Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi (ganoderma sp ) trong điều kiện in vitro

Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi trong điều kiện in vitro .... Đánh giá khả năng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ KIỀU LAN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI BỆNH NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH

TRÊN NẤM LINH CHI (GANODERMA SP.)

TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là

trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào

Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn

và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Lan

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, được sự giúp

đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho

em những kiến thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt thời gian học tập, rèn luyện

và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh – giảng viên khoa Công nghệ sinh học đã định hướng đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh, toàn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang thực tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm

ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Lan

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

Danh mục chữ viết tắt vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích của đề tài 1

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Nấm Linh Chi 3

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố 3

2.1.2 Tình hình trồng nấm Linh chi 4

2.1.3 Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học 5

2.1.4 Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi 8

2.1.5 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật 14

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Vật liệu nghiên cứu 17

3.1.1 Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu 17

3.1.2 Thiết bị và hóa chất 17

3.1.2 Môi trường 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu 20

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, làm thuần 20

3.2.3 Phương pháp giữ giống 20

3.2.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 21

3.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học 21

3.2.6 Phương pháp định loại nấm sợi ( Nguyễn Lân Dũng, 2006) 22

3.2.7 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24

3.2.8 Vi sinh vật 26

Phần 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Kết quả phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi 29

4.1.1 Kết quả phân lập 29

4.1.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi 30

4.1.3 Định danh chủng nấm LC1 32

4.1.4 Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1 34

4.1.5 Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng các yếu tố đến sinh trưởng của nấm LC1 35

4.2 Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi trong điều kiện in vitro 38

4.2.1 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm LC1 38

4.2.2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn 41

4.2.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 44

4.3 Đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trên trực tiếp cây linh chi đã bị nhiễm bệnh 52

4.4 Thảo luận 54

4.4.1 Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi 54

4.4.2 Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi 55

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Kiến nghị 57

Tài liệu tham khảo 58

Phụ lục 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả phân lập nấm nấm mốc gây bệnh 29 Bảng 4.2 Kết quả quan sát nấm LC1 gây bệnh bằng kính hiển vi 32 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm mốc xanh gây

bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 40 Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc xanh gây

bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 41 Bảng 4.5 Một số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 116 sau 5 ngày nuôi ở 30oC 44 Bảng 4.6 Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 116 46 Bảng 4.7 Khả năng sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau của chủng xạ

khuẩn 116 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi 7

Hình 2.2 Cấu tạo thành tế bào của nấm 8

Hình 4.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 31

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 33

Hình 4.3 Kết quả xây dựng cây phân loại cho chủng LC1 34

Hình 4.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm mốc LC1 35

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên nấm mốc xanh 36

Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH tới nấm mốc xanh 37

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên nấm mốc xanh 38

Hình 4.8 Kết quả thử hoạt tính kháng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi của một số chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 39

Hình 4.9 Vi khuẩn đối kháng với nấm LC1 41

Hình 4.10 Hình thái, màu sắc khuẩn lạc chủng xạ khuẩn 116 trên môi trường ISP2 sau 5 ngày nuôi cấy ở 30°C 42

Hình 4.11 Hình thái chuỗi bào tử và hệ sợi khuẩn ty của chủng xạ khuẩn 116 42

Hình 4.12 Hình thái, màu sắc chủng xạ khuẩn 116 nuôi cấy trên một số môi trường 44

Hình 4.13 Hình thái, màu sắc khuẩn lạc của Vi khuẩn trên môi trường LB sau 3 ngày nuôi cấy ở 30°C 45

Hình 4.14 Hình thái bào tử của các chủng vi khuẩn 45

Hình 4.15 Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 116 48

Hình 4.16 Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 50

Hình 4.17 Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 51

Hình 4.18 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 ở các nhiệt độ,20,30,37, 40 và 50°C 53

Hình 4.19 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn 53

Hình 4.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn 54

Hình 4.21 Thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp cây Linh chi bị nhiễm nấm mốc xanh 55

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan

Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu: Phân lập và nghiên cứu về nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) Từ đó tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro Sau đó tiến hành thử khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn được trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh

Phương pháp nghiên cứu:

Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện in vitro với đầy đủ thiết bị, máy móc, hóa chất cần thiết và phòng cách li, từ tháng 2-9/2017

Phương pháp phân lập, nuôi cấy, tái lây nhiễm nhân tạo, nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh trưởng của các yếu tố môi trường, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn cacbon của nấm mốc gây bệnh Phương pháp tách chiết DNA và định danh chủng nấm gây bệnh

Phương pháp hoạt hóa, nuôi cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và vi khuẩn với nấm mốc gây bệnh bằng khuếch tán đĩa thạch Nghiên cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn nitrogen, khả năng chịu muối Bố trí thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đã tuyển chọn được trong điều kiện in vitro với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây Linh chi

Kết quả chính và kết luận:

1 Từ những mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh, đã phân lập được chủng nấm mốc xanh kí hiệu LC1 Tiến hành lây nhiễm nhân tạo thành công để khẳng tính gây bệnh của nấm mốc xanh LC1

2 Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng LC1 cho thấy khuẩn lạc chủng LC1 có màu xanh, hệ sợi khí sinh, dễ phán tán bào tử Sinh trưởng rất tốt trên các môi trường có nguồn đường đa (lactose, saccarose, mantose), tốt nhất trên môi trường chứa D-glucose Phát triển trong phổ nhiệt độ và pH rộng, nhiệt độ tối

ưu nằm trong khoảng 25-30oC và pH tối ưu là 5,5-6,5

3 Qua phân tích các đặc điểm sinh học kết hợp với kết quả định danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1

4 Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01, KCO3 đối kháng mạnh với nấm LC1 trong điều kiện in vitro

5 Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn

116 có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, không có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn, bào tử hình bầu dục chúng tôi dự đoán chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces

6 Qua thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn 116 với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho thấy chủng 116 có thể năng giảm thiểu sự lây lan của vết bệnh nhưng không thể diệt hoàn toàn được bệnh nấm mốc xanh trên cây Linh chi bị bệnh

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Kieu Lan

Thesis title: Research on using resistant microorganisms againts Green Mold Disease

of Ganoderma sp (Ganoderma sp.) in vitro

Major: Biotechnology Code: 60 42 02 01

Educational organnization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives:

Research and isolate the green mold diseases of Ganoderma sp (Ganoderma sp.), to select the strain of microorganisms that strongly resist to the green molds in vitro Experiment to test the resistance of selected strains of microorganisms against the green mold disease directly in infected Ganoderma mushrooms

Material and methods:

All experiments were conducted in in vitro conditions with adequate equipment, machinery, chemicals and isolation rooms, from 2-9 / 2017

Methods of isolation, culture, artificial re-infection, research on the influence of environmental factors, pH, temperature on the growth, the ability to use carbon sources

of pathogenic molds, DNA extraction and identification of pathogenic fungi

Methods of activation, culture, resistance test of actinobacteria and bacteria against pathogenic molds by disk diffusion method Research on the influence of culture medium, pH, temperature, ability to use nitrogen source, salt tolerance on the growth of actinobacteria, bacteria Experiment designed to test the resistance of selected microorganisms against the green mold disease in infected Ganoderma mushrooms under in vitro conditions

Main findings and conclusions:

1 From the specimens of infected Ganoderma lucidum We isolated the strain of pathogenic mold and signed LC1 Artificial reinfection successful conducted to confirm the pathogenicity of the LC1 strain

2 Research on morphological characteristics and biological characteristics of LC1 showed that LC1’s colony has green color, it is aerial mycelium, spore easily disperse LC1 grow well in lactose, saccharose, and mantose environments, especially

on mediums containing D-glucose Develop in wide temperature and pH range, optimum temperature is between 25-30oC and optimum pH is 5.5-6.5

3 By analyzing the biological characteristics associated with the identification results, the LC1 strain closely relate to Penicillium citrinum and we named it Penicillium citrinum LC1

4 An actinobacterial strain: 116 and two bacterial strains: GL01, KCO3 are selected have strongly resistance agianst to LC1 in in vitro condition

5 By researching on the morphological and biological characteristics, an actinobacteria strain: 116 is branched aerial mycelium , straight filaments, aseptate hyphae, short chains of oval spores We estimate that the actinobacterium strain: 116 belong to the Streptomyces genus

6 From the experiment to to test the resistance of selected microorganisms against the green mold disease in infected Ganoderma mushrooms under in vitro conditions The result show that the actinobacteria strain: 116 can reduce the spread of lesions but isn’t able to completely eradicate the green molds disease on the infected Ganoderma mushrooms

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm Linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim

(Ganodermataceae) Nấm Linh chi còn có những tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung Nấm Linh chi là một dược liệu mà con người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc Trong "Thần nông bản thảo" xếp Linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm Trong "Bản thảo cương mục" coi Linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày); gần đây các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi còn có tác dụng phòng và chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ

Ở các nước Đông Nam Á, nhất là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô rộng lớn, cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất, tác dụng dược lý Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều bệnh làm giảm chất lượng và sản lượng gây thiệt hại đến năng suất nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng, đáng chú ý là bệnh nấm mốc xanh Do đó chúng ta cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc gây bệnh trên nấm Linh chi đồng thời tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh làm cơ sở để đưa ra giải pháp phòng chống bệnh Trong nền nông nghiệp hiện đại người ta sử dụng nhiều chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật để thay thế dần các hóa chất vốn đã rất độc hại với con người và môi trường Vì thế việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học bằng các chế phẩm sinh học là giải pháp an toàn và hiệu quả, khắc phục được nhược điểm từ nông dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng

Xuất phát từ những lý do trên và được sự cho phép của bộ môn cũng như thầy hướng dẫn, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro”

1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI

 Phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi

 Tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi và nghiên đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn được

 Đánh giá được khả năng đối kháng của vi sinh vật trên trực tiếp cây Linh chị bị nhiễm nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro

1.3 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

 Phân lập được chủng nấm mốc xanh từ các mẫu nấm Linh chi bị nhiễm bệnh

 Lây nhiễm nhân tạo để xác định chính xác khả năng gây bệnh

 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm mốc xanh gây bệnh đã phân lập

 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm mốc xanh

 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh

 Xác định được khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của chủng vi sinh vật trên trực tiếp cây Linh chi trong điều kiện in vitro

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NẤM LINH CHI

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loài nấm thường được tìm thấy ở các nước Á Đông Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người

Những loại nấm Linh chi được sử dụng rộng rãi trong y học gồm: G lucidum, G luteum Steyaert, G atrum Zhao, Xu and Zhang, G tsugae Murrill,

G applanatum (Pers.: Wallr.) Pat., G australe (Fr.) Pat., G capense (Lloyd) Teng, G tropicum (Jungh.)Bres., G tenue Zhao, Xu and Zhang, and G sinense Zhao, Xu and Zhang

Ở mỗi nơi nấm linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan) Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc) Theo hai cuốc sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập Tuy nhiên, trong các văn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ

Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấm Linh chi Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất nhiều loại khác nhau dựa vào quả thể cũng như hình dáng bên ngoài của nấm

Ở phương Tây, theo bảng phân loại của Alexopolus năm 1979, Lingzhi thuộc giống nấm Linh chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes chi Aphyllophorales và thuộc họ Polyporaceae Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực vật học người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm Linh chi dựa vào

lớp biểu bì bên ngoài của nấm Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano

và Steyaert, … Sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình quả trứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ Cũng từ đó, nấm Linh chi không còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa

2.1.2 Tình hình trồng nấm Linh chi

Theo Wuang X J (Chang, 1993) thì từ đầu thế kỷ 17 (1621) các loại Nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi giá tri dược liệu của chúng Gần nay người lại tìm thấy trên núi Maiji tỉnh Gansu, một tấm bia đá khắc năm

1124 ghi chép về nuôi trồng 38 loại nấm Linh chi Ngày nay, thế giới hàng năm sản xuất được khoảng 4.300 tấn, riêng Trung Hoa trồng khoảng 3000 tấn còn lại

là các nước khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Ðài Loan, Hoa Kỳ, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Sri Lanka và Indonesia

Nhật bản có nghề trồng nấm truyền thống mỗi năm thu đạt gần 1 triệu tấn nấm Nhật Bản là nước có sản lượng nấm cao nhất thế giới Nấm Linh chi vẫn được coi là “thượng dược” được xếp vào hàng siêu dược liệu, trên cả nhân sâm (Panax ginseng) Giá bán tính ra tại thị trường Nhật Bản lên tới trên 200 USD/kg thể quả khô đóng gói Hàn Quốc nổi tiếng với nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) mỗi năm suất khẩu thu về hàng trăm triệu USD Ở Trung Quốc từ những năm 1960 bắt đầu trồng nấm có áp dụng các biện pháp cải tiến kỹ thuật nên năng suất tăng gấp 4-5 lần và sản lượng tăng vài chục lần Hàng năm Trung Quốc xuất khẩu hàng triệu tấn nấm sang các nước phát triển thu về nguồn ngoại

tệ hàng tỷ đô la Hiện nay Trung Quốc đã dùng kỹ thuật (Khuẩn thảo học) để trồng nấm nghĩa là dùng các loại cỏ, cây thân thảo để trồng thay cho gỗ rừng và nguồn nguyên liệu tự nhiên ngày càng cạn kiệt

Ở Đài Loan, Peng (1990), Hseu (1992) báo cáo đã sưu tầm, nuôi trồng tới hơn 10 loài Ganoderma khác nhau Song Trung Quốc vẫn được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng, sản xuất nấm Linh chi (Zhao et Zhang, 1994) Hàn Quốc cũng chiếm một thị phần đáng kể Đài Loan áp dụng các kỹ thuật tiên tiến và công nghiệp hóa trong nghề nấm đã có mức tăng trưởng tăng hàng trăm lần

Các nước vùng Đông Nam Á gần nay cũng bắt đầu công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình nuôi trồng nấm Linh chi ngắn ngày trên các phế thải giàu chất xơ, thậm chí cho thu hoạch thể quả chỉ sau

40 ngày (Teow et al., 1994) Ở Thái Lan đã có một số trạng trại cỡ vừa nuôi trồng Ganoderma lucidum Linh chi cũng được nuôi trồng từ 1929 ở Ấn Độ (Bose,1929) và phát triển ở qui mô nhỏ Ngày nay nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Mỹ, nuôi trồng và đã sản xuất nấm cùng các chế phẩm Linh chi làm thuốc và dược phẩm dưỡng sinh Hằng năm doanh thu của các chế phẩm chống ung thư điều chế từ linh chi ở Đài Loan đạt trên 350 triệu USD

Ở Việt Nam viện Dược liệu - Hà Nội đã trồng nấm Linh chi (giống Trung Quốc) thành công vào năm 1987 Chín năm sau, các nhà khoa học thuộc Đại học khoa học tự nhiên đã chọn được giống nấm Linh chi mọc hoang ở rừng núi Lâm Đồng để nhân giống và đưa vào sản xuất tại trại trồng nấm Linh chi của Xí nghiệp Dược Phẩm Trung ương 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988

Tại Việt Nam, Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác đã nói về Linh chi từ lâu và Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “Nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam” Song gần nay, loài chuẩn Ganoderma lucidum mới được nuôi trồng thành công trong phòng thí nghiệm (1978) và vào thập niên 90, Linh chi mới thật sự bùng nổ tại TP Hồ Chí Minh (Đỗ Tất Lợi et al., 1994), sản lượng hàng năm mới đạt khảng 10 tấn/năm (Cổ Đức Trọng, 1991, 1993) Nghề trồng nấm ở Việt Nam đang phát triển những quy mô nhỏ lẻ hộ gia đình, trang trại mỗi năm sử dụng vài tấn nguyên liệu có sẵn tới vài trăm tấn /1 cơ sở để sản xuất nấm

Nhìn chung nghề trồng nấm linh chi phát triển mạnh và rộng khắp, đem lại hiệu quả kinh tế rất lớn, nhất là trong 20 năm gần đây Trong sinh học nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong nghề nấm về chọn tạo giống nấm, về kỹ thuật nuôi trồng và sự bùng nổ thông tin, nghề trồng nấm đã và đang phát triển trên toàn thế giới, được coi là nghề xóa đói giảm nghèo và làm giàu thích hợp với các vùng nông thôn, miền núi

2.1.3 Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học

Linh chi (Ganoderma) có chu trình sống giống các loại nấm đảm khác, vị trí phân loại như sau:

 Ngành: Eumycote

 Quả thể nấm linh chi cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối điện với mũ nấm)

 Cuống nấm dài hoặc ngắn hay không cuống, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3cm Cuống nấm cứng, ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

 Mũ nấm (tai nấm) hoá gỗ, xoè tròn, khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt, hình bầu dục hoặc thận Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc

từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím, nhẵn, được phủ bởi lớp sắc tố bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2-15cm, dày 0,8-1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong

ra ngoài

Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên Trên lát cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm)

Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2

- 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores)

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi

- Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên Trên lát cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm)

- Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2

- 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores)

*) Thành phần hóa học và của nấm Linh chi

Theo Wachtel-Galor et al (2011), loại nấm này có thành phần hoạt chất sinh học khá đa dạng, chứa vitamin, khoáng chất, có tất cả acid amin thiết yếu (đặc biệt giàu leucine và lysine) Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ acid béo không

no cao là một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm Linh chi

Không như nhiều loài nấm khác có hàm lượng nước đến 90%, nấm Linh chi tươi chỉ chứa khoảng 75% nước Thành phần chủ yếu của G lucidum là chất

xơ, carbohydrate, chất béo và protein, trong đó tỉ lệ xơ thô là trên 50% khối lượng khô (Mau et al., 2001; Wasser, 2010) Các nghiên cứu cho thấy thể quả, khuẩn ty và bào tử của nấm có chứa khoảng 400 hoạt chất sinh học khác nhau, chủ yếu là các polysaccharide, triterpenoid, nucleotide, acid béo, sterol, steroid, protein/peptide, các nguyên tố vi lượng

Trong nghiên cứu của Mizuno (1995), chiết xuất G lucidum chứa các kim loại như kali, magnesi, calci, natri, sắt, kẽm, mangan, đồng, selenium và germanium; trong đó kali, magnesi, calci là những thành phần kim loại chính, và germanium đứng thứ 5 trong số các kim loại có hàm lượng cao nhất (489 µg/g)

Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan trọng nhất trong Linh chi (Skalicka-Woźniak et al., 2012; Wasser, 2010)

Dựa vào nhiều kết quả nghiên cứu, Wachtel-Galor et al (2011) nhận định rằng trong G lucidum còn có các hợp chất khác được xem là có tác dụng dược lý như một số protein và lectin Các protein có hoạt tính sinh học đã được phát hiện bao gồm: Ling Zhi-8; G lucidum peptide có hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa; ganodermin có tác dụng kháng nấm từ thể quả G lucidum Một số lectin được tách chiết từ thể quả và khuẩn ty của Linh chi có khả năng làm đông tụ hồng cầu hoặc tăng cường chức năng miễn dịch Các thành phần khác gồm enzyme như metalloprotease làm chậm quá trình đông máu; tác nhân ức chế α-glucosidase rất đặc hiệu từ thể quả của Linh chi,

*) Cấu tạo thành tế bào của nấm

Thành tế bào nấm được câu tạo từ β-(1,3)-glucan , Mannoprotein và chitin

Hình 2.2 Cấu tạo thành tế bào của nấm

Nguồn: Carmen Sánchez (2016)

Thành tế bào tạo thành cấu trúc hỗ trợ và bảo vệ tế bào, ngoài ra nó còn hoạt động với chức năng lọc Một chức năng quan trọng của thành tế bào là hoạt động như một nồi áp suất, ngăn chặn sự giãn nở quá mức khi nước đi vào tế bào (Carmen Sánchez, 2016)

2.1.4 Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi

Nấm Linh chi cũng như bất kì loại cây trồng nào đều có thể mắc phải nhiều loại bệnh khác nhau do các nguyên nhân như sâu bệnh hại, bệnh nhiễm do

vi khuẩn, virus và nấm bệnh Kết quả sẽ đẫn tới giảm chất lượng và sản lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng

Theo trung tâm ứng dụng tiến bộ KH& KT Quảng Trị, sâu bệnh và một số loài động vật hại nấm bao gồm các nhóm sau:

Nhóm động vật hại nấm: Chuột, sên, ốc, mối, kiến Để phòng trừ các tác nhân gây hại này chúng ta chỉ có cách đánh bẫy, bả chuột, rắc hoá chất xua đuổi mối, kiến, gián, sên, ốc

Rệp (Mites- bọ mạt) có kích thước rất nhỏ như hạt bụi, có màu trắng nhạt, chúng sinh sản rất nhanh theo kiểu bọc ấu trùng, chúng cắn sợi nấm và hút chất dinh dưỡng của sợi, quả thể làm chết sợi và quả thể không lớn được, gây mất mùa tới 100%

Các loại ruồi nấm: Ruồi nhỏ (Mycophila fungicola) kích thước dài 1,0 - 1,2mm và ruồi lớn (Drosophila immigrans) thân dài 3 - 4mm sải cánh 7 - 9mm

Ấu trùng của ruồi ăn sợi nấm, con trưởng thành chích hút vào mũ nấm làm nấm

có các vết đen, ăn sâu vào mũ nấm

Tuyến trùng (Nematodes) như 1 loại giun chỉ rất nhỏ chỉ dài khoảng 1mm, thường ở trong đất ẩm hoặc nước bẩn Có 2 loại tuyến trùng: tuyến trùng ký sinh trên hệ sợi nấm và tuyến trùng gây thối nhũn nấm Tuyến trùng chịu nóng yếu sẽ

bị chết 100% ở nhiệt độ 60oC là 1 phút

Sâu bệnh hại nấm chủ yếu là các loại côn trùng, rệp, nhện gây tác động cơ học làm hư hại sợi nấm và quả thể không thể dùng các loại thuốc trừ sâu như ở các loại cây trồng khác Biện pháp chủ yếu là phòng ngừa bằng cách giữ vệ sinh nhà nuôi trồng nấm Cách ly nguồn lây nhiễm sâu bệnh để hạn chế thiệt hại ở mức thấp nhất

Hệ sợi và phát triển hình thành quả thể của nấm Linh chi phụ thuộc nhiều vào các điều kiện sinh thái Hình thái và năng suất nấm phụ thuộc vào giống nấm

và điều kiện nuôi trồng Gặp điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2, pH bất lợi, sợi nấm và quả thể nấm đều có phản ứng sinh bệnh nên người ta gọi loại bệnh này là bệnh hại sinh lý của nấm Bệnh hại sinh lý là loại bệnh không kèm theo mầm bệnh xảy ra trong quá trình nuôi trồng Bệnh hại sinh lý của nấm xảy ra trong giai đoạn sợi nấm phát triển hay giai đoạn hình thành quả thể Bệnh chết sợi giống biểu hiện khi giống nấm cấy vào các túi giống đã hấp khử trùng sau một thời gian từ 3-5 ngày nuôi sợi không thấy giống ở các túi nấm không có hiện tượng bung sợi hoặc sợi mọc nhưng không bám vào cơ chất Nếu kéo dài thời gian, hạt có sợi giống sẽ bị mốc xanh hoặc nhũn nát, không còn màu trắng của sợi giống nấm ban đầu Có nhiều nguyên nhân làm chết sợi giống trong đó chủ yếu là cơ chất không thích hợp, trong bịch cơ chất đã bị nhiễm khuẩn, có độc tố, bịch nấm bị nhiễm mốc sinh nhiệt CO2, cơ chất quá khô hoặc quá ướt Biện pháp khắc phục là kiểm tra nguồn nguyên liệu và quá trình chế biến, thực hiện đúng quy trình hấp khử trùng túi giá thể và che chắn khu vực ươm sợi nếu nhiệt độ quá lạnh hoặc thông thoáng nếu nhiệt độ quá nóng Bệnh sợi nấm mọc yếu, nhanh chóng lão hóa được biểu hiện sợi giống nấm phát triển nhanh, hệ sợi mảnh, mờ nhạt, không mọc sâu vào cơ chất (cơ chất không chuyển màu) hoặc nhanh chóng kết sợi xù lên như bông Do cơ chất quá ẩm hoặc quá khô, một nguyên nhân khác

là do giống quá yếu do quá trình nhân giống các cấp giống gốc bị nhân chuyền nhiều lần hoặc dovận chuyển, bảo quản không tốt giống bị giảm sinh lực Biện pháp khắc phục kiểm tra độ ẩm nguyên liệu cẩn thận trước khi đóng túi, xử lý nguyên liệu đúng quy trình kỹ thuật, chọn giống tốt, đảm bảo yêu cầu chất lượng Bệnh sợi nấm bị co sợi ban đầu sợi giống bung sợi và sinh trưởng bình thường, nhưng khi sợi mọc gần đến đáy túi thì dừng lại, không mọc tiếp và chuyển sang màu trắng thạch cao Do độ ẩm trong cơ chất quá cao thường đọng ở đáy bịch nấm, cơ chất bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó quá trình xử lý nguyên liệu cho liều lượng vôi quá cao cũng là nguyên nhân gây ra tình trạng co sợi Biện pháp khắc phục có thể lật ngược túi nấm hoặc dùng kim chọc túi tại chỗ đọng nước để nước chảy ra ngoài

Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển hình thái quả thể nấm Linh chi Nhiệt độ thích hợp cho việc nấm ra quả thể dạng hình trứng là 20-350C, tốt nhất là 300C (Wagner et al., 2003), trong giai đoạn này, nếu nhiệt độ thay đổi lạnh đột ngột thì toàn bộ quả thể sẽ ngừng phát triển, teo đầu và trở nên khô cứng và có màu vàng nâu Vì vậy cần chọn tạo giống

khỏe có sức chống chịu tốt, giống nấm nuôi cao sản, chịu nhiệt để phù hợp với từng mùa Bên cạnh đó, độ ẩm không khí cũng ảnh hưởng đặc biệt đến giai đoạn phát triển của quả thể Nấm Linh chi hình thành quả thể tốt nhất ở độ ẩm không khí 80 – 95% Ở độ ẩm không khí thấp (khoảng 50%) nấm Linh chi sẽ ngừng phát triển và khô, nếu nấm ở dạng phiến sẽ bị khô bìa mép và cuốn lại, chuyển thành màu vàng và không phát triển Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp

độ ẩm không khí cao chưa hẳn là tốt đối với nấm Linh chi Quả thể nấm Linh chi sẽ mềm nhũn và thối ở độ ẩm lớn hơn 95% Nồng độ CO2 cũng gây ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Khi nhà trồng nấm Linh chi thiếu oxy, nồng độ CO2 quá cao thì ảnh hưởng rõ rệt đến sự kéo dài của cuống nấm Trong trường hợp này nấm Linh chi có cuống dài, chia nhánh ốm và mảnh, phiến nấm rất nhỏ Biện pháp khắc phục tăng độ thông thoáng bằng cách dùng lưới che chắn hoặc dùng quạt để thông khí hằng ngày và không nên để quá nhiều túi nấm trong nhà trồng

Bệnh nhiễm yếu tố gây bệnh rất đa dạng, chủ yếu là các nhóm vi sinh vật như: vi trùng, nấm mốc xanh (Trichoderma spp.), nấm mốc cam (Neurospora spp.), nấm nhầy (Myxomycetes), nấm dại… hoặc do ấu trùng ruồi (dòi)… hay cũng có thể do tuyến trùng gây ra.Theo Lê Duy Thắng (2005) cơ chất dùng nuôi cấy hoặc trồng nấm cũng có thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác Trong

đó, vi khuẩn và nấm mốc có tốc độ sinh sản nhanh,đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm của chúng thường nhiều hơn Ở đa số trường hợp ghi nhận được, thì nấm trồng có khả năng ức chế một phần mầm bệnh, thậm chí bao chụp lên vết bệnh và vẫn ra tai nấm bình thường, tất nhiên sản lượng nấm

sẽ giảm sút so với không bệnh Nếu trường hợp nhiễm kèm theo ẩm độ nguyên liệu cao hoặc pH acid (chua) có thể ức chế tơ nấm ăn lan và bệnh phát triển gây

hư hỏng toàn bộ cơ chất Đa số trường hợp nấm mốc và vi khuẩn trở thành gây hại là làm biến đổi môi trường, tạo ra nhiều sản phẩm bất lợi đối với nấm trồng Bệnh do vi khuẩn (Bacteria) gây nhiễm môi trường nuôi trồng nấm là chủ yếu

Vi khuẩn phân bố rất rộng, tốc độ sinh sản lại rất nhanh ở nhiệt độ 32 – 34oC, gây thiệt hại rất lớn cho nghề trồng nấm Vi khuẩn nhiễm vào quả thể thường ở chân hoặc phiến nấm, chúng hút dinh dưỡng làm quả thể bị khô xác, mũ nấm bị vết thâm đen, thối nhũn hoặc gây những vết nâu ở mũ nấm.Vi khuẩn cũng không

có thuốc đặc hiệu, chủ yếu phòng bằng biện pháp tuân thủ đúng quy trình hấp khử trùng và vệ sinh

Có rất nhiều loại nấm dại luôn xâm nhiễm vào môi trường trồng nấm (vi nấm hoặc nấm lớn có quả thể) Trong các loại nấm dại thuộc nấm có quả thể lớn gây nhiễm bệnh cho cơ chất trồng nấm có khoảng 7 loại nhưng ở nước ta thấy phổ biến một số loại gây bệnh cho Linh chi như sau: nấm mực (Chi Coprinus sp) miền Nam gọi là nấm gió thường mọc trên các mô nấm rơm, luống nấm mỡ, bịch nấm sò thậm chí cả trong các bịch mùn cưa trồng mộc nhĩ Nấm hoa cúc có kích thước mũ nấm bằng đồng xu, chân nấm như cái tăm Đối với vi nấm, Linh chi rất

dễ mẫn cảm với bệnh nấm mốc, đa số trường hợp nấm mốc gây hại là làm biến đổi môi trường, tạo ra nhiều sản phẩm bất lợi đối với nấm trồng Nấm mốc là sự hình thành vi mô của nấm, phát triển thành từng mảng, có thể nhìn thấy dưới điều kiện thích hợp Chúng có thể được tìm kiếm ở khắp mọi nơi, sống quanh năm ở cả điều kiện trong nhà hoặc ngoài trời Có hàng ngàn loài nấm mốc với các loại màu sắc: trắng, cam, xanh, nâu hoặc đen

Nấm mốc sẽ phát triển nhanh chóng nếu gặp điều kiện thuận lợi : nơi ẩm ướt, độ ẩm cao, ít ánh sáng mặt trời

Nấm mốc phát sinh ra hợp chất hữu cơ rễ bay hơi, phát tán trong không khí, gấy mùi nồng và khó chịu Nếu bị nhiễm hợp chất này sẽ làm mắt bị dị ứng, đường hô hấp bị viêm nhiễm gây ra nhức đầu, chóng mặt, viêm mũi, mệt mỏi

Ngoài ra nấm mốc sinh ra độc tố chống lại những loại nấm hoặc vi khuẩn khác, vô tình độc tố này tác gây động đến con người

Hai độc tố nguy hiểm là islanditoxin do nấm mốc Penicillium islandicium

và citrinin do nấm mốc Penicillium citrinum tiết ra trên các thực phẩm bị nhiễm các nấm này khiến người sử dụng bị tổn thương về gan, sơ gan và ung thư

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, có một số loại nấm mốc thường gặp sau đây rất có hại cho sức khỏe con người :

Nấm mốc liên bào (thuộc họ Streptococus) màu hồng (mốc hoa cau) có nhiều ở nút bông bị ướt, túi bị vỡ hay bị thủng Nấm mốc phát triển rất nhanh chỉ sau 18 - 20 giờ là tạo thành đám mốc màu hồng phấn (màu hoa cau)

Mốc cam (Neurospora) đây là mốc hoại sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ăn đầy bịch phôi, tơ có màu vàng hoặc hồng Sau đó xuất hiện khối thịt nấm màu cam qua miệng bịch hoặc vết rách trên bịch Bệnh lây lan nhanh nên cần cô lập và dập ngay nguồn bệnh

Nấm nhầy (Exomycetes) Nấm nhầy là sinh vật chưa phải là nấm và gồm

hai giai đoạn: giai đoạn động vật, nấm có dạng amib, nhưng nhìn bằng mắt thường như một đám bọt và nhầy nhớt Vai đoạn thực vật, nấm tạo dạng rễ tre và bắt đầu sinh ra cấu trúc đặc biệt là những cọng râu tua tủa màu nâu đen (ở Stemonitis hay nấm râu) hoặc những bọc nhỏ, như quả cà tím, màu vàng đến cam (ở Arcyria)… Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn kệ bằng gỗ hay nguyên liệu xử lý không tốt Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hay đục sữa, nhưng phổ biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặc vàng Thể sinh sản gồm các túi mang bào tử Bệnh làm giảm chất lượng nấm và cạnh tranh một phần thức ăn, nhưng nấm vẫn có thể tạo tai và phát triển bình thường

Nấm mốc trứng cá (Sclerotium rolfsii): Loại mốc này thường nhiễm trên các túi nấm Linh chi nguyên liệu bị dính nước mưa Sợi nấm mốc trứng cá rất mảnh, có màu trắng nhạt phát triển rất nhanh trên cơ chất, nhanh gấp 5 lần sợi nấm Linh chi Sợi nấm mốc phát triển bện kết với nhau tạo thành những hạt có màu trắng đục hoặc nâu nhạt như trứng cá, rất cứng

Nấm mốc xanh màu oliu (thuộc giống Chactomium giống Trichoderma spp) mốc xanh lam (giống Penicillium, verticillium fungicola).Mốc xanh có hệ sợi mảnh, mọc sát vào cơ chất Vết bệnh trải rộng nhanh, bào tử tạo thành dề, mịn, ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh lục hoặc xanh lam Nhóm mốc này tấn công trên bịch đã có tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) Đây là mốc ký sinh và khả năng gây hại rất lớn Nguyên nhân do quá trình di chuyển làm dập tơ nấm hoặc do khí hậu thời tiết không thuận lợi làm nấm yếu dễ phát sinh bệnh Chúng cạnh tranh dinh dưỡng, nguồn ô xy với nấm Linh chi, đồng thời tiết ra độc tố ức chế và tiêu diệt sợi nấm Linh chi

Tất cả các loại nấm mốc đều gây nguy hiểm cho con người

Biện pháp phòng trừ các bệnh nhiễm do nấm có thể sử dụng thuốc vì thuốc vẫn là cách dập dịch bệnh nhanh và hữu hiệu nhất, nên trong trồng nấm vẫn phải dùng một số thuốc để phòng ngừa và điều trị các bệnh ở nấm

Ví dụ một số thuốc thường được dùng để đặc trị:

- Nấm mốc: Bennomyl (Benlate– C), Bordeaux(sulfat đồng), Mancozeb (Dithane,Maneb), Zineb (Tritofboral)…

- Côn trùng: Azodrin 50DD, DDVP2% 50ND (Diclorodivinyl phosphat), Furadan 3H…

- Ruồi, nhện: Basudin10H 50ND (Diazinon, Dd Diazital), Gama HCH (g Hexacloro–cyclohexan) (Lindane…

Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc không phải là biện pháp tối ưu, nó thường dẫn đến các hậu quả xấu như:

– Gây độc cho người, động vật tiếp xúc trực tiếp với thuốc

– Gây độc cho môi trường

– Ảnh hưởng đến nấm trồng, làm tơ yếu dễ nhiễm bệnh hơn Trong nhiều trường hợp tơ bị chết hoặc quả thể ngừng tăng trưởng

– Giảm chất lượng sản phẩm: nấm có thể tích lũy các chất độc của thuốc

và sản phẩm của nó hoặc tai nấm trở nên độc cho người sử dụng

– Làm mất cân bằng sinh thái: thuốc diệt mầm bệnh nhưng đồng thời cũng diệt cả các sinh vật có lợi, bao gồm những “thiên địch” của đối tượng gây bệnh hay những kẻ thù của chúng Thí dụ: kiến ăn nhện mạt (mites) Vì vậy khi bệnh phát triển trở lại, thì lan truyền rất nhanh và hậu quả nghiêm trọng hơn gấp nhiều lần

– Sự nhờn thuốc: việc sử dụng thường xuyên thuốc diệt khuẩn, diệt côn trùng, nhất là tình hình lạm dụng thuốc trong trồng nấm hiện nay có thể dẫn đến hậu quả là vi trùng, nấm mốc hoặc côn trùng quen dần với thuốc (nhờn thuốc) Đến khi dịch bệnh phát triển khó chặn đứng

Vì vậy, hiện nay việc sử dụng thuốc không phổ biến và không được

khuyến khích Rất nhiều dự án hướng đến nghiên cứu và chế tạo chế phẩm sinh học từ nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn bởi tính an toàn của nó

2.1.5 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật

Xạ khuẩn

Xạ khuẩn được biết đến là vi sinh vật có khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: các loại kháng sinh, các tác nhân chống ung thư, ức chế miễn dịch… Trong đó, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn Xạ khuẩn sản sinh một lượng lớn kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh kháng sinh và vai trò của kháng sinh trong chu trình sống của xạ khuẩn cũng chưa được hiểu rõ Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào hay được phóng thích ra ngoài môi trường (Nguyễn Văn Cách, 2004)

Chi Streptomyces của xạ khuẩn – chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất, chiếm hơn 2/3 các kháng sinh tự nhiên đã phát hiện được (Watve et al., 2001), trong đó nhiều kháng sinh đã được ứng dụng và có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh như aminoglycosides, anthracyclines, chloramphenicol, beta-lactams, macrolides và tetracyclines (Bùi Thị Hà, 2008)

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chủ yếu là trong đất, nước và chúng đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực: trong bảo vệ thực vật, trong y học, trong nông nghiệp, trong sản xuất…

Đã có rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu xạ khuẩn để ức chế các vi sinh vật gây bệnh bởi các kháng sinh mà chúng sinh ra Ví dụ, trong bảo vệ thực vật thì sự đối kháng giữa các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đẩt làm giảm tỉ lệ mắc bệnh của cây Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể

ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất

Hiện nay, mở rộng nghiên cứu xạ khuẩn trong việc ức chế các vi sinh vật gây bệnh, không chỉ ở cây trồng hay trong đất mà còn cả các vi sinh vật gây bệnh trên người, trên động vật hay thủy hải sản chính là một hướng mới được nhiều nhà khoa học quan tâm, nhằm tạo ra một phương pháp phòng trừ, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh một cách hiệu quả và thân thiện với môi trường

 Các vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở cùng rễ cây hoặc sống hoại sinh trong đất (Schlegel, 1981) Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu về hiệu lực đối kháng của vi khuẩn đối với các tác nhân gây hại (nấm , vi khuẩn) Kết quả cho thấy loài vi khuẩn đối kháng có thể bảo vệ cây trồng,

chống lại vi sinh vật nhân gây bệnh đồng thời giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt (Weller, 1988; Défago et Haas, 1990; Kloepper, 1993)

Cơ chế tác động của vi khuẩn đối kháng:

- Vi khuẩn đối kháng có khả năng cạnh tranh nguyên tố dinh dưỡng sắt (Fe) (Scher, 1986)

- Vi khuẩn đối kháng có khả năng sản sinh ra cyanide, quy nạp (làm tăng) tính chống chịu của cây, sản sinh ra chất kích thích sinh trưởng và có khả năng phân giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh tiết ra (Utsumi et al., 1988; Toyoda et al., 1988)

- Vi khuẩn đối kháng có khả năng cạnh tranh, chiến chỗ rất thuận lợi ở vùng rễ (Bull et al., 1991; Paker, 1990)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu

- Mẫu nấm bệnh nhận từ Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam”

- Các chủng vi sinh vật được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian: Đề tài thực hiện từ 1/2017 – 9/2017

Hóa chất: Agar, D-glucose, đệm photphat, dịch chiết khoai tây, Tinh bột tan, Glucose, Fructose, Saccarose, cao nấm men, cao malt, cao thịt, K2HPO4,

KH2PO4, MgSO4, NaCl, KNO3, FeSO4…

Hóa chất tách chiết DNA tổng số:

 Môi trường PDA

 Nước chiết khoai tây : 200ml

 D-Glucose : 20g

 Agar : 20g

 Nước cất : 1000ml -> hấp khử trùng

Cách pha dịch chiết khoai tây

- Khoai tây gọt vỏ rửa sạch rồi mang đi cân Đối với 200g khoai tây ta cất nhỏ rồi thêm vào tương đương 1lit nước cất Đun khoai tây tầm 30 phút rồi lọc lấy dịch trong

 Môi trường SNA gồm:

+ Môi trường ISP1 (g/l): Tryptone 5 g; cao nấm men 3 g; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 7,0 - 7,2

+ Môi trường ISP2 (g/l): Cao nấm men 4 g; dịch chiết Malt 10 g; glucoza

+ Dung dịch muối vi lượng của ISP: Bột yến mạch 20 g; Agar 20 g; dung dịch muối vi lượng 1,0 ml; nước cất 1 lít; pH = 7,0 - 7,4

+ Môi trường PDA (g/l): nước chiết khoai tây; glucoza 20g; Agar 20g; nước cất 1 lít; pH = 7,0

+ Môi trường Czapek-dox (g/l): Saccharose: 30g; NaNO3: 3,5g; KH2PO4: 1,5g; KCl: 0.5g; MgSO4.7H2O: 0.5g; FeSO4.7H2O: 0.1g; Agar: 20g; Nước cất: 1 lít; pH = 5,0 – 5,5

+ Môi trường ISP9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64 g; KH2PO4 2,38 g;

K2HPO4.3H2O 5,65 g; MgSO4.7H2O 1 g; dung dịch B 1,0 ml; nguồn cacbon 10 g; Agar 20 g; nước cất 1 lít; pH = 6,8 - 7,0

Dung dịch muối B (%): CuSO4.5H2O 0,64 g; FeSO4.7H2O 0,11 g; MnCl2.4H2O 0,79 g; ZnSO4.7H2O 0,15g; nước cất 100 ml

Các nguồn cacbon: D-Glucose, D-Fructose, D-Maltose, Saccarose, Lactose, Dextrin, Xylose

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu

 Dùng dao, kéo cắt lấy quả thể nấm Linh chi bị bệnh cho vào túi nilong, buộc kín

 Ghi ngày, tháng, nơi lấy mẫu, đánh số, bảo quản lạnh

 Dùng dao, tăm đã khử trùng cạo bề mặt nấm mốc trên mẫu nấm Linh chi nhiễm bệnh đã được lấy ở trên Cấy lên bề mặt đĩa thạch đã có sẵn mẫu môi trường Mẫu được bọc lại và đem đi ủ ở 30°C Sau 2-3 ngày khuẩn lạc sẽ hình thành trên bề mặt môi trường

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy, làm thuần

 Khuẩn lạc trên đĩa petri được cấy chuyển sang môi trường PDA mới để nuôi cấy

 Dùng tăm đã khử trùng cấy chấm điểm trên bề mặt đĩa thạch Sau đó được đặt vào tủ nuôi 30°C trong 2-4 ngày Tiếp tục cấy chuyển đến cho đến khi chúng được làm thuần

3.2.3 Phương pháp giữ giống

 Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng:

Các chủng nấm sau đi được làm thuần thì sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống Các chủng được cấy trên bề mặt thạch nghiêng theo kiếu zíc zắc và nuôi ở 30ºC trong 4 ngày Ống giống được

bảo quản ở 4ºC, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

 Giữ giống trong glycerol

Giống được giữ trong ống eppendoft bằng glycerol 20% với tỷ lệ 20µl glycerol: 80µl nước cất (glycerol và nước cất đã được hấp khử trùng) Các chủng được dùng tăm đã vô trùng cấy vào và được bảo quan ở 4ºC, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

3.2.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Nuôi lỏng tĩnh các chủng nấm sợi trong môi trường PDA lỏng, thời gian

3-4 ngày trong nhiệt độ 30oC, sau đó dùng dao gây vết thương nhân tạo trên các quả thể nấm Linh chi, hút dịch nấm sợi ( đã nuôi lỏng trước đó) nhỏ lên vết thương nhân tạo Theo dõi kết quả sau từng ngày tái lây nhiễm, thí nghiệm lặp lại

3 lần

3.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học

 Tiến hành quan sát trực tiếp chủng nấm mốc trên môi trường PDA bằng mắt thường và quan sát dưới kính hiển vi quang học

 Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm trên PDA

 Khả năng phát triển của khuẩn lạc

 Cấy các chủng nấm sợi vào các đĩa peptri có chứa môi trường PDA, sau

đó lấy 1 tấm lamen vô trùng đặt nghiêng 1 góc 30-45ºC so với bề mặt thạch, nuôi

ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày

Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào 1 giọt dầu kính và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính × 40 và × 100

 Tiến hành quan sát đặc điểm sợi nấm, bào tử, các đặc điểm của bào tử

 Nhân sinh khối các chủng nấm

Trước khi thử hoạt tính ta cần nuôi nấm để lấy dịch nhỏ

 Nuôi nấm trong môi trường PDA 2-3 ngày

 Dùng tăm đã khử trùng cạo lấy sợi nấm cho vào bình tam giác hoặc lọ

đã có sẵn môi trường PDA lỏng đã được hấp khử trùng

 Đem nuôi lắc trong 1-2 ngày để lấy dịch nấm

3.2.6 Phương pháp định loại nấm sợi (Nguyễn Lân Dũng, 2006)

 Quy trình định loại một chủng nấm sợi:

 Quan sát đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi cần định loại

 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch

- Hình dáng

- Kích thước (đường kính, chiều dày)

- Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…)

- Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới

- Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…)

- Giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc)

- Mùi khuẩn lạc (có, không mùi)

- Sắc tố hoà tan (màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có

o Các cấu trúc khác: bó sợi, bó giá (Synnematous or sporodochial conidiomata) các cấu trúc mang bào tử trần (Fruit body - conidiomata) như đĩa giá (acervuli) hoặc túi giá (Pycnidia), đệm nấm (Stroma), hạch nấm (sclerotia) vv

 Quan sát các đặc điểm vi học

- Sợi nấm: (hyphae) có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu

- Bào tử trần(conidia): kiểu phát sinh bào tử trần (ở nấm bất toàn), hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt (nhẵn, có gai, gồ ghề) cách sắp xếp đơn độc chuỗi gốc non (basipetal) chuỗi gốc già (acropetal) khối cầu vv…

- Bộ máy mang bào tử (spore apparatus): nang bào tử và nang bào tử nhỏ

(nếu có) (Sporangia & Sporangiola) hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt của nang, cuống nang, không hoặc có nhánh (nhánh mọc vòng, mọc cách, hợp trục vv…); bào tử nang ( hình dạng, kích thước, bề mặt, …) ở nấm tiếp hợp

- Bộ máy mang bào tử trần (conidiogenous apparatus): giá bào tử trần (conidiophore) - kích thước, đường kính, chiều dài, bề mặt (nhẵn, có gai, có nốt sần, vv…) màu sắc, có vách ngang hoặc không, có hoặc không có cấu trúc đặc biệt như tế bào chân (foot cell) sợi cứng (setae) tăng trưởng ở gốc hoặc ở ngọn có hoặc không có dạng hình thái đặc biệt như bó giá, đệm giá Các nhánh (của bào

tử trần) số lượng nhánh, kích thước bề mặt, màu sắc, cách sắp xếp (đối xứng, không đối xứng sát nhau hoặc tẽ rộng, vị trí dọc giá bào tử trần hoặc tập trung ở ngọn giá)vv…

- Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell)

Kiểu tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đỉnh, dạng sinh bào tử trần đồng thời, như dạng (dạng bình- phialo type; dạng phân đốt, Annello type) Dạng sinh bào tử trần không đồng thời (Aleurio- type), bào tử đính kiểu nảy chồi (Blasto - type), dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo (Poro

- type) vv hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp (đơn dộc hoặc thành cụm, thành vòng), vị trí (trên sợi nấm, dọc theo giá bào tử trần, các nhánh hoặc

ở đính giá) vv…

- Thể quả túi (ascocarp) như cleistothecium, cần khảo sát vị trí, số lượng, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt của thể quả, quan sát túi bào tử (ascus) bào tử túi (ascospore) về hình dạng, kích thước bề mặt

 Tiến hành định loại

Căn cứ vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm của khuẩn lạc

và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên loài (hoặc thứ nếu có) chủng nấm mốc như sau:

Dùng khoá phân loại của các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ, chi) để xác định lần lượt xem những nấm mốc thuộc chi nấm mốc nào Tiếp theo dùng khoá phân loại của chi đó để xác định đến loài (thứ) bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được của chủng nấm mốc đó với các đặc điểm tương ứng của loài nào đó trong khoá phân loại Nếu các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của loài mô tả trong khoá, ta xác định được tên loài của chủng nấm mốc cần định loại

Nếu có chủng nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng của chủng cần định loại Nếu các đặc điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định loại

Nếu có chủng nấm mẫu của loài (hoặc thứ) vừa xác định thì tiến hành so sánh các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm vi học của chủng mẫu với các đặc điểm tương ứng của chủng cần định loại Nếu các đặc điểm của 2 chủng phù hợp với nhau thì có thể khẳng định chắc chắn loài (hoặc thứ) của chủng nấm mốc cần định loại

3.2.7 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

 Cho 150 µl đệm chiết vào ống eppendorf đã chuẩn bị sẵn

 Dùng tăm nhọn lấy mẫu nấm bệnh cho vào ống eppendorf bên trên ( Lượng lấy cỡ đầu một que diêm)

 Dùng chày nhựa nghiền nát sinh khối sợi nấm trong ống eppendorf

 Bổ sung thêm 450µl đệm chiết vào ống eppendorf bên trên

 Hỗn hợp được trộn đều, đem ủ ở 60°C trong 30 phút đến 1 giờ

 Sau đó bổ sung thêm 200µl natri acetate 5M, trộn đều và ly tâm ở 12000v/phút, trong 30 phút, ở 4°C

 Dịch nổi được chuyển sang một ống Eppendorf mới và bổ sung isopropanol lạnh để tủa DNA Để ở nhiệt độ phòng 5 phút Sau đó đem ly tâm ở 12000v/phút, 15 phút, 4°C

 Đổ bỏ phần dịch trong nhẹ nhàng, tủa được rửa trong 1000µl ethanol 70%

 Ly tâm ở 10000v/phút, 10 phút, 4°C, sau đó để khô và bổ sung thêm 50µl TE

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đêm TAE

và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide