Nghiên cứu nhân sinh khối nấm trichoderma sp và ứng dụng phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại hà nội và lào cai

và ứng dụng phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai Phương pháp nghiên cứu Các mẫu đất để phân lập nấm Trichoderma spp.. Trong khoảng thời gian dài 15 năm các

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM QUANG NGUYÊN

NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI NẤM

TRICHODERMA SP VÀ ỨNG DỤNG PHÒNG TRỪ BỆNH LỞ CỖ RỄ VÀ THỐI HẠCH BẮP CẢI

TẠI HÀ NỘI VÀ LÀO CAI

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đức Huy

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm2017

Tác giả luận văn

Phạm Quang Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,

đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc TS Nguyễn Đức Huy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ

môn Bệnh cây, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ

tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trạm BVTV Huyện

Gia Lâm, Chi cục BVTV Tỉnh Lào Cai đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận

văn./

Hà Nội, ngày tháng năm2017

Tác giả luận văn

Phạm Quang Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x

THESIS ABSTRACT xii

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

2.1 NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma spp 4

2.1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp 4

2.1.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp lên các tác nhân gây bệnh cây trồng 6

2.1.3 Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp đối với các loài bệnh gây hại cây trồng 8

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 9

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 12

2.4 NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH CHẾT RẠP CÂY CON, LỞ CỔ RỄ VÀ THỐI NHŨN CẢI BẮP DO NẤM Rhizoctonia solani GÂY RA 16

2.5 NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI HẠCH CẢI BẮP DO NẤM Sclerotinia sclerotiorum GÂY RA 18

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 ĐÔI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20

3.1.3 Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 20

3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21

3.2.1 Địa điểm 21

3.2.2 Thời gian 21

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất và phân lập nấm Trichoderma 21

3.4.2 Phương pháp điều tra mức độ bệnh (tỉ lệ bệnh) lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai 22

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 22

3.4.4 Thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải (giai đoạn cây con) trong nhà lưới 28

3.4.5 Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải bằng chế phẩm Trichoderma tại Hà Nội và Lào Cai 29

3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN 30

4.1 KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC CỦA NẤM TRICHODERMA SP 30

4.1.1 Kết quả thu thập mẫu đất để phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp tại một số tỉnh miền Bắc 30

4.1.2 Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp tại một số tỉnh miền Bắc 31

4.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC CỦA CÁC MẪU NẤM TRICHODERMA 35

4.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum 35

4.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma asperellum 37

4.3 NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI NẤM TRICHODERMA

ASPERELLUM TRÊN MỘT SỐ CƠ CHẤT ĐỂ LÀM NGUỒN TẠO

CHẾ PHẨM TRICHODERMA 40

4.3.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma asperellum 40

4.3.2 Tạo chế phẩm chứa nấm T asperrellum 42

4.4 NGHIÊN CỨU SỨC SỐNG CỦA BÀO TỬ NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM SAU KHI PHỐI TRỘN VỚI PHÂN BÓN 44

4.5 KẾT QUẢ ĐIỀU TRA MỨC ĐỘ BỆNH THỐI HẠCH VÀ LỞ CỔ RỄ BẮP CẢI TẠI HÀ NỘI VÀ LÀO CAI 46

4.5.1 Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch, lở cổ rễ tại Lào Cai 46

4.5.2 Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch và lở cổ rễ bắp cải tại Hà Nội 50

4.6 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ VÀ THỐI HẠCH BẮP CẢI 53

4.6.1 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PDA 53

4.6.2 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Sclerotinia sclerotiorum trên môi trường PDA 54

4.7 THỬ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH LỞ CỔ RỄ (Rhizoctonia solani) VÀ THỐI HẠCH (Sclerotinia sclerotiorum) CÂY BẮP CẢI TRONG NHÀ LƯỚI VÀ NGOÀI ĐỒNG RUỘNG BẰNG CHẾ PHẨM TRICHODERMA 55

4.7.1 Thử nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) cây bắp cải trong chậu 55

4.7.2 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch cây bắp cải (Sclerotinia sclerotiorum) tại Lào Cai và Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma 57

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

5.1 KẾT LUẬN 61

5.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Danh sách mẫu đất đã được thu thập để phân lập nấm Trichoderma sp

trong nghiên cứu này 30

Bảng 4.2 Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp từ các mẫu đất đã thu thập 31

Bảng 4.3 Kết quả tìm kiếm chuỗi gần gũi trên ngân hàng gen của 09 mẫu nấm Trichoderma 33

Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma 35

Bảng 4.5 Khả năng phát triển của nấm T.asperellum trên một số môi trường 37

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm T.asperellum trên môi trường PDA 38

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy (PDA) đến sự phát triển của nấm T.asperellum 39

Bảng 4.8 Sự hình thành bào tử của nấm T.asperellum trên các giá thể khác nhau 41

Bảng 4.9 Khả năng phát triển của nấm T.asperellum sau khi bảo quản 45

Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải (R.solani) tại Lào Cai 46

Bảng 4.11 Tình hình bệnh thối hạch bắp cải tại Bảo Thắng - Lào Cai 48

Bảng 4.12 Tình hình bệnh Lở cổ rễ bắp cải tại Hà Nội 50

Bảng 4.13 Tình hình bệnh thối hạch bắp cải tại Hà Nội 51

Bảng 4.14 Hiệu lực đối kháng của nấm T.asperellum đối với nấm R.solani trên môi trường PDA 53

Bảng 4.15 Hiệu lực đối kháng của nấm T.asperellum đối với nấm S.sclerotiorum trên môi trường PDA 54

Bảng 4.16 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp trên nguồn đất nhiễm R.solani 56

Bảng 4.17 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải tại Gia Phú - Bảo Thắng - Lào Cai vụ thu đông 2016 57

Bảng 4.18 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải tại Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội vụ xuân 2017 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái nấm Trichoderma sp 5

Hình 4.1 Các mẫu nấm Trichoderma sp đã phân lập thuần trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy 32

Hình 4.2 Sản phẩm điện di các mẫu nấm đối kháng Trichoderma Vn.01-Vn.09 Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp 33

Hình 4.3 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của 09 mẫu nấm Trichoderma sp 34

Hình 4.4 Đặc điểm hình thái của mẫu nấm 36

Hình 4.5 Sự phát triển của nấm T.asperellum trên một số môi trường 37

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của T asperellum 39

Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của T.asperellum trên môi trường PDA 40

Hình 4.8 Nhân nuôi nấm T asperellum trên một số giá thể 41

Hình 4.9 Quy trình tạo chế phẩm chứa nấm T.asperellum 44

Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng phát triển của nấm T.asperellum 45

Hình 4.11 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ cải bắp 47

Hình 4.12 Đặc điểm hình thái tản nấm và sợi nấm trên môi trường PDA 47

Hình 4.13 Triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh thối hạch cải bắp 49

Hình 4.14 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ cải bắp 50

Hình 4.15 Triệu chứng bệnh thối hạch cải bắp 52

Hình 4.16 Khả năng đối kháng của nấm T.asperellum đối với nấm R.solani trên môi trường PDA 54

Hình 4.17 Khả năng đối kháng của nấm T.asperellum đối với nấm S.sclerotiorum trên môi trường PDA 55

Hình 4.18 Hiệu lực của chế phẩm T asperellum phòng chống bệnh lở cổ rễ bắp cải trong điều kiện chậu vại 56

Hình 4.19 Bố trí thí nghiệm phòng trừ tại Bảo Thắng – Lào Cai 58

Hình 4.120 Thí nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải 60

DANH MỤC ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Tạo chế phẩm chứa nấm Trichoderma 43

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Phạm Quang Nguyên

Tên Luận văn: Nghiên cứu nhân sinh khối nấm Trichoderma sp và ứng dụng phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai

Phương pháp nghiên cứu

Các mẫu đất để phân lập nấm Trichoderma spp được thu thập ở Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hải Dương, Cao Bằng trên các ruộng trồng rau mầu Nấm đối kháng Trichoderma spp được phân lập từ các mẫu đất sử dụng môi trường WA và phương pháp cấy đơn bào tử dưới sự hỗ trợ của kim thủy tinh và kính hiển vi quang học Giám định các chủng Trichoderma dựa vào đặc điểm hình thái và giải trình tự gene vùng rDNA-ITS

Kết quả chính và kết luận

- Đã thu thập được 18 mẫu đất ở các ruộng trồng rau mầu từ 5 tỉnh ở miền Bắc

Đã phân lập được 09 mẫu nấm Trichoderma sp.từ các mẫu đất thu thập

- Sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gene vùng rDNA-ITS của các mẫu nấm Trichoderma sp cho thấy 08 mẫu nấm là loài T asperellum và 01 mẫu nấm là loài T harzianum Như vậy, phổ biến trong đất là nấm T asperellum

- Nấm T asperellum phát triển tốt trên môi trường PDA, pH 6-7 và nhiệt độ 20o

C-25oC Đường kính tản nấm là 90mm sau 3 ngày nuôi cấy

- Kết quả nhân sinh khối nấm T asperellum cho thấy nấm phát triển nhanh trên cơ chất là thóc luộc (7,8 x 109cfu/g)

- Nghiên cứu phối trộn với cơ chất để tạo chế phẩm, phối trộn chế phẩm với phân bón hữu cơ và bảo quản cho thấy khả năng sống của bào tử nấm được đến 12 tháng

- Tỷ lệ bệnh lở cổ rễ tại Văn Đức – Gia Lâm, Hà Nội (13,3%) cao hơn tỷ lệ bệnh

lở cổ rễ tại Bảo Thắng – Lào Cai (5,0%)

- Tỷ lệ bệnh thối hạch tại Hà Nội (55,5%) cao hơn tỷ lệ bệnh thối hạch tại Lào Cai (7,0%)

- Nấm đối kháng T asperellum có khả năng ức chế tốt đối với sự phát triển của nấm R solani và nấm S sclerotiorum trên môi trường PDA khi nấm T asperellum được cấy trước nấm R solani và nấm S sclerotiorum 24 giờ

- Đã thử nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải trong chậu vại bằng chế phẩm nấm T asperellum cho thấy chế phẩm nấm T asperellum có hiệu quả phòng trừ tốt bệnh lở cổ rễ khi bón chế phẩm phối trộn với phân bón hữu cơ trước 48 giờ

- Đã khảo nghiệm hiệu lực phòng trừ bệnh thối hạch cải bắp tại Bảo Thắng – Lào Cai và Văn Đức – Gia Lâm bằng chế phẩm nấm T asperellum cho thấy hiểu quả phòng trừ cao khi bón chế phẩm T asperellum phối trộn với phân bón hữu cơ lục thần nông Hiệu quả phòng bệnh thối hạch của chế phẩm nấm T asperellum trừ đạt 75,1% ở Bảo Thắng – Lào Cai và đạt 69,2% ở Văn Đức – Gia Lâm

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Quang Nguyen

Thesis title: Biomass production of Trichoderma sp and apply to control rhizoctonia root rot and sclerotinia stem rot of cabbage in Hanoi and Laocai

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives:

To collect soil samples from upland crops in diferent provinces in the North of Vietnam for isolation of Trichoderma To identify Trichoderma based on sequencing of rDNA-ITS region Next, select a good Trichoderma isolate showed ability to control some soil borne fungi like Rhizoctonia solani and Slerotinia sclerotiorum Finaly, produce biomass of Trichoderma to apply for contring the rhizoctonia root tot and sclerotinia stem rot in Hanoi and Laocai provinces

Materials and Methods

In this study, soil samples were collected from different upland crop fields in five provinces in the Norh of Vietnam including Bac Ninh, Ha Noi, Hai Duong, Hoa Binh and Cao Bang Trichoderma from colledted soil samples were isolated using PDA medium by single spore culture To identify Trichoderma, fungal DNA was extracted using CTAB method Two primers, ITS4 and ITS5 (White et al 1990), were used to amplify the complete ITS (Internal Transcribed Spacer) region DNA was applied for PCR reaction PCR product was purified using cormecial Kit based on manufacture introduction Sequencing reaction was carried out by Macrogen in Korea Phylogenetic tree was constructed based on nine squences in this study and others available from Genbank Biological and molecular characterizations were studies To understand incidence of rhizoctonia root rot and sclerotinia stem rot disease, a filed surveys was designed in main growing region of cabbage in Ha Noi and Lao Cai Capacity of Trichoderma against pathogen (R solani, S sclerotiorum) was accessed Greenhouse and field experiment using biomass of Trichoderma combined to organic fertilizer named ‘luc than nong’ to control the diseases of rhizoctonia root rot and sclerotinia stem rot was carried out in Ha Noi and Lao Cai provinces

Main findings and conclusions

- 18 soil samples were collected from upland crops in five provinces in the North

of Vietnam (Ha Noi, Hai Duong, Bac Ninh, Hoa Binh and Cao Bang)

- Based on PCR and sequences of rDNA – ITS region of Trichoderma isolates Trichoderma isolates were identified as Trichoderma asperellum (08 isolates) and Trichoderma harzianum (01 isolate)

- T asperellum was grown well at 25 - 30oC, pH 6 – 7, PDA media, the mycelium was 90mm after three days of culturing

- T asperellum produced big biomass in substrate of boiled rice (7,8 x 109cfu/g)

- Conbination of Trichoderma with orgnic fertilizer showed that spores of Trichoderma could survive and germinate after 12 month of storage

- Disease incidence of rhizoctonia root rot in Gialam – Hanoi (13,3%) was higher than that in Bao Thang - Lao Cai (5,0%)

- Disease incidence of sclerotinia stem rot in Hanoi (55,5%) was higher than that

in Lao Cai (7,0%)

- Our finding showed that the inhibitory of T asperellum against R solani and S sclerotiorum were at the most effective when T asperellum was cultured 24 hours before R solani and S sclerotiorum

- Pod experiments showed that the effect of T asperellum against R solani was found to be the highest one when T asperellum mixed with organic fertilizer and added

to infected soil by R solani before 2 days

- To evoluate the in inhibitory of biomass of T asperellum against sclerotinia stem rot in Lao Cai and Hanoi show that Trichoderma biomass mixed with organic fertilizer could control the disease in the filed Effect control up to 75,1% in Bao Thang – Lào Cai and 69,2% in Van Duc – Gia Lam when apply Trichoderma biomass before seedling or transplanting

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm có nguồn gốc trong đất (Rhizoctona solani, Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Fusarium oxysporum,…) gây bệnh hại vùng rễ một số cây trồng như cây rau (cà chua, khoai tây, rau họ hoa thập tự), cây ăn quả có giá trị kinh tế (chanh leo, chuối,…) và một số cây công nghiệp ngắn ngày (đậu tương, lạc) đã gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam vì phần lớn bệnh làm giảm mật độ cây con trên đồng ruộng

Phòng trừ nhóm nấm có nguồn gốc trong đất bằng thuốc hóa học là rất khó Ngoài việc không cho hiệu quả phòng trừ cao thì khi phun hoặc rải thuốc hóa học vào đất còn gây ô nhiễm môi trường đất, nước, sinh thái từ đó ảnh hưởng tới sức khỏe của con người cũng như vật nuôi Vì vậy, xu hướng trong tương lai để phát triển nông nghiệp bền vững là phải giải quyết những vấn đề nêu trên Việc quan trọng là cần thay dần thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hoá học sang việc dùng những chế phẩm có nguồn gốc sinh học như nấm, vi khuẩn và tuyến trùng đối kháng để phòng trừ nhóm tác nhân gây bệnh có nguồn gốc trong đất Một trong số các nguồn nấm đối kháng có nguồn gốc trong đất được sử dụng nhiều là Trichoderma spp

Nấm Trichoderma spp có nhiều trong tự nhiên, là loại nấm có hoạt tính đối kháng mạnh và phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh hại cây trồng

có nguồn gốc trong đất Ngoài ra, nấm Trichoderma spp còn có khả năng kích thích sự phát triển của bộ rễ tạo cho cây trồng phát triển tốt Do đó nấm Trichoderma spp đã được ứng dụng rộng rãi để tạo ra những chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng và kích thích sinh trưởng của cây Sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma để phòng trừ bệnh cây đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều Trong thực tế dòng nấm đối kháng Trichoderma spp đã được ứng dụng để tiêu diệt một số loại bệnh hại cây trồng và đã có nhiều chế phẩm sinh học được tạo ra cho hiệu quả cao Nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, tạo ra chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh Việc nghiên cứu phân lập lựa chọn những chủng nấm Trichoderma spp có khả năng đối kháng, tiêu diệt nấm bệnh cao là hết sức cần thiết, góp phần nâng cao hiệu quả phòng trừ, an toàn với môi trường

và sức khỏe của con người

Tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, nấm đối kháng Trichoderma cũng đã được Bộ môn Bệnh cây nghiên cứu từ năm 1996 Tuy nhiên, nguồn nấm Trichoderma sp được giám định chủ yếu dựa vào hình thái, các thử nghiệm về phòng trừ của nấm đối kháng đối với nấm gây bệnh chủ yếu vẫn là đánh giá trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành thu thập, phân lập, định danh cụ thể loài Trichoderma spp dựa vào trình tự vùng gene ITS Tiếp tục đánh giá và tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma có tiềm năng phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctona solani, nấm Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Fusarium oxysporum gây ra bắp cải, cà chua, Ngoài ra, nghiên cứu này cũng chọn ra 01 loài Trichoderma sp tốt nhất để phối trộn với phân hữu cơ nhằm tăng hiệu quả phòng trừ đối với một số bệnh lở cổ rễ

và thối hạch bắp cải Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu nhân sinh khối nấm Trichoderma sp và ứng dụng phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

+ Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân tử của nấm Trichoderma sp

+ Nghiên cứu nhân sinh khối nấm Trichoderma sp., phối trộn nấm Trichoderma sp.với phân bón hữu cơ trong phòng trừ bệnh lở ổ rễ và thối hạch bắp cải ngoài đồng ruộng

+ Thử nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ câp bắp cải trong chậu vại

+ Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải tại Lào Cai và

Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma sp kết hợp với phân bón hữu cơ

- Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải trên đồng ruộng tại

Xã Gia Phú - Huyện Bảo Thắng – Lào Cai và Xã Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Đã xác định được nấm Trichoderma sp thu thập tại một số tỉnh miền Bắc

là Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum, trong đó phổ biến là T asperellum Nấm T asperellum có khả năng phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tốt

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Có thể sử dụng chế phẩm nấm T Asperellum phòng trừ bệnh thối hạch và

lở cổ rễ cây bắp cải trong thực tiễn sản xuất ngoài đồng ruộng

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma spp

2.1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp

Giống nấm Trichoderma Pers thuộc họ Moniliaceae, bộ moniliales, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes Nấm Trichoderma spp có sợi nấm dạng bò lan, không màu hay sáng màu Sợi nấm sinh trưởng, phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng, có cành bào tử đơn bào không mầu Cành bào tử phân nhánh và các nhánh này thường mọc đối xứng nhau hoặc theo nhiều phía Trên cành bào tử thường có cuống đính bào tử Cuống đính bào tử hình chai Bào tử hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu, có cấu tạo đơn bào Bào tử có thành dầy Kích thước bào tử thay đổi tùy loài phổ biến từ 3,0 µm đến 4,0 µm Đây là các nấm đối kháng sống trong đất Thường quan sát thấy nấm Trichoderma spp tồn tại trong đất ở dạng sợi nấm hoăc bào tử Bào tử có rất nhiều trong đất ẩm

Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma spp có hình dạng khuẩn lạc khác nhau Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt Khuẩn lạc Trichoderma spp phát triển rất nhanh và thành thục trong

Trichoderma spp ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử xuất hiện Ở một số loài Trichoderma spp còn có khả năng tiết ra sắc tố có màu vàng trên môi trường PGA Một số loài Trichoderma spp còn tạo mùi đặc trưng như Trichoderma viride tạo mùi dừa

Nấm Trichoderma spp có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia Hầu

sinh khối của Trichoderma spp thích hợp là 54 - 56 % PH thích hợp để nấm Trichoderma spp phát triển là 5 - 6, khi PH > 6 sinh trưởng của nấm yếu, PH <

4 sinh trưởng của nấm rất yếu

Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma spp cần có điều kiện thoáng khí vì vậy sau khi vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp bằng cách lắc để chúng không kết lại thành mảng Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được

Hình 2.1 Hình thái nấm Trichoderma spp

Kết quả nghiên cứu của Choudhary (1992) cho thấy, chủng T viride làm giảm thiểu sự sinh sản độc tố aflatoxin B1 (73,5%) và aflatoxin G (100%) khi nuôi cấy chung với chủng A flavus

Nghiên cứu của Srilakshmi et al (2001) đã đánh giá tiềm năng đối kháng của 212 chủng nấm Trichoderma được thu thập, phân lập từ các mẫu đất ở bang Andhra Pradesh và Karnataka ở Ấn Độ, trong đó có 145 chủng Trichoderma đối kháng với nấm A.flavus

Trung tâm BIOTEC (Thái Lan) đã sử dụng kỹ thuật nuuoi cấy trên môi trường PDA Trong số 462 mẫu pphan lập được thue nghiệm có 226 chủng có khả năng ức chế sự phát triển của nấm R solania hoàn toàn, điển hình là các chủng thuộc loài T harianum trên hạt giống lạc (Sawangsri et al., 2007) Trong khoảng thời gian dài 15 năm các nhà khoa học thuộc trung tâm BIOTEC (Thái Lan) đã nghiên cứu rất kỹ, nhiều về nấm Trichoderma và cũng đã tuyển chọn được các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế các loại nấm gây hại cây trồng có nguồn gốc trong đất Các ứng dụng vi sinh cũng đã chỉ ra rằng các loài nấm Trichoderma có khả năng ức chế, phòng trừ các loại bệnh do nấm

R.solania, S.sclerotium và Fusarium oxysporum gây hại các loại cây trồng, đặc biệt là rau màu

Dusanee Thanaboripat et al (Thái Lan) (2009) nghiên cứu cơ chất kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma atroviride kháng A parasiticus IMI 10.256

có thể là chất được dùng để sản xuất các chất kháng nấm

Ở Việt Nam, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma sp để phòng trừ một số loài nấm gây hại vùng rễ và cây con có nguồn gốc trong đất và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma sp để xản xuất phân bón theo hướng an toàn, thân thiện với môi trường

2.1.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp lên các tác nhân gây bệnh cây trồng

Nấm đối kháng Trichoderma sp có nhiều trong đất và được biết rõ đến hiệu quả trong việc kiểm soát các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Botrytis cinerea Cơ chế trực tiếp liên quan đến hiệu quả đối kháng là sự cạnh tranh, sinh kháng sinh và ký sinh

Tùy thuộc vào loài nấm Trichoderma sp mà tạo ra các loại kháng sinh khác nhau Nấm Trichoderma viride sinh ra kháng sinh: viridin, trichodermin, xosukacylin, almatecin hoặc các vitamin, cacbonhydrat, nitơ nhờ vậy làm đất tốt Các chất kháng sinh này có thể ở dạng bay hơi hoặc không bay hơi, khi tiết ra đều ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh ở mức độ khác nhau

Nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma sp có khả năng sản sinh các enzym Chitinase và -glucanase với hàm lượng cao, đây là 2 enzym thủy phân vách tế bào của các loài nấm gây bệnh rất mạnh Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium cho hàm lượng chitinase cao Chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây bệnh cho cây trồng Nấm Trichoderma sp khi ký sinh nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase Các chủng nấm mốc Trichoderma, Aspergillus, Candida

biệt là nấm Trichoderma -glucanase của Trichoderma giữ vai trò chính trong

Trichoderma sp kìm hãm quá trình sinh tổng hợp -1,3-glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh

Tác động đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với vi sinh vật gây bệnh cây được thông qua bởi một số cơ chế sau đây:

- Cơ chế ký sinh: Theo Weindling mô tả từ năm 1932 tác giả gọi đó là hiện tượng "giao thoa sợi nấm" Trước tiên sợi nấm Trichoderma sp vây xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma sp thắt chặt lấy các sợi nấm bệnh, cuối cùng mới thấy nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh bên trong sợi nấm bệnh

Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma

sp trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma sp quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma sp xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá hủy từng phần hoặc hoàn toàn Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma sp Hiện tượng tan

rã Kitin có ở vùng xung quanh nơi xâm nhập của nấm Trichoderma sp (Dubey, 1995; Inbar and Ramirez,1996)

Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm Trichoderma sp trên nấm gây bệnh cây là các bào tử đính của nấm Trichoderma sp sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành được thể giác bám Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ Tỉ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma sp với nấm vật chủ (Inbar and Ramirez, 1996)

- Cơ chế kháng sinh: Nấm Trichoderma sp có khả năng sinh ra một số kháng sinh Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng là khác nhau giống Một số chất kháng sinh do Trichoderma sp sinh ra bao gồm:

+ Gliotoxin: là chất kháng sinh được Weindling (1932) và Emerson (1936)

do nấm Trichoderma lignorum tạo thành Trichoderma sinh kháng sinh Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều trong dịch môi trường Sự tích lũy tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn phát triển sớm của nấm Trichoderma sp Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta pisi; Botrytis, R solani)

+ Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma sp tạo thành trong hoạt động sống của chúng (Bilai, 1974; Martin et al.,1975; Seiketov, 1982) Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945 (Seiketov, 1982) Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao

Ngoài ra, đã xác định được một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma sp sinh ra như: chất kháng sinh U-21693 được Meyer phát hiện năm 1996 Năm 1975, ở Nhật Bản, các tác giả Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2 chất kháng sinh: Trichoderma và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T.koningii và T.aureoviride (Seiketov, 1982)

Nấm Trichoderma sp còn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh dễ bay hơi có hoạt tính sinh lý cao Theo Hutchinson (1973) thì thành phần chính

- Tác động của men: Nhiều loài Trichoderma sp có khả năng sinh ra men phân giải (như men laminarinaza, chitinaza,…) (Score et al.,1994) Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma sp có thể tiết ra

-(1-3)-glukanase và chitinaza (Chet et al., 1981; Jones and Watson, 1969)

- Cơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma sp có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú Nấm Trichoderma sp định cư trước so với các nấm gây bệnh cây Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm gây bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985)

2.1.3 Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp đối với các loài bệnh gây hại cây trồng

Biện pháp hóa học luôn được con người cho rằng đó là biện pháp hữu hiệu nhất, nhưng thực tế đã chứng minh rằng việc sử dụng thuốc hóa học còn nhiều hạn chế Chính vì vậy mà những năm gần đây chúng ta đã dần giảm bớt việc lạm dụng thuốc hóa học trong phòng trừ dịch hại nói chung và dịch bệnh nói riêng Con người đã dần chuyển sang áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như IBM, ICM đặc biệt là sử dụng các sản phẩm sinh học để phòng trừ Điều này đã khắc phục được hạn chế của thuốc hóa học đó là không làm ô nhiễm môi trường, không tạo ra các chủng nòi kháng thuốc

Năm 1932 R.Weingling đã mô tả cơ chế ký sinh của nấm Trichoderma sp trên nấm gây bệnh và ông gọi là “Giao thoa sợi nấm”, sợi nấm Trichoderma sp.xoắn quanh sợi nấm bệnh, thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ vậy mà sợi nấm Trichoderma sp xâm nhập vào bên trong vật chủ và từng phần hoặc toàn phần sợi nấm vật chủ bị phá vỡ (Dubey, 1995; Inbar and Ramirez, 1996; Doukaga et al., 1979)

Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của nấm Trichoderma viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea Ngày nay, người ta còn biết sử dụng nấm Trichoderma sp để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora, ) và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất (như Botrytis cinerea)

Theo Bliss (1951) và Ohr et al (1973) đã cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất, quần thể nấm Trichoderma sp trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide

Well et al (1962) lần đầu tiên công bố sử dụng một số lượng lớn nấm Trichoderma sp được nuôi trồng trên môi trường rắn mang ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng để kiểm soát nấm Sclerotium rolfsii trên cà chua Barkman and Kabano (1975) đã nuôi trồng T harzianum bằng phương pháp thương mại, các giá thể chứa nấm được rải xuống đất dọc theo các hàng đậu với lượng 112 – 140 kg/ha sau 70 - 100 ngày sau khi gieo đậu Với lượng 140 kg/ha, T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng năng suất lên trong khoảng 3 năm

Nấm Trichodema hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm R solani (Chet and Baker, 1980; 1981) và phân lập từ đất tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất (Lumsden, 1977) Nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt nấm R.solani nhưng trong môi trường T.harzianum diệt được nấm này (Nelson et al., 1983), đây là vai trò chính của Trichoderma sp trong việc phòng trừ sinh học

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

Ý niệm sử dụng nấm Trichoderma sp để phòng trừ nấm gây bệnh hại cây trồng có từ đầu thập kỉ 30 Người đầu tiên đề xuất sử dụng loài nấm đối kháng Trichoderma sp để phòng trừ nguồn bệnh hại cây trồng là Weidling Tác giả đã

đề nghị dùng nấm Trichoderma sp để trừ nấm hại Rhizoctonia sp gây bệnh thối

lở cổ rễ cây con mới mọc từ hạt Từ đó các nghiên cứu về loài nấm Trichoderma

sp nhằm sử dụng chúng để phòng trừ bệnh hại cây trồng đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới

Nấm Trichoderma sp thuộc bộ Hyphales, lớp nấm bất toàn (Fungi imperfecti) Có 3 chủng được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất đó là Trichoderma viride, T harzianum, T hamatum…trong đó loài T viride đặc biệt được chú ý nhất Nấm Trichoderma sp là một loài nấm sống hoại sinh trong đất

và trên các tàn dư thực vật Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với nấm gây bệnh cây chủ yếu là kí sinh dẫn đến tiêu diệt sợi nấm (Inbar, 1996; Dubey, 1995; Benhamou, 1996), hay tạo ra các chất kháng có hoạt tính sinh học cao ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cây (Seiketov, 1982; Chet, 1981; Watson, 1969; Cote, 1969;…) Bên cạnh đó nấm Trichoderma sp có tiết ra các loại men gây ra suy biến thành sợi nấm gây bệnh (Chet et al., 1986; Jones and Watson, 1969) Nấm Trichoderma sp còn biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú Nấm Trichoderma sp thường định cư trước so với nấm gây bệnh cây

Các nghiên cứu về nấm Trichoderma sp nhằm sử dụng chúng để phòng trừ bệnh hại cây trồng đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Cho đến nay, có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma sp

để trừ bệnh hại cây trồng như Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hungari, Ấn Độ, Thái Lan,…và đã cho biết hiệu lực phòng trừ của nấm Trichoderma sp đạt hiệu lực cao Weinding đã ghi nhận rằng để trừ nấm Rhizoctonia sp gây bệnh thối cây con mới mọc ở cam quýt chỉ cần bón nấm Trichoderma sp vào đất có thể bảo

vệ được các cây con mới mọc từ hạt bị bệnh

Trong phòng thí nghiệm, các loài nấm Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, Trichoderma pseudokonigii và Trichoderma reesei biểu hiện tính đối kháng cao đối với nấm R solani gây bệnh cho rất nhiều loại cây trồng ở nhiều nước trên thế giới, hiệu lực đối kháng đạt tới 71% Dung dịch chứa 50% dịch nuôi cấy nấm T viride Đã ức chế được 61,1% sự phát triển của khuẩn lạc R solani trên môi trường Agar (Dubey et al., 1995) Nấm T pseudokonigii có thể ức chế được cao hơn 60% sự phát triển của nấm bệnh đạo

ôn Pyricularia oryzae

Hiệu lực phòng trừ bệnh trong nhà lưới, nhà kính để trừ bệnh nấm cho cà

chua, dưa chuột, ớt, lạc… các tác giả cũng cho biết hiệu lực phòng trừ của nấm Trichoderma sp khá cao Nấm Trichoderma harzianum có hiệu lực cao trong hạn chế bệnh do nấm R.solani và nấm S.rolfsii trên cây Iris, sử dụng nấm này đã bảo vệ được 86,7% cây cà chua bị bệnh thối thân do nấm S rolfsii Ở Rumani dùng nấm T viride có hiệu lực cao so với công thức dùng thuốc Methyl tiophanate để trừ bệnh do nấm R.solani trên đậu đỗ trong nhà kính (Sesan et al., 1995)

Nấm T harzianum có hiệu lực cao trừ nấm Pythium sp và nấm R solani gây bệnh chết héo đậu đỗ và củ cải R.sativus ở Nam Mỹ (Chet et al., 1981) Ở Israel, người ta đã sử dụng nấm T harzianum để trừ bệnh héo cây Iris do nấm R.solani, hiệu lực trừ bệnh rất cao đạt 93,0% so với đối chứng (Chet et al., 1980)

Ở Thái Lan, nấm T harzianum là một tác nhân sinh học có triển vọng trong việc bảo vệ cây cà chua chống lại bệnh thối thân do nấm S rolfsii đạt 91,7% (Chamswarng, 1990; Deema et al., 1991) Cũng trên đồng ruộng, nấm T viride được ghi nhận có hiệu lực cao trừ bệnh Nigrospora oryzae trên ngô ở Rumani (Dumitras, 1983)

Tại Mỹ, nấm Trichoderma konigii có hiệu lực phòng trừ cao bệnh héo rũ lúa mì do nấm Gaeumannonyces graminis var tritici (Duffy et al., 1996) Tại Trung Quốc, theo Wang et al (1996), nấm T viride chủng T22 có tính đối kháng mạnh chống lại nấm F.oxysporum gây héo vàng cây cà chua

Đối với nấm Pythium debaryanum gây bệnh chết rạp cây con thì một số vi sinh vật như nấm T viride, Streptomyces grines, Bacillus subtilis đã có hiệu lực làm giảm tỷ lệ bệnh rõ rệt (Ychia et al., 1981) Trong quá trình sử dụng nấm đối kháng Trichoderma sp để phòng chống bệnh hại cây trồng, các nhà khoa học

đã phát hiện ra nấm đối kháng T harzianum có khả năng chung sống với thuốc hóa học để làm tăng hiệu lực phòng trừ của nấm đối kháng Ở Thái Lan, đã cho thấy phối hợp T harzianum (T20) và Mancozeb 1800mg/l để phòng chống nấm

S rolfsii trong nhà kính đạt hiệu lực 90% và trên đồng ruộng đạt hiệu lực 88,9% (Saksirirat et al., 1996), nếu chỉ sử dụng T20 trên đồng ruộng thì chỉ đạt hiệu lực 61%

Qua các nghiên cứu khoa học cho biết, nấm đối kháng Trichoderma sp không những là một tác nhân sinh học trong phòng trừ sinh học mà chúng còn có tác dụng kích thích cây trồng như tăng số cây mọc, chiều dài thân, diện tích là và

trọng lượng chất khô, khi bón vào đất đã được khử trùng dưới dạng huyền phù bào tử, dạng cám – than bùn, hoặc xử lý hạt Các tác giả cũng đã cho biết cơ chế của tác động này có thể là do nấm Trichoderma sp ức chế các nấm thứ yếu trong vùng rễ, sản sinh ra các hoocmon thực vật, các Vitamin hoặc biến đổi các chất thành dạng dễ tiêu cho cây trồng Kết quả nghiên cứu trên chứng tỏ có thể dùng Trichoderma sp làm phân vi sinh cho cây trồng

Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm T harzianum chủng T22 đến sinh trưởng phát triển của cây ngô cho thấy T harzianum có khả năng làm tăng

sự sinh trưởng và phát triển của cây (Samia et al., 2012) Một số chủng của Trichoderma sp có thể tương tác với bộ rễ của cây trồng làm tăng khả năng sinh trưởng của cây và chống được các yếu tố vô sinh gây ra (abiotic stress)(Hermosa

et al., 2012)

Những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài đồng ruộng, nhà lưới cho thấy hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp Là rất có triển vọng trong phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng Chính vì vậy mà phương pháp sản xuất và sử dụng chế phẩm Trichoderma sp là rất quan trọng

Các nước khác nhau sử dụng các nguồn nguyên liệu khác nhau để làm môi trường nhân nuôi nấm Trichoderma sp Ở Irael dùng cám lúa mì hoặc than bùn

Ở Pháp dùng hạt yến mạch và Agar Ở Mỹ dùng cám, than bùn hoặc cám và mạt cưa Ở Ấn Độ dùng các phế liệu trong chế biến nông sản (Vỏ quả cà phê….) Ở Đài Loan dùng vỏ trấu để làm môi trường nhân nuôi

Sau khi nhân sinh khối nấm thì việc sử dụng chế phẩm để phòng trừ bệnh hại một cách hợp lý cũng là vấn đề quan trọng Hiện nay có thể tiến hành phòng trừ chế phẩm Trichoderma sp theo các phương pháp như: Xử lý hạt giống, bón vào đất, phun lên cây hoặc nhúng vào dịch bào tử

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Ở Việt Nam, việc phòng trừ bệnh hại cây trồng chủ yếu bằng biện pháp hóa học Đây là một biện pháp gây ô nhiễm môi trường đất, nước…và chi phí cao Đối với một số bệnh gây hại vùng rễ có nguồn gốc trong đất như bệnh do nấm Rhizoctonia solani, nấm Sclerotium rolfsii, nấm Fusarium oxysforum, nấm Pythium debaryanum, gây ra thì hiệu lực phòng trừ bằng biện pháp hóa học ít hiệu quả, gây ô nhiễm môi trường.… Biện pháp sinh học như sử dụng các vi sinh vạt đối kháng đặc biệt là nấm Trichoderma spp ở nước ta cũng đã được nghiên cứu từ năm 1996 và đang được ứng dụng nhiều trong những năm gần đây

Hiện nay, việc nghiên cứu biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh hại cây trồng đã được thực hiện ở nhiều cơ sở và đạt được những thành tựu đáng kể Năm 1991-1992, Bộ môn bệnh cây - Viện bảo vệ thực vật đã công bố một số kết quả bước đầu về nấm đối kháng Trichoderma sp cho thấy hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp ức chế tốt đối với một số loài nấm như: nấm Fusarium sp., nấm R solani (Bệnh khô vằn lá, bệnh lở cổ rễ), nấm S rolfsii (héo vàng lạc, héo

rũ gốc trắng,…) (Trần Thị Thuần và cs., 1993) Năm 1997, Trần Thị Thuần đưa

ra cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma sp Đối với một số nấm gây hại cây trồng là nhờ cơ chế ký sinh, cơ chế kháng sinh và men, cơ chế cạnh tranh Trên môi trường nhân tạo nấm T harzianum có hiệu lực ức chế cao đối với một số nấm gây bệnh như: Hiệu lực ức chế đối với nấm Fusarium sp Là 76%, nấm R solani gây bệnh khô vằn lúa là 98%, nấm Aspergillus flavus là 79% Cùng năm

1996, theo tác giả Trần Thị Thuần, thí nghiệm chậu vại về hiệu lực đối kháng của nấm T harzianum với nấm S rolfsii gây bệnh héo vàng cây lạc cho hiệu lực phòng trừ đạt 97% Năm 1998, tác giả cũng đã đưa ra một số hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh hại cây trồng

Tại Trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam, nấm đối kháng T.viride đã được Bộ môn bệnh cây phân lập từ nguồn đất tại Việt Nam và bắt đầu nghiên cứu từ năm 1996, theo Lê Lương Tề và cộng

sự thì isolate T.v-96 của nấm T viride có hoạt tính đối kháng mạnh (ức chế và tiêt diệt) đối với một số nấm đất hại cây trồng như: nấm R solani, nấm S rolfsii, nấm F oxysporum, nấm P debaryanum gây bệnh lở cỗ rễ, chết cây, chết héo trên rất nhiều loại cây trồng (Họ cà, Họ đậu…) ở nước ta mà rất khó phòng trừ bằng biện pháp hóa học Tại Phòng nghiên cứu Bệnh cây - trường đại học Nông nghiệp I - Hà Nội, chế phẩm sinh học chế tạo từ các isolate vi sinh vật đối kháng như T.v-96 bước đầu đã được thử nghiệm trong điều kiện invitro, invivo, đã có hiệu lực phòng trừ các bệnh hại nói trên, giảm tỷ lệ cây bệnh chết héo do nấm Fusarium sp., Rhizoctonia sp

Để có một lượng sinh khối nấm đối kháng trong phòng chống bệnh hại cây trồng, năm 1999, Tác giả Trần Thị Thuần đã đưa ra một số phương pháp sản xuất

và sử dụng chế phẩm nấm Trichderma sp để phòng trừ bệnh hại cây trồng Các kết quả nghiên cứu nấm đối kháng ở nước ta tuy còn ít nhưng đây cũng là triển vọng mở ra trong tương lai cho nước ta về việc nghiên cứu và sử dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng

Kết quả khảo sát hiệu lực của nấm T viride với các isolate nấm S rolfsii trên môi trường nhân tạo cho thấy khi nấm T viride có mặt trước nấm gây bệnh thì nấm S rolfsii không phát triển được và bị tiêu diệt Hơn nữa, thí nghiệm trong điều kiện chậu vại cho kết quả nấm T viride có thể phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S rolfsii hại cây đậu tương lên tới 94,4% (Đỗ Tấn Dũng, 2006) Các nghiên cứu của Nguyễn Văn Viên và cs (2012) cũng cho kết quả tương tự

Trong một số năm trở lại đây, nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng để phòng trừ nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất được nghiên cứu nhiều Kết quả

được phân lập từ 8 mẫu đất tại Thừa Thiên Huế và Quảng Trị có khả năng ức chế hoàn toàn sự hình thành hạch của nấm S rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng (Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa, 2012)

Theo Phạm Văn Biên (2002) nấm đối kháng T harianum có khả năng ức chế tiêu diệt được nấm gây bệnh S rolfsii và một số nấm gây bệnh có nguồn gốc trong đất Ủ hạch nấm trong 4 tuần rồi rử lại bằng nước cất sẽ làm giảm đáng kể

tỷ lệ nảy mần của hạch nấm S Rolfsii

Dương Minh và cs (2005, 2006) đã thu thập và phân lập, tuyển chọn được một số chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm bệnh phytophthora palmivora gây chảy nhựa gốc, thân, cành, nhánh cây sầu riêng Theo Dương Minh và cs (2005) năm dòng nấm Trichoderma sp triển vọng được phân lập từ các vườn trồng quýt ở Vĩnh long, Cần Thơ và Đồng Tháp đều

có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây hại F.solani gây bệnh thối rễ trong điều kiện đất trồng có độ pH thấp ( 3,9 – 4,2) ở Đồng bằng song Cửu Long Kết quả nghiên cứu của Ngô Bích Hảo và cs (2006), khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm T.viride phòng trừ bệnh hẽo rũ gốc mốc trắng trên môi trường PGA và trong điều kiện chậu vại cũng cho thấy nấm đối kháng T viride có khả năng ức chế cao nấm gây bệnh S rolfrisii Kết quả được thể hiện rõ đường kính tản nấm T.viride sau 3 ngày nuôi cấy là 87,8 mm, lớn hơn gấp 1,7 lần so với đường kính tản nấm gây bệnh S rolfrisii, và sau 4 ngày nuôi cấy thì đường kính tản nấm T.viride (57,8mm) lớn hơn 2,6 lần đường kính tản nấm S rolfrisii, hiệu lức ức chế đạt 75,2%

Cũng theo Đỗ Tấn Dũng (2006), khi khảo sát hiệu lực của nấm T.viride đối với các isolate nấm S rolfrisii trên môi trường nhân tạo thì thấy rằng khi nấm

T.viride có mặt trước nấm gây bệnh thì nấm T.viride có khả năng chiếm chỗ, cạnh tranh, ức chế và tiêu diệt nấm S rolfrisii và trong điều kiện chậu vại nấm đối kháng T.viride có khả năng sử dụng để phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng hại cây trồng cạn mang lại hiệu quả cao, cây lạc (86,5%), cây đậu tương (94,4%) Nguyễn Văn Viên (2009) cho biết khi xử lý giống lạc bằng chế phẩm T.viride ở các liều lượng khác nhau (5gr,10gr,15gr,20gr) trước khi gieo ngoài đồng ruộng cho kết quả khi trộn 20gr T.viride/30ml nước/1kg hạt cho hiệu quả phòng trừ cao nhất(69,84% với nấm R.solani, đạt 62,17% với nấm S rolfrisii và đạt 60,01% với nấm A.niger)

Để đáp ứng nhu cầu cho việc phòng trừ nấm bệnh hại kết hợp với cung cấp một nguồn dinh dưỡng để cây trồng sinh trưởng phát triển thì việc nghiên cứu phối trộn chế phẩm nấm Trichoderma sp với một loại phân bón hữu cơ là rất quan trọng

Theo Nguyễn Văn Nam (2011) thì một số chủng nấm Trichoderma phân lập tại Tây Nguyên có khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh hại cây trồng như nấm F.oxysporum, R.solani và Phytophthora, phân giả lân, chất hữu cơ

và giúp cây sinh trưởng phát triển tốt

Hiện nay việc tạo chế phẩm có chứa nấm Trichoderma đã được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng Theo Nguyễn Thị Thuần và cs (1997) đã sử dụng các loại môi trường là bã mía, lõi ngô, thóc, cám gạo, bã bia, bã đậu phụ để nhân sinh khối nấm Trichoderma thì thấy trên tất cả các môi trường nấm đều sinh trưởng phát triển và hình thành bào tử Trên môi trường bằng bã đậu phụ thì nấm Trichoderma phát triển tốt nhất nhưng lại gặp nhiều khó khăn trong công tác bảo quản Đối với môi trường nhân nuôi là thóc thì nấm Trichoderma sinh trưởng phát triển tốt và hình thành nhiều bào tử Đây cũng là cơ chất rễ bảo quản sau khi nhân sinh khối

Theo Phạm Thị Thùy (2004), trên hai loại môi trường Trấu + Cám và Thóc cho kết quả nấm Trichoderma phát triển tốt và cho mật độ bào tử cao với môi

Hiện nay trên thị trường có một số chế phẩm sinh học Trichoderma thương mại đã được nông dân chấp nhận và sử dụng trong việc phòng trừ như TriB1 của Viện bảo vệ thực vật, TRICO – ĐHCT của trường Đại học Cần Thơ, Vi-ĐK của công ty Cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam (Vipesco)…

Công ty cổ phần phát triển phân bón nông nghiệp I đã nghiên cứu và sản xuất phân bón hữu cơ Lục thần nông từ nguồn nguyên liệu là chất thải của chăn nuôi lợn gà Phân lục thần nông dạng viên với các thành phần: Hàm lượng Nitơ

lượng dạng chelated: Kẽm (Zn), Magiê (Mg); Đồng (Cu), Mangan (Mn) Phân này đã được đánh giá có hiệu quả tốt đối với sinh trưởng và phát triển của cây trồng như lúa, ngô, rau

Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào phối trộn loại phân này với nấm Trichoderma sp., vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây, vừa lợi dụng nấm Trichoderma sp để hạn chế tác hại của một số bệnh do nấm R solani, S.rolfsii, F oxysporum có nguồn gốc trong đất gây hại một số cây trồng như lúa, ngô, cà chua, cải bắp

2.4 NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH CHẾT RẠP CÂY CON, LỞ

CỔ RỄ VÀ THỐI NHŨN CẢI BẮP DO NẤM Rhizoctonia solani GÂY RA Nấm Rhizotonia solani (R.solani) là tác nhân gây bệnh cho cây trồng nhất

là các loại rau màu Đây là loài nấm gây bệnh có nguồn gốc trong đất phổ biến ở hầu hết các vùng trồng trọt trên thế giới (Janice Y Uchida,2008) Với phạm vi

ký chủ rất rộng, trên 165 loại cây trồng gây ra các bệnh lở cổ rễ, thối thân Nấm

R solani thực sự là một loài dịch hại nguy hiểm gây ảnh hưởng lớn tới năng suất cây trồng

Nấm R solani đã được Decandolle mô tả đầu tiên vào năm 1815, khi đó nó

có tên là Rhizoctonia crocorum Tuy nhiên bệnh chỉ được biết đến vào năm 1858 khi Julius Kuhn nghiên cứu bệnh lở cổ rễ trên cây khoai tây Nấm R.solani là loài phổ biến và quan trọng nhất của Rhizoctonia (Ceresini, 1999)

Nấm R.solani có thể gây hại ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng phát triển nào của cây trồng Nó có thể xâm nhập vào hạt giống trước khi gieo trồng, cũng có thể gây hại ở giai đoạn cây con Nấm R solani có thể tồn tại trong đất, trong tàn

dư cây trồng và các ký chủ phụ kể cả cỏ dại Đặc biệt nấm R.solani có thể sống như một loài nấm hoại sinh nếu đất chứa đầy đủ các chất hữu cơ (Paulo Ceresini, 1999) Khi gặp môi trường và điều kiện thuận lợi chúng sẽ xâm nhập và gây hại cho cây trồng Nấm R.solani lan truyền qua đất, nước, các dụng cụ canh tác, các

bộ phận của cây Bệnh do nấm R.solani gây hại nặng nghiêm trọng hơn ở những vùng đất ẩm ướt (Creek, 2012)

Theo kết quả nghiên cứu của Anderson (1982) cho biết về bệnh lở cổ rễ như sau: Bệnh chỉ phát hiện trên cây sau khi trồng ra ruộng Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất Khi mới xuất hiện nếu quan sát kỹ thấy những vết bệnh có màu khác với vỏ cây, phần vỏ này bị rộp lên, sau đó lan dần bao quanh toàn bộ phần cổ rễ hoạch gốc cây Dần dần phần vỏ này khô teo lại, khi gặp trời mưa hoạc độ ẩm cao sẽ bị thối nhũn, bong ra trơ lại phần lõn gỗ của caay

có màu thâm đen, cây sẽ héo dần và chết Khi bệnh nặng phần cuối của rễ đen và trông như một cái lưỡi mác

Theo Nguyễn Kim Vân (2006) mô tả bệnh thối cải bắp và bệnh do R.solani gây ra như sau:

Bệnh chết rạp cây con: Cây con có thể bị hại trước hoặc sau khi mọc khỏi mặt đất Trước khi nảy mầm cây bị hại đỉnh sinh trưởng Sau khi nảy mầm, nấm gây ra các vết bệnh màu nâu đạm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, phần thân non bị thắt lại, cây trở nên mềm và cây con bị đổ gục, chết

Triệu chứng bệnh lở cổ rễ: Bệnh chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ, phần gốc sát mặt đất, thối nhũn, bong ra, trơ lại lõi gỗ của cây có màu thâm đen, teo thắt lại, toàn bộ lá ở trên cây sẽ héo dần và chết Lúc mới bị nhiễm, lá trên cây còn giữ được màu xanh tươi trong vài ngày, sau đó toàn bộ cây sẽ bị héo rũ gục xuống, chết lụi từng đám rải rác trên ruộng hoặc từng vạt lớn Ở gốc cây triệu chứng có vết lõm màu nâu hoặc hơi nâu đỏ sát mặt đất, vết bệnh có thể lan rộng quanh gốc thân và lan xuống rễ, gốc thân bị lở loét Vào những ngày có nhiều sương mù hoặc lúc sáng sớm ta có thể thấy lớp tơ màu trắng bám nơi vết bệnh Vài ngày sau, trên thân cây và vùng đất xung quanh gốc bị bệnh xuất hiện đốm hạch màu vàng nâu bám xung quanh gốc

Nguyên nhân gây bệnh: Các bệnh trên do nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây

ra Hai giai đoạn chủ yếu nhất trong chu kỳ phát triển của nấm là sợi nấm và

loại bán hoại sinh, đa thực, có thể sống trong đất 2-3 năm

Để phòng trừ bệnh lở cổ rễ, chú ý kỹ khâu làm đất Cần xử lý đất trước khi gieo trồng khoảng 10 ngày Đất trồng cần lên luống cao, không sử dụng phân chuồng tươi chưa hoai mục Tốt nhất là nên ủ phân chuồng với chế phẩm Trichoderma cho hoai mục trước khi bón lót

benh-lo-co-re-o-cay-trong.html)

(http://www.hoinuoitrong.com/2016/07/benh-thoi-goc-re-cach-phong-tri-Nhiều nghiên cứu về hiệu lực của các loại thuốc hoá học đối với nấm

R solani cũng đã được tiến hành Các thuốc trừ nấm được sử dụng hợp lý như: Methyl thiophanate, Chlorothalonil đều có hiệu quả trong phòng trừ bệnh nấm

R solani (Janice Y Uchida, 2008)

Tuy nhiên vấn đề đối với nền nông nghiệp hiện nay là an toàn với môi trường và con người thì việc sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ các bệnh có nguồn gốc trong đất bằng thuốc hóa học là không khoa học Vì vậy, con người đã chú trọng nhiều đến việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc sinh học để phòng trừ dịch hại cây trồng Các sản phẩm này có ưu điểm là an toàn với môi trường, vật nuôi và con người, không tạo ra tính kháng và các nòi, chủng mới đồng thời đảm bảo tính cân bằng trong hệ sinh thái trong đó các chế phẩm có chứ nấm đối kháng Trichoderma sp hiện đang được ứng dụng rộng rãi

Nhiều nghiên cứu được tiến hành ở các nước trên thế giới như Anh, Pháp,

Mỹ cũng đã sử dụng các loài sinh vật có ích đặc biệt là các vi sinh vật đối kháng trong đó có loài nấm Trichoderma sp được đánh giá rất cao

2.5 NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI HẠCH CẢI BẮP DO NẤM Sclerotinia sclerotiorum GÂY RA

Bệnh thối hạch cải bắp gây ra bởi nấm Sclerotinia sclerotiorum S.sclerotiorum) Đây là loài nấm phổ biến trên thế giới và gây hại trên nhiều loại cây trồng và rau quả khác nhau (Purdy, 1979)

Nấm S.sclerotiorum phá hại rất phổ biến trên 160 loài cây thuốc 32 họ khác nhau nhưng chủ yếu là cải bắp, cà rốt, đậu trắng, khoai lang Có phạm vi phân bố rộng, phổ biến nhất là các vùng ôn đới (Stephen A Ferreira and Rebecca A Boley, 1992)

Các triệu chứng trên cây con: Cây con bị bệnh gốc thân sát mặt đất bị thối nhũn làm cây chết đổ gục trên ruộng Trên cây lớn vết bệnh thường bắt đầu từ lá già sát mặt đất và gốc thân Vết bệnh lúc đầu có màu nâu vàng, nếu trời ẩm ướt vết bệnh thối nhũn nhưng không có mùi Nếu trời khô hanh vết bệnh có màu nâu nhạt và teo lại Cuống lá và phiến lá bệnh có màu trắng, ủng nước, thường lan từ rìa mép lá vào trong Bệnh lan rộng lên bắp là bắp thối dần từ ngoài vào trong, đần dần cây chết khô trên đồng ruộng Trên bề mặt bắp hình thành lớp nấm màu trắng xen lẫn nhiều hạch nấm màu nâu đen hình dạng không đều nhau Đến giai đoạn này cải bắp đổ gục, gãy thân và chết trên đồng ruộng (Marc et al.,2001)

Bệnh thối hạch cải bắp do nấm S sclerotiorum (Lib.) De Bary gây ra Nấm thuộc họ Sclerotiniceae, bộ Helotiales, lớp Nấm túi (Vũ Triệu Mân và cs., 2007) Đây là bệnh hại khá phổ biến và gây thiệt hại lớn đối với những vùng trồng cải bắp Bệnh phát sinh gây hại ở những vùng có ẩm độ cao và nhiệt độ thấp

Theo Phạm Thị Dung và cs (2003), bệnh thối hạch chỉ xuất hiện và gây hại

Nấm S sclerotiorum phát triển tốt trong điều kiện pH 4,5 – 5,5 (Phạm thị Dung

dùng vôi bột bón xử lý đất trước, sau khi trồng

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐÔI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm Trichoderma sp

- Bệnh lở cổ rễ cải bắp (Rhizoctoni solani)

- Bệnh thối hạch cải bắp (Sclerotinia sclerotiorum)

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu đất thu thập từ các vùng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc

- Mẫu nấm Trichoderma sp

- Nấm R solani, S sclerotiorum

- Phân bón hữu cơ, phân hữu cơ lục thần nông

- Giống cải bắp No.1827F1

- Biển thí nghiệm

3.1.3 Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

* Dụng cụ:

- Dụng cụ trong phòng thí nghiệm gồm: tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh,

tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa Petri, ống nghiệm, đĩa petri, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,…Máy nhân gene (PCR), máy

- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu,…

- Dụng cụ nhà lưới: Chậu trồng cây, bình phun nước,

* Hóa chất:

- Môi trường nuôi cấy: WA, PDA, PSA và OMA (gồm các vật liệu cần thiết như khoai tây, đường D-Glucose, agar, nước cất, saccarose, )

- Bột Talc dùng để phối trộn chế phẩm nấm Trichoderma

- Chuẩn pH môi trường nuôi cấy bằng HCl 1N và NaOH 1N

- Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR

DNA, đệm TE, đệm TAE chạy điện di,

3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

o Thu thập mẫu đất, phân lập và xác định loài nấm Trichoderma sp thu thập từ một số vùng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc

o Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và phẩn tử của các mẫu Trichoderma sp

o Tuyển chọn được loài nấm Trichoderma sp có khả năng ức chế nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ và S sclerotinia gây bệnh thối hạch cây cải bắp

o Nghiên cứu nhân sinh khối loài nấm Trichoderma spp có triển vọng để làm chế phẩm phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải ngoài đồng ruộng

o Thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây cải bắp trong điều kiện chậu vại

o Điều tra, đánh giá mức độ nhiễm bệnh bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai

o Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây cải bắp tại Lào Cai và

Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma sp kết hợp với phân bón hữu cơ, phân bón Lục thần nông

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất và phân lập nấm Trichoderma

Mẫu đất được thu thập tại các ruộng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam như Hà Nội, Hải Dương, Bắc Ninh, Cao Bằng và Hòa Bình Mẫu đất được thu thập ở độ sâu 5-20 cm

Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp hòa loãng đất trong nước cất

vô trùng theo tỷ lệ 100 gram đất:1000 ml nước cất vô trùng Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al (2017) Xác định nấm Trichoderma sp theo phương pháp của Flegel (1980)

3.4.2 Phương pháp điều tra mức độ bệnh (tỉ lệ bệnh) lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai

- Điều tra bệnh hại cây trồng theo QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT, do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số 71/2010/TT – BNNPTNT ngày

10 tháng 12 năm 2010

- Điều tra theo phương pháp 10 điểm chéo góc

- Mỗi điểm điều tra 5 cây

- Chỉ tiêu theo dõi:

Tổng số cây bị bệnh

+ Tỉ lệ bệnh (%) = - x 100

Tổng số cây điều tra

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.4.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh, que cấy

* Môi trường WA (Water agar):

- Điều chế:

Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ, cắt hạt lựu, cho vào nồi nước cất chứa 1000ml đun sôi Sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc, cho thêm nước cất cho đủ 1000ml Sau đó cho từ từ agar vào khuấy đều rồi cho đường Glucose vào khuấy đều cho tan Môi trường được cho vào bình tam giác rồi đậy kín bằng giấy bạc Đem hấp khử trùng ở

* Môi trường PSA (Potato saccarose agar) và môi trường OMA (Oat meal agar): được điều chế giống môi trường PDA

3.4.3.2 Phương pháp phân lập nấm Trichoderma từ mẫu đất và nuôi cấy thuần

Các mẫu đật thu thập được phơi khô, nghiền mịn, sau đó pha loãng theo tỷ

lệ 100 gram đất:1000 ml nước cất vô trùng Dung dịch pha loãng được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al (2017) Xác định nấm Trichoderma sp theo phương pháp của Flegel (1980)

Sử dụng kỹ thuật cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh với sự hỗ trợ của kính hiển vi quang học (Bộ môn bệnh cây) và phương pháp cấy ria (vi khuẩn) để thu được nguồn nấm Tricoderma sp thuần sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Nguồn nấm thuần sau khi phân lập được giữ theo 2 phương pháp i) trong glycerol 50% và ii) cấy trên môi trường WA và cho bào tử dính vào giấy thấm vô

3.4.3.3 Xác định tên loài nấm Trichoderma spp bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự vùng rDNA-ITS

* Phương pháp xác định tên loài nấm Trichoderma spp

Hiện nay, vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA được sử dụng phổ biến nhất để nghiên cứu đa dạng và xác định nhiều loài nấm Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã Một đơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS4 (ở đầu 5’) và ITS5 (ở đầu 3’) Các vùng ITS,

do có tốc độ đột biến nhìn chung tương ứng với tốc độ biệt hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới mức loài như đã được chứng minh đối với nấm Phytophthora (Duncan and Cooke, 2002)

- PCR và giải trình tự

+ Chuẩn bị khuôn DNA:

DNA của nấm Trichoderma được chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường trong 7 ngày theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) DNA được hòa trong 50 uL đệm TE và bảo

 Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB:

+ Cạo sợi nấm cho vào tube 1.5ml, cho 200µl CTAB vào rồi nghiền nhuyễn, cho thêm 500µl CTAB

+ Hút 400µl dịch trên tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương

+ Lấy ra ly tâm 15 phút, bỏ dịch thu cặn

+ Để khô trong không khí hoặc tủ cấy trong 30 phút

+ Phản ứng PCR:

Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq

phút) x 1 chu kỳ, dừng phản ứng ở nhiệt độ phòng

+ Tinh sạch sản phẩm PCR:

Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết thương mại DNA Gel Extraction Kit (NORGER) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose

 Các bước trong tinh sạch DNA từ agarose gel:

- Thêm 3 lần thể tích Binding Buffer G vào 1 thể tích gel (300 µl Binding Buffer G vào ống 1.5ml chưa 100mg gel)

thời gian ủ, thỉnh thoảng đảo đều để gel được tan hoàn toàn

- Chuyển 750 µl dung dịch trên vào cột tinh sạch DNA và lý tâm ở 8000 rpm trong thời gian 1 phút, chuyển phần cồn lại của dung dịch và lý tâm tương tự

- Thêm 500 µl dung dịch Wash Solution A, ly tâm ở 14000 rpm trong thời gian 1 phút Đổ phần dung dịch sau ly tâm và spin nhẹ

- Thêm 30-50 µl của Elution buffer B để thu lấy DNA

+ Giải trình tự gene:

Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR (ITS4 và ITS5) và kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR (gửi thực hiện phản ứng giải trình tự tại hãng Macrogen) Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)

- Sử dụng ống eppendof, cho 5 µl DNA và 5 µl mồi ITS4 hoặc ITS 5 (5pmol/ µl) Gửi ống phản ứng twosi hãng Macrogen để thực hiện phản ứng giải trình tự gene

- Phân tích trình tự và xác định tên loài

Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Từ đó, sẽ xác định được các mẫu Trichoderma spp thu được giống với loài Trichoderma spp nào trên ngân hàng gene

- Phân tích phả hệ

Dựa trên các trình tự thu được và một số trình tự đồng nhất trên Genbank để phân tích phả hệ sử dụng phàn mềm MEGA7

3.4.3.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma

Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và giữ ở nhiệt độ

25oC-30oC để quan sát các đặc điểm như sự phát triển của nấm (đo đường kính tản nấm), màu sắc tản nấm, hình thái của bào tử, mật độ bào tử…sau các ngày nuôi cấy

3.4.3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm

* Nghiên cứu ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của nấm:

- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng

Petri)

- Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy

* Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến sự phát triển của nấm:

- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng PH: 4, 5, 6, 7, 8 Mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần (3 đĩa Petri)

- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy 3.4.3.6 Đánh giá và tuyển chọn loài Trichoderma spp có tiềm năng phòng chống nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ cây và S sclerotinia gây bệnh thối hạch bắp cải

* Phương pháp đánh giá và tuyển chọn loài Trichoderma sp

Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp được đánh giá bằng thử nghiệm hiệu lức ức chế đối với nấm gây bệnh hại cây trồng có nguồn gốc trong đất như nấm Rhizoctonia solani (gây bệnh lở cổ rễ), nấm Sclerotium sclerotinia (gây bệnh thối hạch) trong điều kiện in vitro Nấm gây bệnh và nấm đối kháng được cấy đối xứng nhau trên cùng đĩa môi trường PDA và cách nhau khoảng 2

cm theo 1) đốichứng: cấy nấm đối kháng và nấm gây bệnh riêng rẽ, 2) cấy nấm đối kháng trước nấm gây bệnh 24 giờ, 3) cấy nấm đối kháng sau nấm gây bệnh

24 giờ và 4) cấy đồng thời nấm đối kháng và nấm gây bệnh

Nấm đối kháng

Trichoderma spp

Nấm bệnh Sclerotium rolfsii Rhizoctoni solani