Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất ở thái nguyên

Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu sự phân bố và đánh giá sự đa dạng sinh học cùa vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Thái Nguyên; - Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis mang

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐH TN http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trang 3

L Ờ I C Ả M Ơ N

&âỉ XÙI hủy tó lòng bui ơn tâu tắe lởi <J& <Vi Ghi te (thinh

-<7rưénọ hộ mòn Sinh ŨƠUM 3C3Ữ3QI - mTŨQQl & <x>?ù, đã tận tình dìu

dắt, giúp đã tồi trong, tuất qua trinh họe lập oà hoãn thành luận oản

này

Qỗi cũng xin nhãn thành cảm tín ?)@S.C7S QlạA r Đìnk Hình

-^rưằng phòng <7)ì trtiụỉn (Vi tinh oái, (Viện ©ăng Qlạhê Sinh họe đã chi

bão- oà tạo- điêu kiên thuận lợi nhối chữ tối dượt nghiên, cứu oà họe tập,

Cĩrvnụ á li ất quá trình tíuỊe hiện đĩ tài này., tài cồn nhận đứớe tự

giúp của 3CẴ Qlạnụỉn C7hỊ &hanh JCanh oà toàn thê eáe cỗ- (liú anh dụ

trong, phàng, nữi trttụên (Ví tinh oặt eũnạ như eáe thầy cỗ- giáo- bỗ- mồn

linh DChtM 3C7Ô<JW - (ĐTô&Ql Ã <Z>7C

Ươi XÙI gửi tài câm ổn chân thành lởi gia đinh, bạn hè đã luôn

đặng ữièỉi chìa iè những, khó- khăn giúp, dữ lỗi hoãn thành Luận nàn

nài/

Mệt lần nữa tho- tỏi đíiỢe tàm ơn những Lự giúp, đễ- quý báu đẻ-

\7hái ntỊẨiụin, ttạtìụ 24 tháng 5 năm 2007

Sinh niên

trường (phúe Tủưnụ

Trang 5

M Ụ C L Ụ C

M Ở ĐẦU Ì

CHƯƠNG Ì: TONG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3

1.2.Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5

1.3 Độc tố của Bacillus thuringiensis 12

1.4 Sự hoạt hoa và mối quan hệ cấu trúc chức năng 14

1.5 Đặc điểm của protein tinh thể độc 15

Ì 6 Những ưu điểm và hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học 20

1.7 Đại cương về côn trùng thử nghiệm 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24 2.2 Hoa chất và thiết bị 24

2.3 Môi trường và dung dịch 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập vi khuẩn Bacilỉus thuringiensis từ các mẫu đất 32

3.2 Sự phân bố vi khuẩn Baciỉỉus thuringiensis trong các mẫu đất 33

3.3 Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập 33

3.4 Hoạt tính sinh học của các chủng Bacillus thurìngiensis phân lập 36

3.5 Sự đa về thành phẩn loài của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại

Thái nguyên 39

3.6 Sự đa dạng về thành phần gen của các chủng Bacillus thuringiensis phàn lập 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Trang 7

P h ả n t ổ n g hợp dây chuyền nhờ polymerase

T A E Tris - acid acetic EDTA

Trang 9

T Ó M T Ắ T K Ế T Q U Ả N G H I Ê N c ứ u

1 Tên đề tài

Nghiên cứu sự đa dạng sinh học cùa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thu thập ở Thái Nguyên

2 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu sự phân bố và đánh giá sự đa dạng sinh học cùa vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Thái Nguyên;

- Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis mang nguồn gen quý, cố hoạt tính diệt sâu cao

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất thu thập ở các

vùng khác nhau cùa Thái Nguyên;

- Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao;

- Phân loại các chùng Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết

hình ovan, hình không xác định

- Đã thử nghiệm khả năng diệt sâu cùa 25 chùng B thuringiensis phân lập được với sâu tơ Kết quả cho thấy ở nồng độ l o5 bào tử/ml hoạt tính diệt sâu là khá cao Còn ở nồng độ l o7 bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu là rất cao

Trang 11

- Đã phân loại được 80 chủng B thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên Các chủng phân lập thuộc về 17 dưới loài khác nhau

- Đã tiến hành phát hiện gen cho 11 chủng B thuringiensis phân lập kết quả cho thấy có 10 chủng trong số 11 chủng tách gen có mang từ Ì đến 5 gen cryl

Trang 13

Xhéa luận tất nghiệp ^ t B g Giường, ipitúe TÔỊứta - &ÌĨ37ÕCK.1

M Ở Đ Ầ U

1 Đạt vấn đề

Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du

và miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 k m2 Với địa hình thấp dần từ núi cao xuống núi thấp, rồi trung du, đồng bằng theo hướng Bắc - Nam làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lanh, vùng lanh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô Do ảnh hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được chia thành ba loại chính, trong đó, đất núi chiếm diện tích lớn nhất (48,4%) hình thành do sự phong hoa trên các đá Macma, đá biến chất và trầm tích, độ cao trên 200 m, tạo điều kiện cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, cây đặc sản đất đồi chiêm 31,4% chủ yếu hình thành trên cát kết, bột kết phiến sét và một phần phù sa cổ kiến tạo, độ cao từ 150 - 200 m, phù hợp với cây ăn quả lâu năm, cây công nghiệp

và đất ruộng chỉ chiếm 14,4% Thái Nguyên còn có một diện tích lớn đất chưa

sử dụng Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh vật

V i sinh vật là nhóm vi sinh vật đặc biệt quan trọng trong bất kỳ hệ sinh thái nào, do những tính chất đặc thù như phân bố rộng, thành phần các loài rất

lớn, có nhiều loài chưa được biết đến

Trong những năm qua vi khuẩn Bacillus thuringiensis {B thuringiensis)

là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng B thuringiensis là trực khuẩn, gram dương, có khả năng di động Đặc trưng nổi bật của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng sản sinh

ra các protein tinh thể gây độc đối với nhiều loại côn trùng của các bộ khác nhau như bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng Trong quá trình hình thành bào tử, B thuringiensis có thể tồn tại trong nhiều môi trường sống khác nhau nhưng môi trường chủ yếu của vi khuẩn này là trong đất Chính vì vậy, việc

Ì

Trang 15

Xhéa tuệ*, ui nghiện su Mí &«ùfHg <J)kúe 'Xxửựi - &ÌIS3KX1

nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn B thuringiensis phân lập được từ một số

mẫu đất tại Thái Nguyên để tìm kiếm các chủng B thuringiensis bản địa có hoạt tính cao là rất cần thiết đồng thời cũng để lưu giữ và bảo tồn các nguồn gen quý của vi khuẩn B thuringiensis ở đây

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Baciilus thurỉngỉensis phân lập từ một số mẫu đ ấ t ở Thái Nguyên"

2 Mục tiêu của đề tài

1 Nghiên cứu sự phân bố và đánh giá được sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ờ Thái Nguyên;

2 Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis mang nguồn gen quý, có hoạt tính diệt sâu cao

3 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập vi khuẩn Bacilỉus thuringiensis từ các mẫu đất thu thập ở các

vùng khác nhau của Thái Nguyên;

2 Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao;

3 Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết

Trang 17

XtiÃa luận ui nụhiỊp, •Ạ ca JSS GNMMV <Vkiíe TCưtt y

-C H Ư Ơ N G 1: T Ổ N G Q U A N T À I L I Ệ U

1.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng của vỉ khuẩn Bacỉllus thuringừnsis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis trên thế giới Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata đã phát hiện ra một loại vi khuẩn gây bệnh sotto ở trên tằm và ông đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, nhà khoa học Đức Berline cũng đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trang Hải, Anagasta kaenniella Mãi đến năm 1915, vi khuẩn này mới chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis (B thuringiensis) do vi khuẩn này được phân lập từ vùng Thuringen của Đức Đến năm 1930, B thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu Năm 1938, chế phẩm B thuringiensis đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein Năm

1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào

và bào tử Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất ra một số lượng lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng B thuringiensis var kurstaki Đến năm

1962, de Barjac và Bonníòi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các

chủng B thuringiensis và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh Vào những năm 1960 - 1976, nhiều chủng B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu cao đã được phân lập và ứng dụng Năm 1977, Goldberg và Margarit

đã phát hiện ra B thuringiensis vai isralensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc

bộ hai cánh Năm 1981, Schnepf và Whiteley đã lần đầu tiên phân lập và tách dòng gen độc tố mã hoa protein tinh thể diệt sâu của chủng B thuringiensis var kustaki HD-1 gọi là gen cry Ì và biểu hiện ở E coli Từ đó, một số lượng lớn các gen đã được tách dòng và đọc trình tự Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phân lập ra loài phụ B thuringiensis var tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại lá

3

Trang 19

Xhía luận lất nghiệp

khoai tây vùng Colorado, Hoa K ỳ từ sâu tenebrio molitar Sau đó, công ty Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự B thuringiensis var tenebrionit tên

là B thuringiensis var sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gen độc tố của chúng Năm 1985, gen cry của B thuringiensis đã được chuyển vào cây trồng

để diệt sâu Năm 1987, phát hiện ra B thuringiensis diệt giun tròn thực vật Năm 1991, phát hiện ra B thuringiensis diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên đã được đưa và sản xuất Năm 2003, Saikai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của B thuringiensis diệt tế bào ung thư Năm 2005, Ohba đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài

B thuringiensis phân lập ở Việt Nam có khả năng chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [3]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thurìngiensis tại Việt Nam

Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu vi sinh B thuringiensis đã được ứng dụng đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm từ 1971 Năm 1973, Nguyên Công Bình và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm B thuringiensis tại Viện sinh vật với môi trường đặc, giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền sẵn có như bã khô lạc, bột đậu tương Các chủng giống được sử dụng để tiến hành lên men có nguồn gốc từ Trung Quốc thuộc dưới loài B thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis var kustaki Các chế phẩm B thuringiensis sản xuất được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đạt được những kết quả đáng quan tâm Chính vì vậy, sau khi đất nước hoàn toàn giải phóng, tại phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học Việt Nam đóng tại Hồ Chí Minh đã sản xuất với quy mô nồi lên men dung tích 3m3 Năm 1982, ban Khoa học Kỹ thuật Hà Nội và Chương trình Sinh học phục vụ Nông nghiệp và Uy ban Khoa học và Kỹ thuật nhà nước (nay là bộ Khoa học và Công nghiệp) đã cho đề tài triển khai tại

4

Trang 21

xttéa iuậtt tất Mựỉúệp

Viện Công nghiệp Thực phẩm trên nồi lên men chìm với dung tích là 5m3 Các

chế phẩm Bt đã được tiến hành thử nghiệm phòng trừ sâu hại tại các vùng rau ngoại thành Hà Nội Từ năm 1984 - 1994, các chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp dịch thể được sử dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ sâu hại rõ rệt và giá thành không cao Cuối năm 1993 - 1994, chế phẩm Bt kém chất lượng không tiêu thụ được Trong những năm trở lại đây thì việc nghiên cứu

B thuringiensis đã được tiến hành tại nhiều nơi như Viện Công nghệ sinh học, Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ sau thu hoạch chủ yếu là phân lập, phân loại để tìm ra các chủng mới có phổ hoạt tính rộng cũng như nghiên cứu các chủng B thuringiensis ở mức độ phân

tử[3]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thurìngiensìs

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo các tài liệu về phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng của Sneath

(1986) Wistreich và Lechtman (1988), Syahly (1991) thì vi khuẩn

B thuringiensis được xếp vào nhóm ì, chi Bacillus, họ Bacillaceae, ngành Firmicutes [1]

B thurỉngiensis thuộc chi Bacillus là vi khuẩn đất, hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, kích thước tế bào từ 3 - 6

|xm, có phủ tiêm mao không dày, chuyển động được Các loài thuộc chi Bacillus có khả năng hình thành bào tử khi gặp những điều kiện bất lợi của môi trường, bào tử có dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - 2 um và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hoa chất, áp suất thẩm thấu cao Màng ngoài nằm ở ngoài cùng đó là phần sót lại của tế bào mẹ, chiếm khoảng 2 - 1 0 % khối lượng khô của bào tử Thành phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có một lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu kém Lớp áo

5

Trang 23

JCJtóa luân tứ nựhiif, ta ca si &rư<*ny 'Phút VCưnạ - &KS76X1

bào tử có cấu tạo bởi 3 - 15 lớp, chủ yếu là protein sừng Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinase, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém đối với các cation Dưới áo bào tử là vỏ bào tử v ỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7 - 10% (tính theo khối lượng khô của bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không chứa axit teicoic Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chứa nước là 70% Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng

nhân

Đặc biệt trong quá trình hình thành bào tử

vi khuẩn B thuringiensis có thể sinh ra những

tinh thể mang tính độc đối với côn trùng Tinh thể

là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 X

0,02 um có thể chiếm 25% trọng lượng khô của

tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp,

hình ovan, hình láp phương hoác có hình dang „ „

• 1 " W F 6 • * Hình 1.1: Protein tinh thể của không xác đinh Khi ở trong tế bào sinh

vi khuân B thuringiensỉs dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm

(cp: tinh thế hình lưỡng

kề nhau, khi t ế bào tan thì bào tử và tinh

tháp; cc: tinh thế hình lập thể cùng thoát ra ngoài [3]

phương; ép: bào tử)

B thuringỉensis có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoa rất giống với

các nhóm trực khuẩn sinh bào tử B cereus, B mycoides và B anthracis tuy nhiên B thuringiensis có khả năng sinh tinh thể còn loài khác thì không [3]

1.2.2 Đặc điểm sinh hoa

B thuringiensis không lên men sinh axit với arabinoza, xiloza và manitol nhưng tạo axít trong môi trường có glucoza, có khả năng thúy phân

6

Trang 25

Xítáa luận lối mihiỉp m ca ai Qnùtng <T>húe Tốựnạ - &H&XCK.1

tinh bột, khử nitrat thành nitrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizoàm B thuringiensis có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ 15-45°c, nhiệt độ tối ưu là 28- 30°c, pH = 7 B thuringiensis không có khả năng khử amin của phenilalanin, không sử dụng axít axetic, không khử muối suntìt

3 mm, giữa có một vành tròn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, hơi ánh quang, dạng hạt thô khô, sau 72 giờ đường kính có thể đạt 2 em Một số chủng

B thuringiensis xuất hiện khuẩn lạc trơn nhẵn [4]

1.2.4 Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis

Có nhiều phương pháp phân loại B thuringiensis khác nhau Khóa phân loại đầu tiên được thiết lập dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoa

[Heimpel và Angus, 1958] Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không

phân biệt được các chủng B thuringiensis một cách rõ ràng bởi vì

7

Trang 27

X/ióa tuân MỞ nụltiÌỊỊ •ạ ta JÊS Gnù/ng <TỊỊuU ỊÊỊÙỊ£ - &MS7ÍŨÍ.1

B thuringiensis có các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá rất giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử Bacillus cereus, B thuringiensis,

B mycoỉdes, B anthracis, B megaterium Mói đây phát hiện thêm 2 loài là B vveihenstephanensis và B pseudomycoides [2, 3]

Ngoài ra, người ta còn phân loại vi khuẩn B thuringiensis theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, typ huyết thanh kháng nguyên - o, theo loại hình enzym lipaza, dựa trên plasmit và phân loại theo nguồn bệnh Nhung trong cùng một chủng có sự tồn tại của các typ gen ngoại độc tố khác nhau (Sanchis và cộng sự, 1988) đã ngăn chặn việc sử dụng các đặc điểm này là cơ

sở cho khoa phân loại các chủng B thuringiensis [3, 16]

Cho đến nay, khoa phân loại vi khuẩn B thuringiensis theo phương

pháp huyết thanh được de Barjac và Bonneíoi đề nghị vào năm 1962, sau đó

được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế B thuringiensis đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu

B thuringiensis trên thế giới từ năm 1982 [3]

Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường Dưới lánh hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh của B thuringiensis [16, 24]

8

Trang 29

3Utóa luận tứ /tựhirp -ạ Ui gí GnútiÊV (phút Thúi* - &XS7GX1

Tế bào vi khuẩn Phân tử kháng

với kháng nguyên thể với 2 vị trí

bề mặt liên kết đặc hiệu Phản úng ngưng kết

Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng th ể

1.2.5 H ệ thống di truyền của vi khuẩn

1.2.5.1 Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringừnsừ

Kích thước hệ gen của vi khuẩn B thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7 triệu bp Thể nhân (nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thúy, chưa

có màng nhân nên không cố hình dạng nhất đinh, và vì vậy được gọi là vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím Đố là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa một sợi ADN xoắn kép Thể nhân chứa đựng thông túi di truyền của vi khuẩn

B thuringiensis Hầu hết các chủng B thuringiensis phân lập mang các nhân

tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng

1.2.5.2 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của BaciUus thurìngiensis

Năm 1982, Held và cộng sự đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ chữ crytal có nghĩa là tinh thể để biểu diễn gen tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các chủng B thuringiensis sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: độc tố Cry (dạng chủ yếu - tình thể độc) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau, độc tố

9

Trang 31

Otkóa luận, tết HQỈÙỊH

Cyt (độc tố phân huy tế bào) do gen cyt mã hoa, độc tố này làm tăng khả năng diệt côn trùng của độc tố Cry và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể

Các chủng B thurỉngiensis khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng hoạt tính và phổ tác dụng diệt côn trùng được quyết định bôi cấu trúc protein tinh thể

1.2.5.3 VỊ trí của các gen mã hoa protein tinh thể diệt côn trùng trong tế

đã làm cuộc điều ưa về sự có mặt của plasmid trong hầu hết các chủng B thuringiensis Những nghiên cứu của họ trên 21 loài phụ B thuringiensis cho thấy số plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của các gen tổng hợp nhiều loại độc t ố trong một tế bào B thuringiensis Ví dụ các plasmid ương

B thuringiensis var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng nằm nhiều vị trí khác nhau trong tế bào [3,15]

Sau những nghiên cứu về xác định vị trí của các gen độc tố trong tế bào

vi khuẩn, rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP của một số dưới

10

Trang 33

Xháa luận tát nghiệp fr ca Mỉ Qrưttny rpiưu 7e*Sn V - &M33CX1

loài B thuringiensis Năm 1981, Schnepí và Whitelay công bố đã tách dòng

và biểu hiện gen cry từ B thuringiensis var kustaki HD1 ương chế phẩm Dipel Họ đã biểu hiện được gen trong E coli và chỉ ra rằng chủng này có hoạt lực đối với ấu trùng Manduca sexta Tiếp theo công bố này, hàng loạt công bố

về gen mã hoa cho tiền độc tố (protoxin), đã được tách và đọc trình tự Các gen này tổng hợp protein diệt côn trùng bộ cánh vảy, hai cánh và cánh cứng Hiện nay có tới hơn 300 gen đã được tách dòng và đăng ký trên ngân hàng dữ liệu gen (gene database) [5]

1.2.5.4 Đặc điểm riêng của một số nhóm gen mã hoa protein diệt côn tràng

• Nhóm gen crylĩ gồm trên 130 gen thuộc các nhóm gen crylA-crylL

mã hoa cho các protein có khối lượng 130 kDa, tích lũy thể vùi hình lưỡng tháp và thường chỉ có hoạt tính chống lại các côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, điển hình là ấu trùng bướm ngài, côn trùng keo, côn trùng tơ Nhóm gen này được phân thành các nhóm phụ sau: crylA, crylB, cryic, crylD, crylE Trong đó nhóm gen crylA được chia thành 3 gen khác nhau: crylAa, crylAb, crylAc với hơn 80% các axit amin tương đồng

• Nhóm gen cry2: mã hóa tổng hợp protein có trọng lượng phân tử khoảng 71 kDa, tạo thể vùi hình lập phương trong đó bao gồm cry2A, cry2B

và cry2C, cả ba gen này đều mã hoa tổng hợp protein có trên dưới 633 axit amin Có độc tính đối với côn trùng bộ cánh vảy (Helỉothis virecens và Lymantri adipans), bộ 2 cánh (Aedes aegypti) Riêng gen cry2B và cry2C tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng bộ cánh vẩy

• Nhóm gen cry3: gồm 16 gen thuộc các nhóm cry3A-cry3C mã hoa cho các protein có khối lượng khoảng 73 kDa tạo tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phương, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng

• Nhóm gen cry4: gồm 8 gen thuộc nhóm cry4A - cry4B mã hoa cho cả

2 loại protein tinh thể có khối lượng 70 kDa và 130 kDa tạo tinh thể hình cầu

l i

Trang 35

Xháa luận lài nịịhiíp

và hình lập phương, có hoạt tính đối với các loài thuộc bộ 2 cánh Độc tính

của protein nhóm 4 tăng mạnh khi chúng tạo phức với protein 27 kDa do gen

cyt mã hoá

• Nhóm gen cry5: mã hoa cho protein có khối lượng 81 kDa, gây độc với côn trùng thuộc bộ cánh vảy và cánh cứng [14]

• Nhóm gen mã hoa cho độc tố Cyt: nhóm gen cyt bao gồm 2 lớp cytl

và cyt2 mã hoa tổng hợp protein 27 kDa, là thành phần chính của tinh thể, protein này có tác dụng tiêu hủy tế bào động vật không xương sống

Nhóm gen cyt thông thường tồn tại ở các chủng B thuringiensis chứa nhóm gen cry4 Nhóm gen cyt mã hoa protein có trọng lượng khoảng 27 kDa

và có trong thể vùi (chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể) Tinh thể độc này thường có tác dụng yếu với côn trùng thuộc bộ 2 cánh và giun tròn thuộc bộ

thân mềm

• Nhóm gen m ã hoa cho độc t ố Vip : gần đây người ta đã phát hiện ra một số loại protein tiết ra môi trường nuôi cấy B thuringiensis trong pha sinh trưởng, có một độc lực lớn đối với côn trùng Protein này được gọi là Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoa tổng hợp Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể

1.3 Độc tố của Bacillus thuringiensis

Ở B thuringiensis có 4 loại độc tố được sản sinh đó là:

Trang 37

XẨtóa LtÔM tứ nụkiifi

photpholipase hay lecithinase được phát hiện vào năm 1953 bởi Tumanoff ỏ vi khuẩn B thuringiensis vai elesti sản sinh ra enzym lecithinase

• Ngoại độc tốp ( f i - exotoxin)

Ngoại độc tố p là một nucleotit có trọng lượng phân tử thấp (707 - 850 kDa) có adenin, riboza, photpho với tỷ l ệ bằng nhau, còn được gọi là độc tố bền nhiệt vì vẫn còn hoạt tính sau 15 phút ở 120°c Tác động của nó là kìm hãm nucleotinase và ARN - polymerase phụ thuộc ADN, các enzym này gắn với ATP và dẫn tới việc ngừng tổng hợp ARN Ngoại độc tố p có phổ tác dụng rộng có tính độc mạnh đối với cả côn trùng bộ cánh vảy và cánh cứng, đặc biệt là đem lại hiệu quả cao trong việc phòng chống sâu non của côn trùng mẫn cảm Nó gây ra những trì trệ trong việc chuyển hoa lột xác và còn có tác động với các con trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc dưới ngưỡng gây chết Một số chủng B thuringỉensis không sinh tinh thể độc nhưng lại có thể sinh ra ngoại độc tố p Ngoài ra, ngoại độc tố p cồn có tác dụng cộng hưởng với nội độc tố 5 sau khi nội độc tố có tác dụng làm vỡ rồi phá huy hoàn toàn biểu mô ruột giữa của côn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tương và máu rồi tới các cơ quan dẫn tới việc thay đổi sinh lý làm cho ấu trùng nhanh chóng bị chết [22]

• Ngoại độc tẩy (y- exotoxin)

Ngoại độc tố Ỵ còn được gọi là độc tố tan trong nước thuộc nhóm photpholipaza, tác động lên photpholipit giải phóng ra axit béo Độc tố này có chứa các peptit với trọng lượng phân thấp và một số axit amin tự do Độc tố này tan trong nước không ổn định, mẫn cảm với ánh sáng, oxy và đặc biệt là nhiệt độ ở trên 60°c trong vòng 10 -15 phút thì bị bất hoạt

• Nội độc tố ỏ (ỏ - endotoxỉn)

Khả năng diệt côn trùng một cách đặc hiệu của chủng B thuringiensis

là do các protein tinh thể độc mà nó tạo ra

13

Trang 39

X/tóa luận lòi nghiệp

Nội độc tố ô hay còn gọi là tinh thể độc là một protein kết tinh gồm

1180 axit amin chủ yếu gồm: axit glutamic, axit asparaginic chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein Đây cũng là nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp Thêm vào đó lượng xistin nhỏ hơn 20% tổng lượng axit amin quy định sự không hoa tan của tinh thể Ngoài ra, còn có các axit amin khác như acginin, treonin Ngoài protein, tinh thể còn chứa các thành phần khác như hydrat cacbon chiếm khoảng 5,6%

Về thành phần nguyên tố của tinh thể thì ngoài các nguyên tố chính như: Ca, Mg, Si, Fe , một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, A I , Mn, Cu và hầu như không thấy có sự có mặt của nguyên tố p M ỗ i tinh thể gồm nhiều loại nội độc

tố ô cùng họ gắn vơi nhau bằng cầu nối disunfua và các liên kết kị nước Tinh thể (nội độc tố) không hòa tan toong nước và dung môi hữu cơ nhung lại có thể tan trong pH rất kiềm (pH < 12), đặc biệt khi có mặt các chất khử trong dung dịch thì tính tan của tinh thể tăng lên và có thể tan ở pH 7,9 - 9,5 Ở pH quá cao (>12) hay quá thấp tinh thể bị mất hoạt tính và mất năng lực phản ứng với tính chất là một kháng nguyên

M ỗ i một bào tử có thể có từ Ì - 3 tinh thể độc Sự tổng hợp tinh thể xảy

ra trong khoảng 3 giờ sau pha cân bằng cùng với sự hình thành bào tử Sinh tổng hợp độc tố hoàn thành trước khi bào tử chúi khoảng 2 giờ Trong khi hình thành bào tử và tinh thể, sự trao đổi chất chủ yếu dựa trên cơ sở là chuyển hoa axit amin của tế bào mẹ và protein của môi trường Ở đây, protein được sử dụng như nguồn năng lượng cacbon [17]

1.4 Sự hoạt hoa và mối quan hệ cấu trúc chức năng

Khi ấu trùng ăn phải nội độc tố delta, thể vùi tinh thể này sẽ bị hoa tan hoàn toàn trong môi trường kiềm (pH < 12) của ruột sâu thành tiền độc tố (protoxin) Trong phản ứng hoạt hoa phân huy protein tiếp theo, gần một nửa phân tử tiền độc tố bị cắt bỏ từ đầu cacbon - c (khoảng 500 axit amin), để lại

14

Định dạng
Số trang	115
Dung lượng	18,92 MB