Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại hải phòng

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Trần Thị Tâm Tên Luận văn: Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 60 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp V

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Trần Thị Tâm

Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy, cô giáo bộ môn Bệnh cây – Khoa Nông Học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Kiểm dịch thực vật Vùng 1 – Hải Phòng, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và đóng góp cho em những ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích

lệ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Trần Thị Tâm

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tầm quan trọng của một số cây họ đậu 3

2.2 Đặc điểm chung chi Begomovirus 5

2.2.1 Đặc điểm hình thái 5

2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus 5

2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A 6

2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B 7

2.2.5 Phân loại các Begomovirus 8

2.2.6 Triệu chứng bệnh do Begomovirus 8

2.2.7 Phạm vi ký chủ 8

2.2.8 Lan truyền 8

2.3 Một số virus quan trọng trên cây họ đậu 9

2.3.1 Bean common mosaic virus (BCMV) 9

2.3.2 Soybean mosaic virus (SMV) 13

2.3.3 Kudzu mosaic virus (KuMV) 16

2.3.4 French bean seavere leaf curl virus (FbSLCV) 17

Phần 3 Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 18

3.1.3 Thời gian nghiên cứu: 2016-2017 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 18

3.3 Vật liệu nghiên cứu 18

3.3.1 Mẫu bệnh cây, cây thí nghiệm 18

3.3.2 Các dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV và FbSLCV 18

3.3.3 Dụng cụ nghiên cứu 19

3.3.4 Hoá chất 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 19

3.4.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng 19

3.4.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh 20

3.4.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp 20

3.4.4 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR và RT-PCR 21

3.4.5 Kỹ thuật Agroinoculation 24

3.5 Phương pháp tính và xử lý số liệu 25

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 26

4.1 Điều tra bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng năm 2016-2017 26

4.1.1 Tình hình sản xuất đậu đỗ tại Hải Phòng 26

4.1.2 Điều tra bệnh virus trên đậu cove tại Hải Phòng năm 2016-2017 26

4.1.3 Điều tra bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng năm 2016-2017 29

4.1.4 Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2016-2017 30

4.1.5 Điều tra bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng năm 2016-2017 30

4.1.6 Điều tra bệnh virus trên đậu đũa tại Hải Phòng năm 2016-2017 32

4.2 Phát hiện virus bằng Elisa trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 32

4.2.1 Phát hiện Potyvirus bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 33

4.2.2 Phát hiện Bean common mosaic virus (BCMV) bằng ELISA trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 35

4.2.3 Phát hiện Bean yellow mosaic virus (BYMV) bằng ELISA trên các mẫu

đậu đỗ 37

4.2.4 Phát hiện Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) bằng ELISA 39

4.2.5 Phát hiện Soybean mosaic virus (SMV) bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 41

4.2.6 Phát hiện Cucumber mosaic virus (CMV) bằng ELISA trên các mẫu đậu đỗ 43

4.2.7 Phát hiện Bean leaf roll virus (BLRV) bằng ELISA trên mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 45

4.3 Đánh giá tính gây bệnh của KuMV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm bằng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV (kỹ thuật Agroinoculation) 47

4.3.1 Phục hồi các dòng vi khuẩn Agrobaterium tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV 47

4.3.2 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV bằng phương pháp châm hạt ủ qua đêm 48

4.4 Đánh giá tính gây bệnh của FbSLCV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật lây nhiễm bằng vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của FbSLCV (kỹ thuật Agroinoculation) 50

4.5 Phát hiện virus trên các mẫu đậu đỗ 51

4.5.1 Phát hiện Potyvirus bằng RT-PCR trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 51

4.5.2 Phát hiện legumovirus bằng PCR trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 52

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 57

Tài liệu tham khảo 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ATP Adenosine triphosphate

Bb Base pair

CP Coat protein

CTAB Cetryl Ammonium Bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

IgG Immunoglobulin gamma

Kb Kilo base

LB Luria and Bertani

NPP Nitrophenyl phosphate

ORF Open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction

PTA-ELISA Plate trapped antigen - ELISA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ) 20

Bảng 3.2 Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 4.1 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 28

Bảng 4.2 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu xanh tại Hải Phòng 2016-2017 29

Bảng 4.3 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng năm 2016 30

Bảng 4.4 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng 2017 31

Bảng 4.5 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên đậu đũa tại Hải Phòng 2016-2017 32

Bảng 4.6 Kết quả ELISA phát hiện Potyvirus trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 34

Bảng 4.7 Kết quả ELISA phát hiện virus BCMV trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 36

Bảng 4.8 Kết quả 38

Bảng 4.9 Kết quả 40

Bảng 4.10 Kết quả 41

Bảng 4.11 Kết quả 43

Bảng 4.12 Kết quả 45

Bảng 4.13 Kiểm tra PCR đối với 2 nguồn vi khuẩn A tumefaciens mang cấu 47

Bảng 4.14 Kết quả lây nhiễm agroinoculation của KuMV trên đậu tương DT26 49

Bảng 4.15 Kết quả lây nhiễm agroinoculation của KuMV trên một số cây họ đậu 50

Bảng 4.16 Kết quả lây nhiễm agroinoculation của FbSLCV trên một số cây họ đậu 51

Bảng 4.17 Kết quả RT-PCR phát hiện Potyvirus trên một số mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 52

Bảng 4.18 PCR phát hiện các legumovirus trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng năm 2017 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái của Begomovirus 5

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của Begomovirus 6

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus 7

Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus 7

Hình 2.1 Triệu chứng BCMV hại trên lá cây đậu đỗ (CABI, 2017a) 11

Hình 2.2 Triệu chứng do SMV trên đậu tương (CABI, 2017b): (A) triệu trứng trên lá, (B) triệu chứng trên hạt 15

Hình 2.3 Triệu chứng KuMV trên đậu tương 17

Hình 4.1 Triệu chứng khảm nhăn trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 27

Hình 4.2 Triệu chứng khảm vàng trên đậu cove tại Hải Phòng 2016-2017 27

Hình 4.3 Triệu chứng bệnh virus trên đậu cove 2016-2017: (A) triệu chứng xoăn- biến dạng lá, (B) biểu hiện triệu chứng xoăn- biến dạng lá dữ dội hơn 28

Hình 4.4 Triệu chứng bệnh virus trên đậu xanh tại Hải phòng 2016-2017: khảm nhăn (A), khảm vàng (B) 29

Hình 4.5 Triệu chứng bệnh virus trên đậu đen tại Hải Phòng: Khảm xanh (A), biến vàng (B) 30

Hình 4.6 Triệu chứng bệnh virus trên đậu tương tại Hải Phòng 2016-2017: (A) nhăn-biến dạng lá; (B) khảm; (C) khảm- phồng 31

Hình 4.7 Triệu chứng trên đậu đũa thu tại Hải Phòng 2016-2017: (A) khảm, (B) khảm- nhăn 32

Hình 4.8 Phát hiện virus bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu đậu đỗ thu thập tại Hải Phòng 2016-2017 33

Hình 4.9 Lây nhiễm nhân tạo agroinoculation KuMV bằng cách châm hạt ủ 48

Hình 4.10 Triệu chứng sau 3 tuần lây nhiễm KuMV trên đậu tương DT26 (A): sau 3 tuần lây; (B): cây đối chứng 49

Hình 4.12 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện legumovirus trên các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi chung Leg-CP-F/R 55

Hình 4.13 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện KuMV trên các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi đặc hiệu KuMV (KuA-F1/R1) 55

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Trần Thị Tâm

Tên Luận văn: Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng

Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 60 62 01 12

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Xác định được thành phần loài virus hại trên cây đậu đỗ tại Hải Phòng

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại cây họ đậu được thu thập tại các vùng trồng đậu đỗ tại Hải Phòng, sau đó được làm khô bằng hạt silicagel Các mẫu được kiểm tra ELISA phát hiện virus bằng các kit ELISA do Viện DSMZ của Đức cung cấp Các mẫu có triệu chứng đặc trưng được kiểm tra PCR và RT-PCR Sử dụng cặp mồi chung CI-F/R phát hiện potyvirus và cặp mồi chung LegA-cpF1/R1 phát hiện legumovirus Sử dụng cặp mồi đặc hiệu MY-A-F1/R1 và KuA-F1/R1 để phát hiện đặc hiệu MYMV và KuMV Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) nhằm đánh giá tính gây bệnh của KuMV và FbSLCV trên một số cây họ đậu

Kết quả chính và kết luận

Điều tra, thu thập các mẫu bệnh virus trên 5 loại cây họ đậu khác nhau (đậu xanh, đậu tương, đậu cove, đậu đũa và đậu đen) với các loại hình triệu chứng Trong đó, triệu chứng điển hình nhất là khảm lá Tỉ lệ bệnh tương đối thấp, cao nhất tại huyện An Dương, dao động chỉ từ 0,7%-7,5%

Kiểm tra ELISA trên 40 mẫu đậu đỗ thu tại Hải Phòng, phát hiện 8 mẫu nhiễm BCMV, 8 mẫu nhiễm BYMV, 11 mẫu nhiễm CMV và 5 mẫu BLRV

Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo KuMV bằng agroinoculation trên giống đậu tương DT26 ;đậu cove TLP68, PN03; đậu đũa VA009 và đậu xanh DX208 Kết quả tỉ lệ nhiễm KuMV chỉ trên đậu tương với tỉ lệ rât thấp 1/40 (2,5%)

Kiểm tra PCR phát hiện legumovirus bằng cặp mồi chung LegA-CpF1/R1 phát hiện 8/13 mẫu dương tính với legumovirus trên các mẫu đậu tương, đậu cove, đậu đũa, đậu đen Đây là lần đầu tiên chúng tôi phát hiện legumovirus trên đậu cove, đậu đen và đậu đũa Không phát hiện thấy MYMV; chỉ phát hiện thấy KuMV trên đậu tương

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Tran Thi Tam

Thesis title: Identify virus-infected diseases on legumes in Haiphong

Major: Plant Protection Code: 60 62 01 12

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Identification of components viruses on legumes in Haiphong Materials and Methods

The viral symptomatic samples were collected on the legume fields in Haiphong, then were dried by silicagel The samples were tested for the presence of viruses by ELISA using kits provided by the DSMZ Institute (Germany) PCR and RT-PCR tests to detect potyviruses, legumoviruse, MYMV and KuMV were carried out using uivarsal and specific primers An agroninoculation method using Agrobacterium tumerfaciens cells harboring infectious structures of KuMV and FbSLCV were used to investigate the pathogenicity of these two geminivirses on some legumes

Main findings and conclusions:

Investigated and collected virus-infected samples on 5 different legumes (mungbean, soybean, common bean, cowpea and black bean) with different types of symptoms The most typical symptom was leaf mosaic The disease incidences were low, ranging from 0.7% -7.5%

ELISA tests on 40 symptomatic legume samples showed 8 samples positive to BCMV, 8 samples positive to BYMV infection, 11 samples positive to CMV infection and 5 samples positive to BLRV However the OD values of most samples were very low compared with threshold of corresponding viruses

Inoculation of KuMV by agroinoculation on soybean DT26, common bean TLP68, PN03, cowpea VA009 and mungbean DX208 showed this virus infected only soybean DT26 with very low inoculation efficacy (the disease incidence of inoculated plants was as low as 2.5%)

PCR and RT-PCR tests of 13 symptomatic samles identified none of them were positive to potyvirus and MYMV, 8 samples were positive to legumovirus and 3 of them, all soybean, were positive to KuMV The important finding was the detection for the first time in Vietnam of the presence of legumovirus/es on black bean, yard long bean and cove bean

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây họ đậu (Fabaceae) là loài cây mang lại giá trị dinh dưỡng vô cùng phong phú, đứng hàng đầu cả về hàm lượng và chất lượng protein- thành phần dinh dưỡng ước tính chiếm tới 80% trong bữa ăn hàng ngày của người dân Châu Á có nguồn cung cấp từ thực vật Bên cạnh đó với một khả năng đặc biệt, là cố định nitơ trong không khí thông qua việc cộng sinh với vi khuẩn nốt

rễ - một loại vi khuẩn sống trong đất Đặc điểm này mang lại lợi ích lớn trong lĩnh vực nông nghiệp và môi trường Cây họ đậu không đòi hỏi các loại phân bón chứa nitơ, vì thế đã giúp làm giảm chi phí và ô nhiễm môi trường

Tuy nhiên, các loại cây họ đậu thường chịu ảnh hưởng lớn bởi sâu hại, bệnh hại, trong đó có các bệnh về virus Ít nhất 150 virus đã được công bố nhiễm

tự nhiên trên cây trồng họ đậu khắp thế giới, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Edwardson and Christie, 1991; ICTV, 2012, Hema et al., 2014)

Năm 2010, ở Việt Nam có 52 virus gây hại thuộc 2 chi chủ yếu là Begomovirus, một số Potyvirus (Hà Viết Cường, 2011) Trong đó gần đây nhất có 2 virus mới được xác định trên cây họ đậu bao gồm 1 Begomovirus là Kudzu mosaic virus (KuMV) gây bệnh khảm lá đậu tương ở Miền Bắc (Hà Viết Cường, 2010) Một virus thứ 2 là French bean severe leaf curl virus (FbSLCV) được phát hiện đầu tiên năm 2012 tại Ấn Độ, gây bệnh cuốn lá dữ dội trên cây đậu cove, và vẫn chưa công bố trên thế giới Năm 2013, virus này

đã được xếp vào một chi mới của họ Geminiviridae là chi Capulavirus

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và khó kiểm soát bằng hóa chất Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi quan sát được triệu chứng một cách rõ ràng thì bệnh đã phát triển mạnh Việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng giúp cho sự thành công của biện pháp phòng trừ Hơn nữa cả KuMV và FbSLCV đều là những virus mới nên đặc tính gây bệnh vẫn đang cần được tiếp tục nghiên cứu

Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định bệnh virus hại đậu đỗ tại Hải Phòng”

- Phát hiện virus bằng ELISA;

- Lây nhiễm nhân tạo đánh giá tính gây bệnh của KuMV và FbSLCV trên các cây đậu đỗ;

- Phát hiện virus bằng PCR và RT-PCR

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TẦM QUAN TRỌNG CỦA MỘT SỐ CÂY HỌ ĐẬU

Nhóm cây đậu đỗ được khai thác để đáp ứng nhu cầu sử dụng dầu thực vật, protein cho người và nguyên liệu thức ăn gia súc đặc biệt là ở các nước phát triển trên thế giới Đây cũng là loại cây trồng có tác dụng tốt trong việc luân xen canh và cải tạo đất

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill là một trong những cây trồng quan trọng và phổ biến nhất để cung cấp và dầu thực vật trên thế giới Cây đậu tương ó nguồn gốc ở Đông Nam hâu Á Hiện nay đậu tương có diện tích, năng suất và sản lượng lớn nhất trong tất cả các cây đậu đỗ (Duke, 2012) Đây là cây trồng có giá trị dưỡng cao được các nhà khoa học xếp vào một trong những “thực phẩm chức năng và đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protêin Lượng dầu của cây đậu tương đứng ở vị trí thứ nhất trong tổng số dầu thực vật được tiêu thụ

ở thế giới Diện tích đậu tương tập trung chủ yếu ở Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Argentina và Ấn Độ, trong đó riêng nước Mỹ thường chiếm 1/3 diện tích đậu tương của toàn cầu (31 triệu ha hằng năm) Xu thế diện tích trồng đậu tương trên thế giới thường gia tăng do nhu cầu sử dụng chính sách quản lý và thương mại của các quốc gia, đặc biệt trong hoàn cảnh ngày càng có nhiều quốc gia sử dụng các giống biến đổi gen (GMO) (Masuda and Goldsmith, 2009)

Đậu xanh (Vigna radiata (L) Wilezek) trên thế giới được phân bố ở vùng Nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu tập trung ở châu Á trong đó Bangladesh, Ấn

Độ, Pakistan, Philippine, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan được coi

là các nước sản xuất chủ yếu Trong những năm trước đây, tại Thái Lan và Philippine đậu xanh là cây đậu đỗ quan trọng hàng đầu (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998) Trên thị trường, cây đậu xanh được sản xuất để khai thác protein, dạng bột trong nguyên liệu thực phẩm, nước giải khát và làm giá sống cung cấp vitamin cho con người Bột cũng như protein của đậu xanh là dạng rất

dễ tiêu, có thể phối trộn với nhiều dạng nguyên liệu khác để tạo sản phẩm do đó

có nhu cầu tiêu thụ rất lớn trên thị trường, chủ yếu là các nước châu Á Trung bình trong 100g bột đậu xanh cho ta 24,2g protein; 1,3g dầu; 3,5g khoáng; 59,9g hyđratcacbon; 75mg Ca; 405mg P; 8,5mg Fe; 49,0mg Caroten; 0,72 mg B1;

0,25mg B2 và 348 Kcalo Với những giá trị về dinh dư ng như trên, từ lâu đậu xanh đã được coi là cây thực phẩm, sử dụng rộng rãi và chế biến thành nhiều sản phẩm rất phong phú phục vụ cho cuộc sống con người Tại Việt Nam, hàng năm phải nhập nguồn nguyên liệu để chế biến dầu thực vật và thức ăn gia súc với tổng giá trị lên đến 3,7 tỷ USD, trong đó riêng khô dầu đậu tương đã có 2,7 triệu tấn (tương đương 5,4 triệu tấn hạt, cao gấp 15 lần so với sản lượng sản xuất được tại Việt Nam) chủ yếu từ Mỹ và Argentina, trong khi 60% diện tích của cây trồng này trên thế giới đang sử dụng giống GMO (Bùi Chí Bửu, 2012) Hiện nay, chính phủ đang có nhưng ưu tiên để nghiên cứu phát triển cây trồng này thông qua Quyết định 899/QĐ-TTg ngày 10/6/2013 phê duyệt đề án tái cơ cấu ngành nông nghiệp theo hướng nâng cao giá trị gia tăng và phát triển bền vững Cùng với chính sách chuyển dịch cơ cấu cây trồng ở một số địa phương, cây đậu xanh đang được sự quan tâm của nhiều công ty phân phối và được trồng rất phổ biến khắp

cả nước (Phan Xuân Thiệu và cs., 2006)

Đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gốc từ miền Nam Mexico, Trung Mỹ Ngày nay, đậu côve vàng được trồng phổ biến ở nhiều vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Sản lượng đậu côve vàng của thế giới (1979) ước tính khoảng 8.3 triệu tấn và Brazil là nước sản xuất nhiều đậu cove nhất thế giới với sản lượng đậu giai đoạn 1973- 1975 là 2,3 triệu tấn (Lewis, 2005)

Cây đậu đũa (Vigna sesquipedalis Wight) có nguồn gốc từ Đài Loan hay miền Nam Trung Quốc hay từ Bangladesh Đậu đũa là một trong 10 loại rau quan trọng ở vùng Đông Nam Á, hiện nay được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới như một vụ rau nhỏ, sản lượng đậu đũa ở Đông Nam Á thường cao hơn ở Châu Phi (Lewis, 2005)

Cây đậu đen (Vigna cylindrica Skeels), thuộc họ cánh bướm Fabaceae (Papilionaceae).Tên khoa học của đậu đen hiện nay chưa được xác định chính xác, nó còn có tên gọi là Vigna catiang Endl.var Hiện nay cây đậu đen cũng được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và kể cả Hoa Kỳ (ở Hoa kỳ cây đậu đen được trồng làm nguồn thức ăn gia súc) ( Lewis, 2005) Hạt đậu đen có giá trị dinh dưỡng cao Ngoài việc dùng làm thực phẩm, đậu đen còn được dùng để bào chế thuốc và làm thuốc, ngâm tẩm các vị thuốc để giảm bớt độc tính của thuốc như Ban miêu, Bã đậu… giảm vị chát của Hà thủ ô

2.2 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CHI BEGOMOVIRUS

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo

ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini) Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer) Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni et al., 2003; Zhang et al., 2001)

Hình 2.1 Hình thái của Begomovirus

Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov

2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus

Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước khoảng 2.6- 2.8 kb Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Hà Viết Cường, 2011)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của Begomovirus

Nguồn: http://education.expasy.org/images/Begomovirus_genome.jpg

2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A

Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus)

có hai gen AV1 và AV2 Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào Gen AV2 mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống

và tích lũy DNA của virus Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4 Trong đó, gen AC1 mã hóa protein tái sinh (Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào Gen AC2 (TrAP- Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây Gen AC3 mã hóa protein tăng cường tái sinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với protein

ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào

ký chủ (Hà Viết Cường, 2011)

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus

2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B

DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược kim đồng hồ chứa gen BC1

BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm soát bởi CP

BC1 là một protein vận chuyển : (MP-Movement protein) có chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ

Hình 2.4 Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus

Nguồn: Hà Viết Cường (2011)

2.2.5 Phân loại các Begomovirus

Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam et al., 1999; Rybicky et al., 1994)

Các Begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen Tất cả các Begomovirus ở cụm Tân thế giới đều

có bộ gen kép, trong khi đó các Begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đó tất cả các Begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005)

Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ

có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới

2.2.6 Triệu chứng bệnh do Begomovirus

Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên

ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh Ở các cây, tế bào già cỗi, quá trình này sẽ chậm lại hay hầu như ngừng hẳn Vì vậy điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh

do các Begomovirus Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2 - 4 tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996)

2.2.7 Phạm vi ký chủ

Begomovirus có phạm vi ký chủ khá phong phú gồm các loại cây trồng và

cỏ dại Riêng đối với một số virus hại cây họ đậu như BYMV, BGYMV, BcaMV, SbCLV chủ yếu tìm thấy trên đậu, tuy nhiên SiMoV tìm thấy đầu tiên trên cây Sida rhombifolia và Leonurus sibiricus, sau đó 3 năm virus này được tìm thấy trên đậu tương tại Brazil (Mello et al., 2002)

2.2.8 Lan truyền

Tất cả các Begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant) Bọ phấn là loài đa thực với phổ ký chủ khoảng 500 loài thực vật, là vector của nhiều loại virus thuộc

họ Geminivirus, Closterovirus, Nepovirus và Carlavirus (Brunt et al., 1996)

Bọ phấn chích nạp Begomovirus trên cây bệnh trong khoảng 15-30 phút, chích truyền trên cây khoẻ cần thời gian ít nhất là 15 phút và có thời gian tiềm tàng là 8-24 giờ

2.3 MỘT SỐ VIRUS QUAN TRỌNG TRÊN CÂY HỌ ĐẬU

2.3.1 Bean common mosaic virus (BCMV)

2.3.1.1 Phân bố

Bệnh được phát hiện, quan sát và mô tả lần đầu tiên ở Mỹ từ năm 1917 (Brunt et al., 1996) Ngày nay BCMV có thể được tìm thấy trên khắp thế giới, bất cứ nơi nào đậu được trồng, bao gồm nhiều khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới (CABI, 2017a)

2.3.1.2 Phân loại

BCMV có bộ gen ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, chi Potyvirus, loài Bean commom mosaic virus Virus còn có một số tên khác như Bean common mosaic potyvirus, Bean mosaic virus, Bean virus 1, Bean western mosaic virus, Phaseolus virus 1, Mungbean mosaic virus, Common bean mosaic virus (Morales and Bos, 1988) Tên thường được dùng phổ biến là Bean commom mosaic virus, viết tắt BCMV

Theo kết quả nghiên cứu của Berger et al (1997), khi phân tích trình tự đầu 3’ không mã hoá và gen CP của 13 chủng của BCMV và 1 chủng của Bean common necrosis mosaic virus (BCNMV) để phân tích phả hệ gen đã cho thấy rằng BCNMV là một chủng khác biệt của BCMV Các virus hại đậu đỗ được sắp xếp vào nhóm BCMV, BCNMV và các nhóm phụ khác

Sự khác biệt trong các triệu chứng của cây kí chủ, huyết thanh học, tế bào học, chiều dài hạt virus và trọng lượng phân tử của protein vỏ (CP) giữa các chủng hoại tử và không hoại tử của Bean commom mosaic virus (BCMV) và sự khác biệt trong các chuỗi đầu N của protein CP của các chủng gây triệu chứng hoại tử (NL8) và không hoại tử (NL4) của BCMV kết luận rằng BCMV nên phân loại lại thành hai potyviruses riêng biệt Các chủng hoại tử được phân loại như chủng Bean necrosis mosaic virus (BNMV) và chủng không hoại tử vẫn được phân loại như BCMV (Vetten et al., 1992)

Công bố kết quả nghiên cứu dựa vào phân tích peptide bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatographic) và trình tự gen

của 22 chủng BCMV, chủng Blackeye cowpea mosaic virus (BlCMV) và chủng Peanut stripe virus (PStV) cho thấy có hai Potyvirus rõ ràng với chủng chết hoại

tử NL3, NL5, NL8 và TN-1, có 90% mức độ tương đồng được xếp trong một nhóm A, các chủng BCMV với mức độ tương đồng từ 60% đến 80% được xếp vào nhóm B, các chủng không chết hoại NL4 và NL6, có chỉ 35% đến 40% tính tương đồng với dòng chết hoại (Larsen et al., 2005; Vetten et al., 1992)

Dựa trên các nghiên cứu này, Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (ICTV) đã chấp nhận để xuất của Mink và cs (1994) rằng các isolate của serotype A là thành viên của loài Bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) và các isolate của serotype B là thành viên của của loài BCMV Một phân tích dựa trên vùng 3’ không mã hóa (3’UTR) và vùng mã hóa gen vỏ protein (CP) của các isolate đại diện cho tất cả các loài/chủng Potyvirus nhiễm trên cây họ đậu cũng xác nhận kết luận phân loại của ICTV (Berger et al., 1997)

Các nghiên cứu phả hệ học (phylogenetic) của Berger et al (1997) cũng cho thấy BCMV và nhiều Potyvirus nhiễm trên cây đậu đỗ như SMV, Bean yellow mosaic virus (BYMV) và Cowpea aphid borne mosaic virus (CABMV), cũng như nhiều Potyvirus không nhiễm trên đậu đỗ như Dasheen mosaic virus (DsMV), Passion fruit woodiness virus (PWV), South African passiflora virus (SAPV), Watermelon mosaic virus II (WMVII) và Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) phân cụm với nhau và hình thành nên một nhóm thuộc chi Potyvirus gọi là “BCMV subgroup”

2.3.1.3 Tầm quan trọng kinh tế

BCMV là virus gây thiệt hại quan trọng trên cây họ đậu ở khắp Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ và Mỹ Latinh Mức độ nhiễm bệnh có thể đạt tới 100%, tùy thuộc vào mức độ bị bệnh mà năng suất giảm từ 53% - 68% (CABI, 2017a) Cây nhiễm bệnh BCMV vừa và nặng làm giảm 50% và 64% số lượng của quả/cây, cắt giảm 53% và 68% sản lượng hạt giống (Hampton, 1975) Nghiêm trọng hơn vào những năm 1972 và 1975 dịch bệnh BCMV xảy ra tại Marốc, trong đó 50 % tất cả các cây đậu trồng nhiễm BCMV từ hạt của vụ trước và lan truyền nhờ rệp, thiệt hại năng suất ước tính tới 50% và 34% hạt bị nhiễm bệnh sau thu hoạch (CABI, 2017a) 2.3.1.4 Triệu chứng gây hại

Cây đậu khi bị nhiễm virus BCMV có thể tạo ra một số triệu chứng sau: khảm thường, khảm vàng, khảm xanh (có các nốt phồng xanh đậm), lá thường nhăn, có thể cuốn, cây trồng từ hạt bị nhiễm bệnh gần như luôn luôn còi cọc và

không có năng xuất (Mukeshimana et al., 2003) Tuy nhiên triệu chứng phụ thuộc nhiều vào chủng virus, giống cây, giai đoạn phát triển, thời điểm nhiễm và điều kiện ngoại cảnh

Trên quả: Nếu cây nhiễm từ hạt thì các lá non đầu tiên bị đốm biến vàng

và biến dạng, cây bệnh có ít quả, quả nhỏ, chín chậm, vỏ quả có các đốm màu xanh đậm

Trên lá: Lá bị nhiễm bệnh bị co lại, hai mép lá thường cụp xuống và uốn cong Trên lá thật có nhiều dạng triệu chứng như khảm xanh nhạt và xanh đậm, cuộn lá, lá bị dị dạng hoặc có những chấm màu vàng (Vũ Triệu Mân, 2003) Một

số chủng virus có thể tạo triệu chứng chết hoại màu nâu đen ở gân lá gọi là bệnh

“thối đen” Triệu chứng này chỉ xuất hiện trên các giống có gen kháng trội I Vết chết hoại có thể phát triển tới thân, rễ và đỉnh sinh trưởng Cây có thể chết nếu nhiễm sớm, nếu nhiễm muộn cây vẫn sống nhưng có thể sống từng phần (Hà Viết Cường, 2011) Sự phát triển của một loại triệu chứng phụ thuộc vàogiống cây trồng, thời gian bị nhiễm, chủng BCMV và điều kiện môi trường (Hart and Saettler, 1981)

Hình 2.1 Triệu chứng BCMV hại trên lá cây đậu đỗ (CABI, 2017a) 2.3.1.5 Lan truyền

* Qua côn trùng môi giới

BCMV lan truyền tự nhiên ngoài đồng ruộng bằng nhiều loài rệp muội theo kiểu không bền vững như Acyrthosiphon pisum, Aphis fabae, Myzus persicae… Nhiều loài rệp mặc dù không sống trên cây đậu nhưng vẫn có khả năng truyền virus khi chúng di chuyển tìm thức ăn Truyền qua rệp là cách truyền bệnh thứ cấp quan trọng trên đồng ruộng (Morales and Bos, 1988)

* Qua hạt giống/phấn hoa

BCMV là một virus nhiễm trên hạt nhiều loại cây họ đậu, đặc biệt trên các giống đậu P Vulgaris BCMV có khả năng truyền qua phấn hoa vì virus đã được phát hiện thấy trong hạt phấn BCMV có mặt ở nhiều bộ phận như lá đài, cánh hoa, nhị và nhụy Dịch chiết từ quả và phôi của hạt non có khả năng lây nhiễm rất cao Cây bị nhiễm sớm có tỷ lệ hạt nhiễm virus rất cao (có thể > 50%) Thời điểm nhiễm bệnh ảnh hưởng đến khả năng truyền qua hạt Cây bị nhiễm ở giai đoạn lá thật đầu tiên thì tỷ lệ truyền qua hạt cao, có thể tới 90% Cây bị nhiễm ở giai đoạn

3 lá thật thì tỷ lệ bệnh virus truyền qua hạt giảm mạnh chỉ còn 1% Nếu cây bị nhiễm sau ra hoa khoảng 1 tuần thì hạt không có khả năng truyền virus (mặc dù vẫn có thể bị nhiễm virus) Trong một nghiên cứu khác, tỷ lệ hạt truyền virus đạt tối đa ở giai đoạn lá thật thứ nhất và hầu như không có khả năng truyền qua hạt khi cây bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng sau trồng Lây nhiễm virus vào lá mầm dẫn tới biểu hiện bệnh cũng như khả năng truyền qua hạt đạt tối đa Virus tồn tại chủ yếu

ở phôi nhưng cũng có thể ở các bộ phận khác của hạt Virus có mặt ở vỏ hạt nhưng biến mất khi hạt khô Virus có khả năng tồn tại trên hạt rất lâu mà vẫn duy trì khả năng truyền bệnh Có thí nghiệm cho biết hạt vẫn có thể truyền bệnh sang cây con sau 30 năm Có thí nghiệm cho thấy hạt bảo quản ở 2oC – 4oC sau 6 năm vẫn có khả năng truyền bệnh với tỷ lệ 3% - 4% (Morales and Bos, 1988)

Kết quả phân tích hơn 8.000 mẫu hạt đậu đỗ thu thập tại các vùng ở Bancăng cho thấy tỷ lệ hạt nhiễm CMV lên tới 20% và 26% nhiễm BCMV Đây được coi là nguồn bệnh ban đầu lây lan trên đồng ruộng (Babovic et al., 1996) 2.3.1.6 Phòng trừ

- Kiểm tra hạt giống trước khi gieo bằng cách: loại bỏ hạt bệnh trước khi gieo trồng, không thu hoạch hạt giống trên cây bệnh, chọn hạt giống khỏe trước khi gieo trồng và trong quá trình sinh trưởng của cây cần loại bỏ cây bệnh

- Phòng trừ côn trùng môi giới: do virus truyền lan trên đồng ruộng qua các côn trùng môi giới nên cần khống chế mật độ các côn trùng môi giới ở mức phù hợp bằng các biện pháp hóa học, sinh học, canh tác

- Chọn tạo giống chống chịu

- Biện pháp canh tác: luân canh cây trồng khác họ và xen canh có tác dụng cắt đứt nguồn bệnh, tăng tính đa dạng sinh học đồng ruộng, tăng mật độ các loài thiên địch, giảm lượng côn trùng môi giới, làm cản trở sự lây lan của virus

- Sử dụng tính kháng chéo bằng các chủng virus nhược độc (Lê Lương

Tề, 1998)

Tuy nhiên, phương pháp tốt nhất là kiểm soát bằng cách sử dụng hạt giống đã qua kiểm tra không nhiễm bệnh và các giống kháng hoặc cây trồng có gen kháng virus BCMV (French and Duncan, 2010)

2.3.1.7 Nghiên cứu về BCMV ở Việt Nam

Cho tới nay, tại Viêt Nam chỉ có 2 công bố về virus quan trọng này Đầu tiên là một nghiên cứu dựa trên phân tích ELISA và giải trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt Nam Dựa trên nghiên cứu này, các tác giả đã xác nhận sự có mặt của BCMV trên hạt đậu (Vigna unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0,8% - 12,4% Nghiên cứu thứ 2 là các phân tích trình tự gen từ 9 mẫu virus phân lập từ các cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh như đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu tương và muồng 3 lá (một cây che phủ

cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh ở Việt Nam Các nghiên cứu gần đây cho thấy vùng Đông Nam Á và đặc biệt Việt Nam là một trong những trung tâm phát hiện các chủng BCMV vì: (i) BCMV đã được phát hiện thấy trên khá nhiều cây họ đậu như đậụ đen, đậu đỏ (Phaseolus vulgaris), đậu đũa (Vigna unguiculata), đậu tương (Glycin max) và muồng 3 lá (Crotalaria anagyroides) – một cây che phủ

cà phê tại Đắc Lắc (ii) Phần lớn các mẫu BCMV phân lập tại Việt Nam đã phân nhóm với 2 nhóm chủng chính là chủng Black Eye Cowpea Mosaic (BlCM) và chủng Peanut Stunt Virus (PSt) (iii) Đặc biệt, 2 mẫu BCMV phân lập từ đậu đen (BCMV-VN-BB2-5) và đậu đũa (BCMV-YB2) đã biểu hiện mức độ biến động trình tự gen rất cao, chẳng hạn thiếu các chuỗi epitope nằm ở đầu amin của protein CP và trong phân tích phả hệ, chúng nằm ở vị trí trung gian giữa cụm chứa tất cả các chủng BCMV và cụm chứa các potyvirus khác thuộc nhóm

“BCMV” (iv) Một phân tích phả hệ mới đây nhất dựa trên so sánh trình tự khoảng 400 chuỗi nucleotide mã hóa phần trung tâm và phần đầu vỏ virus đại diện cho 34 loài potyvirus thuộc nhóm “BCMV” đã chứng minh rõ ràng rằng các virus của nhóm này (kể cả BCMV) có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á, Nam Á,

và khu vực châu Đại Dương (Ha et al., 2008a)

2.3.2 Soybean mosaic virus (SMV)

2.3.2.1 Phân bố

Bệnh được phát hiện, quan sát và mô tả lần đầu tiên năm 1915 ở bang Connecticut thuộc Mỹ (Brunt et al., 1996)

SMV có thể được tìm thấy trên khắp thế giới, bất cứ nơi nào đậu được trồng Điều này bao gồm nhiều khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới (CABI, 2017b)

2.3.2.2 Phân loại

Virus có ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, giống Potyvirus, loài Soybean mosaic potyvirus, ngoài ra virus còn có một số tên khác như Soja virus 1, Soybean virus 1 Tên thường dùng Soybean mosaic virus, viết tắt SMV (CABI, 2017b)

SMV và các Potyvirus như Cowpea aphid-borne mosaic virus, Passionfruit woodiness virus, Zucchini yellow mosaic virus) hiện nay được coi là

có liên quan chặt chẽ đến BCMV và BCMNV nhưng vẫn được phân loại là loài riêng biệt như là Bean yellow mosaic, Sugarcane mosaic virus và Potato Y viruses (trong đó PVY là một thành viên của chi) Tuy nhiên các virus Azuki bean mosaic, Blackeye cowpea mosaic và Peanut stripe viruses, và các mẫu phân lập SMV ở Đài Loan được coi là có liên quan đến các chủng của BCMV (Vetten

et al., 1992) Do vậy để xác định các Potyvirus và để chẩn đoán những bệnh do chúng gây ra cần sử dụng những phương pháp chẩn đoán phức tạp như sử dụng kháng thể đơn dòng, giải trình tự gen, chính dựa trên các kỹ thuật này mà khi so sánh trình tự gen của Peanut stripe virus người ta thấy chúng có liên quan mật thiết đến SMV (Gunasinghe et al., 1994)

và tổng trọng lượng hạt giống trên cây giảm khoảng 6,6% - 17,8% Khi nhiễm SMV hàm lượng protein trong hạt thường tăng lên, hàm lượng dầu trong hạt giảm, hàm lượng axit stearic và oleic tăng (CABI, 2017b)

2.3.2.3 Triệu chứng gây hại

* Trên lá : vùng gần gân lá thường phồng lên và có nhiều nếp nhăn, lá khảm, đốm, úa vàng (CABI, 2017b)

* Trên quả: quả bị giảm về số lượng và kích thước, quả nhẵn hoặc không hạt và sản lượng có thể giảm đáng kể Virus có thể làm giảm kích thước của hạt giống, làm thay đổi thành phần hóa học và làm giảm khả năng nảy mầm của hạt giống do đó chất lượng của hạt giống giảm (CABI, 2017b)

* Cây bị nhiễm thường còi cọc vì cuống lá và lóng bị rút ngắn lại, đặc biệt

là khi cây còn non hay bị nhiễm từ hạt (CABI, 2017b)

Hình 2.2 Triệu chứng do SMV trên đậu tương (CABI, 2017b): (A) triệu

trứng trên lá, (B) triệu chứng trên hạt 2.3.2.4 Lan truyền

* Truyền qua vectơ

Virus SMV truyền qua rệp muội theo kiểu truyền không bền vững Người

ta đã ghi nhận có khoảng 11 loài rệp khác nhau có thể truyền SMV theo phương thức không bền vững, nhất là những loài Cyrthosiphon pisum, Aphis fabae và Myzus persicae (Bos, 1972)

* Truyền qua hạt giống

Virus gây bệnh có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống Trong hạt giống virus có thể tồn tại được 2 năm (Lê Lương Tề, 1998) Virus được tìm thấy trong phôi và lá mầm, nhưng hiếm khi tìm thấy ở ngoài vỏ hạt giống, virus có thể tồn tại trong hạt giống được lưu trữ trong 30 năm Virus xâm nhập vào hạt giống có thể là từ phấn hoa bị nhiễm bệnh (Bos, 1972)

Tuy nhiên con người đóng vai trò chi phối trong việc lây lan của SMV bằng cách quyết định trồng cây họ đậu thông qua giống, thời gian trồng, mật độ Con người cũng góp phần làm lây lan virus bằng việc mua bán hạt giống thương mại (CABI, 2017b)

- Diệt trừ côn trùng truyền bệnh bằng các loại thuốc hoá học

- Loại bỏ vĩnh viễn các nguồn của SMV thông qua luân canh cây trồng và thực tiễn quản lý và kiểm soát vector bằng hành vi khác nhau, hóa học, di truyền, phương thức sinh học cũng sẽ rất hữu ích trong quản lý năng động thời gian và không gian của SMV lây lan (Chen et al., 2008)

2.3.2.6 Nghiên cứu về SMV ở Việt Nam

Hiện nay chưa có đánh giá ghi nhận virus SMV có gây hại tại Việt Nam 2.3.3 Kudzu mosaic virus (KuMV)

Phân loại

Thuộc loài Kudzu mosaic virus, chi Begomovirus, họ Geminiviridae

Tầm quan trọng

KuMV được phát hiện lần đầu tiên trên cây sắn dây tại tỉnh Hòa Bình năm

2005 (Ha et al., 2008b) và tiếp theo được phát hiện thấy cũng trên cây sắn dây tại Trung Quốc năm 2008 (Zhang and Wu, 2013) Năm 2009, trong một thí nghiệm phát hiện Begomovirus trên cây đậu đỗ dùng cặp mồi chung BegoAFor1/Rev1, 5 mẫu đậu tương bị bệnh khảm vàng tại khu thí nghiệm Gia Lâm - trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã có phản ứng dương tính Việc phát hiện thấy Begomovirus trên đậu tương có ý nghĩa lớn vì đây là lần đầu tiên một Begomovirus được phát hiện thấy trên cây trồng họ đậu tại Việt Nam (Hà Viết Cường, 2010)

Phản ứng PCR nhằm phát hiện KuMV đã được thực hiện trên 141 mẫu cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh virus (Hà Viết Cường, 2010) Nghiên cứu cho thấy: kiểm tra 90 mẫu đậu tương biểu hiện triệu chứng như khảm vàng, khảm nhăn và lùn, nhăn lá, biến vàng mép lá thì có tới 26 mẫu (28,8%) cho phản ứng PCR dương tính Mặc dù phần lớn các mẫu đậu tương kiểm tra (70 mẫu) được thu thập tại các huyện ngoại thành – Hà Nội đã phát hiện thấy 1/3 mẫu thu tại Hòa Bình và 1/8 mẫu thu tại Hưng Yên có phản ứng PCR dương tính Ngoài ra,

khi kiểm tra 5 mẫu sắn dây thu tại Hà Nội và Hải Phòng biểu hiện triệu chứng khảm lá (lá không bị biến dạng) thì thấy cả 5/5 mẫu đều có phản ứng dương tính (Hà Viết Cường, 2010)

Triệu chứng

Cây mới nhiễm bệnh biểu hiện đốm biến vàng trên lá, về sau triệu chứng khảm vàng phát triển rõ rệt, kèm theo lá bị nhăn Cây lùn, còi cọc, phát triển kém (Hà Viết Cường, 2010)

Hình 2.3 Triệu chứng KuMV trên đậu tương

Nguồn: Hà Viết Cường và Nguyễn Đức Anh (2013)

2.3.4 French bean seavere leaf curl virus (FbSLCV)

Gần đây, hai loại virus thuộc họ geminiviruses mới được phát hiện là Euphorbia caput-medusae latent virus (EcmLV) đã được phát hiện ở Nam Phi và French bean severe leaf curl virus (FbSLCV) đã được phát hiện ở Ấn Độ (Bernardo et al., 2013) và Việt Nam (Hà Viết Cường, 2014) Dựa vào trình tự phân tách gen và tổ chức bộ gen, Euphorbia caput-medusae latent virus (EcmLV)

và French bean severe leaf curl virus (FbSLCV) đã được đề xuất thuộc vào một chi mới của Geminivirus Chi này được đặt tên là Capulavirus (Bernardo et al., 2013) Đây là virus lần đầu tiên được phát hiện thấy tại Việt Nam

Phân tích các đặc điểm phân tử của FbSLCV mẫu VNP194 trên các vùng gen chủ yếu như vùng liên gen lớn LIR, liên gen nhỏ SIR, protein vỏ CP, protein tái sinh Rep/RepA cho thấy các motif chức năng chủ chốt cần cho quá trình tái sinh

và gây bệnh của virus đều có và phần lớn giống với các geminivirus khác (Hà Viết Cường, 2014)

PHẦN 3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh virus trên cây họ đậu

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Vùng trồng đậu đỗ tại Hải Phòng

Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.3 Thời gian nghiên cứu (2016-2017)

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

* Điều tra bệnh virus hại cây họ đậu tại Hải Phòng

* Phát hiện virus hại cây họ đậu bằng ELISA

* Đánh giá tính gây bệnh của KuMV và FbSLCV trên cây họ đậu bằng hương pháp lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

* Phát hiện virus hại cây họ đậu bằng PCR và RT-PCR

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Mẫu bệnh cây, cây thí nghiệm

* Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra (các giống đậu đỗ) sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silica gel để kiểm tra virus

* Cây thí nghiệm: Các giống đậu (Đậu tương DT26; đậu cove TLP68, PN03, đậu đũa VA009, đậu xanh DX208

3.3.2 Các dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của KuMV và FbSLCV

Sử dụng 3 dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của 2 virus Các dòng này được bảo quản tại TTNCBCNĐ ở - 80 oC glycerol 15% Các dòng bao gồm:

 AT-KuA-3: Mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A của KuMV

 AT-KuA-7: Mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B của KuMV

 AT-VNP194-5-2: Mang cấu trúc xâm nhiễm của FbSLCV

3.3.3 Dụng cụ nghiên cứu

Bản ELISA, máy đọc ELISA, máy PCR, máy điện di, máy li tâm, bể nhiệt, pipet, chày cối sứ, tủ lạnh, máy spin, cân điện tử, máy lắc và các dụng cụ thí nghiệm khác

3.3.4 Hoá chất

- Chất kháng sinh

Kháng sinh (mg/ml) Cách pha

Phương pháp sử dụng/ trung bình (µL/100mL) Kanamycin

- CTAB+β EM: 10 ml β EM / 1 ml đệm CTA

- TAE (1X): mM Tris-acetate chứa 0.5 mM EDTA (pH = 7,8) Đệm đậm đặc (5) được chuẩn bị từ Tris base (2,2 g/L), acid acetic băng (5,71 ml/L) và EDTA 0.5

M pH = 8(10 ml/L) Đệm được hấp khử trùng ở 121 oC trong vòng 30 phút và bảo quản trong tủ lạnh thường Đệm được sử dụng để chạy điện di gel agarose

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng

Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây họ đậu ở ruộng sản xuất: Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật (2003)

Chọn 1 ruộng đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc

(cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra từ 50 cây đến 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ Tính tỷ lệ bệnh: Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh

3.4.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh

Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng điển hình của bệnh hại đem về bảo quản khô bằng hạt Silica gel

3.4.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp

Sử dụng các kít ELISA phát hiện virus cây họ đậu do Viện DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) cung cấp Các kít và phương pháp thử ELISA trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ)

STT Virus Viết tắt Phương pháp Mã kít

1 Bean common mosaic virus BCMV TAS-ELISA AS0915-0228/1

2 Bean leaf roll virus BLRV TAS-ELISA AS0142-0227/1

3 Bean yellow mosaic virus BYMV DAS-ELISA AS-0717

4 Cucumber mosaic virus CMV DAS-ELISA AS-0929

5 Potyvirus potyvirus PTA-ELISA AS-0573/1

Sử dụng kỹ thuật ELISA (TAS-ELISA, PTA-ELISA và DAS-ELISA) theo tài liệu mô tả của viện DSMZ Kỹ thuật PTA-ELISA gồm các bước:

1 Cố định dịch cây vào bản ELISA

Nghiền mẫu cây trong đệm phủ và cho 100l/giếng ủ bản ELISA qua đêm ở 4-6 oC trong hộp ẩm Sáng hôm sau, rửa 3 lần bằng đệm rửa Protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng

2 Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA

Hoà IgG đặc hiệu virus trong đệm huyết thanh và cho 100l/giếng Ủ bản ELISA ở 37 oC 1-2 giờ trong hộp ẩm Rửa bản ELISA như bước 1

3 Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào bản ELISA

Hoà IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP trong đệm liên kết và cho 100

l/giếng Ủ bản ở 37 oC 1-2 giờ IgG liên kết AP thứ 2 này là IgG được tạo ra khi tiêm IgG của thỏ vào 1 loài động vật khác thỏ (chẳng hạn dê) nên không liên kết với virus mà liên kết với IgG thỏ đặc hiệu virus ở bước 2 Sau khi ủ, rửa bản như bước 1

4 Cố định chất nền và đánh giá kết quả

Hoà chất nền trong đệm chất nền theo tỷ lệ 0.6 mg/ml) và cho giếng với lượng100 l/giếng Chất nền ở đây là Nitrophenyl phosphate (NPP) Bản ELISA được ủ ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm trong tối 60 phút Phản ứng hoá học ở đây

là NPP sẽ bị thuỷ phân thành Nitrophenol phosphate dưới sự xúc tác của enzyme

AP Nitrophenol phosphate là chất có màu vàng, do vậy có thể nhận biết được bằng mắt hoặc bằng máy đọc ELISA (máy so màu) ở bước sóng 405 nm Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) Giếng không có màu là cây không bị nhiễm bệnh Hiển nhiên, do nồng độ NPP đều giống nhau ở các giếng nên giếng nào có màu vàng càng đậm chứng tỏ nồng độ enzyme càng cao tức nồng độ virus trong mẫu thử càng cao Có thể ngừng phản ứng thuỷ phân bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 3M với lượng 25-50 l/giếng

Phản ứng ELISA (+) là phản ứng có trị số mật độ quang đo được của mẫu (ODmẫu) lớn hơn hai lần trị số mật độ quang trung bình của mẫu khỏe (Xtrung bình

OD của mẫu khỏe)

3.4.4 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR và RT-PCR

3.4.4.1 Chiết acid nucleic tổng số từ mô lá

Phương pháp chiết acid nucleic tổng số bằng dung dịch đệm CTAB theo mô

tả của Doyle & Doyle (1987)

- Bước 1: Ủ đệm CTAB + βME (100 µl PME + 10 ml CTAB) ở 65 oC trong

30 phút

- Bước 2: Cho mẫu bệnh cần chẩn đoán vào tube 1.5mL theo tỷ lệ 0.1g/1ml đệm CTAB + βME

- Bước 3: Cho vào tube 500 µl CTAB + βME Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ

- Bước 4: Ủ tube trong điều kiện 60 - 65oC, trong khoảng 5 phút

- Bước 5: Ly tâm 7 phút

- Bước 6: Lấy dịch trên tủa (khoảng 400µl)

- Bước 7: Chiết một thể tích tương đương (400µl) dung dịch Chlorofrom:isoanyl alcohol (24:1)

- Bước 8: Ly tâm trong 5 phút

- Bước 9: Lấy dịch trên tủa (khoảng 300µl), để trong tủ lạnh -200 oC trong khoảng ít nhất 2 phút

- Bước 10: Chiết lần 2 với Chlorofrom: isoanyl alcohol (24 : 1) Để lạnh

5 phút

- Bước 11: Ly tâm trong 5 phút

- Bước 12: Lấy dịch trên tủa (khoảng 200µl) cho vào tube trắng 1.5 ml

- Bước 13: Bổ sung một thể tích tương đương (khoảng 200µl) isopropanol lạnh Để lạnh ở nhiệt độ -20 oC trong 20 phút (đến đây là bước an toàn nên có thể

để qua đêm hôm sau làm tiếp)

- Bước 14: Lắc đều, ly tâm trong 15 phút

- Bước 15: Loại bỏ dịch trên tủa, giữ lại cặn Spin trong 15 giây để hút hết dịch trong tube ra

- Bước 16: Rửa cặn DNA 2 lần với etol 70% (khoảng 700µl)

- Bước 17: Làm khô cặn bằng không khí

- Bước 18: Hòa cặn DNA với 20 - 25µl TE, búng nhẹ để acid nucleic tan hết, giữ tube ở điều kiện nhiệt độ - 20 oC

Các bước được thực hiện tương tự với 2 điều chỉnh: thành phần phản ứng có

bổ sung 0.3 µl MMuLV-RT (Thermo Scientific); phản ứng RT-PCR được thực hiện với bước tổng hợp cDNA trong 20 phút ở 45 oC và bước gắn mồi ở nhiệt độ 40 oC

3.4.4.3 Mồi PCR phát hiện virus

Bảng 3.2 Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu

trong lò vi sóng 3 – 4 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100 ml dung dịch gel cho 4µl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng

- Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 40 oC thì đổ vào khuôn có đặt lược tạo lỗ khuôn để khuôn ở nhiệt độ phòng

- Lấy các tube 0.5ml đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự Cho vào mỗi tube 4µl Loading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5 giây Tiến hành: Sau 30 phút để khuôn

ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng)

- Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel

- Nhỏ mẫu vào giếng: Dùng pipet hút 7 – 10µl dung dịch mẫu cần chẩn đoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng Marker làm chuẩn

- Cắm nguồn điện cho máy điện di, đặt ở hiệu điện thế 100V trong 25 - 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại

3.4.5 Kỹ thuật Agroinoculation

Agroinoculation là kĩ thuật đưa cấu trúc xâm nhiễm mang bộ gen của virus vào tế bào thực vật bằng vi khuẩn A tumefaciens A tumefeciens là vi khuẩn đất, gram (-), được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật A tumefeciens có chứa một plasmid lớn, kích thước khoảng 20kb gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây Khi cây bị nhiễm A tumefeciens qua các vết thương biểu hiện rõ nhất là các khối u hình thành ngay chỗ lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được là do A tumefeciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u

Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được nhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi khuẩn vào đất Trong báo cáo này, chúng tôi sử dụng phương pháp tiêm trực tiếp

vi khuẩn vào mô bằng châm hạt ủ qua đêm

Phương pháp châm hạt ủ qua đêm (Madal et al., 1997)

Bước 1: Hạt đậu được xử lý bằng cách ngâm vào nước xà phòng trong vòng 15-20 phút, rửa sạch rồi ngâm trong nước cất vô trùng qua đêm, sau đó loại

bỏ vỏ hạt

Bước 2: Cấy lại 3 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm trên đĩa môi trường LB agar chứa 3 kháng sinh streptomicin 200 μg/mL, rifampicin 34 μg/mL

và kanamycin 100 μg/mL (cấy ria 1 chiều) Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày

Bước 3: Cấy truyền vi khuẩn sang nuôi cấy trên 250 ml môi trường LB lỏng chứa 3 kháng sinh như trên trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28°C/ 1 ngày) Đảm bảo vi khuẩn ở pha sinh trưởng mạnh (pha log) bằng đo OD ở 600nm

Bước 4: Ly tâm vi khuẩn (3000 g / 5 phút) đổ dung dịch LB lỏng giữ cặn đem đi rửa lại bằng nước cất vô trùng ly tâm lại dịch khuẩn Đổ nước giữ cặn hòa cặn vi khuẩn với 10 hoặc 20mL MgCl2 10mM tùy số lượng cần dùng và dùng ngay

Bước 5: Châm hạt gần vùng (xung quanh) trụ mầm Ngâm hạt trong dịch

vi khuẩn đã được chuẩn bị ở bước 4 và châm

Bước 6: Đặt hạt đã châm trong điều kiện nhiệt độ < 30 oC trong vòng 12 giờ, rửa hạt bằng nước cất vô trùng và gieo trong chậu nhựa, để cây ở điều kiện dưới 30 oC Chăm sóc và theo dõi sau 3 - 4 tuần

3.5 PHƯƠNG PHÁP TÍNH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Tỷ lệ bệnh : TLB (%) = a/b *100

Trong đó: a: Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus

b : Tổng số cây điều tra

Số liệu thu thập được xử lý trong Microsoft Office Excel