đặc điểm đột biến gen ở trẻ rối loạn phổ tự kỷ tại bệnh viện nhi đồng 1

Đối với ngành thần kinh học, hình ảnh chụp hưởng từ giải phẫu và chức năng não phát hiện có bất thường trong cấu trúc và chức năng của não ở trẻ mắc RLPTK so với các trẻ phát triển bình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NEÁNG LI NA

ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN Ở TRẺ

RỐI LOẠN PHỔ TỰ KỶ

TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG 1

Chuyên ngành: Nhi khoa

Mã số: 60720135

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS.BS NGUYỄN ANH TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

NEÁNG LI NA

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Định nghĩa Rối loạn phổ tự kỷ (RLPTK) 3

1.2 Thuật ngữ 3

1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán Tự kỷ trẻ em và Rối loạn phát triển lan tỏa theo DSM-4-TR [10] 4

1.4 Dịch tễ học 5

1.5 Nguyên nhân do gen của RLPTK 8

1.5.1 Sự di truyền của RLPTK 8

1.5.2 Những phát hiện về gen trong RLPTK: 9

1.5.2.1 Đột biến điểm, SNVs 11

1.5.2.2 Đột biến cấu trúc ( SVs ) 13

1.6 Vai trò của yếu tố môi trường trong RLPTK 16

1.7 Các phát hiên về hình ảnh học thần kinh trong RLPTK 16

1.7.1 Bất thường Giải phẩu não giải phẫu não 17

1.8 Công cụ sàng lọc RLPTK 17

1.9 Điều trị 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Thiết kế nghiên cứu: 24

2.2 Dân số nghiên cứu: 24

2.2.1 Dân số mục tiêu: 24

2.2.2 Dân số chọn mẫu: 24

2.2.3 Tiêu chí chọn mẫu: 24

2.2.4 Cỡ mẫu: 24

2.3.1 Tại khoa Tâm lí: 24

2.3.2 Tại Viện di truyền Y học: 25

2.4 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.5 Liệt kê và định nghĩa các biến số 31

2.6 Ưu điểm và hạn chế của nghiên cứu : 31

2.7 Y đức 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Đặc điểm chung của dân số nghiên cứu 33

3.1.1 Đặc điểm theo tuổi lúc tham gia nghiên cứu 33

3.1.2 Đặc điểm theo giới tính và địa chỉ 34

3.1.3 Đặc điểm theo tuổi của cha và mẹ lúc sanh con 34

3.1.4 Đặc điểm theo học vấn của cha mẹ 35

3.1.5 Đặc điểm theo nghề nghiệp của cha mẹ 35

3.2 So sánh đặc điểm dịch tễ học theo chẩn đoán lâm sàng 36

3.3 So sánh đặc điểm dịch tễ học theo nhóm đột biến gen và không đột biến gen: 38

3.4 Kết quả giải trình tự gen 40

3.5 Đặc điểm đột biến gen theo chẩn đoán lâm sàng 41

3.6 Mô tả đột biến gen theo chẩn đoán lâm sàng 42

Chương 4 : BÀN LUẬN KẾT QUẢ 44

4.1 Đặc điểm dân số nghiên cứu 44

4.1.1 Đặc điểm dân số nghiên cứu theo tuổi lúc tham gia nghiên cứu 44

4.1.2 Đặc điểm dân số nghiên cứu theo giới 44

4.1.3 Đặc điểm dân số nghiên cứu theo nghề nghiệp và học vấn của cha mẹ 46

4.1.4 Đặc điếm dân số nghiên cứu theo tuổi lúc sinh con của cha mẹ 46

4.2 Đặc điểm gen đột biến 46

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 : PHIẾU ĐỒNG THUẬN

PHỤ LỤC 2 : DANH SÁCH BỆNH NHÂN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

***

TIẾNG ANH

Manual of Mental Disorder

Sổ tay thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần DSM-4-TR Diagnostic and Statistical

Manual of mental disorder-4thedition- Text Revise

Sổ tay thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần -xuất bản lần thứ tƣ-bản sữa

Manual of Mental Disorder- 5thedition

Sổ tay thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần -xuất bản lần thứ năm

Association

Hội tâm thần Mỹ

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

ICD International Classification of

Diseases

Phân loại bệnh quốc tế

CDC Centers for Disease Control and

disoorder- not otherwise specific

Rối loạn phát triển lan tỏa không phân loại khác PDD Pervasive developmental delay Rối loạn phát triển lan tỏa

sPDD Specific Pervasive

developmental delay

Rối loạn phát triển lan tỏa đặc hiệu

Sporadic mutation

De novo mutation

Đột biến tự phát Đột biến mới

WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ gen

Dominant de novo coding variations

Đột biến mất tính năng Đột biến mới di truyền theo kiểu gen trội

complete knockout Đột biến hoàn toàn mát

tính năng

a homozygous state Trạng thái đồng hợp tử

a compound heterozygous state Trạng thái dị họp tử

ROH Runs of homozigosity Vùng đồng dạng

MECP2

CHD8

ATRX

EN2 NAA10 NSD1

BCORL1 GABRA2

PRRT2

NHS DEAF1

ANKRD11

aD

aR

XR

Methyl-Cpg Binding Protein2

Chromodomain Helicase Binding Protein 8

Dna-Alpha-Thalassemia/Mental Retardation Syndrome, X-Linked

Engrailed 2 N-Alpha-Acetyltransferase 10 Nuclear Receptor-Binding Set Domain Protein 1

Bcl6 Corepressor-Like 1 Gamma-Aminobutyric Acid Receptor, Alpha-2;

Proline-Rich Transmembrane Protein 2

Nance-Horan syndrome

Autoregulatory Factor 1 Ankyrin Repeat Domain-Containing Protein 11

Gen BCORL1 Gen GABRA2

Gen PRRT2

Gen NHS Gen DEAF1

Gen ANKRD11

Nhiễm sắc thể thường kiểu gen trội

Nhiễm sác thể thường kiểu gen lặn

Nhiễm sắc thể X kiểu gen lặn

Nhiễm sắc thể X kiểu gen

SNP Single nucleotide Polymorphism

RLPTK

trẻ mắc RLPTK

Lệch khung Nhiễm sắc thể

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tỉ lệ mắc chung của RLPTK và phân bố theo giới tính 7

Bảng1.2 Phân bố của tỉ lệ mắc theo sắc tộc và chủng tộc 7

Bảng 2.1 Danh sách các gen mục tiêu giải trình tự gen 27

Bảng 2.2 Bảng liệt kê và định nghĩa các biến số 31

Bảng 3.1: Phân bố theo tuổi lúc tham gia nghiên cứu 33

Bảng 3.2: Phân bố theo giới tính và địa chỉ 34

Bảng 3.3 Tuổi của cha mẹ lúc sanh con 34

Bảng 3.4 Học vấn của cha mẹ 35

Bảng 3.5 Đặc điểm theo nghề nghiệp của cha mẹ 35

Bảng 3.6 So sánh đặc điểm dịch tễ học theo chẩn đoán lâm sàng 36

Bảng 3.7 Đặc điểm dịch tễ học nhóm đột biến gen và không đột biến gen 38

Bảng 3.8 Kết quả giả trình tự gen 40

Bảng 3.9 Đột biến gen theo chẩn đoán lâm sàng 41

Bảng 3.10 Mô tả đột biến gen theo chẩn đoán lâm sàng 42

Bảng 4.1 Đặc diểm gen đột biến 46

Đặc điểm dịch tễ học giữa 2 nhóm có đột biến gen và không có đột biến gen có đặc điểm sau: 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tỉ lệ mắc RLPTK liên tục tăng trong giai đoạn 1992-2007 8Hình 1.2 Tỉ lệ tái phát RLPTK trong gia đình phân bố theo giới tính 9Hình 1.3 Các kiểu đột biến và di truyền trong RLPTK 10Hình 1.4 Tác động của các đột biến đơn gen và đa gen đối với nguy cơ gây

RLPTK 10Hình 1.5 Ƣớc tính sự di truyền của đột biến dạng phổ biến trên mỗi nhiễm sắc thể 13Hình 1.6 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể làm mất hoặc nhân đôi một đoạn nhiễm sắc thể 13

Hình 1.7 (a) tỉ lệ CNVs có chứa những gen có liên quan đến RLPTK có hay không

có Khuyết tật trí tuệ kèm theo và các đơn gen của RLPTK (b) Tỉ lệ gen trong

CNVs có trùng lấp gữa nhóm bệnh và nhóm chứng 15Hình 1.8 So sánh CNVs giữa nhóm RLPTK với nhóm chậm phát triển và nhóm

chứng 15Hình 1.9 các kĩ thuật hình ảnh dùng trong nghiên cứu về RLPTK 16Hình 1.10 Não phát triển vƣợt mức ở trẻ RLPTK 17

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ giải trình tự gen 29

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 30

Trên thế giới hai ngành thần kinh học và di truyền học tich cực nghiên cứu

về RLPTK và đã đem lại nhiều hiểu biết về RLPTK Đối với ngành thần kinh học, hình ảnh chụp hưởng từ giải phẫu và chức năng não phát hiện có bất thường trong cấu trúc và chức năng của não ở trẻ mắc RLPTK so với các trẻ phát triển bình thường, như bất thường về thể tích chất trắng và chất xám trong não, phát triển bất thường của não cụ thể não phát triển vượt mức bình thường trong giai đoạn sớm sau đó phát triển chậm lại hoặc ngưng phát triển [4, 5] Đối với ngành di truyền học, nhiều nghiên cứu về gia đình và cặp song sinh cho thấy RLPTK có tính di truyền cao, cùng với các kĩ thuật hiện đại về công nghệ phân tử như giải trình tự gen thế hệ mới, giải trình tự toàn bộ bộ gen (GWS), giải trình tự toàn bộ gen mã hóa protein (WES) cho thấy vai trò của gen trong nguyên nhân gây ra RLPTK [6, 7]

Ở Việt Nam nghiên cứu về gen của RLPTK gần đây được quan tâm đến [8] tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu do khó khăn về mặt kỹ thuật Nay chúng tôi

có cơ hội làm giải trình tự gen (WES) nên tiến hành nghiên cứu trên các trẻ RLPTK tại bệnh viện Nhi Đồng 1 nhằm trả lời câu hỏi sau:

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Đặc điểm đột biến gen ở trẻ mắc RLPTK tại bệnh viện Nhi đồng 1 là nhƣ thế nào ?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Trên các trẻ RLPTK tại bệnh viện Nhi Đồng 1, chúng tôi tiến hành:

1 Mô tả đặc điểm dịch tễ học của trẻ RLPTK trong nhóm nghiên cứu

2 Xác định tỉ lệ có đột biến gen ở trẻ RLPTK

3 So sánh các đặc điểm của các phân nhóm TKTE và RLPTLT, và 2 nhóm có đột biến gen và nhóm không có đột biến gen

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Định nghĩa Rối loạn phổ tự kỷ (RLPTK)

RLPT là một khuyết tật về sự phát triển của thần kinh,đặc trưng bởi sự thiếu hụt trong giao tiếp xã hội, tương tác xã hội và; các hành vi, cử chỉ, sở thích

có tính hạn chế và lập lại, có từ hai dấu hiệu trở lên trong các biểu hiện sau:[1]

1 Lập lại hành động hoặc lời nói

2 Kiên định với sự không thay đổi, sự giống hệt

3 Những sở thích rất hạn chế, cố định

4 Tăng hoặc giảm đáp ứng với các kích thích cảm giác

Các triệu chứng xuất hiện trong giai đoạn sớm của sự phát triển, nhưng có thể không bộc lộ rõ ràng cho đến khi nhu cầu của xã hội vượt khả năng bị hạn chế của trẻ, vì vậy không có ngưỡng tuổi được xác định

Các triệu chứng này không giải thích được bởi Khuyết tật trí tuệ (ID), Chậm phát triển toàn thể(GDD)

Độ nặng của triệu chứng được đánh giá trên từng lĩnh vực (thiếu tương tác và giao tiếp xã hội; và nhũng hành vi có tính hạn chế, dập khuôn) Có 3 mức độ :

 Mức độ 1: cần hổ trợ

 Mức độ 2: cần hổ trợ đáng kể

 Mức độ 3: cần hổ trợ rất đáng kể

Tử “phổ” thể hiện tính đa dạng của biểu hiện lâm sàng cũng như tính liên tục trong

độ nặng của triệu chứng dao động từ cực tiểu đến cực đại

Thuật ngữ

Sổ tay thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần (DSM) của Hội Tâm thần

Mỹ (APA), xuất bản lần thứ 5, năm 2013 RLPTK mã hóa : 299.00 (F84.0) được dùng là một thuật ngữ duy nhất để mô tả các rối loạn về phát triển thần kinh có đặc trưng suy giảm trong tương tác và giao tiếp xã hội và những hành vi dập khuôn RLPTK bao phủ các chẩn đoán: Rối loạn tự kỷ (AD), Rối loạn phát triển lan tỏa không phân loại khác(PDD-NOS) và Hội chứng Asperger của DSM-4, năm 1994

Phân loại bệnh quốc tế (ICD) của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) lần thứ 10 năm 1992 Rối loạn phát triển lan tỏa (PDD) mã hóa F84 được chia thành 8 nhóm, gồm[9]

1) Tự kỷ trẻ em (F84.0)

2) Tự kỷ không điển hình (F84.1)

3) Hội chứng Rett (F84.2)

4) Rối loạn phát triển tan rã khác ở trẻ em (F84.3)

5) Rối loạn tăng động kèm theo chậm phát triển tâm thần và cử động dập khuôn (F84.4)

6) Hội chứng Asperger (F84.5)

7) Rối loạn phát triển lan tỏa khác (F84.8)

8) Rối loạn phát triển lan tỏa không đặc hiệu (F84.9)

Tiêu chuẩn chẩn đoán Tự kỷ trẻ em và Rối loạn phát triển lan tỏa theo 4-TR [10]

DSM- Tiêu chuẩn chẩn đoán Tự kỷ trẻ em :

A Có tổng cộng 6 (hoặc hơn) dấu hiệu từ các mục (1), (2), và (3) Trong đó có ít nhất

2 dấu hiệu trong mục (1), và ít nhất một dấu hiệu trong mỗi mục (2) và (3)

(1) Thiếu hụt tương tác xã hội, biểu hiện bởi ít nhất 2 trong các dấu hiệu sau:

 Thiếu hụt rõ ràng việc sử dụng ngôn ngữ không lời (ngôn ngữ cơ thể) ví dụ như: không tiếp xúc mắt, không diễn đạt bằng nét mặt, không dùng tư thế hay điệu bộ trong tương tác xã hội

 Thất bại trong việc phát triển mối quan hệ đồng lứa tương xứng với mức phát riển của trẻ

 Thiếu sự phấn khích, tự phát trong việc chia sẽ niềm vui, sở thích, thành tựu của mình với người khác ví dụ như không bày tỏ, chạm hay chỉ vào món đồ mình yêu thích

 Thiếu sự tương tác qua lại trong tương tác xã hội và trong tương tác cảm xúc (2) Thiếu hụt trong giao tiếp xã hội, bộc lộ bởi ít nhất 1 trong các dấu hiệu sau:

 Chậm nói hoặc hoàn toàn không phát triển được lời nói kèm theo không có sự bù trừ trong giao tiếp bằng ngôn ngữ không lời (ví dụ như điệu bộ hay cử chỉ của cơ

 Đối với những cá nhân phát triển được lời nói, suy giảm rõ trong khả năng khởi đầu hoặc duy trì một cuộc trò chuyện với người khác

 Sử dụng ngôn ngữ lập lại, dập khuôn hoặc ngôn ngữ cá biệt của trẻ

 Không chơi được trò chơi giả vờ hoặc trò chơi bắt trước phù hợp với mức phát triển của trẻ

(3) Những hành vi, cử chỉ, sở thích có tính lập lại , hạn chế thể hiện ít nhất 1 trong các dấu hiệu sau:

 Bị cuốn hút bởi sở thích theo một hoặc vài kiểu dập khuôn nhất định, mà bất thường trong cả mức độ quan tâm hay độ tập trung đến sở thích đó

 Gắn chặt với nhũng thói quen hay nghi thức riêng biệt hay không có tính năng

 Các kiểu cử đông có tính dập khuôn , lập lại (ví dụ vỗ bàn tay hoặc các ngón tay, xoay bàn tay hoặc các ngón tay, hoặc những cử động phức tạp của toàn cơ thể)

 Bị cuốn hút bởi các bộ phận của đồ vật

B Chậm hoặc bất thường về chức năng trong ít nhất 1 trong các lĩnh vực sau và khởi phát trước 3 tuổi: (1) giao tiếp xã hội, (2) ngôn ngữ trong giao tiếp xã hội , hoặc (3) chơi tượng trưng hoặc tưởng tượng

C Những dấu hiệu này không giải thích được bởi Hội chứng Rett hoặc Rối loạn phát triển tan rã ở trẻ em

 Tiêu chuẩn chẩn đoán Rối loạn phát triển lan tỏa không đặc hiệu khác:

Phân nhóm này được chẩn đoán khi có sự thiếu hụt nghiêm trọng và lan tỏa trong (1) sự tương tác qua lại trong xã hội, (2) các kĩ năng giao tiếp bằng lời và không bằng lời; hoặc khi có những hành vi, cử chỉ , sở thích mang tính dập khuôn , lập lại nhưng không thỏa mãn tiêu chí chẩn đoán Rối loạn phát triển lan tỏa đặc hiệu (sPDD), Tâm thần phân liệt, Rối loạn nhân cách phân liệt, Rối loạn nhân cách trốn tránh Ví dụ: phân nhóm này bao gồm Tự kỷ không điển hình- có biểu hiện lâm sàng không thỏa mãn tiêu chuẩn chẩn đoán Tự kỷ trẻ em do tuổi khởi phát muộn, triệu chứng không điển hình hoặc dưới ngưỡng, hoặc bao gồm tất cả những điều này

Dịch tễ học

Tỉ lệ mắc của RLPTK:

Mạng lưới Giám sát Tự kỷ và Khuyết tật phát triển (ADDM) thực hiện bởi CDC năm 2016 khảo sát gồm 3.981 trẻ 8 tuổi thuộc 11 tiểu bang của Mỹ Cuộc điều tra đước tiến hành qua 2 bước Bước 1: Xác định các ca bệnh, nhân viên của ADDM tiến hành điều tra các hồ sơ ghi chép, bệnh án từ nhiều nguồn trong cộng đồng, gồm các dịch vụ y tế, phòng khám, trường học, các cơ sở cung cấp can thiệp trị liệu … nếu ghi nhận có ca RLPTK sẽ yêu cầu cung cấp thêm các thông tin

và các đánh giá khác của trẻ như chỉ số thông minh … rồi tóm tắt và ghi chép lại Bước 2: Các bác sĩ chuyên môn dựa theo các tóm tắt và ghi chép để định nghĩa ca bệnh RLPTK theo tiêu chuẩn của DSM-5[3]

Tỉ lệ mắc của RLPTK liên tục tăng theo thời gian (hình 1.1), tỉ lệ mắc ước tính vào cuối những năm 1990 là 0.5 trên 1.000 trẻ [13, 14] Các nghiên cứu phân tích tổng hợp về dịch tễ học cho thấy thay đổi định nghĩa ca bệnh và tăng cảnh giác về bệnh góp phần chủ yếu trong nguyên nhân tỉ lệ mắc của RLPTK tăng [15, 16] Vai trò của các yếu tố khác gồm: phát hiện sớm bệnh, sự có sẵn của các dịch

vụ phát triển chuyên biêt, dùng các thay thế chẩn đoán ( tăng tỉ lệ mắc của RLPTK kèm theo giảm tỉ lệ mắc của các chẩn đoán khác : khuyết tật phát triển, rối loạn học tập ( LD), rối loạn phát triển ngôn ngữ , và tăng thực sự tỉ lệ mắc của RLPTK [17, 18]

Tỉ lệ mắc RLPTK ở Việt Nam năm 2017 theo tác giả Hoàng Văn Minh là 0.752 %[19]

Bảng 1.1 Tỉ lệ mắc chung của RLPTK và phân bố theo giới tính

Bảng1.2 Phân bố của tỉ lệ mắc theo sắc tộc và chủng tộc

Hình 1.1 Tỉ lệ mắc RLPTK liên tục tăng trong giai đoạn 1992-2007

Nguyên nhân do gen của RLPTK

Cơ chế sinh bệnh của RLPTK chưa được hiểu rõ Có giả thuyết ủng hộ RLPTK là do sự tương tác của 2 yếu tố gen và môi trường [14, 20]

RLPTK trong dân số chung[21]

Tỉ lệ tái phát RLPTK trong gia đình: Nếu trẻ lớn trong gia đình bị RLPTK là trai thì tỉ lệ tái phát ở các trẻ nhỏ trong gia đình lần lượt là 4.2% (95% CI, 3.8%-

4.7%) đối với trẻ gái và 12.9% (95% CI, 12.2%-13.6%) đối với trẻ trai Ngược lại

nếu trẻ lớn trong gia đình bị RLPTK là trẻ gái thì tỉ lệ tái phát ở các trẻ nhỏ trong

gia đình là 7.6% (95% CI, 6.5%-8.9%) đối với trẻ gái và 16.7% (95% CI, 18.4%) đối với trẻ trai [22] (hình 1.2)

15.2%-Sự di truyền của RLPTK là 50% [23]

Hình 1.2 Tỉ lệ tái phát RLPTK trong gia đình phân bố theo giới tính

1.5.2 Những phát hiện về gen trong RLPTK:

Đột biến gen trong RLPTK xảy ra ở cấp độ đột biến điểm (SNVs) làm thay đổi một nucleotide trong gen, đến đột biến cấu trúc của nhiễm săc thể (SVs) làm thay đổi cấu trúc của nhiễm săc thể với thăng bằng – BCRs hoặc mất thăng bằng- CNVs trong cấu trúc của nhiễm sắc thể Kiểu di truyền bao gồm thụ hưởng từ cha

mẹ hoặc tự phát , đột biến tự phát xảy ra trong quá trình giảm phân tạo giao tử [24, 25] (hình 1.3) Trog tất cả các trường hợp RLPTK có phát hiện đột biến gen, nguyên nhân do gen của RLPTK có thể chia làm nguyên nhân đơn gen bao gồm các gen mục tiêu của RLPTK trong nhóm RLPTK có hội chứng kèm theo và các đột biến điểm dạng hiếm; và nguyên nhân đa gen : vai trò của các đột biến dạng phổ biến Đối với nguy cơ gây RLPTK, các đơn gen đột biến có tác động mạnh hoặc trung bình ( gây RLPTK hoặc có khả năng gây RLPTK) các đa gen đột biến

có tác động yếu và tích lũy [26, 27]( hình 1.4)

Hình 1.3 Các kiểu đột biến và di truyền trong RLPTK

Hình 1.4 Tác động của các đột biến đơn gen và đa gen đối với nguy cơ gây

RLPTK

 Đột biến dạng hiếm: gồm đột biến làm mất chức năng của gen và đột biến mới di

truyền theo kiểu gen trội

 Đột biến làm mất chức năng của gen (LoF), di truyền theo kiểu gen lặn

Ở người khoẻ mạnh ước tính có khoảng 100 đột biến lặn kiểu gen dị hợp trong mỗi bộ gen , khi hội tụ lại sẽ dấn tới đột biến mất chúc năng của gen mang alleles đó [28] Giả thuyết cho kiểu di truyền theo kiểu gen lặn của RLPTK là ,một vài trường hợp RLPTK có khả năng có sự kết hợp của của 2 alleles bị đột biến mất chức năng trên gen dẫn đến hoàn toàn mất tính năng (complete knockout ) của gen

đó Cơ chế là do thụ hưởng 2 alleles giống nhau bị đột biến mất chức năng- trạng thái đồng hợp tử , hoặc do thụ hưởng 2 alleles khác nhau bị đột biến mất chức năng- trạng thái dị hợp , hoặc chỉ có một allele bị đột biến mất chúc năng của gen nằm trên nhiễm sắc thể X ở trẻ trai- trạng thái bán hợp Trong gia đình có cha mẹ

có quan hệ gần huyết thống tăng khả năng xảy ra trường hợp gen nhận 2 alleles bị đột biến mất chức năng từ đó làm hoàn toàn mất chức năng của gen đó Vì trong

bộ gen của cha mẹ có chung huyết thống có nhũng vùng trên bộ gen giống nhau giữa cha và mẹ, vùng này gọi là vùng đồng dạng-ROH Một nghiên cứu năm 2013, [29] tiến hành nghiên cứu vai trò của vùng đồng dạng trong gia đình gần huyết thống có nhiều trẻ mắc RLPTK phát hện có 2 gen AMT và PEX7 bị đột biến mất tính năng bán phần, nếu bị đột biến làm mất hoàn toàn tính năng của 2 gen gây ra kiểu hình nặng hơn của rối loạn phát triển

 Đột biến mới di truyền theo kiểu gen trội

Đột biến mới của RLPTK là đột biến gen tìm thấy ở trẻ mắc RLPTK có cha

mẹ và anh em không mắc RLPTK Đột biến tự phát tuy không do thụ hưởng từ cha

mẹ nhưng có góp phần ước tính sự di truyền của RLPTK bởi vì trong các trường hợp trẻ song sinh cùng trứng thường cùng mang gen đột biến mới Các nghiên cứu

về đột biến gen mới dùng WES cho bộ ba cha mẹ và trẻ phát hiện có mối quan hệ

giữa cha mẹ tuổi cao và tần số xuất hiện đột biến gen mới ở các con bao gồm trẻ mắc RLPTK và trẻ không mắc RLPTK, trong đó các gen có đột biến mới nằm chủ yếu trên nhiễm sắc thể X của cha [30-32] Sự khác biệt của dột biến mới giữa trẻ mắc RLPTK và anh em không mắc RLPTK là chức năng của kiểu đột biến mới Đối với trẻ mắc RLPTK ,đột biến mới ở cấp độ đột biến điểm phổ biến nhất là đột biến sai nghĩa và đột biến vô nghĩa.[30, 32, 33] Năm 2014 một nghiên cứu tìm thấy có 22 gen đột biến mới ở các trẻ mắc RLPTK và 107 gen khác xuất hiện hơn 5% các trường hợp mắc RLPTK Những gen này mã hóa các protein cần cho việc tạo thành các synape thần kinh, điều hòa dịch mã RNA, điều hòa chromatin,… [34]

 Các đột biến đơn gen trong RLPTK còn gọi là nguyên nhân đơn gen của RLPTK chiếm khoảng 5 % trong tất cả các trường hợp RLPTK có phát hiên đột biến gen

 Trước khi có WES, những nghiên cứu khởi đầu tìm đơn gen đột biến chủ yếu tập trung vào RLPTK nằm trong nhóm hội chứng Cụ thể gen fragile X mental retardation 1(FMR1) trong hội chứng nhiễm sắc thể X yếu [35] ; gen methyl-CpG binding protein 2 (MECP2) trong Hội chúng Rett [36] [37]

Hình 1.5 Ƣớc tính sự di truyền của đột biến dạng phổ biến trên mỗi nhiễm sắc thể

1.5.2.2 Đột biến cấu trúc ( SVs )

Đột biến cấu trúc gồm: đột biến cấu trúc mất cân bằng trong nhiễm sắc thể,

là đột biến làm mất hoặc thêm một đoạn gen trên nhiễm sắc thể (CNVs) ( hình1.5); và đột biến cấu trúc thăng bằng nhiễm sắc thể, là đột biến trong cấu trúc của nhiễm sắc thể nhƣng không làm mất hoặc thêm đoạn gen trên nhiễm sắc thể (BCRs)

Hình 1.6 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể làm mất hoặc nhân đôi một đoạn

nhiễm sắc thể

 Đột biến cấu trúc làm mất thăng bằng nhiễm sắc thể CNVs

CNVs là một dạng của đột biến tự phát ở cấp độ cấu trúc của nhiễm sắc thể Đột biến cấu trúc làm mất thăng bằng nhiễm sắc thể trong RLPTK có 2 dạng lập lại (điểm gãy điều hòa bởi NAHR) và không lập lại (điểm gãy không điều hòa bởi NAHR)

Đột biến mới CNVs có vai trò quan trọng trong nguyên nhân do gen của RLPTK vì nhiều nghiên cứu so sánh tần xuất của CNVs giữa nhóm RLPTK và nhóm không RLPTK cho thấy CNVs nhiều gấp 2–5 lần ở nhóm bệnh so với nhóm chứng [44, 45] Nghiên cứu với dân số quy mô lớn tìm thấy 8 vùng thuộc kiểu lập lại CNVs có nguy cơ làm tăng khả năng mắc RLPTK (1q21.1, 2p16, 3q29, 7q11.23, 16p11.2, 15q11.2–13, 22q11.2, và 22q13.33 [45] Đặc biệt là vùng 16p.11.2 là một trong những lập lại CNVs có tần suất cao nhất trong nhóm RLPTK (0,025% là đột biến xóa 1 đoạn nhiễm sắc thể và 0,015% là đột biến nhân đôi 1 đoạn nhiễm sắc thể) Tuy nhiên, đột biến vùng này nếu ở dạng xóa cấu trúc thường có kiểu hình lâm sàng gồm RLPTK kèm theo Chậm phát triển, nếu ở dạng nhân đôi thường có kiểu hình lâm sàng là tâm thần phân liệt Ngoài ra còn các loci nằm rải rác trong bộ gen có nguy cơ cao đối với RLPTK[46] Các CNVs không lập lại được phát hiện gồm: 9q34.3 [47], 2 q23.1[48], 1 q21[49], 16q24.2 [49] Có

sự trùng lắp các đơn gen gây LPTK trong CNVs: MBD5 trong 2q23.1[50], CHD1L trong 1q21.1 và ACACA trong 17p21 [51] ( Hình 1.7) và ( Hình 1.8)

Hình 1.7 (a) tỉ lệ CNVs có chứa những gen có liên quan đến RLPTK có hay không

có Khuyết tật trí tuệ kèm theo và các đơn gen của RLPTK (b) Tỉ lệ gen trong

CNVs có trùng lấp gữa nhóm bệnh và nhóm chứng

Hình 1.8 So sánh CNVs giữa nhóm RLPTK với nhóm chậm phát triển và nhóm

chứng

 Đột biến cấu trúc thăng bằng nhiễm sắc thể (BCRs): cũng là đột biến tự phát ở

cấp độ đột biến cấu trúc, bao gồm các dạng: chuyển vị, đảo vị trong mỗi sự kiện tại điểm cắt có thể gây tổn hại đến 1 hoặc nhiều hơn gen

Vai trò của yếu tố môi trường trong RLPTK

Ô nhiễm không khí làm tăng nguy cơ mắc RLPTK Một nghiên cứu phân tích tổng hợp gồm 23 nghiên cứu cho thấy người mẹ lúc mang thai tăng tiếp xúc với không khí bị ô nhiễm làm tăng nguy cơ sinh con mắc RLPTK , tuy nhiên kết luận này không hằng định đối với mỗi loại khí ô nhiễm [52]

Các yếu tố sản khoa (mẹ béo phì, tiểu đường, tuổi cao, ) và biến chứng lúc sinh (sinh mổ, sang chấn lúc sinh, ngạt, …) đều làm tăng nguy cơ mắc RLPTK [53]

Các phát hiên về hình ảnh học thần kinh trong RLPTK

Hình ảnh học thần kinh được dùng để nghiên cứu giải phẫu và chức năng của não trong RLPTK gồm: (xem hình 1.9)

Khảo sát giải phẩu não gồm: hình ảnh cộng hưởng từ giải phẫu não(sMRI), chụp cộng hưởng từ khuếch tán ( difusion MRI) PET và SPECT dùng để đánh giá giải phẫu não ở cấp độ phân tử

Đánh giá chức năng não gồm : hình ảnh cộng hưởng từ chức năng não (fMRI), điện lý học (EEG)

1.7.1 Bất thường Giải phẩu não giải phẫu não

Hình ảnh chụp cộng hưởng từ giải phẩu não:

Các nghiên cứu về hình ảnh giải phẫu học của não ở nhóm trẻ RLPTK so với nhóm trẻ phát triển bình thường phát hiện các bất thường sau:

Trẻ RLPTK có não phát triển bất thường, não phát triển vượt mức trong giai đoạn sơ sinh và nhũ nhi sau đó phát triển chậm hoặc giảm phát triển.[54] (xem hình 1.10)

Bất thường trong thể tích của tiểu não [55] Sinh thiết tiểu não cho thấy giảm thể tích các tế bào Purkinnje [56]

Tăng hoặc giảm thể tích trong cấu trúc hệ viền [57]

Bất thường thể tích chất trắng và chất xám [58]

Giảm thể tích vỏ não ở thùy trán , thùy thái dương, thùy chẩm [59]

Hình 1.10 Não phát triển vượt mức ở trẻ RLPTK Hình ảnh chụp cộng hưởng từ khuếch tán trong RLPTK:

Giảm độ khuếch tán ở thể chai, thùy trán.[60], rãnh não dọc trước bên phải [61]

Công cụ sàng lọc RLPTK

Chỉ định sàng lọc RLPTK:

- Trẻ bị chậm so với mốc phát triển bình thường trong lĩnh vực ngôn ngữ hoặc giao tiếp

- Trẻ bị thoái lui trong kĩ năng ngôn ngữ hoặc xã hội

- Trẻ có cha mẹ lo lắng bị RLPTK tại bất kỳ tuổi nào

- Theo American Academy of Pediatrics (AAP) và CDC, sàng lọc RLPTK cho tất cả các trẻ từ 18- 24 tháng tuổi vì đây là giai đoạn thiết yếu để phát triển sớm kĩ năng ngôn ngữ và xã hội, và có hiệu quả hơn khi được can thiệp sớm

- Các nhóm chuyên gia khác không có khuyến cáo đặc biệt về sàng lọc riêng biệt RLPTK mà kết hợp vào sàng lọc về phát triển và hành vi chung

CÔNG CỤ SÀNG LỌC RLPTK CHO TRẺ DƯỚI 3 TUỔI:

M-CHAT-R/F (Modified Checklist for Autism in Toddlers, Revised with Up): Dùng cho trẻ 15-30 tháng, (xem các dấu hiệu và triệu chứng sớm của trẻ RLPTK) Gồm 2 giai đoạn, giai đoạn 1 là 1 bảng câu hỏi gồm 20 mục trả lới có hay không bởi cha mẹ của trẻ; giai đoạn 2 là 1 bảng câu hỏi về theo dõi , đánh giá bởi bác sĩ chuyên môn Độ nhạy:85%, Độ đặc hiệu: 99% Kết quả đánh giá từ giai đoạn 1 dùng để xếp loại nguy cơ và tái khám theo dõi, cụ thể:[62]

Follow 0Follow 2 điểm: nguy cơ thấp, không cần tái khám để theo dõi trừ khi có yếu tố nguy cơ khác

- 3-7 điểm: nguy cơ trung bình, chỉ định đánh giá giai đoạn 2 Nếu kết quả gia đoạn 2 từ 2 điểm trở lên lập tức chuyển bé đến khám chẩn đoán RLPTK và can thiệp sớm

- 8-20 điểm: nguy cơ cao lập tức chuyển đến khám chẩn đoán và can thiệp

- Cha/mẹ lo lắng trẻ thiếu kĩ năng xã hội

- Cha mẹ lo lằng trẻ thiếu kĩ năng ngôn ngữ, và hành vi

- Cha/mẹ lo lắng biểu hiện của trẻ: trẻ hay giận giữ hoặc không chấp nhận sự thay đổi

- Chậm phát triển ngôn ngữ và các kĩ năng tương tác và giao tiếp xã hội:

- Khi gọi tên trẻ kém đáp ứng lúc 12 tháng

- Không chỉ, hay ra cử chỉ điệu bộ thể hiện sự yêu thích ( ví dụ không chỉ và máy bay khi thấy máy bay bay) lúc 14 tháng tuổi

- Không chơi giả vờ ( cho búp bê ăn) lúc 18 tháng tuổi

- Tránh tiếp xúc mắt, thích ở một mình

- Khó khăn trong việc hiểu cảm xúc của người khác hoặc bày tỏ cảm xúc của mình

- Nhạy lời

- Trả lời không phù họp khi bị hỏi

- Trở nên buồn khi có thây đổi nhỏ

- Có sụ thích thú quá mức

- Vỗ tay, đung đưa cơ thể, hoặc xoay vòng tròn

- Có phản ứng bất thường đối với âm thanh, mùi, vị, hình ảnh hay cảm xúc STAT (Screening Tool for Autism in Toddlers and Young Children) dùng cho trẻ từ 24-36 tháng, là công cụ được thiết kế dùng trong sàng lọc thứ cấp STAT là

1 tiết mục dài 20 phút gồm 12 hoạt động trong 4 lĩnh vực: Chơi (2 hoạt động), yêu cầu (2 hoạt động), định hướng chú ý (4 hoạt động), hoạt động bắt chước (4 hoạt động)[63] Mỗi lĩnh vực được chấm điểm tương ứng hoạt động bé không thực hiện được Độ nhảy cảm là 92-95%, độ dặc hiệu là 73-85% tùy theo ngưỡng điểm được dùng[64] Người sử dụng STAT dòi hỏi phải được đào tạo

ITC (Infant-Toddler Checklist) là 1 bộ câu hỏi gồm 24 mục dùng cho trẻ 6 đến

24 tháng để tầm soát chậm kĩ năng giao tiếp Độ nhạy cảm và đặc hiệu của ITC đối với RLPTK là 88,9%.[65]

POSI (Parent's Observations of Social Interactions), công cụ sàng lọc sơ cấp dùng cho trẻ 16-35 tháng Độ nhạy cảm và độ dặc hiệu tương ứng là 83% và 75% [66]

CÔNG CỤ SÀNG LỌC RLPTK CHO TRẺ TRƯỚC TUỔI ĐI HỌC VÀ TRẺ TUỔI ĐI HỌC:

SCQ (Social Communication Questionnaire) trướu đây gọi là ASQ (Autism Screening Questionnaire) là một phần của ADI-R (Autism Diagnostic Interview – Revised), dùng trong nghiên cứu Gồm 40 câu hỏi trả lời có / không bởi cha/mẹ trẻ Gồm 2 mẫu cho trẻ dưới 6 tuổi và từ 6 tuổi trở lên Độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 85% và 75% [67]

ASSQ ( the high functioning Autism Spectrum Screening Questionnaire) dùng sàng lọc Hội chứng Asperger ở trẻ 7-16 tuổi Đô nhạy và độ đặc hiệu thay đổi theo ngưỡng điểm được chọn, ngưỡng điểm cao làm tăng độ nhảy cảm và giảm

độ dặc hiệu [68]

AQ ( Autism Spectrum Quotient) là bộ câu hỏi tự đánh giá dành người trưởng thành có trí tuệ bình thường, gồm 50 câu hỏi sđánh giá kĩ năng xã hội, sụ chú ý, kĩ năng giao tiếp, và kĩ năng tưởng tượng[69]

CÔNG CỤ SÀNG LỌC DÙNG CO TRẺ KHUYẾT TẬT TRÍ TUỆ

DBC-ASA (The developmental behaviour checklist-autism screening algoritm), dùng để đánh giá bất thường về hành vi và cảm xúc của trẻ khuyết tật trí tuệ từ 4-

18 tuổi , đánh giá bởi cha/mẹ của trẻ Độ nhạy và độ đặc hiệu là 86% và 69% [70]

DBC-ES (The developmental behaviour checklist- early screen) sàng lọc RLPTK cho trẻ chậm phát triển tuổi từ 18-48 tháng[71]

Điều trị

Cách tiếp cận:

Can thiệp tích cực trên từng các nhân các lĩn vực hành vi, giáo dục , tâm lí

là biện pháp điều trị hiệu quả nhất trong RLPTK Học viện nhi khoa Mỹ (AAP) khuyến cáo có chỉ định can thiệp sớm cho tât cả trẻ có dấu hiệu hoặc triệu chứng sớm của RLPTK [72] Phát hiện sớm và can thiệp tích cực sớm có tiên lượng tích cực [73, 74] Tháng 12, năm 2015 nhóm chuyên gia đưa ra đồng thuận cho trẻ RLPTK và trẻ khuyết tật trí tuệ được diều trị tại đơn vị tâm thần [75]

Giáo dục chuyên biệt là tâm điểm trong điều trị RLPTK:

Giáo dục đặc biệt tích cực cho từng cá nhân trẻ bởi các giáo viên có kinh nghiệm dạy cho các trẻ RLPTK, tích cực can thiệp hành vi có chỉ định cho tất cả các trẻ nghi ngờ bị RLPTK [76]

Liệu pháp ngôn ngữ, hành vi, nghề nghiệp , thể chất:

Các liệu pháp được báo cáo có hữu ích gồm:

- Hổ trợ giao tiếp: Giao tiếp hỗ trợ - Sử dụng bàn phím, bảng chữ cái, bảng từ

và các thiết bị khác (ví dụ: Hệ thống Giao tiếp Trao đổi Hình ảnh[77]) với

Tập thể dục thường được điều trị cho những người mắc chứng rối loạn tự kỷ; một chương trình hoạt động thường xuyên do bác sĩ vật lý trị liệu quy định có thể hữu ích Ngoài ra, đào tạo các kỹ năng xã hội đã giúp một số trẻ mắc RLPTK, bao gồm cả những trẻ bị rối loạn lo âu đi kèm

Trong một nghiên cứu kéo dài 2 năm, các trẻ tiếp cận sớm ESDM (the Early Start Denver Model) một chương trình can thiệp hành vi phát triển toàn diện dành cho trẻ nhũ nhi mắc RLPTK, kết quả cho thấy cải thiện đáng kể về chỉ số IQ, hành

vi thích nghi so với trẻ em được can thiệp chuyên bệt sẵn có trong cộng đồng [78] Bắt đầu can thiệp ở độ tuổi sớm và tăng số giờ can thiệp cải thiện hành vi của trẻ mắc RLPTK [79]

Chế độ ăn:

Trẻ em RLPTK có nhiều khả năng gặp các vấn đề về đường tiêu hóa và dị ứng tpức ăn Theo một nghiên cứu, trẻ em RLPTK có nguy bị đầy hơi, chướng bụng, táo bón, tiêu chảy và mẩn cảm với thức ăn cao gấp 6 đến 8 lần so với trẻ phát triển bình thường Các nhà nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ giữa các triệu chứng đường tiêu hóa với hành vi kém thích nghi ở trẻ em RLPTK Trẻ có các triệu chứng đường tiêu hóa thường xuyên, thường có biểu hiện cáu kỉnh, xa lánh

xã hội, dập khuôn và tăng động hơn so với những trẻ RLPTK không có triệu chứng thường xuyên [83]

Trong một thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược, 3 tháng điều trị với bổ sung vitamin , khoáng chất cải thiện có ý nghĩa thống kê về tình trạng dinh dưỡng và chuyển hóa ở trẻ RLPTK Ngoài ra, nhóm có bổ sung cải thiện đáng kể so với nhóm giả dược về điểm thay đổi trung bình của Parental Global Impressions-Revised (PGI-R) [84]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu:

2.2.3 Tiêu chí chọn mẫu:

 Tiêu chí đưa vào :

 Tất cả trẻ được chẩn đoán Tự kỷ trẻ em hoặc Rối loạn phát triển lan tỏa

và có hoặc không có các hội chứng khác kèm theo theo tiêu chuẩn DSM-4-TR (xem mục 1.3) và

 Có đầy đủ cha mẹ ruột, và

 Cha mẹ ruột đồng ý tham gia nghiên cứu

 Tiêu chí loại trừ

 Không đủ cha mẹ ruột , hoặc

 Gia đình không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.2.4 Cỡ mẫu:

Lấy trọn

Các bước tiến hành:

2.3.1 Tại khoa Tâm lí:

Xem hồ sơ bệnh án tại khoa Tâm lí trong thời gian từ tháng 1/2018 đến hiện hành, lọc ra những ca bệnh được chẩn đoán Tự kỷ trẻ em, hoặc Rối loạn phát triển lan tỏa và có hoặc không có hội chứng khác kèm theo

Goi điện thoại những ca có địa chỉ ở Tp HCM giới thiệu về chương trình

Tất cả nhũng ca bệnh đến khám ở khoa Tâm lí bao gồm các ca gọi điện tới

và ca mới nhập khoa sẽ được khám chuyên môn với các bác sĩ của khoa Tâm lí

Những ca thỏa tiêu chuẩn chẩn đoán Tự kỷ trẻ em hoặc Rối loạn phát triển lan tỏa của DSM-4-TR, và có hay không có các hội chứng khác kèm theo sẽ được giới thiệu tới Phòng tư vấn và lấy mẫu

Tại phòng tư vấn và lấy mẫu : tác giả của đề tài nghiên cứu tư vấn cha mẹ ruột của trẻ về chương trình nghiên cứu, khai thác thông tin theo mẫu soạn sẵn, và thực hiện phết niêm mạc miệng chotrẻ

Mã hóa mẫu phết niêm mạc miệng

Lập danh sách các trẻ tự kỷ tham gia nghiên cứu

Các mẫu phết niêm mạc miệng, đã được mã hóa, được gom lại và gởi tới Viện Di truyền Y học mỗi tuần

2.3.2 Tại Viện di truyền Y học:

Dùng WES để giải trình tự toàn bộ gen có mã hóa protein Sau đó so sánh với cơ sở dữ liệu gen có sẵn để biết đột biến gen gây RLPTK và đột biến gen có khả năng gây RLPTK Trong nhóm gen có khả năng gây bệnh có nhóm 25 gen mục tiêu

Mẫu phết niêm mạc miệng được tiến hành qua các giai đoạn sau:

Tách chiết DNA: sử dụng bộ kit tách chiết Magmax Ultra Whole blood

DNA từ máu của hãng Thermo Scientific Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của bộ kit DNA tách chiết được định lượng bằng máy Quantus (Promega) và bộ kit QuantiFluor ONE dsDNA System (Promega) Sự phân bố kích thước của DNA tách chiết được phân tích gel

Tạo thư viện: ít nhất 200 ng DNA tách chiết sẽ được sử dụng để tạo thư viện

(gắn adaptor, index và PCR) sử dụng bộ kit NEBnext Ultra II FS library preparation kit và NEBnext Multiplex Oligos Dual (NEBnext) Quy trình tạo thư viện được tiến hành theo hướng dẫn của bộ kit DNA được tinh sạch bằng hạt từ AMPure XP beads (Beckman-Coulter)

Lai và bắt giữ (hybridization-capture): sản phẩm PCR từ bước tạo thư

viện sẽ được tiến hành lai với hỗn hợp mẫu dò (probe) gắn biotin đặc hiệu cho "y" các gen SPINK1, SPSS, CFTR, CTRC; sau đó sử dụng hạt từ Dynabeads MyOne

Streptavidin T1 (ThermoFisher) để bắt giữ phân mảnh DNA của các gen trên thông qua tương tác streptavidin-biotin DNA được làm giàu sẽ được nhân bản lần

2 bằng PCR với 8-14 chu kì Phản ứng lai sử dụng hóa chất và hướng dẫn từ bộ kit xGen (IDT) Các mẫu dò được thiết kế và tổng hợp bởi xGen (IDT) Các mẫu dò này sẽ bắt giữ tất cả các vùng mã hóa của gen mục tiêu và vùng biên giữa exon và intron (khoảng 20-30 bp)

Giải trình tự Sanger: DNA tách chiết sẽ được nhân bản bằng PCR với mồi

đặc hiệu và gởi giải trình tự tại Macrogen (Korea) sử dụng máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzers (Applied Biosystem)

Giải trình tự gen thế hệ mới: thư viện đạt tiêu chuẩn sẽ được giải trình tự

trên hệ thống máy giải trình tự gen thế hệ mới của hãng Illumina với độ sâu 20X - 100X

Nhóm nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoàn chỉnh và tối ưu hoá để đảm bảo độ tin cậy phù hợp Kết quả giải trình tự được xử lý trên hệ thống máy tính theo các bước sau để xác định các loại biến thể

- Cặp trình tự (pair-end reads) được sắp xếp (align/map) lên trình tự bộ gen của người phiên bản số 19 (human genome version hg19) bằng phần mềm BWA Những cặp trình tự sắp xếp duy nhất lên một vị trí trên bộ gen (uniquely mapped pair-end reads) sẽ được sử dụng để xác định đột biến di truyền

- Đột biến điểm và đột biến mất/thêm đoạn ngắn được xác định bằng quy trình chuẩn do viện Broad thuộc Đại học Harvard xây dựng qua nhiều bước kiểm tra để tăng độ tin cậy của mỗi đột biến được tìm thấy dựa trên tỉ lệ từng loại nucleotide tại vị trí đột biến bằng phần mềm SAMtools

Kết quả giải trình tự sẽ được lượng giá dựa trên các thông số sau:

- Chất lượng của tín hiệu giải trình tự: sử dụng ngưỡng Q30 (nghĩa là xác suất 1 nucleotide bị giải sai là 1/1.000), đây là ngưỡng cho tín hiệu chất lượng cao

- Độ phủ (coverage) trung bình và độ phủ tối thiểu: cho phép đánh giá hiệu quả bắt giữ các gen mục tiêu của mẫu dò ở bước lai-bắt giữ, độ tin cậy của giải trình tư và nhận biết có hay không một vùng nào đó trên gen mục tiêu không được giải trình tự