Mối quan hệ di truyền của một số quần thể chim yến sào giống aerodramus ở việt nam

Lời cam đoan Đề tài nghiên cứu của tôi về “Mối quan hệ di truyền của một số quần thể chim yến sào giống Aerodramus ở Việt Nam” do chính tôi thực hiện, chưa từng được công bố trong bất k

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN GIANG SƠN

MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ QUẦN THỂ CHIM

YẾN SÀO (GIỐNG AERODRAMUS) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGUYỄN GIANG SƠN

MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ QUẦN THỂ

CHIM YẾN SÀO (GIỐNG AERODRAMUS) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 60 42 10

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG TẤT THẾ

Hà Nội - 2010

Lời cam đoan

Đề tài nghiên cứu của tôi về “Mối quan hệ di truyền của một số quần

thể chim yến sào (giống Aerodramus) ở Việt Nam” do chính tôi thực hiện,

chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 19 tháng 12 năm 2010

Người thực hiện

Nguyễn Giang Sơn

Lời cảm ơn

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại Phòng Hệ thống học phân

tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi

Khi thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp Sự ủng hộ về mặt tinh thần và những chỉ dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô cùng quý báu này khiến tôi thực sự cảm kích, biết ơn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới NCVC TS Đặng Tất

Thế, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn Tôi vô cùng biết ơn ThS Phạm Đỗ Loan, người đã luôn quan tâm giúp

đỡ tôi cả trong công tác và học tập

Cuối cùng, tôi cảm ơn gia đình, những người thân đã luôn bên tôi, là hậu phương, là động lực để tôi vượt qua khó khăn

Hà Nội, ngày 19 tháng 12 năm 2010

Học viên

Nguyễn Giang Sơn

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các nghiên cứu về chim yến 3

1.1.1 Khái quát về phân loại học 3

1.1.2 Các vấn đề trong phân loại chim yến sào 4

a Tình hình nghiên cứu ngoài nước 4

b Tình hình nghiên cứu trong nước 11

1.2 Cách tiếp cận và thiết kế nghiên cứu 14

1.2.1 Ứng dụng kỹ thuật phân tử DNA trong nghiên cứu hệ thống học 14

1.2.2 Sử dụng hệ gen ty thể trong nghiên cứu hệ thống học 16

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu 19

2.2.2 Các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu 20

2.2.3 Một số hóa chất, vật tư sử dụng trong nghiên cứu 21

2.2.4 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 23

2.2.3 Phân tích kết quả 27

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Nhân bản vùng gen đích bằng PCR 29

3.2 Giải trình tự đoạn gen đích từ các mẫu nghiên cứu 30

3.3 Mô hình phân tích 48

3.4 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể 49

3.4.1 Đánh giá sự đa dạng di truyền 49

a Sự đa dạng di truyền giữa các quần thể chim yến đảo 52

b Sự đa dạng di truyền giữa các quần thể chim yến nhà 53

3.4.2 Sự phân hóa của các quần thể 53

3.4.3 Tổng hợp về quan hệ phát sinh chủng loại 57

3.4.4 Vị trí phân loại của các nhóm chim yến đảo và chim yến nhà 62

3.4.5 Mối quan hệ di truyền giữa các phân loài chim yến tổ trắng 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

BI: Bayesian Inference

bp: base pair

ctgk: các tác giả khác

DNA: Deoxyribo Nucleotide Acid

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

ME: Minimum Evolution

PCR : Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

Danh mục các bảng

Bảng 2.1 Danh sách mẫu vật nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Các trình tự gen tham khảo 20

Bảng 2.3 Thành phần PCR 25

Bảng 2.4 Chu trình PCR 25

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng giải trình tự 26

Bảng 2.6 Chu trình phản ứng giải trình tự 26

Bảng 3.1 So sánh trình tự nucleotide 30

Bảng 3.2 Thành phần nucleotide các mẫu chim yến đảo 42

Bảng 3.3 Thành phần nucleotide các mẫu chim yến nhà 43

Bảng 3.4 So sánh trình tự amino axit 44

Bảng 3.5 Những khác biệt trình tự nucleotide giữa chim yến đảo và chim yến nhà 60

Danh mục các hình

Hình 1.1 Bản đồ phân bố của các loài trong giống Aerodramus 4

Hình 1.2 Cấu trúc gen ty thể của động vật có xương sống 17

Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu 19

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 23

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR 29

Hình 3.2 Ma trận khoảng cách di truyền giữa các trình tự nghiên cứu 51

Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại ME 54

Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại MP 55

Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại ML 58

Hình 3.6 Ma trận khoảng cách di truyền giữa các trình tự của các phân loài chim yến tổ trắng 65

Hình 3.7 Cây phát sinh các phân loài chim yến tổ trắng A fuciphagus 67

MỞ ĐẦU

Hiện nay, chim yến là đối tượng được quan tâm đặc biệt bởi nguồn lợi yến sào Các đảo, hang yến, nhà yến là địa điểm hấp dẫn du lịch Bên cạnh đó, chim yến còn là thiên địch của nhiều loài côn trùng gây hại như rầy nâu, mối… Nuôi yến vừa trực tiếp mang lại giá trị kinh tế vừa giúp bảo vệ mùa màng, giữ cân bằng sinh thái

Chim yến cho tổ có giá trị bao gồm một số loài và phân loài, phân bố trên nhiều vùng lãnh thổ khá rộng trên thế giới, trong đó Đông Nam Á là một trong những khu vực cư trú của các quần thể chim yến sào với số lượng lớn Chim yến sào cư trú ở Việt Nam đã có lịch sử lâu đời, chúng làm tổ tập đoàn trong các hang động tự nhiên trên các đảo ven biển Tổ của chim yến được định giá rất cao trên thị trường Nhu cầu tiêu thụ lớn đã đặt áp lực lên các quần thể tự nhiên Một số quần thể bị khai thác quá mức đã dẫn đến suy giảm

số lượng

Thời gian gần đây, xuất hiện nhiều đàn chim yến sào vào làm tổ trong các công trình xây dựng, trong đất liền Đây là cơ hội phát triển kinh tế tại các địa phương Tuy nhiên, vấn đề bảo tồn lưu giữ nguồn gen quý của loài cũng trở nên cấp thiết bởi thông tin phân loại và nguồn gốc của các quần thể hiện còn chưa rõ ràng

Trong khi các phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái thường khó khăn khi phân biệt những loài đồng hình và tiếp cận các thông tin phân loại dưới loài thì phân tích di truyền lại rất hiệu quả trong việc tìm hiểu các đặc điểm phân biệt giữa các quần thể

Để giải quyết những vấn đề vừa nêu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Mối

quan hệ di truyền của một số quần thể chim yến sào (giống Aerodramus) ở Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài:

Xác định vị trí phân loại của chim yến sào ở Việt Nam

Đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể chim yến sào

Suy luận nguồn gốc của các quần thể chim yến sào làm tổ trong nhà

Nội dung nghiên cứu của đề tài: Giải trình tự DNA các mẫu vật đại diện cho các quần thể chim yến sào cư trú ngoài đảo và trong nhà tại Việt Nam Dựa trên trình tự DNA, phân tích mối quan hệ di truyền giữa các quần thể chim yến sào trong nước và quan hệ với các quần thể chim yến sào ở các khu vực lân cận

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các nghiên cứu về chim yến

1.1.1 Khái quát về phân loại học

Bộ Yến (Apodiformes) gồm có khoảng 454 loài có kích thước trung bình

và nhỏ, thuộc 3 họ: Họ Yến (Apodidae), Họ Yến mào (Hemiprocnidae), Họ Chim ruồi (Trochilidae) (Clements, 2009) [12] Hệ thống phân loại Sibley-Ahlquist (Sibley và Monroe, 1996) [46] nâng bộ này lên thành liên bộ (Apodimorphae) và tách các loài chim ruồi thành một bộ riêng (bộ Trochiliformes) Trong khi đó, các tài liệu phân loại khác như các tác giả Gill

và Wright (2006) [16] lại xếp cả nhóm Cú muỗi (họ Aegothelidae) vào bộ Apodiformes Đặc điểm chung của nhóm phân loại này là chân nhỏ, không có vẩy sừng, cánh dài hình lưỡi liềm với các xương cánh to và ngắn – đây là đặc trưng tiến hóa phù hợp với hoạt động bắt mồi trên không

Họ Apodidae gồm có 19 giống, khoảng 102 loài (được chia thành 4 tông) phân bố rộng khắp thế giới trong khu vực nhiệt đới và ôn đới Những loài ở vùng ôn đới có tập tính di cư về vùng nhiệt đới trong mùa đông để tránh rét Nhiều loài trong họ Apodidae có hình dáng đặc trưng, đuôi ngắn và chẻ, cánh dài cụp về phía sau

Các loài trong giống Aerodramus (tông Collocalini) phát triển khả năng

định vị bằng tiếng vang, làm tổ trong các hang động tối Tổ xây bằng dịch tiết

từ tuyến nước bọt, có thể sử dụng làm thực phẩm bổ dưỡng, đây chính là cơ

sở nguồn lợi yến sào. Giống Aerodramus có vùng phân bố hạn chế ở khu vực

nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Nam Á, các đảo ở Nam Thái Bình Dương, Đông Bắc Australia, trong đó khu vực Đông Nam Á có sự đa dạng cao nhất Nhiều loài trong số này có vùng phân bố hẹp, chỉ giới hạn ở một số đảo nhỏ Đây

chính là nguyên nhân dẫn đến tình trạng nguy cấp của một số loài như yến

Seychelles (A elaphrus), yến đầu trắng (A whiteheadi) và yến Guam (A

bartschi ) Bản đồ phân bố của các loài trong giống Aerodramus thể hiện trong

hình 1.1

Hình 1.1 Bản đồ phân bố của các loài trong giống Aerodramus

(Chantler et Driessens, 2000) [10]

1.1.2 Các vấn đề trong phân loại chim yến sào

a Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trước kia các loài chim yến sào được xếp trong giống Collocalia, nhưng

Aerodramus

Oberholser (1906) (Chantler et Driessens, 2000) [10] Giống Aerodramus gồm khoảng 25 loài, tách biệt khỏi giống Collocalia bởi khả năng sử dụng

tiếng vang để định vị đường bay trong bóng tối Đây là nhóm có sự đồng hình, và khó khăn trong công tác phân loại Phân tích tiếng vang, giải trình tự DNA và kí sinh trùng đã được sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ giữa các loài này

Tuy nhiên, vấn đề quan hệ giữa các loài chim yến vẫn chưa có câu trả lời

hoàn hảo, chẳng hạn như vị trí của loài yến Papua (Aerodramus papuensis) sử

dụng định vị bằng tiếng vang vào thời gian ban đêm ở ngoài hang, nơi chúng đậu ngủ Yến Papua chỉ có 3 ngón chân và sử dụng tiếng vọng đơn trong khi các loài khác thuộc giống này có 4 ngón chân và sử dụng tiếng vọng kép

Phân tích trình tự DNA cho thấy loài A papuensis có quan hệ tiến hóa gần với loài yến thác nước (yến lớn) (Hydrochous gigas) hơn so với các loài khác trong giống Aerodramus (Price et al., 2005) [40] Điều này có thể lý giải rằng

có sự tiến hóa song song và nhóm phân loại hiện nay chỉ là cận nhóm với một

số loài có thể đã tuyệt chủng trước khi được con người biết đến, loài A

papuensis có lẽ thuộc về một giống riêng đã tuyệt chủng

Vấn đề phân loại khó khăn của các loài chim yến còn thể hiện qua nhiều điểm không thống nhất ở các bậc phân loại thấp, danh pháp khoa học và vị trí

phân loại của các phân loài có nhiều thay đổi Chim yến tổ trắng (A

fuciphagus ) là loài cho tổ có giá trị nhất ban đầu gồm có 8 phân loài: A f

fuciphagus (Thunberg, 1812), A f vestitus (Lesson, 1843), A f inexpectatus (Hume, 1873), A f germani (Oustalet, 1876), A f amechanus (Oberholser, 1912), A f micans (Stresemann, 1914), A f perplexus (Riley, 1927), A f

dammermani (Rensch, 1931), nhưng nhiều tài liệu phân loại hiện nay đã tách

2 phân loài A f germani và A f amechanus vào loài mới có tên khoa học A

germani (Sibley et Monroe, 1996; Dickinson, 2003; Clements, 2009) [46, 14,

12] Một số tài liệu còn nâng các phân loài A f inexpectatus và A f vestitus

thành loài riêng biệt

Đặc điểm phân loại học quan trọng của giống Aerodramus đã được Fullard et al (1993) [15] phân tích khá chi tiết khi nghiên cứu về tiếng vang

của loài chim yến Atiu (A sawtelli) ở quần đảo Cook Chim yến sử dụng phổ

tiếng vang khá rộng trong vùng ngưỡng nghe của con người, tần số âm thanh

đo được của các loài chim yến nằm trong khoảng 1-16 kHz Với loài A

sawtelli dải tần số âm thanh đo được là 3-10 kHz, với đỉnh tần ở khoảng 6-7 kHz, xung âm thanh ngắn (1-3 msec) Chim không điều chỉnh đỉnh tần âm phát ra nhưng khoảng thời gian giữa những lần phát âm thu hẹp khi chúng bay qua cửa hang

Bởi các dữ liệu hình thái không đủ để phân biệt các loài chim yến, Lee et

al (1996) [26] đã kết hợp phân tích khả năng sử dụng tiếng vang với đặc trưng tổ và kiểm tra độ tin cậy của kết quả phân tích dựa trên các đặc điểm tập tính này bằng phân tích chủng loại phát sinh dựa trên trình tự gen cytochrome

b Nghiên cứu cho thấy khả năng sử dụng rộng rãi đặc điểm tập tính cho phân loại, và cũng cho thấy nhóm phân loại này không phải là đơn phát sinh Giống

Aerodramus với đặc trưng sử dụng tiếng vang được nhóm cùng với giống

không sử dụng tiếng vang Hydrochous trong khi giống không sử dụng tiếng vang khác là Collocalia lại không phải là đơn vị phân loại chị em với các loài

yến trên Trong khi khả năng sử dụng tiếng vang là đặc điểm tương đồng của

giống Aerodramus (có lẽ đặc điểm này đã bị mất đi ở giống Hydrochous), thì không có đặc điểm làm tổ nào của giống Aerodramus phù hợp có ý nghĩa

thống kê với phát sinh chủng loại phân tử, điều này chỉ ra rằng các đặc điểm

làm tổ không phải là dấu hiệu phát sinh chủng loại đáng tin cậy trong nhóm này

Sankaran (1995, 1998, 2001) [42, 43, 44] nghiên cứu về các quần thể

chim yến C fuciphaga ở quần đảo Andaman và Nicobar đã đưa ra thông tin

về sự suy giảm số lượng của một số quần thể

Viruhpintu et al (2002) [56, 57] chỉ ra những đặc điểm phân loại của loài

A fuciphagus về việc lựa chọn nơi làm tổ theo các đặc trưng nhất định Hầu hết chim tập trung làm tổ thành các mảng có diện tích từ 1-80 m2 tại những nơi có bề mặt nhẵn, trên các tường hang nghiêng vào bên trong Đặc biệt các

vị trí tường hang có cấu trúc lõm và các gờ nhô tạo vòm hình chữ U hỗ trợ tốt

để chim làm tổ, và luôn được chim sử dụng hết Những cặp yến mới ghép đôi

vì thế chịu làm tổ ở những nơi ít thuận lợi hơn so với các cặp yến đã có vị trí cao trong đàn

Thomassen et al (2003) [49] đã đưa ra đánh giá về phát sinh chủng loại mới của chim yến (Aves: Apodidae) dựa trên trình tự gen cytochrome b có chiều dài 1143 bp Với trình tự dài hơn nhiều so với dữ liệu của Lee et al., phân tích đã ủng hộ mạnh nhiều nhánh phát sinh Tuy nhiên vị trí phân loại

của Hydrochous vẫn không như mong đợi Bổ sung phân tích ở nhiều vùng

gen bảo tồn và thêm nhiều mẫu có thể giúp giải quyết vấn đề này Điều quan trọng là nghiên cứu đã giải quyết được Collocaliini như một nhóm đơn phát sinh Cấu trúc bên trong của nhóm cũng cho thấy giống không sử dụng tiếng

vang Collocalia và giống sử dụng tiếng vang Aerodramus là hai nhóm huyết

thống tách biệt Nghiên cứu này phù hợp với những phân loại trước đây dựa trên các đặc điểm hình thái, nhưng đối lập với nhiều nghiên cứu phân loại trong thời gian gần đây

Price et al (2004) [39] phân tích dựa trên thông tin trình tự DNA và tiếng

vang nhận thấy: Loài yến lùn (C troglodytes) - trong phân tích phát sinh

chủng loại có vị trí phân loại chắc chắn cùng với các loài khác không sử dụng

tiếng vang giống Collocalia - trong thực tế có khả năng sử dụng tiếng vang

Tiếng vang vì thế mất đi giá trị phân biệt giữa các giống yến hang khác nhau Hơn thế nữa, phát sinh loài phân bố theo tiếng vang có thể diễn giải bởi tiến hóa ở một vị trí nucleotide của yến hang, với những quá trình mất đi về sau,

hay bởi tiến hóa độc lập giữa Aerodramus và C troglodytes Vì vẫn chưa có

tài liệu nào công bố về trung khu thính giác trong não chim yến hang phù hợp với sử dụng tiếng vang, hi vọng vào những diễn giải tiếp theo cho vấn đề này Thomassen et al (2005) [50, 51] khai thác về mối quan hệ giữa các nhóm chim yến dựa trên tiếp cận đa locus để giải quyết một số vấn đề còn tồn tại

của nghiên cứu trước nhất là vị trí phân loại của yến lớn (Hydrochous gigas)

và quan hệ với các loài trong chi Aerodramus Phân tích tổ hợp trình tự 12S

rDNA gen ty thể và trình tự intron 7 của gen nhân beta fibrinogen (Fib7) với trình tự gen cytochrome b (cyt-b) của 6 loài yến hang, 2 loài yến khác và 1 loài chim ruồi làm đối sánh ngoài nhóm Kiểm tra sự tương đồng từng phần,

từ đó xác định sự thống nhất về dấu hiệu phát sinh chủng loại giữa 2 tập hợp trình tự, đề xuất rằng trình tự cyt-b và Fib7 là không thống nhất và vì thế không nên tổ hợp trong phân tích Tuy nhiên, các phân tích xa hơn đã bộc lộ rằng sự không thống nhất rõ ràng có thể do số lượng cao các biến dị trong trình tự gen cyt-b Phân tích tách rời và tổ hợp 3 trình tự cho thấy kết quả rõ

ràng đặt H gigas như nhóm chị em của Aerodramus và ủng hộ tính đơn phát

sinh của nhóm yến hang này Những kết quả này cũng phù hợp với các phân tích tổ hợp trình tự NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) và trình tự cyt-b

Thomassen et al (2006) [52] khi phân tích tiếng vang, âm thanh xã hội và trình tự DNA nhận thấy: Tiếng vang và âm thanh xã hội là đặc trưng loài và

có thể dùng các đặc điểm này để định loại Nhưng phân tích chủng loại phát sinh theo hai đặc điểm này không thu được kết quả Âm thanh bầy đàn cho kết quả phân tích phát sinh loài không thống nhất với phân tích dựa trên trình

tự DNA

Thomassen et al (2007) [53] đã nghiên cứu đặc trưng phân loại về sự phù hợp của cấu trúc tai giữa với khả năng sử dụng tiếng vang của chim yến Thực hiện đối chiếu 4 loài chim yến có sử dụng tiếng vang (mỗi loài 7 mẫu vật) và

5 loài chim không sử dụng tiếng vang (mỗi loài 1 mẫu vật) Cấu trúc, hoạt động của chuỗi xương màng nhĩ được tái hiện trên máy quét 3 chiều Nghiên cứu sử dụng kết hợp các mô hình phân tích 2 chiều và 3 chiều Mô hình phân tích 2 chiều với trục xoay cố định được phát triển để nghiên cứu biên độ dao động, mô tả sự thay đổi trật tự của chuỗi xương màng nhĩ và ảnh hưởng của

sự thay đổi đó tới chức năng mà nó đảm nhận Mô hình phân tích 3 chiều được sử dụng để dự đoán sự di chuyển của chuỗi xương màng nhĩ và đánh giá

sự thích hợp của mô hình phân tích 2 chiều Kết quả phân tích không tìm thấy đặc điểm nào ở tai giữa của chim phù hợp có hệ thống với khả năng sử dụng tiếng vang Khảo sát biên độ dao động tối đa và dự đoán cấu trúc phù hợp nhất thu được kết quả là một dải rộng cấu trúc tai giữa Tiếng vang dường như không chắc chắn phụ thuộc vào sự phù hợp cấu trúc chuỗi xương màng nhĩ ở tai giữa

Aowphol et al (2008) [8] khảo sát khác biệt di truyền ở 2 gen ty thể

(cyt-b và ND2) và 8 locus microsatellite giữa và trong các đàn yến A fuciphagus

từ những công trình được con người xây dựng trong thời gian gần đây ở Thái Lan Thực hiện lấy mẫu 10 đàn yến dọc theo bờ biển thuộc Gulf và biển

Andaman từ 2003-2006 Sự đa dạng di truyền theo mtDNA ghi nhận là rất thấp, và một vài giá trị thống kê có ý nghĩa được tìm thấy giữa các cặp đàn Phân tích mối quan hệ dựa trên các haplotype không chỉ ra được cấu trúc di truyền theo phân bố Mức đa dạng di truyền của các microsatellite cao nhưng giá trị thống kê không có ý nghĩa Tuy nhiên do kích thước lấy mẫu nhỏ ở một vài đàn có thể hạn chế kết luận về khác biệt di truyền dựa theo các chỉ số thống kê, phân tích cấu trúc dựa trên dữ liệu microsatellite tìm thấy một số dưới quần thể yến tổ trắng là một Sự thiếu khác biệt di truyền giữa các quần đàn yến nhà có thể là kết quả của dòng gen cao giữa các đàn và quần thể kích

thước lớn Kết quả này cho thấy chim yến A fuciphagus sống trong nhà ở

Thái Lan thời gian gần đây là một quần thể ngẫu giao Những nghiên cứu xa hơn là cần thiết để xác định trạng thái hỗn giao là ổn định hay chỉ tạm thời do kết quả của sự mở rộng của một số đàn, và so sánh với các đàn tự nhiên để hiểu về cơ chế sản sinh và sự thiếu cấu trúc di truyền trong các đàn yến nhà Sheshnarayan et al (2009) [45] đã chỉ ra những đặc điểm phân loại khác

biệt giữa loài A fuciphagus và loài yến hang cùng vùng phân bố là C

esculenta Những đặc trưng mang tính loại trừ như việc A fuciphagus lựa

chọn vị trí làm tổ ở khu vực tối trong hang, tập tính kiếm ăn trong không gian trên tán và gần tán nơi được che phủ bởi rừng cây Một số đặc điểm phân biệt

khác cũng được ghi nhận về thời gian ấp trứng và nuôi con non của A

fuciphagus dài hơn C esculenta Sheshnarayan cũng khẳng định những đặc

điểm lựa chọn nơi làm tổ không ngẫu nhiên của chim yến A fuciphagus giống như trong các nghiên cứu trước đây

b Tình hình nghiên cứu trong nước

Về khu hệ chim yến của Việt Nam

Võ Quí (1975) [6] ghi nhận ở Việt Nam có các loài chim yến: yến cọ

(Cypsiurus balasiensis infumatus Sclater, 1865), yến mào (Hemiprosne

longipennis coronate Tickell, 1833), yến đuôi cứng lớn (Hurundapus

gigantean indica Hume, 1878), yến đuôi nhọn lưng bạc (Hirundapus

cochinchinensis Oustalet, 1878), yến cằm trắng (Apus affinis subfurcatus Blyth, 1849), yến hông trắng (gồm 2 phân loài Apus pacificus pacificus Latham, 1801 và Apus pacificus cooki Harington, 1912) Riêng chim yến hang gồm có loài yến núi (với hai phân loài Collocalia brevirostris

innominata Hume, 1873 và C b inopina Thayer et Bangs, 1909) cho tổ được dùng làm thuốc và yến hông xám (Collocalia francia germaini Oustalet,

1878) cho tổ yến là loại thực phẩm có giá trị

Theo Chantler và Driessens (2000) [10] ở Việt Nam có phân bố của

loài yến Đông Dương – A rogersi (có tài liệu xếp là phân loài của A

brevirostris ) và yến tổ đen – A maximus maximus

Theo Nguyễn Cử và ctgk (2000) [2] ở Việt Nam còn có thể gặp loài di

cư là yến đuôi nhọn họng trắng (Hirundapus caudacutus)

Danh pháp khoa học của chim yến sào

Tên khoa học của chim yến sào tại Việt Nam không thống nhất Theo

Nguyễn Quang Phách (1991) [4] chim yến hàng có tên khoa học Collocalia

fuciphaga germani Oustalet, 1878 Một số tài liệu còn sử dụng các tên gọi C

francica, C germani, C inexpectata, C fuciphaga

Vùng phân bố chim yến sào tại Việt Nam và các thông tin phân loại học khác

Theo Võ Quí (1975) [6] chim yến hông xám (C francia germani

Oustalet, 1878) thường gặp làm tổ ở vách núi đá trong các hang ở bờ biển như vịnh Hạ Long, Đồng Hới, Qui Nhơn, Cù Lao Chàm, Nha Trang, Côn Lôn và Phú Quốc

Theo TTKHTN&CNQG (1992) [5] ở Việt Nam chim yến hàng (C

fuciphaga germaimi Oustulet, 1871) làm tổ từ khoảng 18° vĩ bắc trở vào: Quảng Bình (hòn Vĩnh Sơn, hòn Chùa, hòn La), Đà Nẵng (Cù Lao Chàm), Quảng Ngãi (hòn Đồi Mồi, hòn Nối, hòn Ngoại,…), Côn Đảo, Phú Quốc, Nam Du, Thổ Chu

Nguyễn Quang Phách và ctgk (1991, 1992, 1994, 1997, 2002) [4, 28,

29, 30, 31] đã thực hiện các nghiên cứu tại Đà Nẵng và Khánh Hòa về phân

loại học chim yến hàng (C f germani) và đưa ra các thông tin điều kiện vi

khí hậu trong hang, ảnh hưởng của hoạt động thu hái tổ tới sự phát triển quần thể Những đặc điểm phân loại học của chim yến sào như chu kì thay lông, làm tổ và sinh sản 2 lứa một năm trong khoảng thời gian từ tháng 12 đến tháng 7 năm sau đã được nghiên cứu khá tỉ mỉ Từ những kết quả nghiên cứu trên, các tác giả đã đề ra chiến lược thu hoạch tổ yến một năm 2 đợt: đợt đầu khoảng cuối tháng 3 đầu tháng 4 khi có khoảng 10-15% số tổ có trứng và đợt tiếp theo vào cuối tháng 8 khi lứa chim non thứ 2 đã rời tổ Chiến lược thu hoạch này đã đem đến thành công, không những duy trì mà còn tăng số lượng của các quần thể chim yến sào Việt Nam được coi là một điểm sáng khi cân

chim yến mặc dù chỉ chiếm 2,5% thị trường yến sào toàn cầu Những công bố này cũng tổng kết, so sánh giữa chim yến tổ trắng và chim yến tổ đen từ thành phần tổ tới những đặc điểm phân loại học khác

Về di truyền: Phân tích ban đầu của Đặng Tất Thế và ctgk (2007) [1] dựa trên trình tự gen cytochrome b nhận thấy có sự đa dạng di truyền giữa các quần thể chim yến sào tại Bình Định và Khánh Hòa Sự đa dạng này được cho

là phản ánh khác biệt về nguồn gốc của các quần thể

Thông tin về sự mở rộng các quần thể chim yến sào tại Việt Nam

Về chim yến cư trú ngoài đảo: Chim yến tự nhiên ở Việt Nam tập trung chủ yếu ở các tỉnh Quảng Nam, Bình Định và Khánh Hòa Trong đó Khánh Hòa có số lượng quần thể lớn nhất Số lượng các quần thể chim yến được phát hiện đã tăng lên theo thời gian Theo Công ty Yến sào Khánh Hòa, trước năm

1976 Khánh Hòa có 6 đảo yến, đến năm 1988 có 8 đảo yến và đến 1992 đã tăng lên 12 đảo yến [67]

Về chim yến cư trú trong nhà: Quần thể chim yến nhà được ghi nhận đầu tiên ở Việt Nam là ở Ninh Thuận, có thể xuất hiện từ những thập kỉ 1970,

1980 Tiếp theo là Khánh Hòa với những quần thể chim yến đầu tiên được ghi nhận khoảng năm 1993 Sau đó là ở các tỉnh khác: Thành phố Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Kiên Giang, Cà Mau, Bình Định, Bình Dương, Bạc Liêu, … Hiện

đã có khoảng 20 tỉnh ở khu vực Nam Trung Bộ và Nam Bộ có các quần thể chim yến làm tổ trong nhà

Nghiên cứu về phân loại học và nguồn gốc của những quần thể mới xuất hiện chưa được công bố nhưng những thông tin ban đầu đã ghi nhận có biến dị khác biệt giữa chim yến đảo và chim yến nhà

Nhiều hội thảo đã được tổ chức bàn về chim yến nhà Một số tài liệu về chim yến nhà đã được công bố nhưng chủ yếu là về phương pháp dẫn dụ, quy trình công nghệ sinh sản và nuôi chim như tài liệu “Kỹ thuật nuôi chim yến trong nhà” của Nguyễn Khoa Diệu Thu (2007) [3]

Tóm lại, những nghiên cứu phân loại học về đối tượng chim yến sào ở trong nước và ngoài nước là khá phong phú Tuy nhiên, nghiên cứu về di truyền ở mức dưới loài còn ít được thực hiện và vấn đề danh pháp khoa học

có nhiều điểm chưa thống nhất Nhiều tài liệu phân loại trong nước vẫn sử

dụng tên giống Collocalia Trong khi các tài liệu phân loại ngoài nước đã chuyển sang sử dụng tên giống Aerodramus Bên cạnh đó các quần thể chim

yến sào mới xuất hiện làm tổ trong các công trình xây dựng trong đất liền ở nước ta hiện nay có số lượng ngày càng nhiều nhưng chưa được nghiên cứu phân loại

1.2 Cách tiếp cận và thiết kế nghiên cứu

1.2.1 Ứng dụng kỹ thuật phân tử DNA trong nghiên cứu hệ thống học

Kể từ khám phá cấu trúc DNA của Watson và Crick (1953), hệ thống học phân tử đã có nền tảng lý thuyết vững chắc Cùng với các tiến bộ của các khoa học khác, các công cụ và kỹ thuật phân tích di truyền ngày càng được hoàn thiện

Các đặc điểm và quy luật biến đổi phân tử vẫn còn tranh luận và có nhiều học thuyết khác nhau đã được đưa ra để diễn giải cơ chế tiến hóa Thuyết tiến hóa tổng hợp và thuyết trung tính (Kimura, 1968) cho thấy nhiều khía cạnh khác nhau của quá trình biến đổi di truyền dưới áp lực của tự nhiên

Quá trình phát sinh và tích lũy biến đổi do đột biến gen, sự sai lệch di truyền ngẫu nhiên, nguyên lý tổ hợp di truyền, các cơ chế cách ly và các quá trình chọn lọc: đào thải, thích nghi và cân bằng tạo sự đa dạng di truyền và khiến quá trình tiến hóa phân ly theo thời gian Lịch sử phát sinh chủng loại vì thế tạo ra các thế hệ gồm các đơn vị phân loại mới ngày một khác biệt Tuy vậy, các đơn vị phân loại vẫn còn lưu giữ những đặc điểm giống nhau do cùng nguồn gốc tổ tiên, những đặc điểm tương đồng này là cơ sở để suy luận

về nguồn gốc phát sinh, quan hệ của các đơn vị phân loại và các quần thể địa

lý Sự sai khác mang dấu ấn tích lũy của các biến dị di truyền và bởi vậy có thể áp dụng lý thuyết đồng hồ phân tử để ước lượng sự phân rẽ trong một giới hạn nhất định (Avise, 1994) [9]

Mặt khác, còn những vấn đề không thể bỏ qua là tiến hóa độc lập, sự bão hòa biến đổi các trạng thái đặc điểm ở một giới hạn nào đó và các quá trình tiến hóa ngược, song song và hội tụ có thể tạo ra các đặc điểm tương tự

ở các cá thể, các đơn vị phân loại do trùng hợp ngẫu nhiên hay do định hướng chọn lọc thích nghi với môi trường sống giống nhau Do đó, các mô hình phân tích tiến hóa đều dựa trên cơ sở so sánh các đặc điểm tương đồng với số lượng đủ lớn để loại bỏ nhiễu gây ra bởi các đặc điểm tương tự

Trong các quần thể của một loài, các nhân tố di truyền cũng có sự biến đổi và xáo động do các dòng gen (di nhập gen) và sự phiêu bạt di truyền (biến động di truyền) Sự thay đổi này không biểu hiện bởi các hàm xác định mà mang tính ngẫu nhiên, do đó cần có những khảo sát cho từng nhóm đối tượng, từng locus cụ thể

Tóm lại, tuy cũng có những hạn chế và vấn đề còn tồn tại nhưng hệ thống học phân tử có ưu thế so với các phương pháp hình thái truyền thống bởi khai thác trực tiếp các thông tin di truyền, loại bỏ được các đặc điểm biến

dị không di truyền (thường biến) ra khỏi các phân tích Bên cạnh đó với việc lựa chọn các locus có độ bảo thủ phù hợp, phân tích di truyền phân tử có thể thực hiện các khảo sát từ vi tiến hóa tới đại tiến hóa và đặc biệt có ưu thế trong phân tích vi tiến hóa khi mà các dấu hiệu hình thái không thực sự rõ ràng

So với các phương pháp phân tích đa hình axit nucleic (RFLP, RAPD, microsatellite, Southern blot, Northern blot…), hay đa hình polypeptide (điện

di isozyme, Western blot…) thì giải trình tự DNA là phương pháp tỏ ra ưu việt hơn cả về phương diện các yếu tố kỹ thuật và phạm vi áp dụng trong hệ thống học Giải trình tự DNA vừa đạt được độ nhạy cao nhờ được nhân bản qua PCR, hơn nữa lại là phương pháp chính xác nhất bởi khảo sát trực tiếp trình tự các nucleotide của phân tử mang thông tin di truyền Cơ sở dữ liệu trình tự DNA của các đơn vị phân loại được bổ sung ngày một nhiều là cơ sở

để giúp con người khám phá lịch sử tự nhiên của sinh giới

1.2.2 Sử dụng hệ gen ty thể trong nghiên cứu hệ thống học

Hệ gen ty thể (mtDNA): là hệ gen đơn bội, có cấu trúc DNA mạch kép dạng vòng khép kín

Cấu trúc điển hình của mtDNA ở động vật có xương sống thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc gen ty thể của động vật có xương sống

(Cambridge, 1992) mtDNA của động vật có xương sống có kích thước vào khoảng 15-17

Kb Cấu trúc mtDNA bao gồm 13 locus mã cho protein chức năng, 22 locus

mã cho các RNA vận chuyển, 2 locus mã cho các tiểu phần RNA ribosomal (trong đó chuỗi nặng mã cho 28 gen và chuỗi nhẹ mã cho 9 gen) Cấu trúc gen này cũng phổ biến ở các động vật đa bào, một số loài có thể không có ty thể, các loài nấm hay thực vật có thể có kích thước mtDNA nhỏ hơn với sự vắng mặt một số gen hay có kích thước mtDNA khổng lồ tới 2,5 Mb nhưng tập hợp gen cũng giống với những loài có mtDNA nhỏ đến mức đáng ngạc nhiên

mtDNA được tái bản và di truyền độc lập với hệ gen nhân, tức không tuân theo chu kỳ tế bào Một tế bào soma bình thường có từ 100-10000 bản sao mtDNA Các tế bào cơ, gan có hoạt động mạnh có số lượng ty thể lớn và

số bản sao gen cũng nhiều hơn Ở các loài động vật sinh sản hữu tính thông qua sự thụ tinh của các dị giao tử, trong đó trứng là giao tử mang lượng lớn nguyên sinh chất với số lượng ty thể được bảo tồn, thì tương ứng hầu hết genome ty thể được di truyền theo dòng mẹ

mtDNA có kích thước nhỏ với số lượng bản sao lớn, đặc biệt có cấu trúc di truyền rất ổn định ở các loài động vật có xương sống nên phân lập gen

ty thể thuận lợi hơn so với gen nhân mtDNA có cơ chế di truyền đơn giản, hiếm có sự tái tổ hợp giữa nhiều dòng hay tương tác như các alen của hệ gen nhân nên phân tích dựa theo gen ty thể đơn giản, dễ so sánh Vì những lý do trên nên gen ty thể được sử dụng phổ biến trong phân loại học, phân tích tiến hóa và khảo sát đa dạng di truyền quần thể ở động vật có xương sống (Avise, 1994) [9]

Tùy theo tốc độ biến đổi, các vùng gen khác nhau của hệ gen ty thể được áp dụng cho các phân tích khác nhau như vùng điều khiển (D-loop) được sử dụng trong phân tích quan hệ họ hàng và tiến hóa gần, còn các vùng gen chức năng (cyt-b, rDNA, COI, COII, ND4…) được dùng cho phân tích di truyền quần thể và quan hệ phát sinh chủng loại ở mức loài và phân loài Các phân tích này đều dựa trên việc so sánh trình tự nucleotide các vùng tương ứng của các cá thể với nhau và với cơ sở dữ liệu đã có sẵn Tất nhiên do lượng thông tin hạn chế và tốc độ biến đổi tương đối cao so với gen nhân, sử dụng gen ty thể trong phân tích phả hệ các dòng không quá cách xa nhau sẽ cho kết quả ít bị sai lệch do tích lũy biến đổi bão hòa

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Mẫu vật nghiên cứu

Tổng hợp thông tin từ các tài liệu phân loại đã công bố, kết hợp với các khảo sát và nguồn thông tin khác chúng tôi quyết định lựa chọn địa điểm thu mẫu là các quần thể chim yến sào cư trú ngoài đảo (yến đảo) và chim yến sào

cư trú trong đất liền (yến nhà) thuộc các tỉnh Quảng Nam, Bình Định, Khánh

Hòa và Bình Dương Bản đồ thu mẫu thể hiện trên hình 2.1

Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu

Yến đảo, Quảng Nam

Yến nhà, Bình Định

Yến đảo, Khánh Hòa

Yến nhà, Bình Dương

Yến đảo, Bình Định

Yến nhà, Khánh Hòa Yến nhà xây trên đảo, Bình Định

Các mẫu chim yến sào được thu trong thời gian từ năm 2007 – 2010 Các mẫu vật này được đánh số kí hiệu theo địa điểm và thời gian thu Bảo quản các mẫu vật trong ethanol 96%, ở -20°C Từ các mẫu chim yến sào thu được, lựa chọn 27 mẫu chim yến sào đại diện cho các quần thể khác nhau để phân tích, danh sách các mẫu nghiên cứu thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách mẫu vật nghiên cứu

1 DQN1-4 Mẫu cơ Cù Lao Chàm, tỉnh Quảng Nam

2 DBD1-7 Mẫu cơ Các đảo thuộc tỉnh Bình Định (3 quần thể)

3 N.DBD1,2 Mẫu cơ Nhà yến xây trên đảo, tỉnh Bình Định

4 NBD1-7 Mẫu cơ Nhà yến, tỉnh Bình Định (3 quần thể)

5 DKH1-3 Mẫu cơ Các đảo thuộc tỉnh Khánh Hòa

7 NDN1-3 Mẫu cơ Nhà yến, tỉnh Bình Dương

2.2.2 Các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu

Các trình tự gen của các loài chim yến sào được thu thập từ ngân hàng trình tự DNA (Genbank) Danh sách một số trình tự gen cytochrome b tương đồng của các loài chim yến sử dụng trong nghiên cứu trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các trình tự gen tham khảo

2 A fuciphagus germani A.f.ger AY294429

Balambangan Is., Sabah, Malaysia

3 A fuciphagus vestitus A.f.vesB1 AY135627 A.f.vesB2 AY135629 Borneo

A.f.vesB6 AY135628

4 A maximus lowi A.m.lowi AY294445

Madai caves, Sabah,

Malaysia

5 A spodiopygius assimilis A.s.assi AY294438 Suva, Fiji

6 A spodiopygius spodiopygius A.s.spod AY294437 Western Samoa

2.2.3 Một số hóa chất, vật tư sử dụng trong nghiên cứu

- Dung dịch TBE 10x (10 mM Tris, 0,9 mM axit boric, 0,01 mM EDTA) (Invitrogen, Mỹ)

- Agarose (Invitrogen, Mỹ)

- Ethidium Bromide (EtBr) 10 mg/ml (Invitrogen, Mỹ)

- 100 bp DNA ladder (Invitrogen, Mỹ)

- Kít tách chiết DNA: Dneasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Đức)

- Taq PCR mastermix 2x (Qiagen, Đức)

- Kít tinh sạch sản phẩm PCR: Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Đức)

- BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ)

- Sephadex G50 (Sigma, Mỹ)

2.2.4 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức)

- Máy trộn rung (Fluka, Mỹ)

- Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức)

- Máy ly tâm lạnh 200R (Mikro, Đức)

- Máy chu trình nhiệt Mastercycler (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di gel agarose (BioRad, Mỹ)

- Máy soi gel (UVP, Mỹ)

- Máy phân tích trình tự ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ)

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu bao gồm một số nội dung, công việc được tiến hành theo các bước thể hiện trên sơ đồ (hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu

nghiên cứu

Khảo sát trình

tự trên Genbank

Lựa chọn locus, Thiết kế primer Thu mẫu

Chuẩn bị vật

tư cần thiết

Đọc kết quả, hiệu chỉnh, kiểm tra

Phản ứng giải trình tự DNA, tinh sạch sản phẩm BLAST, Dịch mã

Công bố,

đề xuất

Phân tích, đánh giá, kết luận Đặt vấn đề

2.2.2 Lựa chọn locus, thiết kế mồi và điều kiện thí nghiệm

Qua tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã công bố về chim yến sào, khảo

sát dữ liệu trình tự DNA của các loài chim yến sào (giống Aerodramus) và một số giống có quan hệ gần gũi như giống Collocalia, Hydrochous đã được

công bố trên Genbank chúng tôi nhận thấy trình tự gen cytochrome b thuộc hệ gen ty thể mang thông tin thích hợp để giải quyết mục tiêu của đề tài

Thực hiện so sánh các trình tự gen cytochrome b giữa các loài trong

giống Aerodramus chúng tôi đã lựa chọn được vùng gen đích để nghiên cứu

và đoạn trình tự bảo thủ thích hợp để thiết kế cặp mồi nhân bản vùng gen này với sự hỗ trợ của chương trình phần mềm FastPCR v5.4.1 Đoạn gen đích được lựa chọn là một phần trình tự gen cytochrome b có chiều dài 650bp Cặp mồi để nhân bản đoạn gen này có trình tự như sau:

>SwiftF: 5’ - AAC CCT AGC CTT CTC ATC AG - 3’

>SwiftR: 5’ - AGT GGG CTT AAG AAT AGG ACT - 3’

Điều kiện bắt cặp mồi theo tính toán lý thuyết như sau: nhiệt độ 56°C, nồng độ Mg2+ 1,5 mM, nồng độ Na+ 50 mM, pH 9,0

• Sau khi thử nghiệm chúng tôi xây dựng được quy trình tiến hành thí nghiệm giải trình tự DNA các mẫu nghiên cứu như sau:

Tách chiết DNA tổng số từ phần cơ mềm của các mẫu vật, sử dụng Dneasy blood and tissue kit (Qiagen, Đức) theo quy trình được đưa

ra bởi nhà sản xuất kit

Nhân bản đoạn trình tự đích bằng kỹ thuật PCR với thành phần chuẩn bị cho một ống phản ứng thể hiện trong bảng 2.3 và chu trình

Bước Nhiệt độ ( o C ) Thời gian (giây) Số chu kì

Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1x, nhuộm EtBr và hiện kết quả trên đèn tử ngoại (ở bước sóng 302 nm) Vạch sản phẩm DNA nhân bản được (có kích thước như thiết kế) được cắt, tinh sạch bằng Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức) theo quy trình được đưa ra bởi nhà sản xuất kít

Thực hiện phản ứng giải trình tự DNA với thành phần chuẩn bị cho một ống phản ứng thể hiện trong bảng 2.5 và chu trình phản ứng thể hiện trong bảng 2.6

25

Tinh sạch sản phẩm phản ứng giải trình tự bằng sắc kí lọc gel (cột Sephadex G50) theo quy trình:

1 Hydrat hóa gel sephadex trong 2-4 giờ

2 Ly tâm 2000 x g trong 1 phút, bỏ dịch qua

3 Cho toàn bộ sản phẩm phản ứng giải trình tự DNA lên cột, ly tâm

2000 x g trong 1 phút

4 Làm khô sản phẩm sau lọc gel bằng thiết bị cô quay chân không

5 Đọc trình tự trên máy ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ)

Phương pháp ME dựa trên ma trận khoảng cách di truyền chuyển đổi,

là một trường hợp đặc biệt của phương pháp Neighbor Joinning (NJ) (Saitou and Nei, 1987) với việc kiểm tra đầy đủ ở tất cả các bước tính toán để đưa ra cây hình học gọn nhất Phương pháp MP thực hiện việc phân tích trên các đặc điểm có giá trị phát sinh với tiêu chuẩn là số bước biến đổi tối giản Phương pháp ML tìm kiếm cây phát sinh có xác suất cao nhất Phương pháp BI tiến hành phân tích Monte Carlo chuỗi Markov

Các phương pháp này đều có ưu điểm và hạn chế riêng Phương pháp

ME thực hiện đơn giản hóa việc tính toán nhưng cũng làm mất dữ liệu phân tích; phương pháp MP, ML, BI sử dụng đầy đủ dữ liệu đầu vào nhưng lại yêu cầu năng lực xử lý mạnh và thực tế khó bao quát được mọi khả năng với khối lượng dữ liệu lớn Do đó, tiến hành phân tích song song theo các phương

pháp này sẽ giúp so sánh, kiểm chứng kết quả và có được đánh giá toàn diện nhất

Ngoài ra ở mỗi phương pháp có thể thực hiện các phép kiểm tra để đánh giá độ tin cậy của kết quả phân tích Trong các phương pháp kiểm tra thì bootstrapping và jackknifing là các phương pháp kiểm tra dựa trên việc lấy lại mẫu thường được sử dụng hơn cả bởi hiệu quả mà nó mang lại, giá trị kiểm tra này phản ánh sự phân tán hay tập trung của dữ liệu khảo sát (Lanyon, 1987) [25]

Tất cả các quy trình tính toán, thống kê, phân tích và kiểm tra này được thực hiện bằng các chương trình phần mềm MEGA v4.0 (Tamura et al., 2007) [48], PAUP v4.0 (Swofford, 2002) [47], MrBayes v3.1.2 (Ronquist và Huelsenbeck, 2003) [41], Modeltest v3.7 (Posada, 2005) [37] và MrModeltest v2.3 (Nylander, 2008) [32]

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nhân bản vùng gen đích bằng PCR

Các mẫu nghiên cứu sau khi tách chiết DNA tổng số, đã được kiểm tra

độ tinh sạch bằng chỉ số OD260/OD280 cho kết quả đảm bảo chất lượng để tiến hành kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đích Sản phẩm PCR nhân bản đoạn DNA đích được điện di, kết quả điện di thể hiện trên hình 3.1

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR

Chú giải: M: 100 bp DNA ladder; 1-27 tương ứng với các mẫu phân tích: DQN1-4,

DBD1-7, N.DBD1-2, NBD1-7, DKH1-3, NKH, NDN1-3Ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các mẫu nghiên cứu đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, cùng kích thước, thể hiện ở vạch điện di sắc nét, thẳng hàng Đối chiếu với thang chuẩn kích thước phân tử (100 bp DNA ladder) xác định các sản phẩm này có kích thước khoảng 650 bp, phù hợp với thiết kế

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

3.2 Giải trình tự đoạn gen đích từ các mẫu nghiên cứu

Kết quả giải trình tự DNA đích của các mẫu nghiên cứu, sau khi cắt bỏ trình tự mồi và một số phần có nhiễu, thu được trình tự nucleotide có chiều dài 606 bp Đối chiếu các trình tự DNA của các mẫu vật này với cơ sở dữ liệu trình tự DNA (Genbank) bằng chương trình BLAST cho thấy các trình tự DNA thu được có sự tương đồng rất cao (từ 97-99%) với các trình tự gen

cytochrome b của loài Aerodramus fuciphagus (các trình tự có mã hiệu AY294429, AY135631, AY135632) Kết quả so sánh trình tự giữa các mẫu

nghiên cứu thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 So sánh trình tự nucleotide

A.f.ger GGA TGA TTA ATC CGC AAC CTA CAC GCC AAC [ 30] DQN1 [ 30] DQN2 [ 30] DQN3 [ 30] DQN4 [ 30] DBD1 [ 30] DBD2 [ 30] DBD3 [ 30] DBD4 [ 30] DBD5 [ 30] DBD6 [ 30] DBD7 [ 30] N.DBD1 [ 30] N.DBD2 [ 30] DKH1 [ 30] DKH2 [ 30] DKH3 [ 30] NBD1 A [ 30] NBD2 [ 30] NBD3 A [ 30] NBD4 [ 30] NBD5 A [ 30] NBD6 [ 30] NBD7 [ 30] NKH [ 30] NDN1 [ 30] NDN2 A [ 30] NDN3 [ 30] A.fu.B4 [ 30]

A.f.ger GGA GCC TCA TTC TTC TTC ATC TGT ATC TAC [ 60] DQN1 [ 60] DQN2 [ 60] DQN3 [ 60] DQN4 [ 60] DBD1 [ 60] DBD2 [ 60] DBD3 [ 60] DBD4 [ 60] DBD5 [ 60] DBD6 [ 60] DBD7 [ 60] N.DBD1 [ 60] N.DBD2 [ 60] DKH1 [ 60] DKH2 [ 60] DKH3 [ 60] NBD1 T [ 60] NBD2 T C [ 60] NBD3 T C [ 60] NBD4 T C [ 60] NBD5 T C [ 60] NBD6 T C [ 60] NBD7 T C [ 60] NKH T [ 60] NDN1 T C [ 60] NDN2 T C [ 60] NDN3 T C [ 60] A.fu.B4 T C [ 60] A.fu.B5 T C [ 60] A.f.ger CTC CAC ATC GGA CGA GGA TTC TAC TAT GGA [ 90] DQN1 [ 90] DQN2 [ 90] DQN3 [ 90] DQN4 [ 90] DBD1 [ 90] DBD2 [ 90] DBD3 [ 90] DBD4 [ 90] DBD5 [ 90] DBD6 [ 90] DBD7 [ 90] N.DBD1 [ 90] N.DBD2 [ 90] DKH1 [ 90] DKH2 [ 90] DKH3 [ 90] NBD1 [ 90] NBD2 [ 90] NBD3 [ 90] NBD4 [ 90] NBD5 [ 90] NBD6 [ 90] NBD7 [ 90]