XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI cổ CÒ

Kết quả đánh giá trị dược liệu nấm linh chi Cổ cò được thu hái tại vườn quốc gia KonKaKinh cho thấy nấm linh chi Cổ cò là loại nấm có giá trị dược liệu và có nhiều hợp chất sinh học có hoạt tính cao như: + Có hàm lượng polysaccharides cao chiếm 10,05% chất khô, protein trong nấm chiếm 10%, khoáng tổng số chiếm 1,27%. Định tính cho thấy trong quả thể nấm có alkaloid, saponin triterpenoid là các hợp chất sinh học có hoạt tính sinh học cao. +Nấm linh chi Cổ cò còn có khả năng kháng khuẩn trên E.coli với vòng phân giải 28,8 mm sau 24h. Khả năng kháng oxy hóa mạnh ở nồng độ 1,52ml dịch chiết, đặc biệt nấm linh chi Cổ cò còn có khả năng peroxy hóa lipid với chỉ số HTCO 37,01% ở nồng độ không pha loãng. Đã xây dựng được quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò một loài nấm quý có giá trị dược liệu tại vườn quốc gia KonKaKinh. + Môi trường tối ưu cho quá trình phân lập từ quả thể nấm linh chi Cổ cò tươi là môi trường Hansen (glucose 50g, pepton 10g, K2HPO4 3g, MgSO4. 7H2O 2,5g, cao nấm men 1g, agar 20g) với thời gian bắt đầu bung sợi là 3 ngày sau khi phân lập và 16 ngày để lan kín ống nghiệm. Sợi nấm linh chi Cổ cò trên môi trường Hansen phát triển khỏe, dày.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

LÊ VĂN KIÊM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH

CHI CỔ CÒ (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst)

ĐƯỢC THU HÁI TẠI VƯỜN QUỐC GIA KONKAKINH

TỈNH GIA LAI

Đà Nẵng – Năm 2017

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG

LÊ VĂN KIÊM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI

CỔ CÒ (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) ĐƯỢC THU

HÁI TẠI VƯỜN QUỐC GIA KONKAKINH TỈNH GIA LAI

Ngành: Công nghệ sinh học

Đà Nẵng – Năm 2017

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG BIỂU ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ iii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 NẤM LINH CHI 4

1.1.1 Giới thiệu về nấm 4

1.1.2 Biến đổi dinh dưỡng trong nấm 5

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm 6

1.1.4 Chu kỳ sống của nấm linh chi 7

1.1.5 Thành phần hóa học chính của nấm linh chi 7

1.2 NẤM LINH CHI CỔ CÒ 8

1.2.1 Giới thiệu về nấm linh chi Cổ cò 8

1.2.2 Giá trị của nấm linh chi Cổ cò 9

1.2.3 Đặt điểm hình thái, cấu trúc và sinh thái nấm linh chi Cổ cò 9

1.2.4 Một số dược tính của linh chi Cổ cò 10

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 12

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Phương pháp đánh giá tính dược liệu nấm linh chi Cổ cò 18

a Xác định hàm lượng polysaccharides thô 18

b Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry 18

c Phương pháp định tính alkaloid 20

d Phương pháp định tính hợp chất saponin 21

e Định tính triterpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard) 22

2.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 23

2.3.3 Xác định khả năng kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ cò 23

a Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp reducing power 23

2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò 25 a Phương pháp phân lập quả thể nấm 25

b Phương pháp nhân giống cấp I và khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của giống cấp I 27

c Phương pháp nhân giống cấp II và khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân giống cấp II 28

2.3.5 Phương pháp đo sự phát triển của chiều dài hệ sợi và tính tốc

độ lan sợi theo thời gian 29

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ GIÁ TÍNH DƯỢC LIỆU CỦA NẤM LINH CHI CỔ CÒ 30

3.1.1 Định lượng hợp chất polysacchride trong nấm Cổ cò 30

3.1.2 Định lượng hàm lượng protein có trong nấm Cổ cò 31

3.1.3 Định tính alkaloid trong nấm Cổ cò 33

3.1.4 Định tính hợp chất saponin trong nấm Cổ cò 34

a Định tính saponin trong nấm 34

b Định tính trierpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard) 35

3.1.5 Xác định khả năng kháng khuẩn của nấm Cổ cò 36

3.1.6 Khả năng kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ cò 38

a Khả năng oxy hóa của nấm bằng phương pháp Reducing power 38

b Khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) 40

3.2 XÂY DỰN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI CỔ CÒ 43

3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm phân lập 43

3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển của sợi nấm trên môi trường nhân giống cấp I 46

3.2.3 Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng phát triển của sợi nấm trên

môi trường nhân giống cấp II 49

3.2.4 Quy trình nhân giống nấm cổ cò 52

a Sơ đồ quy trình nhân giống 52

b Thuyết minh quy trình nhân giống 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

Kết luận 54

Kiến nghị 55

Phụ lục 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu

2.1 Cách bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa

2.2 Chỉ tiêu đánh giá cảm quan mật độ hệ sợi 29

3.1 Hàm lượng polysaccharides thô trong nấm linh chi

3.2 Khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi Cổ cò trên

3.3 Khả năng phát sinh và ảnh hưởng của môi trường

3.4 Ảnh hưởng của môi trường nhân giống cấp I đến sự

phát triển của hệ sợi nấm linh chi Cổ cò 46 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu nông nghiệp đến

quá trình nhân giống cấp II của nấm linh chi Cổ cò 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

3.1 Polysacchride thô trong nấm linh chi Cổ cò 30

3.2 Dãy nồng độ đường chuẩn protein và mẫu thử

3.3

Phương trình đường chuẩn BSA Mẫu thử

nghiệm(OD=0,534, 12,1%) Mẫu kiểm chứng

(OD=0,488, 11%)

32

3.4

Kết quả định tính alkaloid trong nấm linh chi Cổ

cò (a) Mẫu đối chứng với thuốc thử Mayer; (b)

Mẫu thử với thuốc thử Mayer; (c) Mẫu đối chứng

với thuốc thử Dragendorff; (d) Mẫu thử với thuốc

thử Dragendorff

34

3.5 Kết quả định tính saponin trong nấm linh chi Cổ

3.6

Kết quả định tính triterpenoid nấm linh chi Cổ cò

Kết quả định tính trierpenoid trong nấm: (a)-Mẫu

nước, (b)-Mẫu đối chứng chứa H2SO4 và

chloroform không có mẫu thử, (c)-Mẫu đối chứng

chứa H2SO4 và chloroform và có mẫu thử

35

3.7

Vòng vô khuẩn dịch chiết nấm linh chi Cổ cò

(a)-Mẫu đối chứng, (b)-(a)-Mẫu dịch chiết nấm (c)-(a)-Mẫu

dịch chiết nấm pha loãng 20 lần

37

3.8 Khả năng kháng oxi hóa của nấm linh chi Cổ cò

theo nồng độ dịch chiết tăng dần 39

3.9 Khả năng kháng oxi hóa của nấm linh chi Cổ cò ĐC- đối chứng, (a)-0,5ml, (b)-1ml, (c)-1,5ml,

(d)-2ml dịch chiết

40

3.10 Khả năng peroxy hóa lipid màng tế bào chuột của

3.11

Dãy ống nghiệm thể hiện mật độ quang khả năng

peroxy hóa lipid màng tế bào chuột của nấm linh

chi Cổ cò, ĐC-đối chứng, (a)-tỉ lệ pha loãng 1/8

lần, (b)-1/4 lần, (c)- 1/2 lần và (d) mẫu không pha

loãng

41

3.12 Hệ sợi nấm sau 16 ngày phân lập a)-MT PDA,

3.13 Ảnh hưởng của môi trường nhân giống cấp I đến

3.14 Hệ sợi nấm linh chi Cổ cò trên môi trường Hansen

3.15

Hệ sợi nấm linh chi Cổ cò trên môi trường

PDA-CÁM (a), môi trường PDA-RƠM (b) và trên môi

trường Bán tổng hợp (c)

48

3.16

Hệ sợi nấm trên các môi trường nghiên cứu sau 12

ngày (1) và 20 ngày (2) trên ba nguyên liệu hạt

thóc (a), lõi ngô (b), que sắn (c)

50

3.17 Sơ đồ quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò 52

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm khả năng chữa trị bệnh từ các loại nấm dược liệu đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, … Trong số đó, nấm linh chi là đối tượng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu và ứng dụng [1]

Các chất chống oxy hóa bao gồm polyphenol, carotenoid, vitamin C và vitamin E … trong nấm linh chi có hiệu quả hữu ích trong việc phòng chống viêm khớp, viêm phế quản, hen suyễn, viêm loét dạ dày, và cải thiện hiện tượng mất ngủ insomnia [34], [50] Ngoài ra, các hợp chất polysaccharides, peptide phức tạp, β-glucans, lectin, germanium hữu cơ, adenosine, triterpenoids và nucleotide là những hợp chất có hoạt tính sinh học với khả năng hữu ích làm tăng cường các chức năng của hệ thống miễn dịch và điều trị các bệnh về suy giảm miễn dịch (nhiễm virus, ung thư), dị ứng, nhiễm vi sinh vật gây bệnh, chống đông máu [27], [39] Thêm vào đó, nấm linh chi còn có tác dụng làm giảm cholesterol, chữa cao huyết áp, tiểu đường, nâng cao hoạt động của gan, chống HIV, HIV-1 và chống HIV-1 protease [4], [36], [44]

Hiện nay, có nhiều loại nấm linh chi được khai thác và sử dụng Nhưng trên thực tế vẫn còn nhiều loại nấm có giá trị kinh tế cao, giá trị dược liệu trong tự nhiên chưa được nghiên cứu nuôi trồng [51] Một trong số đó không

thể bỏ qua nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst), loại

nấm được xem là thảo dược y học cổ truyền thuộc nhóm thuốc bổ thượng phẩm, nó được sử dụng trong nhiều loại thực phẩm chức năng và thuốc phòng bệnh ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Dịch chiết nấm

linh chi Cổ cò được xem là nguyên liệu quý dùng chống khối u [37] Một số

báo cáo còn chỉ ra rằng dịch chiết nấm linh chi Cổ cò có khả năng ức chế sự

phát triển khối u trong tuyến tiền liệt của con người và các dòng tế bào ung thư bàng quang, ức chế sự tăng sinh tế bào và cảm ứng apoptosis trong cơ thể người [38] Bên cạnh đó, dịch chiết nấm còn có tác dụng lên ung thư biểu

mô ruột và các dòng tế bào ung thư vú [38] Một số triterpenes có trong nấm linh chi Cổ cò cũng được chứng minh ức chế sự tăng trưởng của các tế bào gan bất thường bằng cách thay đổi con đường phosphoryl hóa nội bào [32], [41] Gần đây, nấm linh chi Cổ cò đã được cho rằng có khả năng ức chế sự gia tăng của các dòng tế bào máu khác nhau như K562, HL1-60, U937, Blin-

1, Nalm-6 [26] Không dừng lại ở việc có giá trị dược liệu quý mà nấm linh chi Cổ cò còn có nhiều nghiên trên cứu cho thấy trong nấm có thành phần dinh dưỡng rất phong phú bao gồm các nhóm acid amin, protein, chất béo, đường khử, hợp chất phenol, và nguyên tố khác như Ag, Fe, Na, Cu, là nguồn thực phẩm tốt cho sức khỏe của con người [6] Chính vì thế hiện nay, nấm linh chi Cổ cò được khai thác rất nhiều và trở thành nguồn kinh tế chính của người dân vùng đệm vườn quốc gia trên nước ta Nhưng việc khai thác của người dân đã một phần làm tác động tiêu cực đến hệ sinh thái của các vườn quốc gia nói chung và nấm linh chi Cổ cò nói riêng, làm cho số lượng nấm linh chi Cổ cò giảm mạnh qua từng năm và đang trên nguy cơ cạn kiệt trong tự nhiên do việc khai thác quá mức

Vì những lí do nêu trên chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình nhân

giống nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) được thu

hái tại vườn quốc gia KonKaKinh tỉnh Gia Lai”

2 Mục tiêu đề tài

- Đánh giá tính dược liệu của nấm linh chi Cổ cò phục vụ quá trình nghiên cứu tách chiết các hợp chất cần thiết

- Xây dựng được quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò

(Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) đạt hiệu quả cao và chất lượng tốt,

đồng thời bảo tồn loài nấm quý ở vườn quốc gia KonKaKinh

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Đánh giá ban đầu về giá trị của nấm từ một số hợp chất có hoạt tính sinh học, kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của nấm Có ý nghĩa bảo tồn đa dạng sinh học vì hiện nay nấm linh chi trong tự nhiên đang bị khai thác quá mức và có nguy cơ tuyệt chủng

- Cung cấp một kết quả nghiên cứu mới cho dẫn liệu khoa học, có tính logic và hệ thống về quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học vững chắc để phát triển quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò ở quy mô công nghiệp nhằm cung cấp nguồn giống chất lượng cao cho quá trình sản xuất quả thể nấm linh chi Cổ cò, tạo tiền đề cho việc sản xuất nguyên liệu nấm có hợp chất giá trị cao dùng làm dược liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NẤM LINH CHI

1.1.1 Giới thiệu về nấm

Năm 1969 nhà sinh thái học, phân biệt thực vật người Mỹ Robert Harding Whittaker đã đề ra hệ thống phân loại gồm 5 giới [6]:

- Giới khởi sinh (Monera): Gồm vi khuẩn và tảo lam

- Giới nguyên sinh (Protista): Gồm một số tảo đơn bào, nấm đơn bào

có khả năng di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật sinh

- Giới nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota)

- Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia)

Dựa theo sự sinh sản hữu tính, các nhà phân loại đã chia chúng thành các ngành phụ nhỏ sau:

- Ngành phụ nấm tiên mao (Mastigomycotina)

- Ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomycotina)

- Ngành phụ nấm túi (Ascomycotina)

- Ngành phụ nấm đảm (Basidiomycotina)

- Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina)

Nấm là loài không có lục lạp, không phân hóa thành rễ, thân, lá và không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát triển chung như thực vật Nguồn dinh dưỡng cần thiết của nấm chủ yếu được hấp thu từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm Nấm sinh sản bằng cách tạo bào tử hữu tính hoặc vô tính Nấm có cấu tạo chủ yếu là dạng hệ sợi nấm Các sợi có dạng ống tròn, đường kính 2 - 4 µm Các ống đều có vách ngăn ngang Sợi nấm được gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm được gọi là khuẩn ty thể (mycelium) Thành tế bào sợi nấm đều có cấu tạo chủ yếu bởi kitin – glucan

Đối với nấm đảm có 3 cấp sợi nấm:

Sợi nấm sơ sinh (cấp một): Lúc đầu có nhiều nhân nhưng không có vách ngăn, dần dần sẽ tạo vách ngăn và phân thành những tế bào đơn nhân trong sợi nấm

Sợi nấm cấp thứ sinh (cấp hai): Được tạo thành do sự phối hợp giữa hai sợi nấm cấp một Các sợi nấm liên kết với nhau bằng các liên kết giữa các nguyên sinh chất sẽ trộn với nhau Trong khi đó nhân của của hai sợi nấm vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào trở thành có hai nhân được gọi là sợi nấm song nhân (dicaryolic hyphae)

Sợi nấm tam sinh (cấp ba): Do các sợi nấm thứ sinh phát triển thành Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với nhau và tạo thành quả thể nấm

1.1.2 Biến đổi dinh dưỡng trong nấm

Nấm có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào, những enzyme ngoại bào này giúp cho nấm biến đổi những chất hữu cơ phức tạp thành dạng hòa tan

dễ hấp thu Chính vì thế, nấm là loài dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu cơ

Thức ăn được nấm hấp thu qua màng tế bào hệ sợi Dựa vào cách hấp thu dinh dưỡng của nấm có thể chia làm 3 nhóm:

Hoại sinh: Thức ăn là xác bã thực vật hay động vật Nhóm nấm này có khả năng biến đổi những chất khó phân hủy thành những chất đơn giản dễ hấp thu nhờ hệ men ngoại bào

Ký sinh: Sống bám vào cơ thể sinh vật khác để hút thức ăn của sinh vật chủ

Cộng sinh: Lấy thức ăn và hỗ trợ cho sự phát triển của sinh vật chủ (như nấm Tuber hay Boletus cộng sinh với cây sồi, …)

1.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm

Nguồn carbon: Chủ yếu được cung cấp từ môi trường ngoài cơ thể để tổng hợp nên các chất cần thiết cho sự phát triển của nấm như: hydratcarbon, amino acid, acid nucleic, lipid trong đó carbon chiếm gần một nửa trọng lượng khô của sinh khối nấm, đồng thời là nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất Về nguồn cacrbon trong tự nhiên, được cung cấp chủ yếu từ các nguồn như: cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất này có kích thước lớn nên nấm không thể tiêu hóa được Muốn tiêu hóa được những cơ chất đó, nấm phải tiết các ra enzyme ngoại bào phân hủy cơ chất thành các chất có kích thước nhỏ hơn, đơn giản để có thể xâm nhập được vào trong thành và màng tế bào [14]

Nguồn đạm: Là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy hiện nay, cho sự phát triển hệ sợi nấm Để hệ sợi nấm sử dụng tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào Nguồn đạm được sử dụng trong các môi trường chủ yếu ở dạng muối (muối nitrat, muối amon)

Một số nguồn dinh dưỡng thiết yếu khác:

Các khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm

Nguồn sulfur: Được cung cấp vào môi trường từ nguồn sulfat và cần thiết để tổng hợp một số loại acid amin

Nguồn phosphat: Cung cấp phospho, tham gia vào quá trình tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng tế bào

Nguồn vitamin: Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt trong hoạt

độ enzyme Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần một lượng rất ít nhưng không thể thiếu được Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là vitamin H (biotin) và vitamin B1 (thiamin)

1.1.4 Chu kỳ sống của nấm linh chi

Bào tử đơn bội của nấm khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo thành hệ sợi sơ cấp Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội sẽ phát triển và phối hợp với nhau tạo thành hệ sợi thứ cấp, phát triển và phân nhánh khắp giá thể Lúc này hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày, chúng dễ dàng phân tán và khi gặp điều kiện phù hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh cho đến khi đạt giai đoạn cộng bào [9]

Sau đó là giai đoạn các sợi bện kết lại chuẩn bị cho sự sinh thành mầm mống thể quả Đây chính là giai đoạn phân hóa hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng hơn, ít phân nhánh và bện kết thành các cấu trúc bó Từ đó hình thành lên các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn Phần đỉnh trụ bắt đầu phát tán bào tử liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô và lụi dần trong vòng 3 – 4 tháng [4]

1.1.5 Thành phần hóa học chính của nấm linh chi

Thành phần nấm linh chi có sau:

Nước: 12 – 13%

Cellulose: 54 – 56%

Lignin: 13 – 14%

Chất béo (kể cả dạng xà phòng hóa): 1,9 – 2%

Hợp chất phenol: 0,08 – 0,1%

Hợp chất Sterol toàn phần: 0,11 – 0,16%

Saponin toàn phần: 0,3 – 1,23%

Ngoài ra, hiện nay trong nấm chi còn có rất nhiều loại hoạt chất sinh học khác nhau đã được xác định có trong nấm linh chi như polysaccharides, triterpenoide, nucleotide, steroide, acid béo, peptid và các nguyên tố vi lượng cũng được tìm thấy trong nấm [14]

1.2 NẤM LINH CHI CỔ CÒ

1.2.1 Giới thiệu về nấm linh chi Cổ cò

Nấm linh chi Cổ cò có tên khoa học là:

Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst được công bố vào năm 1881 [15]

Nấm còn được gọi làm nấm muỗng, nấm linh chi Cổ cò (tên nấm linh chi Cổ cò được đặt theo hình dáng bên ngoài của cây nấm, đặc điểm chân nấm dài và nhỏ có mũ nấm nhìn giống như cổ con cò)

Nấm linh chi Cổ cò thuộc:

Giới: Mycetalia Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycetes Bộ: Ganodermatales Họ: Ganodermataceae

Chi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

1.2.2 Giá trị của nấm linh chi Cổ cò

Nấm linh chi Cổ cò có giá trị trong chữa trị các bệnh ung thư như ung thư gan, ung thư phổi, ung thư đại tràng… Dùng trị suy nhược thần kinh, chóng mặt, mất ngủ, viêm khí quản mãn tính, bệnh ho lao do nhiễm bụi silic Viêm gan, huyết áp cao Ðau mạch vành tim, tăng cholesterol huyết, đau dạ dày, chán ăn, thấp khớp Theo kết quả thử nghiệm linh chi còn có khả năng kìm hãm sự phát triển của virus HIV, kéo dài tuổi thọ [45]

Đặc biệt nấm linh chi Cổ cò có tác dụng chống suy dinh dưỡng, hậu sản, bổ âm, an thai, tráng dương, tiêu độc, bổ máu, trị suy giảm trí nhớ Hồi phục nhanh cho người gầy (ốm) hoặc sau khi mổ Nấm linh chi Cổ cò dùng khi suy nhược cơ thể, chậm mọc tóc, kém ăn, khó tiêu hóa

1.2.3 Phân bố

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Từ khi xác

lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn

200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài

Ở Việt Nam nấm linh chi Cổ cò được tìm thấy nhiều ở tỉnh Lâm Đồng, Khánh Hòa, Gia Lai, Quảng Nam và một số tỉnh phía bắc có độ cao từ 1000 mét so với mực nước biển Nấm linh chi Cổ cò theo đánh giá và phân tích giá trị của nhà nghiên cứu cho thấy, nấm linh chi Cổ cò tốt nhất được tìm thấy ở vùng núi tỉnh Khánh Hòa, Gia Lai Nấm linh chi Cổ cò thường mọc

trên các loại cây gỗ thuộc họ đậu (Fabales) đặt biệt là cây gỗ chò đã chết 1.2.3 Đặt điểm hình thái, cấu trúc và sinh thái nấm linh chi Cổ cò

Quả thể nấm linh chi Cổ cò có cuống dài, thường đính bên Cuống nấm

hình trụ (đường kính cỡ 0,3 – 1,0 cm), ít khi phân nhánh, cao từ 10 - 22 cm, đôi khi uốn khúc cong Lớp vỏ cuống láng nâu đỏ - nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm dạng thận gần tròn, đôi khi mũ nấm xòe kiểu hình quạt Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm, màu sắc từ nấm biến đổi dần theo thời gian từ vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen, nhẵn bóng Nấm thường sẫm màu dần khi già, lớp vỏ láng phủ tràn kín mặt trên mũ, đôi khi có lớp phấn Kích thước mũ nấm có thay đổi Phần đính cuống nhô lên hoặc lõm xuống Phần thịt nấm có màu nâu nhạt hoặc trắng kem Ở lớp trên, các tia sợi hướng lên được thấy rõ, đầu các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng chứa laclate không tan trong nước Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

Nấm phát triển từ tháng 5 đến tháng 8, quả thể rộ vào mùa mưa, mọc quanh gốc cây chò hoặc từ các rễ cây (nổi hoặc ngầm gần mặt đất) Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ

Điều kiện môi trường cho nấm phát triển cụ thể như sau: nhiệt độ thích hợp nấm phát triển từ 18 oC đến 25 oC, độ ẩm cao từ 60 đến 70%, độ ẩm không khí từ 80 đến 95% Nấm linh chi Cổ cò không cần nhiều ánh sáng nấm phát triển trong môi trường ánh sáng khuếch tán là chủ yếu

1.2.4 Một số dược tính của linh chi Cổ cò

a Polysaccharides

Polysaccharides là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong các loại nấm nh chi Được phát hiện có hoạt tính dược lý, nâng cao khả năng miễn dịch cơ thể, điều hòa hệ thống miễn nhiễm của cơ thể, có tác dụng chống phóng xạ, nâng cao chức năng gan, tủy xương, máu, tăng sinh tổng hợp các thành tố: DNA, RNA, protein, kéo dài tuổi thọ, chống u ác tính

Thành phần polysaccharides ở nấm linh chi Cổ cò nay đã được xác định, phân ly thành hơn 100 loại, trong đó phần lớn là β-glucan, một số ít là γ-glucan Các polysaccharides có cơ chế ức chế khối u ác tính của cơ thể qua nâng cao miễn dịch của cơ thể, khiến tế bào miễn dịch tấn công và giết chết

u ác tính phát triển thời kì đầu [6] Nâng cao khả năng hình thành albumin sợi ở tiểu cầu, lượng lớn albumin sợi sẽ bao vây khối u ác tính ở thời kì đầu, cách ly nó với bên ngoài, chặn nguồn dinh dưỡng cung cấp làm chuyển nó qua thời kì “ngủ” Kìm hãm sự phát triển của tế bào u ác tính Vì vậy ngày nay, polysaccharides nấm đã trở thành một trong những dược liệu dùng để

hỗ trợ điều trị u ác tính

b Alkaloid

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,

có phản ứng kiềm, thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử chung của alkaloid, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng

Tuy nhiên cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng nối với nitơ

và một số alkaloid không có phản ứng kiềm Một số alkaloid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng nhiều trong dược liệu và có nhiều chất rất độc Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid [13]

c Hợp chất saponin

Saponin là một loại glycosid Saponin là một trong những thành phần hóa học của các loại thảo mộc, có hiệu quả rất lợi cho sức khỏe con người

Có cấu trúc gồm 2 phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi

là aglycon Saponin khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề

mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, làm vỡ hồng cầu Saponin thường ở dạng

vô định hình, có vị đắng Saponin bị tủa bởi chì acetat, hidroxid barium, sulfat amonium [15]

d Saponin triterpenoid

Saponin triterpenoid: phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 carbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: Saponin triterpenoid pentacylic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng

và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean [8] Saponin triterpenoid tetracylic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dummanran, lanostan, cucurbitan Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan [17] Triterpenoid không vòng như squalen, ambrein

Triterpenoid 4 vòng: thuộc loại squalenoxid (mọi vòng 6C đều ở cấu hình trans với nhau) lanosterol, protosterol, agnosterol, cycloaudinol

Triterpenoid 5 vòng: được chia thành 3 nhóm (nhóm α- amyrin, nhóm β- amyrin, nhóm lupeol)

Triterpenoid có tác dụng sinh học trong giảm nguy cơ ung thư, làm giảm cholesterol, giúp máu lưu thông tốt, làm giảm huyết áp, nếu dùng lâu dài nó được coi là kháng sinh tự nhiên, chống oxi hóa

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Nấm linh chi loài nấm có tính dược liệu rất phong phú và đa dạng Việc khai thác, nuôi trồng nấm linh chi hiện nay rất phát triển tuy nhiên một số nấm linh chi hiện nay chưa được nhân giống và đánh giá tính dược liệu cụ thể của nấm Điển hình nấm linh chi Cổ cò là nấm linh chi được đánh giá có

tiềm năng lớn trong ngành dược liệu nhưng việc nuôi trồng loại nấm này hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Có rất nhiều nghiên cứu nấm Ganoderma lucidum về tính chất dinh

dưỡng, dược liệu, nhân giống và trồng trọt Như quy trình nuôi trồng nấm linh chi đen (Hắc chi) trên môi trường mùn cưa của TS Ngô Anh Hay dự

án sản xuất thử nghiệm nấm linh chi trắng (Buna – shimeji) trên các giá thể

làm từ các phế phẩm nông nghiệp như cùi bắp, cám gạo, bã mía … của TS Nguyễn Bỉnh Nguyên, Nguyễn Minh Thơ (Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh) và Lê Duy Thắng (Đại học KHTN Tp Hồ Chí Minh) cũng đã nghiên cứu và trồng thành công nấm linh chi trên cơ chất là cây Mai Dương

Nhưng về loài (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) hiện chưa có

nghiên cứu về nuôi trồng trên môi trường tổng hợp và đánh giá dinh dưỡng cũng như tính dược liệu nấm Nhưng trên thực tế vẫn có những nghiên cứu xác định về sự phân bố hình thái bên ngoài và định tính dược liệu của nấm Năm 2005, nghiên cứu một số tác dụng sinh học của ba loài nấm linh

chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat), (Ganoderma lobatum (Schw.) Atk) và (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr) Karst) theo hướng làm thuốc

hỗ trợ điều trị ung thư và thuốc chống lão hóa của tác giả Nguyễn Thượng Dong [3]

Năm 2007 cơ quan chủ trì Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội),

đánh giá một số tính chất sinh y học của nấm linh chi Ganoderma lucium

của tác giả ThS Tạ Bích Thuận [18]

Năm 2014 trên tạp chí khoa học và công nghệ trường Đại Học Khoa Học Huế, Lê Trung Hiếu và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá khả năng kháng

oxy hóa một số đối tượng có tính dược liệu trong đó có loài nấm linh chi

Ganoderma lucium được lấy từ tự nhiên [7]

Năm 2015 nghiên cứu của tác giả Nguyễn Phương Đại Nguyên về đa dạng thành phần loài của chi Ganoderma ở vườn quốc gia KonKaKinh, tỉnh Gia Lai, Việt Nam cho thấy hiện vườn quốc gia có hơn 25 loài trong chi Ganoderma đã xác định, trong đó 5 loài ghi nhận mới bổ sung vào danh mục

nấm lớn Tây Nguyên, 1 loài Ganoderma steyaertanum ghi nhận mới bổ sung

vào danh mục nấm lớn Việt Nam và có 10 loài có tác dụng dược liệu [10] Nhìn chung, việc xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng nấm linh chi Cổ cò ở Việt Nam chưa ai nghiên cứu thực hiện, chỉ có một số nghiên cứu so sánh đánh giá chất lượng của nấm

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới việc nghiên cứu nấm linh chi Cổ cò dùng ở mức độ đánh giá sơ bộ một số tính chất dược liệu và bảo tồn

Năm 2005 một nghiên cứu về việc khôi phục lại hơn 80 loài nấm lớn ở Thổ Nhĩ Kỳ của tác giả Ahmet Afyon, kết quả góp phần khôi phục các loài nấm và giúp tái sử dụng các nguồn dinh dưỡng trong tự nhiên [22]

Năm 2007 nghiên cứu của Ben-Zion Zaidman và cộng sự về loài

(Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P Karst) được sử dụng rộng rãi ở các nước

châu Á trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa hoặc điều trị nhiều loại bệnh, kể cả

ung thư Trong nghiên cứu này đã chỉ ra các cơ chế tác động của Ganoderma lucium dịch chiết thô và GLF4 phần tích cực trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt Dữ liệu đã chứng minh rằng Ganoderma lucium ức chế khả năng

phát triển tế bào bằng cảm ứng apoptosis thông qua con đường bên ngoài, bao gồm kích hoạt caspase-8 và caspase-3 và ức chế sự tăng sinh tế bào bằng cách điều hòa biểu hiện cyclin D1 Những kết quả này chỉ ra rằng dịch chiết

Ganoderma lucium có có tác động đối với các tế bào có khả năng trị liệu cho

điều trị ung thư tuyến tiền liệt [51]

Năm 2010 Michael Adams và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu khả kháng năng kháng lại các thể amip, thể trùng và hoạt động của ký sinh trùng

Leishmania, từ chiết xuất ethyl acetate của nấm linh chi với sự ức chế 79%

ở mức 4,9 mg /ml [21]

Năm 2012 một nghiên cứu so sánh hoạt động chống oxy hóa của phenolic và các chất chiết xuất polysaccharides từ quả thể, bào tử và sợi nấm của nhóm tác giả Sandrina A Heleno và cộng sự, kết quả cho thấy các chất chiết xuất phenolic có tiềm năng chống oxy hóa cao hơn so với chiết xuất polysaccharides tương ứng Trong số các chất chiết xuất phenolic, chiết xuất phenolic từ quả thể có khả năng chống oxy hóa tốt nhất (EC50 ≤ 0.6 mg/ml) trong tổng số phenolic (29 mg/g chiết xuất) và các axit phenolic (axit p-hydroxybenzoic và p-coumaric) Đối với bào tử cho chiết xuất polysaccharides có khả năng chống oxy hóa tốt nhất (EC50 ≤ 2 mg/ml) Tuy nhiên, mức cao nhất trong tổng số phenolic đã thu được trong quả thể là

56mg/g chiết xuất [46]

Năm 2013 nghiên cứu về loại nấm Ganoderma lucium (M.A (Curtis.Fr) P) đánh giá hoạt động của các chiết xuất của Ganoderma lucium

ở chuột mắc bệnh tiểu đường Khả năng chống oxy hóa trong huyết thanh

của chuột được điều trị với chiết xuất dung dịch nước của Ganoderma lucidum cao hơn đáng kể; trong khi các sản phẩm protein oxy hóa và lipid

lại thấp hơn Những phát hiện này ủng hộ mạnh mẽ việc sử dụng dịch chiết

có lợi của chiết xuất Ganoderma lucium trong việc đẩy nhanh lành vết

thương ở chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra [28]

Năm 2013 Sandrina A Heleno và cộng sự nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dẫn xuất glucuronid từ acid p-hydroxybenzoic và cinnamic trong

dịch chiết loài (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) chỉ ra rằng khả năng

kháng khuẩn của dẫn xuất rất mạnh mẽ với một số loài nhất định [47] Nhìn chung, các nghiên cứu trong và ngoài nước tập trung vào việc đánh giá chất lượng và khẳng định dược tính có trong nấm nh chi Cổ cò, điều đó cho thấy việc nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nấm linh cho Cổ cò là vấn đề có tính cấp thiết

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu:

Nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst) (nấm Cổ

cò) được thu hái ngoài tự nhiên tại vườn quốc gia KonKaKinh, tỉnh Gia Lai

Hình 2.1 Mẫu nấm linh chi Cổ cò ở vườn quốc gia KonKaKinh (N14 o 11’18.5” – E108º17’48.1” ở độ cao 1333m)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá tính dược liệu của nấm linh chi Cổ cò loại nấm có được khai thác sử dụng nhiều tại vườn quốc gia KonKaKinh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng pháp

triển của hệ sợi nấm linh chi Cổ cò (Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst)

- Xây dựng quy trình nhân giống cấp I và cấp II nấm linh chi Cổ cò

(Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp đánh giá tính dược liệu nấm linh chi Cổ cò

a Xác định hàm lượng polysaccharides thô

Hàm lượng polysaccharides được xác định theo phương pháp của Sun và cộng sự (2006) Lấy 1g mẫu bột nấm linh chi Cổ cò chiết soxhlet trong 3 giờ với dung môi ethanol 80 % để loại bỏ tạp chất màu, protein tự do bất hoạt enzyme Phần cặn được cho vào bình tam giác 250ml và thêm vào 30ml nước cất sau đó chiết sạch bằng sóng siêu âm ở 60oC trong 30 phút Dịch chiết được thêm 40ml ethanol 95%, ủ qua đêm ở 4oC để kết tủa polysaccharides Định tính polysaccharides bằng phương pháp soi màu: Tiến hành hòa tan kết tủa polysaccharides với 3ml nước cất, 1ml phenol và 7ml acid H2SO4 ủ trong bể ủ nhiệt 4oC trong 30 phút rồi làm lạnh về nhiệt

độ phòng và tiến hành soi màu trên máy quang phổ ở bước sóng 485 nm Mẫu đối chứng có thành phần như mẫu phân tích nhưng không có polysaccharides Hàm lượng polysaccharides được xác định dựa trên đường chuẩn D-glucose

b Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry

- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein

trong một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

- Hoá chất cần dùng:

+ Dung dịch A: 0,4g NaOH (0,1M) và 2g Na2CO3 (2%) pha trong 100ml nước cất

+ Dung dịch B: 0,05g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%

+ Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng)

+ Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N và albumin huyết thanh bò 1mg/ml

- Cách tiến hành

Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ màu cực đại Đem so màu của hỗn hợp trên máy đo quang ở bước sóng 660nm Xác định được trị số mật độ quang học (OD) của dung dịch nghiên cứu Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình Mẫu đối chứng ta lấy 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

- Xây dựng đường đồ thị chuẩn

Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn

Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước,

ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so màu với bước sóng 660nm

Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm Kết quả ta thu được có phương trình hồi quy y = ax + b

Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của OD với hàm lượng protein Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

c Phương pháp định tính alkaloid

- Phần 1: Quả thể nấm linh chi Cổ cò được sấy khô sau đó nghiền thành bột Cân (10 – 20 g) bột nấm ngâm trong dung dịch H2SO4 trong bình tam giác, đun nhẹ hổn hợp trong 1 giờ Sau đó tiến hành lọc thu dịch chiết rồi tiến hành thử với thuốc thử Mayer Quan sát hiện tượng nếu có kết tủa màu vàng khi bỏ Mayer vào chứng tỏ trong dịch chiết nấm linh chi Cổ cò có alkaloid Tuy nhiên nếu không có kết tủa chưa khẳng định được nấm linh chi Cổ cò không có alkaloid

- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 g) ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 95%: NHOH đậm đặc (theo tỷ lệ là 8:8:1) Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1%,

đun ấm cho dễ tan Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer, Dragendorff

- Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36g HgCl trong 60 ml nước cất và 5g KI

trong 10 ml nước cất Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho

đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có chứa alkaloid thì sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

- Thuốc thử Dragendorff: Hỗn hợp 1 hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25ml HNO3 30% (D = 1,18) Hỗn hợp 2 hòa tan 28g KI và 1ml HCl 6N trong 5ml nước cất Trộn 2 hỗn hợp ta được dung dịch màu cam

- đỏ được chứa trong bình sậm màu để che sáng, cất trong tủ lạnh Nhỏ thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid nếu có alkaloid

sẽ xuất hiện tủa màu cam - nâu [16]

d Phương pháp định tính hợp chất saponin

Chiết 5 g dược liệu với cồn 70% (1:20) bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc bằng giấy lọc Cô quay dịch đến cặn khô Dùng cặn để làm các phản ứng định tính saponin

Bọt bền trong 15 phút: +

Bọt bền trong 30 phút: ++

Bọt bền trong 60 phút: +++

- Thử ngiệm phương pháp Fontan – Kaudel

Lấy một lượng cặn rắn tương ứng với 1g bột dược liệu, đun cách thủy rồi hòa tan với 10 ml nước Chia đều vào 2 ống nghiệm

Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1 N (pH = 1)

Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1 N (pH= 13)

Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bọt trong cả 2 ống nghiệm

Nếu cột bọt trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền như nhau thì sơ

bộ kết luận có saponin triterpenoid

Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid [12]

e Định tính triterpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard)

Chiết 5 -10 g bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình tam giác, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether bốc hơi hết không để lại vết mờ trên mặt kính, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại cho đến khi dung môi cong lại khoảng 50 ml dịch chiết ether

Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào bình tam giác,rồi cho bốc hơi tới cắn Sau đó hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm khô, dùng pipet thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm

Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím ta kết luận

có triterpenoid

2.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Sử dụng chủng chuẩn vi khuẩn E.coli, tiến hành thử khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Sử dụng

2 dịch chiết từ quả thể không pha loãng và dịch chiết pha loãng 20 lần, đối chứng không sử dụng dịch chiết Nồng độ chất chiết tạo ra vòng vô khuẩn ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn

2.3.3 Xác định khả năng kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ cò

a Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp reducing power

Lần lượt cho vào mỗi ống nghiệm: Dịch chiết : 0 - 2ml; 2ml dung dịch etanol 96%; 2ml dung dịch đệm photphate (0,2M, pH=6,6), 2ml Kali ferricyanide 1% như sau:

Bảng 2.1 Cách bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa bằng

phương pháp reducing power

Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dịch chiết

0,5 ml Ferric chloric 0,1% Đo độ hấp thụ của dung dịch trên với thiết bị Vis bước sóng 700nm [5]

UV- Tính toán kết quả

AAI = 𝑹 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒍𝒆

𝑹 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍

Trong đó:

AAI: chỉ số chống oxy hóa;

Rsample : Mật độ quang của mẫu Rcontrol: Mật độ quang mẫu kiểm chứng

b Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) [11]

Chuẩn bị dịch chiết cao cồn nấm linh chi Cổ cò bằng cách chiết hồi lưu soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96% theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết được cô quay chân không thu được cao cồn

Xác đinh khả năng ức chế peroxy hóa lypid của dịch chiết nấm linh chi Cổ cò qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào Lượng MDA sinh ra có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric (NH.CO.CH2.CO.NH.CS) để tạo thành phức hợp trimethin có màu hồng có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532

đo mật độ quang ở bước sóng 532 nm [13]

Vitamin C được sự dụng làm chất đối chứng

 Phương pháp toán kết quả

Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO):

HTCO% = [(ODC– ODT) / ODc] x 100

ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO hay MeOH)

ODT: Mật độ quang của mẫu thử

Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của

3 lần đó khác nhau

2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ cò

a Phương pháp phân lập quả thể nấm

Chọn tai nấm điển hình và ở giai đoạn trưởng thành, để dễ đánh giá chất lượng giống Tai nấm được gọt sạch chất bẩn bám ở chân nấm Sau

đó lau cồn, tách đôi lấy phần thịt nấm để được mô thịt Mô thịt nấm tách ở những vị trí kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất Cho mô thịt lên môi trường thạch nghiêng hoặc thạch petri, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng, kiểm tra tạp nhiễm Từ phân lập ta thu được giống gốc

Môi trường phân lập gồm:

- Môi trường Bán tổng hợp:

Khoai tây được rửa sạch sau đó gọt vỏ rồi tiến hành thái nhỏ, đun sôi

từ 20 – 30 phút tiến hành lọc loại bỏ bã khoai tây thu dịch Sau đó cân lượng

hóa chất đúng theo tỷ lệ và bổ sung nước cất cho đủ lượng cần dùng, đun sôi cho tan hết thạch agar, rót vào các ống nghiệm, đậy nút bông, rồi hấp khử trùng 1atm, 121oC trong thời gian là 20 phút

- Môi trường PDA:

Khoai tây được rửa sạch sau đó gọt vỏ rồi tiến hành thái nhỏ, đun sôi từ

20 – 30 phút tiến hành lọc loại bỏ bã khoai tây thu dịch Sau đó cân lượng hóa chất đúng theo tỷ lệ và bổ sung nước cất cho đủ lượng cần dùng, đun sôi cho tan hết thạch agar, rót vào các ống nghiệm, đậy nút bông, rồi hấp khử trùng 1atm, 121oC trong thời gian là 20 phút

- Môi trường Hansen