ĐỀ CƯƠNG LUẬN văn (y dược) định danh được căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc phân lập được tại viện mắt trung ương

TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC VÀ CÁC NGÀNH KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viờm loét giác mạc là bệnh phổ biến ở các nước đang phát triển, có thể dẫnđến mờ đục giác mạc, giảm thị lực trầm trọng, là nguyên nhân chính trong cácnguyên nhân gõy mự lòa do bệnh lý giác mạc [24], [37],[43]

Viờm loét giác mạc do nhiều nguyên nhân gây nên như: vi khuẩn, nấm,virus, ký sinh trùng, hoặc nguyên nhân chưa rõ ràng [30] Theo các báo cáo gầnđây, tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm ngày càng tăng, chiếm tới 16% đến 37%các trường hợp viờm loột giác mạc [12],[16], [18],[35], [24]

Viờm loét giác mạc do nấm là một bệnh lý nặng nề ở mắt, nhưng có thểđiều trị được nếu được chẩn đoán sớm và kịp thời Việc chẩn đoán xác địnhđược sớm căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc sẽ có ý nghĩa rất quan trọnggiúp cho việc sử dụng thuốc chống nấm được thực hiện ngay từ đầu, làm tănghiệu quả của thuốc chống nấm, giảm thời gian và chi phí điều trị, giảm thiểu tối

đa sự hình thành sẹo đục gây giảm thị lực

Hiện nay, chẩn đoán căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc vẫn chủ yếudựa vào hình ảnh tổn thương trên lâm sàng và kết quả nhuộm soi, nuôi cấy phânlập nấm, chủ yếu dựa trên hình thái học để định danh căn nguyên nấm Tuynhiên, thực tế có nhiều loại nấm gây bệnh cảnh lâm sàng không điển hình không

dễ cho việc chẩn đoán Kỹ thuật nhuộm soi có độ nhạy thấp [11], kỹ thuật nuôicấy phân lập nấm cũng có những thất bại do các loài nấm khó nuụi cấy hoặcchưa nuôi cấy được Do đó mà đã bỏ sút khụng chẩn đoán được một tỉ lệ khá lớntrong các trường hợp bị bệnh Trong những trường hợp nuôi cấy được nấm đểđịnh danh bằng tính chất sinh vật hóa học thì cũng không đơn giản và sẵn có,thời gian lâu vài ngày đến vài tuần do đó làm chậm tốc độ quá trình điều trị Vìvậy, việc định danh chính xác căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc tại Việt

Nam chưa được thực hiện đầy đủ Các nghiên cứu về các loài nấm gây viêmloétgiác mạc ở Việt Nam cũng rất ít và nếu có cũng chủ yếu dựa trên những tiêuchuẩn về hình thái học Định danh được chính xác loại nấm gây viêm loétgiácmạc, mô tả được mối liên quan giữa căn nguyên nấm với một số yếu tố dịch tễhọc, nhận định được căn nguyên đang lưu hành sẽ giúp ích cho việc điều trị tốtbệnh nhân Từ đó, trong một số trường hợp cỏc bỏc sỹ lâm sàng có thể dựa vàocăn nguyên thường gặp,đang lưu hành mà có hướng điều trị ban đầu khi chưa cókết quả định danh.

Kỹ thuật giải trình tự gen định danh căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc

có tính ưu việt hơn nhiều so với các phương pháp định danh kinh điển bằngnhuộm soi và nuôi cấy [23],[24],[28][29],[30] Kỹ thuật này cho phép định danhchính xác căn nguyờn gây viêm loétgiác mạc ít nhất ở mức độ chi

Tại Việt Nam đó cú một số nghiên cứu về căn nguyên nấm gây viêmloétgiác mạc được báo cáo Tuy vậy, chưa có một nghiên cứu đầy đủ, chính xác

về các căn nguyên nấm gây VLGM Chính vì vậy mà chúng tôi tiến hành nghiêncứu này với mục tiêu:

1 Định danh được căn nguyên nấm gây viêm loét giác mạc phân lập được tại Viện Mắt Trung ương

2 Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học liên quan tới căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Viờm loét giác mạc

Giác mạc là một mảnh mô trong suốt nằm phía trước con ngươi, độ dàycủa giác mạc không đồng đều Giác mạc bình thường không có mạch máu, đượcdinh dưỡng chủ yếu nhờ sự thẩm thấu từ vựng rỡa vào do hai cung mạch nông

và sâu, nhờ thủy dịch và nước mắt Giác mạc được cấu tạo gồm năm lớp từtrước ra sau: biểu mô, màng Bowman, nhu mô, màng Descemet, nội mô

Biểu mô giác mạc thuộc loại biểu mụ lỏt tầng, chiếm khoảng 1/10 chiều dàygiác mạc, có thể chia thành ba phần: màng đáy, các lớp tế bào và phim nước mắt

Viờm loét giác mạc là tình trạng mất lớp biểu mô giác mạc kèm theonhiễm vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng vào lớp nhu mô hoặc biểu mô giácmạc Viờm loột giác mạc là bệnh thường gặp và tỷ lệ dẫn đến mù lòa rất cao.Bệnh thường xảy ra sau khi bị dị vật giác mạc như bụi, mạt sắt, hạt thóc hoặcsau khi bị chấn thương vào giác mạc như cành cây, lá cây, lỏ lỳa, và có thể xuấthiện tự nhiên Khi bị bệnh, bệnh nhân thấy cộm chói, chảy nước mắt, đỏ mắt vànhìn mờ

Viờm loét giác mạc là một bệnh rất nguy hiểm vỡ nú để lại những dichứng vĩnh viễn như sẹo giác mạc, teo nhãn, lồi mắt cua và làm mất một phầnhoặc toàn bộ thị lực

Viờm loét giác mạc có thể xuất hiện tự nhiên nhưng đa số có yếu tố khởiphát là một tổn thương của lớp biểu mô do các nguyên nhân ngoại lai

Có nhiều yếu tố nguy cơ gây viêm loétgiác mạc do nấm, trong đó thườnggặp nhất là chấn thương (lỏ lỳa quệt vào,hạt bụi, mạt sắt,…) Ngoài ra, việc sửdụng kính tiếp xúc, can thiệp phẫu thuật vào bề mặt giác mạc (mổ mộng, mổ thể

thủy tinh, ), các bệnh mạn tính ở bề mặt nhãn cầu, khô mắt, … cũng là nguy cơgây viêm loétgiác mạc do nấm.

1.2 Căn nguyên gây viêm loétgiác mạc

Các căn nguyên gây viêm loétgiác mạc thường gặp là: vi khuẩn, nấm,virus Cơ cấu nguyên nhân gây VLGM có thay đổi theo thời gian và vùng địa lýkhác nhau Tại Việt Nam, theo Phạm Ngọc Đụng,Hoàng Thị Minh Châu (2007),

tỷ lệ VLGM do nấm là 59,8%, do vi khuẩn là 29,4%, do virus là 9,1%, do amip

là 1,8% [3] Theo Hoàng Năng Trọng, tỷ lệ VLGM do vi khuẩn là 30,1%, donấm là 23,3%, không phát hiện được amip[18]

1.2.1.Vi khuẩn

Nhiều vi khuẩn có thể gây viêm loétgiác mạc Tỷ lệ loài vi khuẩn có thểkhác nhau và thay đổi theo thời gian và vùng địa lý Theo một số tác giả, các vi

khuẩn gây bệnh có thể gặp là: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus

aureus, Pseudomonas spp, Enterobacteriaceae,Moraxella spp, Streptococcus pyogenes, Enterobacteriacea…[12],[13],[42],[47].

1.2.2 Nấm

Có hơn 70 loại nấm khác nhau có thể gây viờm loét giác mạc [30], [34],[40] Nấm thường gây bệnh ở những giác mạc đã bị tổn thương sau sang chấn[24] Nấm có thể phân lập được từ mi mắt và túi kết mạc của người bình thường,đặc biệt ở những người làm việc ngoài trời [38]

Nấm có cấu trúc giống như thực vật, thô sơ, không di động, không chứachất diệp lục, sống cộng sinh, ký sinh hay hoại sinh Nấm có thể phát triển được

ở nhiệt độ từ 0-37oC, tốt nhất là từ 20-30oC Màng tế bào nấm chứa nhiều sterol.Nấm có thể phân biệt với vi khuẩn bởi sự có mặt của hạt nhân, ty thể, ribosom80-S, tiêu thể trung tâm và sự ưa thích môi trường acid[]

Có nhiều cách phân loại nấm, người ta thường phân thành 2 nhóm: nấmsợi và nấm men để tiện cho xét nghiệm chẩn đoán và lựa chọn thuốc điều trị.

Nấm sợi là những vi sinh vật đa bào, gồm những sợi có nhánh dài, rõ rệt

Nấm men bao gồm chủ yếu là các loài Candida, là những sinh vật đơn

bào có hình tròn hoặc ô- van

Cả nấm sợi và nấm men đều có khả năng gây viêm loétgiác mạc Lần đầutiên Leber (1879) phát hiện nấm gây bệnh tại giác mạc Viờm loột giác mạc donấm rất phổ biến ở các nước nhiệt đới Theo Dunlop, tỷ lệ viờm loột giác mạc

do nấm tại Bangladesh là 35,9% [27] Theo Srinivasan và cộng sự, ở miền Nam

Ấn Độ tỷ lệ VLGM do nấm là 44% [42] Việt Nam , trường hợp nhiễm nấmgiác mạc đầu tiên được phát hiện vào năm 1965 [18] Từ đó tới nay số bệnhnhân nhiễm nấm giác mạc ngày một tăng

Các loại nấm gây bệnh trên giác mạc có thể là: Fusarium, Aspergillus,

Acremonium, Penicillium, Curvularia, Candida, , [34], [40], [41].

Theo Maurin và Cornand [36], ở các nước nhiệt đới thường gặp nhất là

Aspergillus và Fusarium.

Ở các nước ôn đới thường gặp là nấm Candida.

Đối với viờm loột giác mạc do nấm, tỉ lệ gây bệnh của các chủng có thayđổi theo từng năm

Theo một số nhà khoa học Ấn Độ, trong 623 bệnh nhân viờm loột giácmạc do nấm có nuôi cấy dương tính ở miền Đông Ấn Độ từ tháng 1/ 2001 –

12/2003 có 373 trường hợp nhiễm Aspergillus spp (59,8 %), 132 trường hợp nhiễm Fusarium spp (21,2%) [24],[25] Theo một nghiên cứu ở bệnh viện Mắt Bắc Kinh từ năm 1989 đến năm 2000, có 58,7% nhiễm Fusarium spp, 16,8% nhiễm Aspergillus spp, 6,3% nhiễm Mycelia sterilia và 5,7% nhiễm Alternaria

spp[43]

Fusarium và nhất là Fusarium solani là tác nhân gây nhiễm nấm giác mạc

được báo cáo là có mặt ở tất cả cỏc vựng trờn thế giới, đặc biệt ở những vựng cú

khí hậu nóng [40] Aspergillus hay gặp nhất là Aspergillus Fumigatus (90%) là

tác nhân phổ biến gây VLGM do nấm sợi trong các trường hợp được báo cáo ở

Ấn Độ [24] Ở Florida và cỏc vựng miền nam nước Mỹ, Aspergillus ít gặp hơncác loài nấm khỏc gây viêm loétgiác mạc [34], [39], [40] Candida albicans làloại nấm chớnh gây viêm loétgiác mạc ở miền Bắc nước Mỹ

Trước năm 1990, Nguyễn Hiền và Nguyễn Duy Tân, nghiên cứu tại ViệnMắt Trung ương cho biết nấm gây viêm loétgiác mạc đứng hàng đầu là

Aspergillus [4] Theo Trần Thu Phương (1994-1995) Aspergillus vẫn đứng

đầu.Theo Thỏi Lờ Na (2006) nấm Fusarium chiếm tỷ lệ cao nhất (43,3%), tiếp đến là Aspergillus (17,9%) [7].

1.2.3 Virus

Các loại virus có thể gây VLGM là :Herpes simplex, herpes Zoster.

Thường gặp nhất là Herpes simplex virus.

Virus Herpes nằm trong họ Herpesvirinae Bệnh Herpes giác mạc thườnggặp ở lứa tuổi trẻ Sauk hi vào cơ thể, virus có thể tiềm tàng mãi ở hạch thầnkinh và không gây bệnh, song khi gặp điều kiện thuận lợi như: cơ thể bị sốt hoặc

bị nhiễm trựng, cỏc vi chấn thương tại mắt,… virus có thể tái hoạt và gõy viờmtái phát

1.2.4 Căn nguyên khác

Ngoài ra, có thể gặp viờm loột giác mạc do Acanthamoeba Nhiễm

Acanthamoeba giác mạc thường gặp sau chấn thương giác mạc mà tác nhân cóthể do cành cây, côn trùng, nước, mùn cưa, chất bẩn, bụi bặm [33]

1.3 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm căn nguyên nấm gây viêm loétgiác mạc

Hiện nay, có nhiều phương pháp được dùng để chẩn đoán căn nguyên nấm

1.3.1 Soi tươi

Kỹ thuật này đơn giản, cho kết quả nhanh ,nhận định nhanh tác nhân gâybệnh, nhưng độ nhạy thấp nên đã bỏ sót một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bịbệnh Xét nghiệm này có thể nhận biết được trong bệnh phẩm có vi khuẩn haynấm, nhưng không xác định được loài nấm

1.3.2.Nhuộm soi

Cho phép nhận định nhanh tác nhân gây bệnh, độ nhạy thấp nên cũng bỏsót căn nguyên gây bệnh Có nhiều kỹ thuật nhuộm để tìm nấm như nhuộmGram, Giờmsa, KOH 10%, Lactophenol Nhuộm Gram và Giờmsa khụngnhuộm được vách tế bào và vách ngăn của sợi nấm nhưng chất nguyên sinh củanấm sợi hấp thụ được các thuốc nhuộm này [24] Nhuộm soi cho phép phân biệtđược nấm sợi hay nấm men, giúp sơ bộ cho chẩn đoán và hướng điều trị Cũngkhông định danh được loại nấm

1.3.3.Nuôi cấy phân lập

Thạch Sabouraud cho thêm Gentamycin ở nhiệt độ phòng là môi trườngnhạy cảm nhất cho việc phân lập nấm Hình thái trên kính hiển vi ,đặc điểm ởmôi trường nuôi cấy, màu sắc, tốc độ phát triển và sắc tố ở phía dưới là đặc điểm

để nhận định sơ bộ loài nấm

Bệnh phẩm lấy được đem cấy vào môi trường Sabouraud Nếu có nấm cóthể mọc sau 2-3 ngày Nhưng có trường hợp mất thời gian lâu hơn, có thể 5-7ngày ,thậm chí tới 2 tuần [6] Có nhiều loại nấm khó nuôi cấy hoặc chưa nuôicấy được

Để định danh được chính xác loại nấm cần phải qua nuôi cấy sau đó làmcác thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học( các thử nghiệm đồng hóa đường,phângiải ure,…) Nhưng hiện nay, thực tế những bộ tính chất sinh vật hóa học đểđịnh danh nấm rất phức tạp, không sẵn có nờn ít làm được.Bờn cạnh đú, trờn thịtrường có những giá đường để giúp định danh nấm nhưng giá thành đắt và bộtính chất không đủ Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ làmột trở ngại lớn nhất Vì nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì không chỉphân tích hình thái đại thể và vi thể, vốn dĩ phức tạp và công phu, mà còn phảilàm cho được các khảo sát sinh vật hóa học khác như đồng hóa đường, phân tíchcác chất biến dưỡng,…Chớnh vì vậy thông thường ít có phòng xét nghiệm visinh làm được xét nghiệm định danh vi nấm

PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình

tự Giải trình tự gen nấm rồi dựa vào ngân hàng gen nấm đối chiếu sẽ cho phépđịnh danh được chính xác căn nguyên nấm

Tách chiết DNA

Những mẫu bệnh phẩm được giữ ở ống eppendorf được lấy ra và táchchiết DNA DNA được tách chiết bằng kít MasterPure TM DNA purificationkit (USA)

Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

PCR sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 (AlphaDNA, Canada) [29] khuếchđại đoạn gen ITS (intergenic transcribed spacer) nằm giữa đoạn gen mã hóa chotiểu phần 18S và 28S của RNA ribosom Mỗi ống PCR chứa 25ml các thànhphần với nồng độ như sau: MgCL2 2mM; dNTPs, 200mM mỗi loại, AmpliTaqpolymerase, 0,025UI; cặp mồi, và 5ml DNA khuôn mẫu Sản phẩm 550bp

-Giải trình tự gene : PCR dựa trên giải trình tự gen nhằm vào vùng ITS đãđược thực hiện trong ABI Prism 3100 AVANT (Applied Biosystems, FosterCity, USA) Giải trình tự nấm dựa vào phân tích BLAST để xác định các chi và /hoặc loài của nấm Từ kết quả giải trình tự dựa vào ngân hàng gen của nấm đểđịnh danh nấm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Các chủng nấm gây viêm loétgiác mạc phân lập được tại Viện Mắt Trung ương năm 2008, kèm theo hồ sơ và thông tin bệnh nhân Các chủng này được giữ tại bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà nội

2.2 Vật liệu nghiên cứu

-Sổ sách, giấy tờ ghi chép.

-Vật liệu giữ chủng: nước cất, ống eppendorff, que cấy, đèn cồn,…

-Sinh phẩm dùng cho tách chiết DNA: Bộ kít MasterPureTMDNA

Purification Kit (Mỹ)

-Sinh phẩm, hóa chất, cụng cụ, máy móc dùng trong PCR, giải trình tự gen.+ Sinh phẩm:

Cặp mồi ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5

’-GCATATCAATAAGCGGAGGA -3’) (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch đại đoạn gen ITS nằm giữa đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 18S và 28S của RNA ribosom Mỗi ống PCR chứa 25ml các thành phần với nồng độ như sau: MgCl2, 2mM; dNTPs, 200mM mỗi loại, Ampli Taq Polymerase, 0,25UI; cặp mồi và 5mlDNA khuôn mẫu

Kít tinh sạch sản phẩm PCR: Big DyeTM Purification kit (Mỹ)

Kít giải trình tự gen: Big Dyeđ XTerminator (Mỹ)

Kít làm chứng chuẩn để kiểm tra quá trình giải trình tự gen của các mẫu nghiên cứu: Big DyeTM Terminator v1 1/ Matrix Standard Kit.

+ Hóa chất

Thạch Agarose dùng trong điện di gen

Ethidium bromide dùng để nhuộm gen

.TAE (Tris Acetate EDTA)

PBS (Phosphate buffer Saline)

2.3 Dụng cụ và máy móc

- Máy điều nhiệt tự động GeneAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh

- Bộ điện din gang Horizonđ 58 (Gibco-BRL)

- Máy soi gen Wealtec Corp Model MD-20 (Mỹ)

- Máy chụp ảnh gen

- Máy đo nồng độ DNA Bio photometer (Đức)

-Máy giải trình tự gen ABI 3130 (Mỹ)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.4.2.Cỡ mẫu nghiên cứu

Lấy mẫu thuận lợi

2.4.3.Quy trình nghiên cứu

Chủng nấm đã phân lập đượcGiữ trong ống eppendorff ở nhiệt độ phòngTách DNA

PCR khuếch đại vùng gen ITSKiểm tra sản phẩm khuếch đạiTinh sạch sản phẩm PCR

Cycle giải trình tựGiải trình tự genHiệu chỉnhTrình tự genPhân tích kết quả dựa vào phần mềm BLAST

2.4.4 Kỹ thuật

2.4.4.1 Giữ chủng

Lấy một miếng thạch chứa khuẩn lạc nấm (1cm2) từ môi trường chủng nấm đã phân lập được cho vào ống eppendorff có chứa nước cất vô trùng đậy chặt nắp, để ở nhiệt độ phòng

2.4.4.2 Tách chiết DNA từ chủng

- Chuẩn bị bệnh phẩm: lấy mẫu đã được giữ ra

- Sử dụng bộ kít MasterPureTMDNA Purification Kit (Mỹ)

Quy trình tiến hành theo hướng dẫn của bộ kít

1 Chuyển 50μl mẫu bệnh phẩm đã được chuẩn bị vào một ốngeppendorf sạch, loại 1,5 ml

2 Pha dung dịch Proteinase K như sau: 10μl dung dịch 50μg/ μlProteinase K cho vào 400 μl (1μl dung dịch 50μg/ul

Proteinase K cho 400 μl dung dịch ly giải Tissue and Cell lysis Solution) (có trong bộ kít) Lắc đều trờn mỏy lắc, ly tâmnhanh cho dung dịch xuống đáy

3 Cứ mỗi bệnh phẩm đã chuẩn bị ở (1), cho 400μl dung dịch từ(2) Lắc đều 1 phỳt trờn mỏy lắc

4 Ủ ở 65oC trong 25 phút, cứ sau 5 phút lại lắc đều 1 lần

5 Để hỗn hợp hạ nhiệt độ xuống 37oC, thêm 1μl dung dịch 5μg/μl RNAase vào mẫu, lắc đều trờn mỏy

6 Ủ ở 37oC trong 30 phút

7 Lấy tube ra cho vào đá vụn hoặc cho vào ngăn đá trong tủ lạnh để trong 10 phút

8 Thêm 250μl dung dịch tủa Protein MPC (MPC Protein Precipitation Reagent) vào 450μl dung dịch bệnh phẩm ở bước (7) Lắc đều trờn mỏy lắc 10 giây.

9 Ly tâm tube ở 12000 vũng/phỳt x 10 phút

10.Chuyển cẩn thận phần nước nổi sang 1 ống eppendorf 1,5ml sạch khác, bỏ phần cặn

11.Thêm 600μl isopropanol, lắc đều xuôi ngược 40 lần

12.Ly tâm tube ở 12000 vũng/phỳt x 10 phút ở nhiệt độ 4oC

13 Hút bỏ nhẹ nhàng phần nước nổi, tránh làm bong phần DNAtủa màu trắng

14 Cho 500μl Ethanol 75%, lắc đều trờn mỏy lắc 1 phút Ly tâm tube ở 12000/phút x10 phút ở nhiệt độ 4oC Hút bỏ nhẹ nhàng phần nước nổi

15 Nhắc lại (14) thêm một lần Hút bỏ hoàn toàn phần nước nổi

* Giải trình tự gen cho vùng gen ITS

- Tiến hành chạy PCR khuếch đại vùng gen ITS

Các thành phần tham gia phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tương ứngcủa vùng gen ITS theo Ferrer và cộng sự [29], hướng dẫn của bộ sinh phẩmMastermix (Mỹ)

Nước đã khử ion: 8,5 μlPCR mastermix: 12,5μlPrimer 1(2,5 mM): 0,5 μlPrimer 2 (2,5mM): 0,5 μlTổng cộng: 22,0 μlCho vào 3μl DNA khuôn mẫu vừa táchTổng thể tích phản ứng là 25 μl

2μl loading dye + 10μl sản phẩm PCR cho vào mỗi giếng

Điện di 120V trong 30-40 phút bằng bộ điện din gang Horizonđ58(Gibco-BRL)

Nhuộm: bản gel sau khi chạy điện di nhuộm trong dung dịch Ethidiumbromide trong 15-20 phút Vớt ra ngâm vào nước trong 5 phút

Đọc kết quả: Sử dụng máy soi gel Wealtec Corp Model MD-20 (USA).Kích cỡ sản phẩm PCR: 550bp

-Đo nồng độ DNA của sản phẩm PCR

Sử dụng máy Bio photometer (Đức) để đo

Tube chứng: 50μl dung dịch PBS hoặc nước cất

Tube mẫu: 5μl sản phẩm PCR + 45μl dung dịch PBS hoặc nước cất

Đo ở bước songs260 nm: 1 đơn vị = 50 μg/ml

Đọc kết quả: Lượng DNA có trong mẫu (μg/ml) x10 x103/103 (μl) = ng/μl(x 10: độ pha loãng 10 lần, x103/103: đổi từ đơn vị μg/ml sang ng/μl).

-Giải trình tựu gen cho vùng ITS

+Chạy phản ứng cho giải trình tự

Sử dụng bộ kít Dyeđ XTerminator (Mỹ) Pha mix theo hướng dẫncủa bộ kít:

Big Dyeđ Terminator (Ready mix) v 3.1 cycle sequencing RR-100: 4μlBig Dyeđ Terminator v 1.1, v 3 15X sequencing buffer: 2μlPrimer: 1μlDNA template: 2,5μlNước khử ion: 10,5μlTổng thể tích phản ứng: 20μl+ Tinh sạch sản phẩm

Sử dụng kít Big DyeTM Purification kit (Mỹ) để tinh sạch

Cho vào mỗi tube PCR phản ứng có thể tích 20μl (sản phẩm PCR cho giảitrình tự gen) 2 dung dịch sau:

SAMTM solution: 90 μl

X TerminatorTM Solution (Big Dye X): 20μl

Sauk hi cho 2 dung dịch trên vào, lắc thật kỹ trong 30 phút bằng máy

Pha 170- 200 μl Hi-DiTM Formamid vào 1 tube MatrixStandard và lắc cho đều.

Ủ ở 95oC trong 2 phút Sau đó lấy ra ngâm vào đá

Cho vào giếng chứng 20μl

- Chạy giải trình tự gen trờn mỏy ABI PRISM 3130 (Mỹ) và phân tích kếtquả dựa vào phần mềm BLAST có đối chiếu với Genbank để xác địnhcác chi và / hoặc loài của nấm

2.5 Phân tích số liệu

Các số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm 16.0 Sự khácbiệt giữa 2 tỷ lệ được đánh giá bằng test χ2 Giá trị p≤ 0,05 được coi làkhác biệt có ý nghĩa thống kê

2.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại:

- Bệnh viện Mắt Trung ương: năm 2008 (lấy bệnh phẩm, thu thập thôngtin bệnh nhân, nuôi cấy)

- Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội từ 1008-2010 (Giữ chủng,tách chiết DNA)

- Khoa xét nghiệm Viện Các Bệnh Truyền Nhiễm và Nhiệt Đới QuốcGia: từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011 (Giải trình tự gen)

2.7 Tiến độ thực hiện

- 3/2011: Thông qua đề cương

- 3-6/2011: Tiến hành giải trình tự gen

- Tháng 6 xử lý số liệu

- Tháng 7-8 viết luận văn

- Tháng 9 bảo vệ luận văn