Xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm linh chi trong môi trường dinh dưỡng dịch thể .... Phương pháp nghiên cứu Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TS Nguyễn Văn Giang

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Tiến Dũng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Bích Thùy và TS Nguyễn Văn Giang – Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công Nghệ Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Lãnh đạo, cán bộ viên chức Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu và Phát triển Nấm, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Tiến Dũng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Danh mục biểu đồ, sơ đồ ix

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xii

Phần 1 mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Phạm vi về nội dung nghiên cứu 3

1.3.2 Phạm vi về thời gian 3

1.3.3 Địa điểm nghiên cứu: 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Khái quát chung về nấm linh chi 4

2.1.1 Phân loại học và phân bố 4

2.1.2 Giải phẫu hình thái quả thể nấm linh chi 5

2.1.3 Giá trị dược liệu của nấm linh chi 7

2.1.4 Sinh trưởng và phát triển của nấm linh chi ganoderma lucidum 9

2.2 Công nghệ sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu bằng phương pháp nhân giống nấm dạng dịch thể 13

2.2.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể trên thế giới 13

2.2.2 Nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể tại việt nam 17

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 19

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.1.2 Vật liệu có nguồn gốc tự nhiên 19

3.1.3 Hóa chất và vật tư 19

3.1.4 Trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 19

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường và các điều kiện thí nghiệm 25

3.3.3 Phương pháp theo dõi và đánh giá 26

3.3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 29

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 30

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 30

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của ph môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 30

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dịch chiết tự nhiên tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 34

4.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng carbon tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 35

4.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng nitrogen tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi 37

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm linh chi trong môi trường dinh dưỡng dịch thể 40

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lắc 40

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí 41

4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi 44

4.3 Kết quả nghiên cứu sử dụng giống nấm linh chi dạng dịch thể 46

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi nuôi cấy dịch thể 46

4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống tới sinh trưởng hệ sợi nấm linh

chi nuôi cấy dịch thể 49

4.4 Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể 50

4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn giống và nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi và năng suất nấm linh chi 50

4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của lượng giống thương phẩm đến sự sinh trưởng của nấm linh chi trên nguyên liệu nuôi trồng 53

4.5 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất nấm linh chi bằng phương pháp nhân giống dạng dịch thể 54

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

Phụ lục 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại học nấm Linh chi 4 Bảng 2.2 Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu 8 Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến

đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi 31 Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến

sinh khối của hệ sợi nấm Linh chi 33 Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của dịch chiết tự nhiên đến đặc điểm sinh trưởng

hệ sợi nấm Linh chi 34 Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của glucose đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi nấm

Linh chi 36 Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của cao nấm men đến đặc điểm sinh trưởng hệ sợi

nấm Linh chi 37 Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của các chế độ lắc đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 40 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể

(cho bình lên men dung tích 2lit) 42 Bảng 4.8 So sánh hiệu quả nuôi lắc và nuôi sục khí 44 Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng

hệ sợi nấm Linh chi 45 Bảng 4.10 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cây giống đến sinh trưởng hệ

sợi nấm Linh chi 47 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của nguyên liệu nuôi trồng nguồn giống đến sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm Linh chi 52 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của nguyên liệu nuôi trồng đến sự hình thành quả thể nấm

Linh chi 53 Bảng 4.13 Ảnh hưởng của lượng giống cấy đến sự sinh trưởng của nấm Linh chi

trên nguyên liệu nuôi trồng 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi 5

Hình 2.2 Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 10

Hình 4.1 Hệ sợi nấm Linh chi nuôi tĩnh sau 10 ngày nuôi cấy 32

Hình 4.2 Ảnh hưởng của cao nấm men tới sinh trưởng hệ sợi Linh chi 38

Hình 4.3 Hệ sợi nấm Linh chi sau 10 ngày nuôi cấy trong bình sục khí 41

Hình 4.4 Sinh trưởng của nấm Linh chi sử dụng nguồn giống khác nhau 51

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Kết quả ảnh hưởng của dịch chiết tự nhiên đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 35 Biểu đồ 4.2 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng glucose trong môi trường dinh dưỡng

dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 36 Biểu đồ 4.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men trong môi trường dinh

dưỡng dịch thể đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 38 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của thành phần Pepton của môi trường dinh dưỡng dịch thể

đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 39 Biểu đồ 4.5 Đường cong sinh trưởng nấm Linh chi 46 Biểu đồ 4.6 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 48 Biểu đồ 4.7 Kết quả ảnh hưởng của tuổi giống đến SKS hệ sợi nấm Linh chi 49

Sơ đồ 4.1 Quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nhân

giống dạng dịch thể 55

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Phạm Tiến Dũng

Tên luận văn: “Xây dựng quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể”

Xác định được các điều kiện nuôi trồng tối ưu trong nuôi trồng nấm Linh chi trên

cơ chất tổng hợp sử dụng nguồn giống dạng dịch thể

Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi trên môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể

để nghiên cứu nhân tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm; sau đó,

sử dụng giống nấm dịch thể nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp để nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng nấm Linh chi Từ đó, xác định được các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dich thể và nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể; trên cơ sở các kết quả đạt được, xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi sử dụng nguồn giống nấm nuôi cấy dạng dịch thể

Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng dịch thể tới sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh được nuôi cấy, tác giả thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường dịch thể vànghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy dịch thể

Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ nuôi khác nhau tới sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dịch thể, tác giả thực hiện thí nghiệm nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường dinh dưỡng dịch thể và nghiên cứu trong các điều kiện: nuôi tĩnh, nuôi trên máy lắc và nuôi sục khí

Trong nội dung nghiên cứu phương pháp sử dụng giống nấm dạng dịch thể, thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và độ tuổi giống được sử dụng để cấy chuyển tốt nhất, nghiên cứu tỷ lệ cấy chuyển giống tối ưu nhất khi cần nhân giống các cấp trung gian

Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn giống tới hiệu quả nuôi trồng nấm Linh chi, tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng

nguồn giống dịch thể với đối chứng là nguồn giống thể rắn truyền thống; nghiên cứu tỷ

lệ sử dụng giống dịch thể hữu hiệu để cấy lên cơ chất tổng hợp nuôi trồng nấm

Kết quả chính và kết luận

Kết quả nghiên cứu đã xác định được các điều kiện tối ưu để nhân giống nấm Linh chi dạng dịch thể và các điều kiện tối ưu để nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể Đồng thời, tác giả đã chứng minh được hiệu quả và ưu điểm vượt trội của công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi trên cơ chất tổng hợp sử dụng nguồn giống dạng dịch thể so với công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống trên thể rắn đang phổ biến hiện nay

Trên các cơ sở đó, tác giả xây dựng được chi tiết các công đoạn sản xuất và đề xuất quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nhân giống dịch thể./

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Tien Dung

Thesis title: Establish the production process of Ganoderma lucidum by breeding method of the liquid form

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

Determination of optimum culture conditions in culture of Ganoderma lucidum Identification of optimum culture conditions for growing Lingzhi mushrooms on synthetic substrates using humoral material sources

Materials and Methods

Propagation of the Lingzhi mushroom variety on a nutrient medium to study factors affecting the growth and development of mycelium; After that, using the fungus cultured on synthetic substrates to study the effect of growing conditions of the mushrooms From there, the optimum conditions for cultivating Lingzhi mushrooms and cultivating Lingzhi mushrooms using the source of the same species; On the basis

of the results obtained, to build up the technological process of producing Lingzhi mushrooms using the source of cultured mushrooms

In the study on the effect of the nutrient medium environment on the growth of the mycotoxins cultured, the authors studied the effect of pH on the medium and studied the effects of nutrients of the culture medium

In the study of the effect of different culture regimes on the growth of the mycobacterium hyphae in culture media, the author conducted experiments on culture

of hyphae in mushroom hybrids and in the study of static culture, raising on the shaking machine and aeration

In the research on the method of using the mushroom species, we conducted a study on the effect of time and age on seedlings used for best transplantation like intermediate levels

In the contents of the study on the effect of seed sources on the efficiency of growing Lingzhi mushrooms, the experiments to compare the effectiveness of growing Lingzhi mushrooms using the source of seedlings with the control is a traditional solid seed source; Study on the rate of use of effective bacillary seedlings for transplanting into synthetic mushroom culture

Main findings and conclusions

The results of the study have identified the optimal conditions for propagation of the Ganoderma lucidum of the liquid form and the optimal conditions for the productions the Ganoderma lucidum At the same time, the author has proved the effectiveness and advantages of the technology of growing Lingzhi mushrooms on the synthetic substrate using the source of aquatic species compared with the technology of growing Lingzhi mushrooms using the same source solids are popular nowadays

On that basis, the author elaborated the production steps and proposed the production process of Lingzhi mushrooms by breeding method of the liquid form./

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm Linh chi là loại nấm dược liệu có giá trị cao đối với sức khỏe con người; từ hơn 4000 năm trước ở Trung Quốc, nấm Linh chi đã được biết đến và

sử dụng như một loại dược liệu quý hiếm có hiệu quả cao trong việc điều trị và làm thuyên giảm một số căn bệnh nan y, giải độc, bồi bổ sức khỏe tăng cường sinh lực,… Vì thế Linh chi được xem như một loại thần dược, chỉ dành riêng cho các bậc vua chúa

Hiện nay, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi ở trong nước và trên thế giới ngày càng gia tăng, thị hiếu của người tiêu dùng ngày càng cao, đòi hỏi thêm nhiều sản phẩm từ nấm phù hợp với nhu cầu sử dụng Do đó, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong công nghệ dược liệu cũng như thực phẩm chức năng ngày càng tăng Tuy nhiên, lượng cung của nấm Linh chi luôn thấp hơn so với nhu cầu đặc biệt là các sản phẩm đáp ứng được các yêu cầu về chất lượng thương phẩm cùng với hàm lượng của một số dược chất quý giá trong nó

Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh

đó điều kiện tự nhiên cũng rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm nói chung cũng như nấm Linh chi nói riêng Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu Nhu cầu tiêu thụ ngày càng lớn đặt ra yêu cầu về công nghệ nhằm nâng cao sản lượng cũng như chất lượng trong sản xuất nuôi trồng nấm Linh chi Các dược chất có giá trị được chiết xuất từ quả thể nấm dược liệu, trong đó có Linh chi, đã

và đang là nguồn dược liệu quan trọng cung cấp cho ngành sản xuất dược phẩm

và thực phẩm chức năng Việc nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất nấm nói chung và sản suất nấm Linh chi nói riêng nhằm rút ngắn chu kỳ nuôi trồng, giảm chi phí sản xuất, nâng cao hiệu quả và chất lượng nấm là yêu cầu tất yếu

Ở nước ta hiện nay, sản xuất nấm ăn - nấm dược liệu ngày càng phát triển mạnh, tuy nhiên các cơ sở nhân giống và nuôi trồng nấm ở nước ta đều đang áp

dụng công nghệ nuôi trồng nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng chủ yếu được thực hiện theo quy trình công nghệ nhân giống trên cơ chất rắn (như nhân giống trên các môi trường thạch, mùn cưa tổng hợp, thóc, que sắn, v.v ) Đây là phương pháp truyền thống, quá trình sản xuất đơn giản và được sử dụng phổ biến; tuy nhiên phương pháp này có một số hạn chế như hệ số nhân giống thấp, chất lượng giống không ổn định và không đồng nhất về tuổi giống trong cùng một chai giống, rất khó khăn khi cần sản xuất một lượng lớn giống phục vụ sản xuất; thời gian nhân nuôi một cấp giống kéo dài trung bình từ 15 đến 25 ngày, thời gian từ khi cấy giống vào nguyên liệu nuôi trồng đến khi thu hái nấm thương phẩm dài trong vòng 3-4 tháng, dẫn đến giá thành giống nấm và nấm thương phẩm cao; hơn nữa, các công đoạn của quy trình sản xuất truyền thống chỉ thích hợp cho các cơ sở nuôi trồng thủ công với quy mô manh mún nhỏ lẻ, chỉ có thể áp dụng cơ giới hóa một phần nào đó (nhưng chưa có hiệu quả cao) trong quá trình sản xuất

Trong khi đó, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm;nghiên cứu và sản xuất giống dịch thể trên thế giới đã đạt được một số thành tựu đáng kể Ứng dụng sản xuất giống dịch thể có hiệu quả rõ rệt so với giống thể rắn như rút ngắn thời gian sinh trưởng chỉ còn 4 - 6 ngày một cấp giống, độ thuần cao, chất lượng tốt, tỷ lệ nhiễm giảm, thích hợp cho sản xuất giống nấm và nuôi trồng nấm theo quy mô công nghiệp Việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể có ý nghĩa quan trọng và cấp thiết góp phần giải quyết các khó khăn và hạn chế của công nghệ sản xuất hiện nay; đáp ứng nhu cầu thực tiễn cũng như xu hướng sản xuất theo định hướng thị trường và trên quy mô công nghiệp

Nhận định được vai trò và tầm quan trọng đó, tác giả lựa chọn thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy dịch thể” nghiên cứu nhằm góp phần giải quyết các vấn đề tồn tại nêu trên

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đánh giá kết quả nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịch thể với đối chứng nuôi trồng Linh chi sử dụng nguồn giống thể rắn được sản xuất theo phương pháp truyền thống; từ đó xây dựng được quy trình sản xuất nấm Linh chi bằng phương pháp nuôi cấy giống dạng dịch thể

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Phạm vi về nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy giống nấm Linh chi cấp trung gian dạng dịch thể để xây dựng quy trình nhân giống nấm dạng dịch thể phục vụ sản suất; Nghiên cứu nuôi trồng nấm Linh chi sử dụng nguồn giống dạng dịnh thể trên cơ chất nuôi trồng tổng hợp để sản xuất quả thể nấm

1.3.2 Phạm vi về thời gian

Thời gian thực hiện đề tài: từ 08/2016 đến 08/2017

1.3.3 Địa điểm nghiên cứu:

Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu và Phát triển Nấm,Bộ môn Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học về các chỉ tiêu sinh trưởng cơ bản của hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường dịch thể, cũng như nhu cầu về dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh tối ưu cho sinh trưởng, phát triển của Linh chi trong điều kiện nuôi cấy dịch thể

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất nấm Linh chi, trong đó công nghệ nhân giống dạng dịch thể của giống nấm Linh chi Ga-1 cho phép cải thiện khả năng sinh trưởng của giống, rút ngắn thời gian nuôi cấy giống, tăng chất lượng giống nấm cung cấp cho nuôi trồng nấm Công nghệ này có tính khả thi cao, có thể thay thế cho công nghệ truyền thống, rút ngắn chu kỳ nuôi trồng nấm, tăng năng suất nấm thương phẩm, giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả kinh tế

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM LINH CHI

2.1.1 Phân loại học và phân bố

Nấm Linh chi có tên khoa học là: Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst Tên tiếng Anh: Lingzhi, Reishi

Tên thông dụng là Linh chi (Việt Nam), Lingzhi (Trung Quốc), Reishi (Nhật Bản) Ngoài ra, nấm Linh chi còn có nhiều tên gọi khác nhau, như: Bất lão thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo,…

Nấm Ganoderma rất phong phú và phân bố khá rộng ở vùng nhiệt đới ẩm

và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là thân gỗ mục hay các nguyên liệu có cellulose; trong tự nhiên, Linh chi có thể được tìm thấy ở các rừng

có nhiều loại cây lá rộng, nhất là rừng gỗ lim nên còn gọi là nấm lim

Bảng 2.1 Phân loại học nấm Linh chi

Nguồn: Trịnh Tam Kiệt (2013) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Các loài Linh chi được xếp vào một họ riêng là họ Ganodermataceae Từ khi xác lập thành

một chi riêng là Ganoderma, đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận (Lê Xuân Thám,1996)

Trong đó, chỉ riêng với Linh chi đỏ Ganodermalucidum, hiện nay có khoảng 45 thứ (variete) Linh chi được xác định; nghĩa là chỉ với Linh chi đỏ ta

đã có 45 loại có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, vàng cam đến cam, đỏ cam,

đỏ, đỏ sậm, đỏ tía, Do vậy Linh chi đỏ được gọi là Linh chi chuẩn để phân biệt với những loài khác cùng chi Ganoderma nhưng không phải là Linh chi thật sự Khi nói đến “Linh chi” là đề cập đến Linh chi đỏ Ganoderma lucidum

Ngoài ra còn có Linh chi đen (Ganoderma subresinosum) và Linh chi tím là hai loại hoàn toàn khác Linh chi đỏ Linh chi vàng gặp ở Việt Nam, chưa phát hiện thấy ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á khác

Trong số các loại Linh chi tìm thấy cho đến nay thì Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) được nghiên cứu y dược chi tiết nhất Loài chuẩn Ganoderma lucidum có thành phần hoạt chất sinh học phong phú và hàm lượng dược liệu nhiều nhất

2.1.2 Giải phẫu hình thái quả thể nấm Linh chi

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales) Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây Ở Việt Nam nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard N.T (1890 đến 1928)

Hình 2.1 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi

Nguồn: Lê Xuân Thám (1996)

Quả thể của nấm Linh chi (cây nấm) gồm hai phần: cuống nấm và mũ nấm (phiến nấm, tai nấm)

Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên đôi khi đính tâm do sự liền tán; cuống

có hình trụ đường kính từ 0,3-3,5 cm; cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo

Lớp vỏ cuống láng bóng, không có lông, phủ suốt lên đến mặt tán nấm; vỏ cuống có thể có màu đỏ, nâu đỏ, hay nâu đen,…

Mũ nấm khi còn non có hình trứng, lớn dần có hình quạt, đôi khi dị dạng; trên mặt mũ thường nhẵn bóng như láng vecni, không có lông, có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím, càng về già thì màu càng sẫm lại

Mũ nấm trưởng thành có thể có đường kính biến động lớn từ 2-15cm, thường dày 0,8-3,3 cm; có loài Linh chi đường kính lớn tới 100 cm; ở phần đỉnh cuống thường lồi lên hay hơi lõm xuống (Nguyễn Hữu Đống, 2002)

Mặt dưới thể quả thuờng phẳng, có màu trắng kem hay hơi vàng nhạt, có nhiều

lỗ nhỏ li ti; đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ này là nơi hình thành và phóng thích bào tử khi quả thể trưởg thành Mật độ lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn Khi bổ đôi quả thể ra thì thấy dây là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm Còn phần thịt nấm ở trên thì có màu vàng nâu đến nâu đỏ Phân cách giữa phần trên và phần duới (tầng sinh sản) là khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần duới thì là ống thẳng hướng xuống

Phần thịt nấm dày từ 0,4 – 2,2 cm, màu vàng kem – nâu nhợt – trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên Trên lát cắt trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 – 0,5 mm) Nhờ lớp láng bóng không tan trong nước do đó mà nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

Tầng sinh sản (bào tầng hay thụ tầng - hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,8 cm màu kem – nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3 - 35 ống/mm Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng hình chùy, không màu dài 16 – 22 µm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores) Nấm đến tuổi trưởng thành lỗ sinh bào tử ở phía dưới phiến có màu nâu sẫm; khi bào tử đảm chín thì nó được phóng thích dọc theo ống và thoát ra ngoài

qua miệng lỗ ống Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử bay như khói bám vào mặt trên Linh chi tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ, rất mịn, như đất đỏ bazan

Bào tử đảm của nấm Linh chi có hình trứng hoặc hình trứng cụt (truncat),

có phần phụ không màu bao quanh lỗ nảy mầm, có màu vàng rỉ sắt Bào tử đảm

có vỏ với cấu trúc hai lớp màng, màng ngoài nhẵn, không màu, màng trong màu nâu rỉ, phát triển thành những gai nhọn vươn sát màng ngoài Kích thước 5 – 6,5

Quả thể, sợi nấm, bào tử Linh chi đều có thể trị bệnh bởi chúng chứa hơn

400 hợp chất có hoạt tính sinh học (Sanodiya et al , 2009)

Tác dụng của bào tử cũng giống như tác dụng của nấm Linh chi Thường một vài sản phẩm của các hãng trên thị trường có phối hợp Linh chi và bào tử phá vỏ hoặc không phá vỏ Các sản phẩm này thường đắt hơn các sản phẩm không có bào tử Tuy nhiên những bào tử đã phá lớp vỏ thì dễ bị oxy hóa nếu bảo quản không tốt, còn nếu không phá vỏ thì cơ thể khó hấp thụ nếu dùng dưới dạng viên nang

2.1.3 Giá trị dược liệu của nấm Linh chi

Theo Đông y, nấm Linh chi có vị ngọt, tính bình, bổ ngũ tạng (tim, gan, lá lách, phổi, thận), không độc mà còn có tác dụng giải độc, an thần, lưu thông khí huyết, Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của nấm Linh chi như sau: Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn); Bảo can (bảovệ gan); Cường tâm (thêm sức cho tim); Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá); Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp); Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm); Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Từ cách đây hàng ngàn năm, Linh chi là một trong số các dược thảo thiên nhiên đã được sử dụng để làm thuốc Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của nhiều triều đại Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm Trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhà

Châu (thời hậu Hán, năm 25 đến 22 trước Công nguyên), đề cập đến 365 dược thảo thì Linh chi được xếp vào hàng “Thượng dược”, ở vị trí số một sau đó mới đến Nhân sâm

Đến thời Minh, nhà dược học nổi tiếng Lý Thời Trân viết Bản thảo cương mục gồm 2000 loài thuốc thì Linh chi vẫn được xếp vào hàng đầu; Ông viết:

“Dùng lâu người nhẹ nhàng, không già, sống lâu như thần tiên” Ông căn cứ vào tính vị, công năng dược lý khác nhau mà khái quát “Lục bảo Linh chi” (sáu loại Linh chi) ứng theo từng màu như sau:

Bảng 2.2 Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu

Thanh chi

Linh chi xanh Còn có tên là Long chi

Vị chua, tính bình, không độc; Chủ trị sáng mắt, bổ can khí an thần, tăng trí nhớ

Xích chi

Linh chi đỏ Còn có tên là Hồng chi hay Đơn chi

Vị đắng, tính bình, không độc; Tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ trung, chữa trị xung trung kết (tứcngực)

Hoàng chi Linh chi vàng

Còn có tên là Kim chi

Vị cam (ngọt), tính bình, không độc; Chủ trị ích trùng khí, an thần

Bạch chi

Linh chi trắng Còn có tên là Ngọc chi

Vị cay, tính bình, không độc;

Chủ trị ích phế khí, làm thông miệng, mũi, an thần

Hắc chi Linh chi đen

Còn có tên gọi là Huyền chi

Vị mặn, tính bình, không độc; Chủ trị chứng ù tai, lợi khớp, bảo thần (bảo vệ công năng của hệ thần kinh), ích tinh khí, làm dai gân cốt

Tử chi Linh chi tím

Còn có tên gọi là Mộc chi

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông – Lê Hữu Trác (1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi) trong “Y lý thâu nhàn ngôn phụ chí” Sau đó, nhà bác học Lê Quý Đôn (1726 – 1784) viết về Linh chi trong “Vân Đoài loại ngư” và “Kiến văn tiểu lục” đánh giá Linh chi là “Một sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam” với những tác dụng lớn như kiện não, bảo can, cường tâm, kiên vị, cường phế, giải độc, giải cảm và giúp con người sống lâu tăng tuổi thọ

Công hiệu của Linh chi ghi trong “Thần nông bản thảo kinh” đến nay hoàn toàn được khẳng định đồng thời còn phát hiện các hoạt tính dược lý và trị liệu đa phương của Linh chi Lý do là Linh chi có khả năng nâng cao sức đề kháng của

cơ thể, chính vì vậy mà phòng trừ được các chứng bệnh sinh ra do sức đề kháng của cơ thể yếu

Khoa học hiện đại ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật và công nghệ tiên tiến đã chứng minh, các hoạt chất trong nấm Linh chi có khả năng: ức chế tế bào ung thư, cải thiện thể chất của bệnh nhân ung bướu, giảm nhẹ triệu chứng bệnh;

hạ và ổn định đường huyết giúp điều hòa huyết áp, điều trị bệnh tiểu đường; giảm cholesterol toàn phần giúp giảm mỡ máu, xơ mạch, điều trị các bệnh về tim; chữa tổn thương gan đối với các bệnh gan mạn tính mới phát và nâng cao chức năng gan; giúp cơ thể tăng cường hệ miễn dịch, kháng vi khuẩn, kháng virus, chống dị ứng, chữa suy nhược thần kinh, chống suy nhược cơ thể; v.v (Trần Văn Mão, 2004)

2.1.4 Sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi Ganoderma lucidum Chu kì sống của nấm Linh chi

Vòng đời của nấm Linh chi bắt đầu từ khi quả thể trưởng thành và phóng thích bào tử đảm đơn bội vào không khí để phát tán nhờ gió Khi gặp điều kiện thuận lợi về nhiệt độ (28 – 30oC), độ ẩm, ánh sáng… bào tử đảm sẽ nảy mầm, hình thành hệ sợi mầm sơ cấp đơn nhân Hệ sợi sơ cấp nhanh chóng phát triển thành hệ sợi thứ cấp nhờ sự tiếp hợp giữa hai sợi sơ cấp – tức là tạo thành hệ sợi song hạch Hệ sợi thứ cấp phát triển và phân nhánh mạnh tràn ngập khắp giá thể

và chiếm hầu hết chu kỳ sống của Linh chi

Lúc này, thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày – rất dày Chúng dễ dàng rụng ra khi gặp điều kiện phù hợp để nảy mầm cho ra hệ sợi song mạch tái sinh Hệ sợi thứ cấp phát triển đến khi đạt đến giai đoạn cộng bào

thì các vách ngăn được hòa tan Sau đó hệ sợi hấp thu và tích lũy dinh dưỡng rồi liên kết lại tạo mầm quả thể; đây chính là giai đoạn phân hóa hệ sợi Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dày, ít phân nhánh bên kết lại thành cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bên phân nhánh rất mạnh Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập

Ở môi trường thuận lợi, độ ẩm và dinh dưỡng dồi dào, mầm quả thể sẽ sinh trưởng nhanh, phần đỉnh trụ bắt đầu xòe tán đồng thời lớp vỏ láng đả cam xuất hiện; Tán phát triển lớn dần thành quả thể trưởng thành hình thành bào tầng chuẩn bị phát tán bào tử đảm Lúc này sự dung hòa của hai nhân xảy ra, sau đó giảm nhiễm tạo thành bốn nhân Chúng di chuyển về bốn bào tử hình thành nên bốn bào tử đơn nhân (n) Các bào tử trưởng thành sẽ phóng thích ra môi trường

và bắt đầu chu kỳ mới

Hình 2.2 Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

Nguồn: Nguyễn Lân Dũng (2001) Điều kiện sinh trưởng và phát triển

Nấm Linh chi thích nghi ở nhiệt độ thấp, phát triển tốt từ 22-280C, độ ẩm không khí từ 75-80%, độ ẩm cơ chất từ 65-70

Dinh dưỡng

Nấm Linh chi là loại nấm phá gỗ mạnh, có khả năng sử dụng trực tiếp nguồn cellulose Do đó, nguyên liệu nào có cellulose thì nấm Linh chi có thể sống và phát triển Chúng có khả năng phân giải và hấp thu lignin, cellulose, hemicellulose chủ yếu dựa vào các enzym Do vậy mùn cưa, rơm rạ, bông phế thải, bã mía, lõi ngô,… đều có thể trồng nấm Linh chi Ngoài carbon thì nitrogen

là nguyên tố cần thiết thứ hai đối với nấm Nitrogen hình thành nên acid amin, acid nucleic,… Sợi nấm có thể hấp thu nitrogen hữu cơ hoặc vô cơ Nguồn nitrogen có thể lấy từ nước luộc ngũ cốc, cao nấm men, bột đậu tương, pepton, (NH4)2SO4, asparagine, alanine, glycine

Nitrogen có tác dụng tăng tốc độ phát triển của hệ sợi nấm, nhưng nếu quá nhiều sẽ khó hình thành quả thể Vì vậy trong giai đoạn phát triển sợi nấm thì tỷ

lệ C/N là 25/1, còn giai đoạn hình thành quả thể tỷ lệ là 30/1 hoặc 40/1 (Trần Văn Mão, 2004)

Dinh dưỡng khoáng và Vitamin

Chất khoáng chiếm một lượng nhỏ trong nấm nhưng lại vô cùng cần thiết Những chất khoáng quan trọng nhất bao gồm P, K, S, Mg, Na, Ca, Fe, Cu, Zn, Mo,… đó là các thành phần dinh dưỡng đa lượng hay vi lượng cấu thành nên các cấu trúc protein có hoạt tính sinh học

Vitamin là thành phần của coenzyme hay cofactor của các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất Đối với nấm thì các vitamin nhóm B và K có vai trò quan trọng trọng với sự sinh trưởng và hình thành quả thể

Linh chi chứa khá đầy đủ thành phần khoáng vi lượng mà các khoáng tố này là nhân tố quan trọng trong rất nhiều phản ứng chống ung thư, dị ứng, chống lão hoá, xơ vữa, chống kết dính tiểu cầu…điều chỉnh dẫn truyền luồng thần kinh

Do đó, sử dụng Linh chi được xem như một biện pháp phòng trị cơ bản

Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, do đó ảnh hưởng đến trao đổi chất và sinh trưởng của nấm Nấm Linh chi thích hợp với nhiệt độ trong khoảng từ 22 đến 28°C Đối với nuôi cấy nấm Linh chi dạng dịch thể, nhiệt độ môi trường tối ưu là 25°C

Giai đoạn nuôi sợi: Từ 20oC đến 32oC;

Độ ẩm không khí: Gọi là độ ẩm tương đối không khí Nó biểu hiện bảng phần trăm của tỉ lệ độ ẩm tuyệt đối trên độ ẩm bảo hoà của không khí, độ ẩm không khí thích hợp chi Linh chi từ 70% đến 95% Độ ẩm không khí càng cao thì nguy cơ nhiễm bệnh càng tăng (Trần Văn Mão, 2004)

Ánh sáng

Nấm Linh chi phát triển trong điều kiện tối sợi nấm sinh trưởng nhanh hơn, nếu có ánh sáng tán xạ thì sẽ sinh trưởng chậm lại Đối với pha hình thành quả thể, nấm Linh chi cần ánh sáng 500-800 lux chiếu cân đối từ mọi phía để quả thể phát triển đều Nếu chiếu sáng một phía thì quả thể sẽ mọc dài về phía ánh sáng dẫn đến tán nấm nhỏ, cuống nấm dài

Giai đoạn nuôi sợi: Không cần ánh sáng

Giai đoạn phát triển quả thể: Cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng có thể đọc sách được)

pH

Linh chi thích nghi trong môi trường trung tính đến acid yếu (5,0 – 7,0) Đối với nguyên liệu trồng nấm, không ở dạng dung dịch, nên khó đo với các loại máy đo pH ở dạng dung dịch Người ta có thể dùng “pH đo đất” để xác định độ

pH của nguyên liệu

Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, đến khả năng hòa tan của các hợp chất Trong quá trình nuôi nấm Linh chi dạng dịch thể, pH môi trường là một tín hiệu ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp exopolysaccharide (các hợp chất hữu cơ cao phân tử do vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường), cấu tạo hóa học và khối lượng phân tử, hình thái của hệ sợi nấm

Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm Linh chi đều cần có

độ thông thoáng tốt

2.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NẤM ĂN VÀ NẤM DƯỢC LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG NẤM DẠNG DỊCH THỂ

Giống nấm dịch thể là giống nấm được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể Giống nấm sẽ được nuôi dưỡng trong các loại bình khác nhau thông qua quá trình khuấy lắc hoặc đảo trộn thông khí không ngừng, tạo điều kiện để sợi nấm luôn tiếp xúc với dinh dưỡng và đủ lượng oxy cần thiết tạo điều kiện cho giống sinh trưởng mạnh trong môi trường dịch thể

2.2.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống nấm dịch thể trên thế giới

Hiện nay,việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng đang là một trong các vấn đề được nhiều nước trên thế giới quan tâm Công nghệ lên men đã được áp dụng trên quy mô công nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm y học, thực phẩm, tận thu sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất của các loài cây thuốc, nhân sâm,… để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh hoặc sản xuất thuốc kháng sinh và một số sản phẩm khác Phương pháp này đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và chi phí trong sản xuất nấm (Diamantopoulou et al., 2012)

Giống nấm dịch thể là loại giống được nuôi dưỡng trong môi trường lỏng, đảm bảo các điều kiện về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ thông thoáng, thời gian nuôi, tạo điều kiện để sợi nấm sinh trưởng mạnh trong môi trường dịch thể tầng sâu Công nghệ này cho phép thu được một lượng lớn sinh khối sợi nấm để làm giống cấp 1, giống cấp 2 và có thể trực tiếp làm giống thương phẩm (giống cấp 3) Công nghệ trên còn được áp dụng trong việc tách chiết sinh khối sợi nấm dùng

để sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng, gia vị, đồ uống, mỹ phẩm,… trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm Phương pháp lên men dịch thể đã được ứng dụng để sản xuất các giống nấm ăn và nấm dược liệu (Kawai et al., 1995; Liu et al., 2010)

Theo Liu và et al (2010), phương pháp nuôi cấy truyền thống, giống nấm

ăn và nấm dược liệu đã được sản xuất trong các môi trường rắn sử dụng nguyên liệu tổng hợp có chứa nhiều lignocellulose, quá trình này thường kéo dài 2 - 3 tháng

để sản xuất ra đến quả thể Nuôi cấy trong môi trường dịch thể khác hẳn với nuôi cấy trên các cơ chất rắn vì nó đưa đến tiềm năng sản xuất giống nấm cao hơn trong một thời gian ngắn hơn với mức độ nhiễm bệnh ít hơn

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, sợi nấm sinh trưởng trong môi trường dịch thể là một phương pháp thay thế nhanh chóng để thu được sinh khối sợi nấm với chất lượng phù hợp (Kwon et al., 2009)

Nghiên cứu ở Ấn Độ trên một giống nấm Vân chi đã chỉ ra rằng sinh khối sợi (SKS) nấm Vân chi thu được khi môi trường pH = 5 và pH = 6 là 2,99 g/lít và 4,28 g/lít Khi môi trường pH = 8 thu được SKS là 1,97 g/lít, môi trường pH = 9 SKS thu được 1,62 g/lít Tại nhiệt độ 30oC, SKS đạt được 4,32 g/lít; tại 40oC, SKS nấm Vân chi ghi nhận là thấp nhất đạt 1,72 g/lít.Trong nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến SKS nấm Vân chi, các tác giả đã chứng minh rằng tất cả các nguồn cacbon hầu hết đều khuyến khích sợi nấm sinh trưởng, khi sử dụng cùng hàm lượng 1% fructose cho SKS nấm Vân chi đạt 5,41 g/lít; bổ sung glucose SKS đạt 5,54 g/lít; bổ sung mannitol SKS đạt 5,53 g/lít; bổ sung lactose cho SKS thấp nhất 1,47 g/lít (Sukumar et al., 2008)

Khi nghiên cứu tối ưu hóa nguồn cacbon và nguồn nitơ trong nuôi cấy giống nấm Vân chi dịch thể, các tác giả đã bổ sung 8 nguồn cacbon khác nhau, kết quả khi bổ sung maltose thu được SKS nấm Vân chi cao nhất là 8,6 g/1000ml trong thời gian nuôi 7 ngày; kết quả cũng cho thấy nếu nuôi 14 ngày (gấp 2 thời gian) thì SKS có tăng nhưng không đáng kể, đạt 9,2 g/1000ml Đồng thời, sau giai đoạn 7 ngày nuôi sợi thì giá trị pH của môi trường nuôi giống đo được là 2,92; kết thúc 14 ngày nuôi sợi giá trị pH tăng lên 4,39 (Bolla et al., 2010) Adebayo and Ugwu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung tới SKS nấm Vân chi, thành phần môi trường cơ bản gồm MgSO4.7H2O (0,2 g); K2HPO4 (1,0 g); NH4SO4(5,0 g); glucose (9,75 g); CNM (3,0 g); peptone (1,0 g) và 1000 ml nước cất, được bổ sung 9,75 g của mỗi nguồn carbon gồm: lactose, glucose, sucrose, mannitol, maltose, galactose, fructose, xylose, sorbitol và tinh bột Kết quả chỉ ra rằng nguồn carbon có ảnh hưởng lớn đến SKS nấm Linh chi, bổ sung các nguồn lactose, mannitol, maltose SK thấp hơn các nguồn carbon còn lại, sự biến thiên của SKS khi bổ sung các nguồn carbon này cũng rất khác so với các nguồn carbon cùng nghiên cứu Khi bổ sung các nguồn lactose, glucose, mannitol, maltose SK tăng cực đại ở ngày thứ 4, giảm xuống cực tiểu ở ngày thứ 7, sau đó đến ngày thứ 14 SK lại tăng gần như ngày thứ 4 Còn khi bổ sung nguồn carbon: sucrose, galactose, fructose, sorbitol

và tinh bột, SK tăng cực đại ở ngày thứ 7, sau đó giảm gần hết ở ngày thứ 14 Các kết quả của các tác giả cho thấy nguồn nitơ và nguồn carbon ảnh hưởng lớn

đến SKS, đường cong sinh trưởng của giống cũng không phải lúc nào cũng tuân theo qui luật tự nhiên mà nó phụ thuộc nhiều vào nguồn dinh dưỡng bổ sung Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đạm đến SKS nấm Vân chi, Sukumar et al., (2008) cũng đã chứng minh khi bổ sung cùng hàm lượng 0,3% thì ammonium sulfate cho SKS cao nhất là 4,16 gam/lít; bổ sung sodium nitrate cho SKS đạt 3,54 g/lít; bổ sung glycine cho SKS 3,48 g/lít

Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến SKS nấm Vân chi cũng được các tác giả minh chứng, 10 nguồn nitơ được thử nghiệm trong quá trình nuôi cấy SK nấm Vân chi, kết quả cho thấy CNM và casein là 2 nguồn đạm khuyến khích sợi tăng trưởng, CNM cho SKS nấm Vân chi cao nhất sau 7 ngày lên men, còn casein cho SKS cao nhất sau 4 ngày lên men (Adebayo and Ugwu, 2011) Nguồn nitơ cũng được các tác giả nghiên cứu bổ sung vào môi trường nuôi cấy SKS nấm Vân chi Kết quả cho thấy, trong 8 nguồn đạm bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì gelatin cho SKS cao nhất CNM cũng là nguồn đạm cho SKS nấm Vân chi cao đáng kể, đạt 8,6 g/1000ml sau 7 ngày nuôi cấy; sau

14 ngày nuôi cấy SKS không tăng mà giảm xuống còn 8 g/1000ml pH của môi trường sau 7 ngày nuôi cấy đo được pH = 5,75 nhưng sau 14 ngày nuôi cấy môi trường có giá trị pH = 4,96 (Bolla et al., 2010)

Nguồn amino acid bổ sung để SKS sớm đạt cao nhất được các tác giả chứng minh bao gồm alanine, valine, aspatic, đây là các axit amin cho SKS cao nhất ở ngày thứ tư, trong khi các axit amin khác cho SKS thấp hơn và đạt cực đại

ở thời gian dài hơn (Adebayo and Ugwu, 2011)

Kawai et al., (1995) đã tiến hành nghiên cứu thời gian hình thành quả thể nấm Hương (Lentinus edodes) khi sử dụng giống dịch thể Kết quả khi sử dụng giống dịch thể đã rút ngắn được thời gian ươm bịch và thời gian hình thành quả thể (từ 120 ngày xuống còn 90 ngày)

Yan et al., (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nấm Kim châm trên các môi trường dịch thể khác nhau, kết quả cho thấy nấm Kim châm nuôi cấy trong môi trường gồm các thành phần: 5% bột ngô; 1% malt; 0,5% CNM; 2% glucose; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,2% CaCO3; 1mg vitamin B1 cùng với điều kiện nhiệt độ 250C, chế độ lắc 180 vòng/phút, thời gian nuôi 6 - 7 ngày, kết quả thu được dịch giống nấm trong, màu vàng nhạt, mùi giống thơm, mật độ KLC đều Jonathan et al (2009) công bố một số kết quả nghiên cứu của họ về nuôi nấm trong môi trường dịch thể để thu SKS, nhóm tác giả đưa ra một số kết luận

về điều kiện thích hợp cho nấm Mộc nhĩ sinh trưởng tốt trong môi trường lỏng như: nguồn cacbon là 1,6% glucose; nguồn nitơ là 0,8% pepton; môi trường có giá trị pH = 6,5; nhiệt độ nuôi là 250C

Liu et al (2010) nghiên cứu môi trường dịch thể thích hợp để nuôi giống nấm Kim châm LP03, đã đưa ra các kết luận môi trường dịch thể nuôi cấy tốt nhất gồm: pepton; glucose; bột ngô; MgSO4.7H2O; KH2PO4; vitamin B1, trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 3ºC và chế độ lắc 160 vòng/phút phù hợp cho sự phát triển sợi nấm, thu được giống nấm phát triển tốt, kích thước KLC đồng đều Marquez-Rocha et al (1999), nghiên cứu nuôi cấy giống dịch thể của nấm

Sò trong bioreactor, kết quả chỉ ra rằng bằng cách thay đổi tốc độ và cường độ sục khí thì tỷ lệ tăng trưởng và kích thước KLC thay đổi Một xu hướng rõ ràng

đã được quan sát thấy phá vỡ kích thước viên nhỏ hơn, dẫn đến tốc độ tăng trưởng cao hơn Để thúc đẩy tăng trưởng sợi nấm thì giống cần được phá vỡ dạng viên mịn, nhưng mặt khác phải giữ cân bằng giữa sự tăng trưởng và phân mảnh của sợi nấm

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm trong nuôi cấy lỏng cho rằng giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nhiều yếu

tố bao gồm cả giống giống được nuôi cấy (Xu and Yun, 2003) Theo Lin (2006) thì pH ban đầu và nhiệt độ tối ưu để nuôi sợi phụ thuộc vào loài và môi trường nuôi cấy, cả hai đều là yếu tố quyết định rất quan trọng đến SKS nấm

Đa số các giống nấm sinh trưởng tốt trong điều kiện pH từ 5 - 7, Shin et

al (2007) đã chứng minh giá trị pH tối ưu cho nấm Kim châm là 6,5; còn kết quả nghiên cứu của Hamedi et al (2007) ghi nhận giá trị pH ban đầu tối ưu của môi trường dinh dưỡng để sản xuất SKS nấm Mặt trời Agricus blazei tại giá trị pH = 7

Nghiên cứu trên nấm Linh chi của Fang et al (2002) đã cho thấy khi mật độ giống cấy tăng lên thì kích thước KLC giảm, với một lượng giống cấy 670 mg/lít, thu được 68% các viên sợi có đường kính nhỏ hơn hơn 1,2 mm Tuy nhiên, khi cấy lượng giống 70 mg/lít, thì thu được 91% các viên có đường kính lớn hơn 1,6 mm Theo Lee et al (2004) thì cường độ sục khí ảnh hưởng rõ rệt đến hình thái KLC, nuôi trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M, tốc độ cánh khuấy 100 vòng/phút, KLC có lông tua ngắn Nuôi trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M, tốc độ khuấy 250 vòng/phút, KLC có hình viên tròn trơn, không có lông tua;

nuôi trong điều kiện sục khí là 1,16 V/V/M, tốc độ khuấy 166 vòng/phút, KLC

có tua dài

Sự lưu thông dòng chảy của môi trường lỏng bị ảnh hưởng mạnh bởi SKS nấm, khi cấy mật độ quá lớn dẫn đến sự gia tăng lớn về độ nhớt của môi trường trong quá trình lên men, gây ra khó khăn cho việc hấp thụ dinh dưỡng và trao đổi oxy Đối với các trạng thái hình dạng sợi nấm tồn tại trong môi trường nuôi cấy, khi sợi nấm phát triển như dạng viên thì có xu hướng ít nhớt hơn so với phát triển dạng sợi mảnh phân tán (Gibbs et al., 2000)

Trong những năm gần đây, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan và Đức là những nước có ngành công nghiệp sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu rất phát triển; đặc biệt có những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu sử dụng công nghệ nhân giống nấm dịch thể Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, công nghệ nhân giống nấm lớn trong dịch thể ngày càng được hoàn thiện và được xây dựng thành quy trình chuẩn, ứng dụng khá phổ biến ở một số nước có ngành công nghiệp nuôi trồng nấm phát triển Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống nấm lớn khác nhau, phụ thuộc vào quy mô sản xuất và điều kiện kinh tế xã hội, trình độ khoa học công nghệ của từng nước Việc sử dụng phương pháp cấy giống dịch thể để sản xuất giống nấm ăn và nấm dược liệu đã đạt được thành công với nhiều giống nấm khác nhau, từ kết quả thử nghiệm tại các phòng thí nghiệm cho thấy, đại đa số các hệ sợi nấm đều phát triển tốt trong điều kiện môi trường dịch thể thích hợp (Hasan et al., 2012)

2.2.2 Nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể tại Việt Nam

Mặc dù sản xuất nấm ở nước ta bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ 19, nhưng việc tiếp cận các công nghệ sản xuất tiên tiến, hiện đại của ngành nấm nước ta còn rất nhiều hạn chế Trong khi nghiên cứu và sản xuất nấm bằng công nghệ dịch thể với những ưu điểm của mình đã và đang được thế giới phát triển mạnh thì vấn đề này ở Việt Nam có rất ít các công trình nghiên cứu liên quan

Vũ Thị Hằng (2012), nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống nấm Kim châm Flammulina velutipes dạng dịch thể Kết quả bước đầu cho thấy nấm Kim châm Flammulina velutipes sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có chứa 1 g/l pepton 1g + 2 g/l cao nấm men + 0,5 g/l MgSO4.7H2O + 150 g/l nấm

Sò tươi + 20 g/l cám ngô + 20 g/l glucose, nhiệt độ nuôi giống 22±1oC, tốc độ lắc

140 vòng/phút, thời gian nuôi giống từ 5 - 7 ngày

Nguyễn Thị Bích Thùy (2012; 2013), đã nghiên cứu công nghệ nhân giống nấm Sò Vua (Pleurotus eryngii) và nấm Vân Chi (Tremates versicolor) dạng dịch thể Kết quả đã xác định điều kiện tối ưu để nhân giống cấp 1 dạng dịch thể cho 2 loại nấm này Nấm Sò Vua (Pleurotus eryngii) thích hợp với môi trường nhân giống 2,5 g/l Cao nấm men + 2,5 g/l pepton + 0,5 g/l MgSO4 7H2O + 1 g/l

KH2PO4 + 100 g/l nấm tươi + 15 g/l đường glucose Giống nấm Vân Chi thích hợp với môi trường nhân giống 2 g/l cao nấm men + 0,2 g/l MgSO4.7H2O + 1 g/l

KH2PO4 + 1,5 mg/l Thiamin + 15 g/l đường glucose

Trong số các công trình khoa học được công bố ở Việt nam đã có một số công trình nghiên cứu về giống nấm dịch thể trên một số giống nấm ăn và nấm dược liệu khác nhau nhưng đối với nấm Linh chi hiện nay vẫn chưa thấy báo cáo nào nói

về nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dịch thể

Nhìn chung, công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng mới cần được

ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất quy mô công nghiệp, dần dần đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm Hơn nữa việc áp dụng công nghệ mới vào sản xuất sẽ tạo ra một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm chức năng

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Nấm Linh chi chủng Ga-1

Nguồn giống: Sử dụng giống gốc nấm Linh chi chủng Ga-1 được lưu giữ tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.2 Vật liệu có nguồn gốc tự nhiên

Khoai tây: tươi, đồng đều kích thước, không nhiễm bệnh, không mọc mầm; Mùn cưa: mùn cưa cao su, không nhiễm mốc, chưa bị xử lý qua hoá chất Lõi ngô nghiền; bông phế loại;

3.1.3 Hóa chất và vật tư

Glucose, cao nấm men, pepton, HCl, NaOH;

Bông hóa học không thấm nước; túi nilon chịu nhiệt, và dây chun chịu nhiệt; cổ nhựa và nút nhựa chịu nhiệt; Các phụ gia;

3.1.4 Trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Bình tam giác (500ml, 2000ml,…); máy lắc, máy nghiền mẫu, máy li tâm; máy bơm áp lực và máy nén khí; màng lọc khí midisart kích thước 0,02µm của công ty Sartorius; Bình duran - Đức 2000ml và 5000ml được thiết kế như một bioreactor nhỏ theo công nghệ của Hàn Quốc;

Nồi hơi để hấp nguyên liệu, box cấy vô trùng ; tủ bảo quản giống, máy

đo pH, máy đo nồng độ CO2; máy đo nhiệt độ và độ ẩm; máy đo cường độ chiếu sáng,

Phòng nuôi giống có điều hòa nhiệt độ 2 chiều, quạt thông gió

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần dinh dưỡng tới sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡngdịch thể

Nội dung 2, nghiên cứu ảnh hưởng của một số chế độ nuôi tới sinh trưởng

hệ sợi giống nấm Linh chi trong điều kiện nuôi cấy dạng dịch thể

Nội dung 3, nghiên cứu ảnh hưởng của giống nấm Linh chi tới hiệu quả nhân giống trong điều kiện nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dịch thể

Nội dung 4, nghiên cứu nuôi trồng nấm Linh chi trên cơ chất tổng hợp sử dụng nguồngiống Linh chi dạng dịch thể

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi trong các mẫu môi trường dịch thể

PG (Potato, Glucose) có độ pH khác nhau;các mẫu được nuôi trong điều kiện như nhau; từ đó theo dõi, đánh giá để xác định ngưỡng pH phù hợp nhất cho sự sinh trưởng của hệ sợi giống nấm

Thí nghiệm sử dụng công thức môi trường: 100g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ theo định mức pha chế dịch thể dinh dưỡng; và thay đổi các giá trị pH mẫu thí nghiệm theo 7 công thức nghiên cứu khác nhau:

CT1.1: pH = 4 CT1.2: pH = 5CT1.3: pH = 6 CT1.4: pH = 7

CT1.5: pH = 8 CT1.6: pH = 9 CT1.7: pH = 10

Các mẫu được nuôi trong điều kiện nuôi tĩnh ở 25±2oC, nuôi và theo dõi sự phát triển hệ sợi trong 10 ngày

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết tự nhiên tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm Linh chi trong môi trường nuôi cấy dịch thể

Nuôi cấy giống nấm Linh chi trong các công thức môi trường dịch thể PG khác nhau về định mức sử dụng khoai tây trong chiết xuất dịch thể dinh dưỡng để xác định công thức môi trường dinh dưỡng tối ưu về lượng sử dụng nguyên liệu khoai tây tươi

Thành phần 1 lít môi trường dịch thể nghiên cứu theo 4 công thức dinh dưỡng khác nhau về lượng khoai tây như sau:

CT2.1: 100g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT2.2: 200g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT2.3: 300g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT2.4: 400g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

Môi trường được hiệu chỉnh về mức pH = 6; các mẫu được nuôi như nhau ở điều kiện 250C, nuôi lắc trong 10 ngày, quan sát và theo dõi sự phát triển của hệ sợi

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng carbon (C) trong môi trường dinh dưỡng tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm Linh chi được nuôi cấy dạng dịch thể

Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi trong các môi trường dịch thể PG khác nhau về công thức sử dụng glucose để xác định môi trường dinh dưỡng tối

ưu nhất

Thành phần 1 lít môi trường nuôi cấy nghiên cứu theo 5 công thức khác nhau về lượng glucose như sau:

CT3.1: 300g/l khoai tây + 10g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT3.2: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT3.3: 300g/l khoai tây + 30g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

CT3.4: 300g/l khoai tây + 40g/l glucose + nước cất bù đủ 1000ml

Môi trường được hiệu chỉnh về mức pH = 6; các mẫu được nuôi như nhau ở điều kiện 250C, nuôi lắc trong 10 ngày, quan sát và theo dõi sự phát triển của hệ sợi

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitrogen (N) tới sinh trưởng hệ sợi giống nấm Linh chi trong môi trường nuôi cấy dịch thể Thí nghiệm sử dụng cao nấm men và pepton làm nguồn bổ sung nitrogen cho môi trường dinh dưỡng nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi

Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi trong các môi trường dịch thể theo

5 công thức khác nhau về hàm lượng sử dụng cao nấm men như sau:

CT4.1: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 0g/l cao nấm men

CT4.2: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 1g/l cao nấm men

CT4.3: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 2g/l cao nấm men

CT4.4: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 3g/l cao nấm men

CT4.5: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 4g/l cao nấm men

Đồng thời, nuôi cấy giống nấm Linh chi trong các môi trường dịch thể theo

5 công thức khác nhau về hàm lượng sử dụng pepton (Protoese peptone – cao thịt) như sau:

CT4.6: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 0g/l pepton

CT4.7: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 1g/l pepton

CT4.8: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 2g/l pepton

CT4.9: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 3g/l pepton

CT4.10: 300g/l khoai tây + 20g/l glucose + 4g/l pepton

Các mẫu thí nghiệm được nuôi như nhau trong cùng một điều kiện, từ đó theo dõi và đánh giá hiệu quả nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi khi bổ sung dinh dưỡng nitrogen từ các nguồn khác nhau vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể

Tiến hành nuôi cấy giống nấm Linh chi dạng dịch thể trong các điều kiện nuôi khác nhau: nuôi trên máy lắc và nuôi trong bình sục khí.Thí nghiệm sử dụng công thức môi trường dinh dưỡng: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/lCao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế

Các mẫu được nuôi đồng thời trong các điều kiện như nhau khác nhau về các chế độ cung cấp dưỡng khí trong mỗi điều kiện nuôi cấy như sau:

a Nuôi cấy giống nấm Linh chi dịch thể trên máy lắc với biên độ lắc 5 cm/vòng theo 5 công thức nghiên cứu khác nhau về tốc độ lắc:

CT5.1: 110 vòng/phút

CT5.2: 120 vòng/phút

CT5.3: 130 vòng/phút

CT5.4: 140 vòng/phút CT5.5: 150 vòng/phút

b Nuôi cấy giống nấm Linh chi dịch thể trong các bình sục khí Duran (Đức) dung tích 2 lít được thiết kế như các bioreacter nhỏ, nghiên cứu với 5 công thức khác nhau về lưu lượng sục khí:

CT5.6: 0,2 V/V/M

CT5.7: 0,3 V/V/M

CT5.8: 0,4 V/V/M

CT5.9: 0,5 V/V/M CT5.10: 0,6 V/V/M

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng của của hệ sợi giống nấm Linh chi trong môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể

Thí nghiệm sử dụng công thức môi trường dinh dưỡng: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/lCao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế

Tiến hành nuôi cấy và nuôi mẫu trên máy lắc ở tốc độ lắc 120 vòng/phút, theo dõi sinh trưởng của giống trong 6 công thức khác nhau về giai đoạn tuổi giống tính từ thời điểm cấy giống lên môi trường nuôi cấy:

CT6.1: 48 giờ CT6.2: 72 giờ CT6.3: 96 giờ

CT6.4: 120giờ CT6.5: 144giờ CT6.6: 168 giờ Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống tới sinh trưởng của

hệ sợi giống nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể Thí nghiệm sử dụng công thức môi trường dinh dưỡng: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/lCao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế

Giống được nuôi sau 120 giờ nuôi (5 ngày tuổi) cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy dạng dịch thể với các tỉ lệ sau:

CT7.9: 9% giống CT7.10: 10% giống

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi nguồn giống tới sinh trưởng của hệ sợi giống nấm Linh chi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể

Thí nghiệm sử dụng công thức môi trường dinh dưỡng: 300g/l Khoai tây + 20g/l Glucose + 3g/lCao nấm men + Nước cất bù đủ định mức pha chế

Sử dụng giống gốc ở các độ tuổi giống khac nhau để nuôi cấy lên môi trường dinh dưỡng dịch thể theo các công thức sau:

CT8.1: 72 giờ nuôi CT8.2: 96 giờ nuôi CT8.3: 120 giờ nuôi

CT8.4:144 giờ nuôi CT8.5:168 giờ nuôi

Thí nghiệm 9: Đánh giá ảnh hưởng của nguồn giống và nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng của nấm Linh chi

Tiến hành nuôi trồng nấm Linh chi trên nguyên liệu cơ chất tổng hợp để sản xuất sinh khối quả thể nấm, sử dụng nguồn giống nấm dạng dịch thể để so sánh với đối chứng sử dụng nguồn giống nấm thể rắn (giống cấy theo công nghệ cũ) Giống nấm Linh chi được sử dụng trong các thí nghiệm nuôi trồng bao gồm: nguồn giống 1, giống nấm thể rắn – giống đối chứng; nguồn giống 2, giống nấm thương phẩm dạng dịch thể

Thành phần nguyên liệu nuôi trồng nấm Linh chi được xử lý phối trộn theo các công thức như sau:

CT9.1: 84% mùn cưa + 10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3

CT9.2: 79% mùn cưa + 5% trấu + 10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 CT9.3: 74% mùn cưa + 10% trấu +10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3 CT9.4: 69% mùn cưa + 15% trấu +10% cám gạo + 5% bột ngô + 1% CaCO3Công thức CT9.1 là công thức đối chứng để đánh giá hiệu quả phối trộn nguyên liệu cơ chất tổng hợp theo các công thức khác nhau

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của lượng giống dịch thể đến sinh trưởng của nấm Linh chi trên nguyên liệu nuôi trồng

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nguồn giống dịch thể trung gian

để cấy vào bịch nguyên liệu nuôi trồng

Lượng giống cấy vào bịch nguyên liệu (1400g/bịch) gồm 5 công thức khác nhau:

CT10.1: 10ml/ bịch CT10.2: 15ml/ bịch CT10.3: 20ml/ bịch

CT10.4: 25ml/ bịch CT10.5: 30ml/bịch

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường và các điều kiện thí nghiệm

a Chuẩn bị dịch giống gốc nấm Linh chi

Chọn giống gốc Linh chi chủng Ga-1,giống đủ tiêu chuẩn: sợi trắng mọc đều kín mặt thạch, không quá non và chưa quá già (không bị vàng và hóa sần, ), không có dấu hiệu nhiễm bệnh

Mỗi một (01) ống giống gốc nấm Linh chi được sử dụng được đánh với lượng 100 ml nước cất để tạo dịch giống cấy cho các mẫu thí nghiệm

Thao tác trong tủ cấy vô trùng, cào giống bằng que cấy từ ống giống gốc vào bình tam giác có 100ml nước cất vô trùng, chú ý bỏ không lấy phần môi trường không có sợi nấm; đánh giống trên máy khuấy từ ở tốc độ khuấy 200 vòng/phút trong khoảng thời gian 3 giờ; sau đó để lắng trong 10 phút trước khi

sử dụng cho cấy giống

Độ tuổi giống và số lượng ống giống được sử dụng có thể phụ thuộc vào yêu cầu của thí nghiệm nghiên cứu cụ thể được thiết kế

b Chuẩn bị môi trường thí nghiệm

Khoai tây chọn củ đều nhau, không mọc mầm, không sâu bệnh, không thối hỏng, gọt vỏ rửa sạch, khoét bỏ mắt (mầm) ngủ; thái kích thước 1cm*1cm*2cm; Cân lấy một lượng 100g khoai tây đun với tối đa 1000 ml nước cất trong 30 phút chiết lấy dịch; quá trình đun sôi cần đun nhỏ lửa để dịch chiết không bị trào

và ít tạo màng bọt đồng thời vớt màng bọt nổi trên bề mặt dịch chiết Sau đó lọc dịch chiết ba lần qua vải lọc nhiều lớp để loại bỏ bã khoai tây và huyền phù tế bào khoai tây Cân 60g đường glucose cho vào dịch chiết thu được khuấy tan đều; Thêm nước cất bù đủ tới 1000ml dung dịch để có 1 lít môi trường dịch thể dinh dưỡng gốc cho các thí nghiệm

Tùy theo yêu cầu cụ thể của mỗi thí nghiệm mà lượng khoai tây và lượng nước cất cũng như các thành phần cần thiết bổ sung vào dịch chiết (cao nấm men, pepton, ) sẽ được cân đong và bổ sung phù hợp

Chuẩn bị mẫu và cấy chuyển giống

Thí nghiệm được thực hiện với các công thức môi trường dịnh thể dinh dưỡng khác nhau về chỉ tiêu nghiên cứu, cụ thể thiết kế theo từng thí nghiệm (pH, thành phần môi trường dinh dưỡng, tỷ lệ giống, )

Mỗi công thức thí nghiệm nghiên cứu sẽ được nuôi với 5 mẫu/lần; mỗi mẫu nuôi lắc được nuôi trong chai lắc dung tích 500ml với thể tích dịch thể môi