BC DƯỢC LIỆU 1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

BÀI 6: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN I.CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ BỘT CAM THẢO1.Tiến hành: 0.5g bột Cam thảo + 50ml ethanol 70% lọc bông2.Kết quả Dịch chiết SaponinII.ĐỊNH TÍNH BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC1.Phản ứng trên bột dược liệuTiến hành:•Bột cam thảo + amoniac (TT)  quan sát màu.•Thêm tiếp acid sulfuric 80% (TT)  quan sát màu.Hiện tượng: Nhỏ dung dịch ammoniac lên bột dược liệu sẽ xuất hiện màu vàng tươi. Thêm sulfuric acid 80% thì màu vàng tươi nhạt dần. Giải thích: Glycyrrhyzic acid có tính acid yếu (trong bột Cam thảo) phản ứng với NH3 tạo muối monoammonium glycyrrhizinate có màu vàng tươi. Khi cho dung dịch H2SO4 80%, H2SO4 sẽ phản ứng với muối trên cho lại glycyrrhyzic acid  làm màu vàng tươi nhạt dần.2.Phản ứng Lierbermann BurchartTiến hành•10ml dịch lọc khô cắn.•Cắn + 1ml anhydrid + 1ml clorofrom dịch trong.•Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 2ml acid sulfuric → Quan sát hiện tượng.Hiện tượng: Khi nhỏ từ từ theo thành ống khoảng 2 ml sulfuric acid → xuất hiện vòng ngăn cách màu nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng, lớp dung dịch phía trên có màu vàng nâu sẫm.→ Phản ứng phân loại sapogenin: dẫn chất triterpenoid thì cho màu hồng đến tía. Giải thích:•Anhydric acetic+ chloroform giúp hòa tan cắn saponin.•Khi cho H2SO4 đậm đặc vào, H2SO4 khử nhóm hydroxyl ở vị trí C3 tạo 1 nối đôi, quy trình này lặp lại → tạo aromatic triterpene có các nối đôi liên hợp (nhóm mang màu)  xuất hiện vòng nâu đỏ ngăn cách giữa 2 lớp.3.Phản ứng ShinodaHiện tượng: Khi cho vào dịch lọc một ít bột magnesi kim loại và hydrochloric acid xuất hiện màu đỏ sẫm.Giải thích: Mg + HCl tạo ra hydro mới sinh (H+), hydro này sẽ khử nhóm carbonyl trong flavonoid (nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong rễ Cam thảo) tạo nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) → Sản phẩm có màu đỏ sẫm. III.ĐỊNH TÍNH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG1.Dược liệu Cam thảo1.1.Chuẩn bị:a.Mẫu thử:B1: 0.5g dược liệu + 20ml ether → Siêu âm 15p → Gạn bỏ dịch ether, chiết thêm 2 lần nữa để loại bỏ tạp → Thu bã.B2: Bã + 1ml HCl (TT) + 20ml cloroform (TT) → Siêu âm 1h → Lọc bông.B3: Bốc hơi dịch chiết → Cắn + 1ml methanol (TT).b.Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – Methanol – nhexane (7:1:2) cho vào bình lắng gạn lắc đều, xả khí. Để yên trong 15 phút rồi lấy lớp dưới cho vào bình chạy sắc ký. Lưu ý để thêm một miếng giấy lọc (10 x 12) vào bình sắc ký để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn.1.2.Tiến hànhB1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa. Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 3 vết: Vết chuẩn – Vết thử trước (dịch chiết với ethanol 70%) – Vết thử sau (mẫu thử)B2: Quan sát sắc ký đồ:•Để khô bản mỏng đã triển khai, lần lượt quan sát bản mỏng với UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc ký đồ.•Tiếp tục lấy bản mỏng trên, phun H2SO4 10% trong methanol (TT), đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút. Lần lượt quan sát bản mỏng với UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc kí đồ.1.3.Kết quả Soi UV ở bước sóng 254nmNhận xét: Trong dung dịch sau khi chiết có một vết màu hồng giống với dung dịch chuẩn. Trong dịch chiết ban đầu không xuất hiện vết tương tự như dung dịch sau khi chiết. Soi UV ở bước sóng 365nmNhận xét: Khi soi UV 365 hoàn toàn không thấy vết của dung dịch chuẩn. Các vết trên dịch chiết ban đầu hiện rõ hơn so với UV 254. Phun sulfuric acid 10% trong mẹthanolGiải thích:•Glycyrrhizin là saponin quan trọng nhất của rễ Cam thảo, ở dạng bột kết tinh trắng, dễ tan trong nước nóng và cồn loãng, không tan trong ether và chloroform.•Glycyrrhizin ở trong cây dưới dạng muối Mg và Ca của glycyrrhizinic acid. Dưới tác dụng của acid vô cơ (hydrocloric acid), glycyrrhizinic acid bị đẩy ra khỏi muối, bị thủy phân tạo thành glycyrrhetic acid. → Do đó, với dung dịch chiết ban đầu, khi cho thủy phân với ethanol 70% thì vẫn chưa loại hết tạp chất, glycyrrhetic acid sinh ra chưa được nhiều nên vết sắc ký mờ nhạt. → Còn dung dịch sau khi chiết đã được chiết siêu âm 3 lần với ethylic ether để loại chất béo và tạp chất, sau đó thủy phân bằng HCl acid nên glycyrrhetic acid sinh ra nhiều và không lẫn tạp chất, nên vết sắc ký rõ nét hơn. 2.Dược liệu Tục đoạn2.1.Chuẩn bịa.Mẫu thử: 0.5g dược liệu + 20ml ether → chiết siêu âm 15’ → lọc bôngb.Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – methanol – H2O (65:35:10)ta nên pha hệ dung môi này bên ngoài trước rồi mới cho vào bình sắc kí một lượng phù hợp. Lưu ý để them một miếng giấy lọc (10x12) vào bình sắc ký để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn.2.2.Tiến hànhB1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa. Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 2 vết: Vết chuẩn – Vết thử (mẫu thử).B2: Quan sát sắc ký đồ: Để khô bản mỏng đã triển khai, phun H2SO4 10% trong methanol (TT) lên, đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút → thu được sắc ký đồ.2.3.Kết quả Nhận xét: Các vết sắc ký trong mẫu Tục đoạn chuẩn và thử tương đương nhau về vị trí, màu sắc, kích thước. Rf = 0.55Nhận định kết quả•Dược liệu cho vết màu tím ( màu saponin)•Rf =0.55Hiện tượngNguyên nhânCách khắc phụcVết di chuyển không hoàn toànMẫu còn nhiều tạp phân cựcLoại tạp kĩ nhiều lầnVết hình ngọn lửa nhiều dầuChấm vết không trùng nhau, đậmChấm kĩ, cẩn thận, không chấm quá nhiều dịchVết trải dài không táchPha hệ dung môi sắc ký chưa tốt hoặc do chiết không hiệu quảChọn hệ dung môi sắc ký và dung môi chiết xuất mẫu chuyên biệt

BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 1

BÀI 6: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

[KHOA DƯỢC]

I CHIẾT XUẤT SAPONIN TỪ BỘT CAM THẢO

1 Tiến hành: 0.5g bột Cam thảo + 50ml ethanol 70% lọc bông

2 Kết quả

Dịch chiết Saponin

1 Phản ứng trên bột dược liệu

− Tiến hành:

• Bột cam thảo + amoniac (TT) → quan sát màu

• Thêm tiếp acid sulfuric 80% (TT) → quan sát màu

− Hiện tượng: Nhỏ dung dịch ammoniac lên bột dược liệu sẽ xuất hiện

màu vàng tươi Thêm sulfuric acid 80% thì màu vàng tươi nhạt dần

Đun cách thủy 15’

Màu vàng tươi

Màu vàng tươi nhạt dần

− Giải thích: Glycyrrhyzic acid có tính acid yếu (trong bột Cam thảo) phản

ứng với NH3 tạo muối monoammonium glycyrrhizinate có màu vàng tươi Khi cho dung dịch H2SO4 80%, H2SO4 sẽ phản ứng với muối trên cho lại glycyrrhyzic acid → làm màu vàng tươi nhạt dần

2 Phản ứng Lierbermann- Burchart

− Tiến hành

• 10ml dịch lọc khô cắn

• Cắn + 1ml anhydrid + 1ml clorofrom dịch trong

• Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 2ml acid sulfuric → Quan sát

hiện tượng

− Hiện tượng: Khi nhỏ từ từ theo thành

ống khoảng 2 ml sulfuric acid → xuất hiện vòng ngăn cách màu nâu đỏ giữa

2 lớp chất lỏng, lớp dung dịch phía trên có màu vàng nâu sẫm

→ Phản ứng phân loại sapogenin: dẫn

chất triterpenoid thì cho màu hồng đến tía

− Giải thích:

• Anhydric acetic+ chloroform giúp hòa tan cắn saponin

• Khi cho H2SO4 đậm đặc vào, H2SO4 khử nhóm hydroxyl ở vị trí C3

tạo 1 nối đôi, quy trình này lặp lại → tạo aromatic triterpene có các nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) → xuất hiện vòng nâu đỏ ngăn cách giữa 2 lớp

Cô cách thủy

Khuấy, lọc

3 Phản ứng Shinoda

Cho 2 – 3ml dịch lọc vào ống nghiệm

− Hiện tượng: Khi cho vào dịch lọc một ít bột magnesi kim loại và

hydrochloric acid xuất hiện màu đỏ sẫm

− Giải thích: Mg + HCl tạo ra hydro mới sinh (H+), hydro này sẽ khử

nhóm carbonyl trong flavonoid (nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong

rễ Cam thảo) tạo nối đôi liên hợp (nhóm mang màu) → Sản phẩm có màu

đỏ sẫm

III ĐỊNH TÍNH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

1 Dược liệu Cam thảo

1.1 Chuẩn bị:

a Mẫu thử:

− B1: 0.5g dược liệu + 20ml ether → Siêu âm 15p → Gạn bỏ dịch ether, chiết thêm 2 lần nữa để loại bỏ tạp → Thu bã

− B2: Bã + 1ml HCl (TT) + 20ml cloroform (TT) → Siêu âm 1h → Lọc bông

− B3: Bốc hơi dịch chiết → Cắn + 1ml methanol (TT)

b Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – Methanol – n-hexane (7:1:2) cho vào bình lắng gạn lắc đều, xả khí Để yên trong 15 phút rồi lấy lớp dưới cho vào bình chạy sắc ký Lưu ý để thêm một miếng giấy lọc (10 x 12) vào bình sắc ký để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn

1.2 Tiến hành

− B1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 3 vết: Vết chuẩn – Vết thử trước (dịch chiết với ethanol 70%) – Vết thử sau (mẫu thử)

− B2: Quan sát sắc ký đồ:

• Để khô bản mỏng đã triển khai, lần lượt quan sát bản mỏng với

UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc ký đồ

• Tiếp tục lấy bản mỏng trên, phun H2SO4 10% trong methanol (TT), đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút Lần lượt quan sát bản mỏng với UV 254nm và UV 365nm → Thu được sắc kí đồ

1.3 Kết quả

Soi UV ở bước sóng 254nm

Nhận xét: Trong dung dịch sau khi chiết

có một vết màu hồng giống với dung dịch chuẩn Trong dịch chiết ban đầu không xuất hiện vết tương tự như dung dịch sau khi chiết

Soi UV ở bước sóng 365nm

Nhận xét: Khi soi UV 365 hoàn toàn

không thấy vết của dung dịch chuẩn Các vết trên dịch chiết ban đầu hiện rõ

hơn so với UV 254

Chú thích:

C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau khi chiết

Chú thích:

C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau khi chiết

Phun sulfuric acid 10% trong mẹthanol

− Giải thích:

• Glycyrrhizin là saponin quan trọng nhất của rễ Cam thảo, ở dạng bột kết tinh trắng, dễ tan trong nước nóng và cồn loãng, không tan trong ether và chloroform

• Glycyrrhizin ở trong cây dưới dạng muối Mg và Ca của glycyrrhizinic acid Dưới tác dụng của acid vô cơ (hydrocloric acid), glycyrrhizinic acid bị đẩy ra khỏi muối, bị thủy phân tạo thành glycyrrhetic acid

→ Do đó, với dung dịch chiết ban đầu, khi cho thủy phân với ethanol 70% thì vẫn chưa loại hết tạp chất, glycyrrhetic acid sinh ra chưa được nhiều nên vết sắc ký mờ nhạt

→ Còn dung dịch sau khi chiết đã được chiết siêu âm 3 lần với ethylic ether để loại chất béo và tạp chất, sau đó thủy phân bằng HCl acid nên

Chú thích:

C: Dung dịch chuẩn Bđ: Dịch chiết ban đầu Ch: Dung dịch sau khi chiết

glycyrrhetic acid sinh ra nhiều và không lẫn tạp chất, nên vết sắc ký rõ nét hơn

2 Dược liệu Tục đoạn

2.1 Chuẩn bị

a Mẫu thử: 0.5g dược liệu + 20ml ether → chiết siêu âm 15’ → lọc bông

b Bình sắc ký có hệ dung môi: Cloroform – methanol – H2O (65:35:10)

ta nên pha hệ dung môi này bên ngoài trước rồi mới cho vào bình sắc kí một lượng phù hợp Lưu ý để them một miếng giấy lọc (10x12) vào bình sắc ký

để bão hòa dung môi, giúp chạy sắc ký được chuẩn và đẹp hơn

2.2 Tiến hành

− B1: Triển khai chạy sắc ký với hệ dung môi tương ứng đã bão hòa Trên bản mỏng (7:3) chấm riêng biệt lần lượt 2 vết: Vết chuẩn – Vết thử (mẫu thử)

− B2: Quan sát sắc ký đồ: Để khô bản mỏng đã triển khai, phun H2SO4

10% trong methanol (TT) lên, đem sấy bản mỏng ở 105oC trong 5 phút

→ thu được sắc ký đồ

2.3 Kết quả

Nhận xét: Các vết sắc ký trong mẫu Tục đoạn

chuẩn và thử tương đương nhau về vị trí, màu sắc, kích thước Rf = 0.55

Chú thích:

TĐC: Dung dịch chuẩn

TĐ thử: Dung dịch thử chứa

dịch chiết Tục đoạn

❖ Nhận định kết quả

• Dược liệu cho vết màu tím ( màu saponin)

• Rf =0.55

Vết di chuyển

không hoàn toàn

Mẫu còn nhiều tạp phân cực Loại tạp kĩ nhiều lần

Vết hình ngọn lửa

nhiều dầu Chấm vết không trùng nhau, đậm

Chấm kĩ, cẩn thận, không chấm quá nhiều dịch Vết trải dài không

tách Pha hệ dung môi sắc ký chưa tốt

hoặc do chiết không hiệu quả

Chọn hệ dung môi sắc ký

và dung môi chiết xuất mẫu chuyên biệt