ ) [21, 29]

Ngày nay các nhà Sinh học phân tử và Khoa học hình sự trên thế giới đã cho ra đời và ứng dụng những bộ kít phân tích tới 16, 24 hoặc 27 gen Việc phân tích ít hay nhiều gen phụ thuộc vào đặc điểm quần thể, dân số của mỗi quốc gia Nếu chỉ phân tích từ 2 đến 3 gen thì độ tin cậy khoảng 85 % - 90% Số lượng gen được phân tích càng nhiều thì độ tin cậy càng cao Theo tập đoàn Perkin-Elmer (Mỹ) khi phân tích tổ hợp 9 gen hệ Profiler Plus thì khả năng trùng hợp

về một kiểu gen là vô cùng nhỏ, vì tần suất xuất hiện của một kiểu gen là khoảng 1/72 tỉ [40] Hiện nay, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an Việt Nam

sử sụng hẹ Identifiler để xây dựng cơ sở dữ liệu tần xuất các gen (database) của người Việt (Kinh); truy nguyên cá thể và xác định huyết thống cha con Qua giám định cho thấy khả năng trùng hợp của một kiểu gen trong quần thể người Việt cũng vô cùng nhỏ Ví dụ: Trong vụ án hiếp, giết và cướp tài sản xảy ra ngày 12/01/2005 tại xã Long Thành Bắc, huyện Hoà Thành, tỉnh Tây Ninh,

Trang 21

giám định gen theo hệ Profiler Plus cho thấy kiểu gen của tinh trùng có trên quần lót nạn nhân trùng hoàn toàn với kiểu gen của đối tượng và tần xuất của kiểu gen này trong quần thể người Việt là 1/60 tỉ (trong khi đó dân số Việt nam hiện nay chỉ khoảng 82 triệu); do vậy đã truy nguyên được đối tượng gây án Trong một vụ án giết người xảy ra ngày 09/12/2004 tại xã Hàm Thạnh, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận, phân tích gen đã khẳng định được máu trên con dao chính là máu của nạn nhân vì kiểu gen phân tích từ dấu vết máu trên dao trùng với kiểu gen của nạn nhân với tần xuất trong quần thể người Việt là 1/638404 tỉ

Theo các nhà khoa học hình sự khi phân tích bằng bộ kit Identifiler thì độ

tin cậy trung bình đạt là khoảng: 1/ 4,62 x 10 19, có nghĩa là trong số 4,62 x 1019

người thì mới có một người ngẫu nhiên nào đó trùng với kiểu gen trên [17, 28]

Bộ kit Sefiler có 12 locus, độ tin cậy trung bình là khoảng: 1/ 6,47 x 1015

gồm các locus:

D2S1338 D3S1358 D8S1179 TH01 D16S539 SE33

D18S51 D19S433 D21S11 FGA VWA Amelogenin

Bộ kit ProfilerPlus có 10 locus, độ tin cậy trung bình là khoảng1/ 1,48 x

1011 gồm các locus:

D3S1385 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317

D18S51 FGA D21S11 VWA Amelogenin

Bộ kit Cofiler có 7 locus, độ tin cậy trung bình là khoảng: 1/ 3,15 x 107

Trang 22

truy tìm tội phạm, xét xử đúng người, đúng tội và minh oan cho người vô tội Giá trị chứng cứ của ADN ngày càng được coi trọng trong hệ thống pháp luật, đặc biệt ở các nước phát triển Ở Mỹ hiện có hơn 100 phòng giám định gen hình

sự của nhà nước và hàng chục phòng thí nghiệm của tư nhân Hàng năm họ đã giám định hàng trăm ngàn mẫu ADN Ở hầu hết các nước châu Âu và châu Á đều có giám định ADN ở các mức độ phát triển khác nhau Riêng ở Trung Quốc ngành công an đã triển khai giám định ADN xuống tận cấp quận, huyện Trên thế giới số lượng phòng giám định ADN ngày càng tăng [7, 14, 15] Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng thí nghiệm giám định ADN đã được triển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám định viên đư-

ợc đào tạo chuyên sâu Trong qua trình phát triển trình độ năng lực cán bộ ngày càng được nâng cao, trang thiết bị được bổ sung và nâng cấp, đã đáp ứng và phục vụ hữu hiệu cho công tác đấu tranh phòng chống tội phạm của lực lượng Công an và công tác xét xử của ngành Tư pháp

1.1.3 Khái niệm về locus và alen

Locus là một đoạn ADN trên nhiễm sắc thể, dành cho một gen nhất định Trong giám định ADN thì locus còn có thể là những đoạn ADN không mã hóa [26]

Alen là các trạng thái khác nhau của cùng một locus Mỗi cá thể đều có hai alen cho mỗi một locus, trong đó một alen di truyền từ bố, một alen di truyền

từ mẹ Nếu hai alen của một locus hoàn toàn giống nhau thì được gọi là đồng hợp tử, còn khác nhau được gọi là dị hợp tử [16, 26]

1.1.4 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN

Giám định ADN hiện nay sử dụng các locus STR là chủ yếu Phương pháp giám định gen có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính

đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [16, 32] Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được ba hoặc nhiều STR

Trang 23

hơn trong cùng một thời điểm Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đã bị phân hủy phần nào [14, 15]

Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thể phải đảm bảo các thông số sau:

- Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp)

- Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đã đạt được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất

- Các locus STR có độ dài ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp so với các đoạn

đa hình ngẫu nhiên khác Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh Do vậy, khi tiến hành PCR thực hiện sẽ thu được hiệu quả tốt hơn các đoạn ADN dài

- Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quan trọng Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài của các alen thông thường khác nhau số đoạn lặp Do vậy, việc sử dụng các STR có chiều dài dưới

400 base để dễ dàng phân tích là một yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4 nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích

cá thể người Các đoạn này có đặc tính như sau:

- Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%)

- Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR

- Sản phẩm PCR ổn định, ít xảy ra trường hợp khi PCR đoạn lặp bị thiếu

1.1.5 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng không ai giống ai, trừ những trường hợp sinh ra cùng một trứng [7] Nếu xét rộng trong cả một quần

Trang 24

thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn có thể giống nhau (trùng lặp) Mặt khác mỗi một quần thể người (tộc người) khác nhau cũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗi quần thể [30, 40] Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoa học hình sự ngoài lựa chọn, nghiên cứu những locus (vị trí trên nhiễm sắc thể)

có tính đa alen (đa hình) cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trong quần thể của từng locus để sử dụng Quần thể được nghiên cứu khảo sát phải đạt được các yêu cầu trong thống kê, di truyền như: các mẫu dùng trong nghiên cứu phải đảm bảo tính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống trong 3 đời [19, 36]

Để có được tần suất của mỗi alen, trước hết phải tìm được số lần xuất hiện của mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết của alen đó theo luật di truyền quần thể [40] Khi có được tần suất thực tế và tần suất lý thuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen có được chấp nhận với mức xác suất đã chọn

Giám định gen (ADN) đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toán xác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyền đặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điều tra, phá án) Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suất xuất hiện của một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [12, 29, 32]

Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người có phải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng cho nhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệ huyết thống (Paternity Index - PI) Từ đó tính độ tin cậy đạt được Mặt khác, đó cũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tích được nhiều locus gen hoặc ít locus gen hơn [31]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN

Trang 25

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụng các

kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hay Microsatellite) cho mục đích giám định ADN hình sự [21, 29]

Ứng dụng các thành tựu của Công nghệ sinh học nói chung và kết quả của Dự

án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) nói riêng, Các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kit phân tích tổ hợp các locus có trình tự lặp lại ngắn: kit 2 locus (TPOX/CSF1PO), kit 3 locus (THO1/F13A1/FES), kit 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer, Mỹ), kit 15 locus (hệ Identifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãng Promega) [11]

Tổ chức Cảnh sát hình sự quốc tế (Interpol) có hiệp hội giám định ADN và rất nhiều quốc gia đã có phòng thí nghiệm giám định ADN hình sự

Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16

Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc

Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và

357 người Mỹ gốc Phi [17, 20]

Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khác nhau lại có những khảo sát khác nhau về tần suất các alen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đó: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139

Trang 26

người tại Rumani [38, 39]

Tại Singapore, Cảnh sát Singapore sử dụng tần suất các alen theo hệ Identifiler của dân tộc người Hoa, dân tộc người Mã Lai, dân tộc người Ấn Độ

để phục vụ công tác giám định [7]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, giám định gen được triển khai từ tháng 4 năm 1999, tại Viện

Khoa học hình sự - Bộ Công an Toàn bộ quy trình giám định gen được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc cùng đội ngũ giám định viên được đào tạo cơ bản tại Úc

Năm 2000, đề tài cấp Bộ "Nghiên cứu, khảo sát và xây dựng tần suất các

alen của các gen trong hệ NinePlex II (9 locus gen) trên đối tượng người Kinh"

được triển khai và năm 2002 được nghiệm thu, kết quả là bảng tần suất các alen của người Kinh được sử dụng hiệu quả trong các bản kết luận giám định truy nguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống giúp các cơ quan tố tụng giải quyết có hiệu quả rất nhiều vụ việc [7]

Năm 2004, Việt Nam đã thông báo bảng tần suất các alen của các locus gen

hệ Nineplex II trên đối tượng người Kinh cho Interpol, đây là một cột mốc đánh dấu sự phối hợp toàn cầu trong đấu tranh phòng chống tội phạm dựa vào lĩnh vực giám định ADN

Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Viện Kỹ thuật hóa sinh và tài liệu

nghiệp vụ đã tiến hành “Khảo sát tần suất của 3 locus D5S818, D7S820 và

D13S317 trên đối tượng người Mường” bằng các bộ kit phân tích ADN theo công

nghệ điện di nhuộm bạc

Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai hệ Identifiler (15 locus gen: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA) trong giám định ADN Với bộ kit mới này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so

Trang 27

với bộ kit 9 locus gen Nineplex II Cũng như các phòng thí nghiệm giám định ADN khác trên thế giới, để có cơ sở pháp lý cho việc ứng dụng hệ Identifiler tại Việt Nam thì phải khảo sát để có tần suất các alen của các dân tộc khác nhau

Bảng 1.1 Các locus gen hệ Identifiler [17]

Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen

vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25

Trang 28

Năm 2008, Viện Khoa học hình sự đã triển khai đề tài cấp Bộ "Khảo sát tần

suất các alen theo hệ Identifiler (ID) trên đối tượng người Kinh" Đề tài tiến hành

khảo sát số mẫu là 170 cá thể người Kinh và kết quả đã được triển khai ứng dụng trong công tác giám định ADN Đây là cơ sở khoa học và cơ sở pháp lý vững chắc

để đưa ra các bản kết luận giám định về truy nguyên cá thể và xác định huyết thống phục vụ tố tụng hình sự và dân sự đối với những vụ án, vụ việc có liên quan đến người dân tộc Kinh [11]

Như vâ ̣y chính các đă ̣c trưng trong cấu tạo của phân tử DNA (trong cấu trúc phân tử, tính đa hình về trâ ̣t tự sắp xếp và tính đa hình về chiều dài) cùng với sự phân ly độc lâ ̣p trong quá trình hình thành giao tử và tổ hợp tự do trong quá trình thụ tinh hình thành hợp tử của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở người là cơ sở khoa học cho giám đi ̣nh DNA Có nhiều phương pháp giám đi ̣nh DNA khác nhau tù y theo viê ̣c sử du ̣ng đối tượng trong quá trình phân tích là gì Thực tế hiện nay phương pháp giám đi ̣nh DNA dựa trên việc phân tích trình tự các locus gen STR hệ Identifiler đươ ̣c sử dụng hiê ̣u quả và phổ biến nhất

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu tần suất các alen hê ̣ Identifiler củ a quần thể người thuô ̣c mô ̣t số dân tô ̣c ta ̣i Viê ̣t Nam song chưa có công trình nào nghiên cứu tần suất các alen hê ̣ Identifiler của quần thể người dân tộc Tày, nên việc lựa chọn đề tài nghiên cứu tần suất các alen hê ̣ Identifiler của quần thể ngườ i dân tô ̣c Tày là rất cần thiết và có ý nghĩa cao cả về khoa ho ̣c và thực tiễn

Trang 29

CHƯƠNG II

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Thu 120 mẫu máu của 120 cá thể người Khmer

- Phân tích mẫu bao gồm các bước tách chiết ADN, định lượng ADN, nhân bội ADN, điện di trên máy điện di mao dẫn, kết quả lập được bảng kiểu gen của các mẫu nghiên cứu

- Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen giữa kết quả thực tế

và tính toán lý thuyết với độ tin cậy p = 0,05 Tính toán và đưa ra bảng tần suất các alen của các locus gen hệ Identifiler cho 120 cá thể người Khmer

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau

- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia

- Phương pháp điều tra khảo sát thực tế, thu đại diện ngẫu nhiên mẫu, đảm bảo các điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: phân tích kiểu gen 120 cá thể theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự

- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong hệ Identifiler của dân tộc Khmer

Luận văn sử dụng các kỹ thuật sau

- Thu mẫu máu: dùng kim chích đầu ngón tay và thấm lên giấy FTA

- Kỹ thuật tách chiết ADN dùng chelex 100

- Kỹ thuật PCR và định lượng ADN bằng hệ thống Realtime PCR

- Kỹ thuật điện di mao quản

2.2.1 Thu mẫu

Trang 30

Thu mẫu máu của 120 cá thể người Khmer theo nguyên tắc ngẫu nhiên, không có quan hệ họ hàng huyết thống:

- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau

- Quan sát hình thái học (người dân tộc Khmer có các đặc điểm nhân chủng học đặc trưng)

- Kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh )

- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu

- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA

- Mẫu thu phải đảm bảo chất lượng, không bị lẫn, nhiễm, phơi khô tự nhiên,

đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu từ KM1 đến KM122 (hai mẫu bị hỏng)

2.2.2 Phân tích mẫu

2.2.2.1 Quy trình phân tích ADN

Chúng tôi tiến hành phân tích theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự đã được chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b của Luật Giám định tư pháp 2012, gồm các bước sau:

Tách chiết ADN (phương pháp vô cơ)

Định lượng ADN (phương pháp Real-time PCR)

Nhân bội ADN (PCR) (bộ Kit Identifiler)

Điện di mao quản (Máy AB3130)

Phân tích kết quả (Phần mềm GenmapperID v3.2)

Trang 31

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN

1 Dung dịch Chelex 100, tỷ lệ 5%

2 Block nhiệt khô cho ống 1,5ml (1000C) kèm nhiệt kế

3 Máy li tâm ống 1,5ml 14.000v/p

4 Tủ an toàn sinh học

5 Ống tách chiết 1,5ml

6 Các đầu típ 10µl, 200µl và 1000µl cùng pipet tương ứng

b Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN

1 Quantifiler Human DNA quantification Kit (hãng Applied Biosystems)

2 Optical plate 96 well

3 Optical seal

4 Máy Realtime PCR 7500 (hãng Applied Biosystems)

5 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di

1 Máy giải trình tự Applied Biosystems 3130

2 Máy PCR 9700 96 well Applied biosystems

3 Kit Identifiler của hãng Applied biosystems

Trang 32

10 Septa

11 Ống PCR (0,25 ml) và điện di (0,5 ml)

12 Các loại đầu típ 10 µl, 200 µl và 1000 µl cùng pipet tương ứng

2.2.3 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen

2.2.3.1 Cơ sơ ̉ lý thuyết

Để số liê ̣u nghiên cứu về các locus gen sử du ̣ng được cho những ứng du ̣ng

cụ thể, điều cần thiết đầu tiên là cần đánh giá xem mẫu nghiên cứu với locus gen đươ ̣c phân tích có đảm bảo rằng cấu trúc di truyền của mẫu (tần số tương đối của các alen và tần số các kiểu gen) là ổn đi ̣nh hay không qua các thế hê ̣, nghĩa

là mẫu có tuân theo định luâ ̣t Hardy - Weinberg hay không [9, 13, 40]?

Do đó cần kiểm tra sự phù hơ ̣p giữa mẫu với quần thể cân bằng lý thuyết thông qua đánh giá chênh lệch giữa tần số quan sát thực tế với phân bố lý thuyết của các kiểu gen của mỗi locus gen được nghiên cứu có sai khác nhau hay

không? [3, 40]

2.2.3.2 Phương pha ́ p xử lý thống kê

Kiểm định sự phù hợp phân bố tần số kiểu gen giữa mẫu khảo sát và quần thể lý thuyết dựa vào tiêu chuẩn Khi bình phương 2 [2, 40]

Đánh giá sự phù hợp giữa số liệu thực nghiệm và giả thuyết lý thuyết theo phương pháp kiểm định 2 ta dùng chỉ số sau :

(2.1) Trong đó : * k là số lớp của dãy số liệu thực nghiệm

* nij là số kiểu gen AiAj quan sát được trong một locus gen

* Eij là số kiểu gen AiAj tính toán theo lý thuyết Eij = npi2

nếu i=j, Eij = 2npipj nếu i ≠ j (2.2)

Tra giá trị 2 lý thuyết trên bảng theo hệ số tự do:

k(k-1)/2 (2.3)

Trang 33

Quy tắc kiểm định 2 là trong một locus gen số lượng kiểu gen quan sát dưới 5, thì phải kết hợp các alen bên cạnh để tăng số lượng quan sát cao hơn 5

để tính toán

2.2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định

- 120 kiÓu gen cña 120 c¸ thÓ ng-êi Khmer ®-îc thèng kª tÇn sè kiÓu gen, tÇn sè alen

- Tính tần suất các alen của mỗi locus theo số liê ̣u thu đươ ̣c trong nghiên

- Tính chỉ số kiểm định 2 theo công thức

- Xác định khi bình phương tiêu chuẩn (α) theo mứ c xác suất p=0.05 (tra bảng)

- So sánh giá tri ̣ khi bình phương tính được với khi bình phương tiêu chuẩn: Nếu khi bình phương tính đươ ̣c nhỏ hơn 2 tiêu chuẩn thì phân bố thực tế phù hợp với phân phối lý thuyết, nghĩa là mẫu phù hợp với quần thể lý thuyết [2,

3, 4, 13, 10]

Trong chương này chúng tôi đã trình bày các bước thu thập và bảo quản mẫu đúng với qui trình tiên tiến tại các phòng thí nghiệm giám định ADN của các nước trên thế giới Cùng với đó là qui trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự đã được chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b Luật Giám định tư pháp 2012

Sử dụng phương pháp thống kê phổ biến trong nghiên cứu Sinh học, do quần thể nghiên cứu lớn nên chọn phương pháp kiểm định 2 là phù hợp

Trang 34

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN

- Thu ngẫu nhiên được 120 mẫu máu của 120 người Khmer trên thẻ thu

mẫu FTA và bảo quản theo quy định tại phòng thí nghiệm ADN của Viện Khoa học hình sự (có danh sách ở phần phụ lục)

- Chúng tôi cũng đã tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu máu trên theo

phương pháp vô cơ, định lượng ADN theo phương pháp Realtime PCR Do điều kiện thu mẫu tương đối tương đồng về các mặt khách quan như cán bộ thu mẫu, vật liệu thu mẫu và thời gian thu - bảo quản mẫu và sử dụng máy đục lỗ (Punching) để lấy mẫu với kích thước giống nhau nên chúng tôi chỉ tiến hành định lượng trên 10 mẫu ngẫu nhiên từ 120 mẫu máu thu trên thẻ FTA và cho kết quả như sau:

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR

Trang 35

Chúng tôi đã thực hiện 120 phản ứng PCR với bộ kit Identifiler (thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt theo nhà sản xuất từ 120 mẫu, điện di trên máy giải trình tự ADN ABI 3130 và phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenemaperID v3.2

Kết quả chúng tôi đã thu được 120 bảng kiểu gen khác nhau của 120 mẫu

Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu KM100

Trang 36

3.3 Kết quả xử lý số liệu thống kê

3.3.1 Kết quả tính toán tần suất các alen

Từ 120 kiểu gen hệ Identifiler, chúng tôi đã đếm được tổng số 3600 alen, gồm 52 loại alen (từ 6 đến 35.2) với tần suất và số loại alen ở từng locus gen là khác nhau

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	1,79 MB