Đánh giá tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa cúm gia cầm a h5 a h7 và một số yếu tố liên quan ở người buôn bán giết mổ gia cầm tại các chợ ở hà nội năm 2017

Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu và tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7 .... “Đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ HIỀN

ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƯỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ

GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ HIỀN

ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG ĐẶC HIỆU VI RÚT CÚM MÙA, CÚM GIA CẦM (A/H5, A/H7) VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN Ở NGƯỜI BUÔN BÁN, GIẾT MỔ

GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ Ở HÀ NỘI NĂM 2017

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG VŨ MAI PHƯƠNG

PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này tôi xin trân trọng cảm ơn:

Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Vi rut, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Thị Quỳnh Mai, Viện phó Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người đã giúp tôi có định hướng đúng đắn và phương pháp luận khoa học trong nghiên cứu Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Hoàng Vũ Mai Phương, Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi tới khi hoàn thiện luận văn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có được kết quả như ngày hôm nay Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi kiến thức chuyên ngành hữu ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh Vật học, Khoa Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, cho tôi những kiến thức bổ ích

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, ThS Lê Thị Thanh

và các anh chị đồng nghiệp PTN Cúm, PTN Các Vi rút đặc biệt đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2020

PHẠM THỊ HIỀN

LỜI CAM ĐOAN

Là thành viên trong nhóm thực hiện nghiên cứu, được sự đồng ý của trưởng nhóm nghiên cứu, tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

HỌC VIÊN

PHẠM THỊ HIỀN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3

1.1 Vi rút cúm 3

1.1.1 Đặc điểm vi rút cúm 3

1.1.2 Kháng nguyên và kháng thể 5

1.1.3 Tính đa dạng của vi rút cúm 7

1.1.4 Độc lực của vi rút cúm 7

1.2 Nguồn lây nhiễm 9

1.3 Đường lây và cơ chế lây truyền 10

1.4.Phương pháp phân tíchchuẩn đoán vi rut cúm………11

1.4.1 Phương pháp sinh học phân tử……… ……….11

1.4.2 Phương pháp xác định trình tự gen……… 11

1.4.3 Phươngpháp phân lập vi rút……… 13

1.4.4 Phươngpháp phát hiện kháng thể………13

1.5 Phòng bệnh và điều trị 14

1.6 Các yếu tố liên quan tới nhiễm cúm gia cầm 15

1.7 Tình hình nhiễm cúm tại Việt Nam và trên thế giới 17

CHƯƠNG 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2.1.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 20

2.2 Phương pháp 21

2.2.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) 22

2.2.2 Kỹ thuật trung hòa vi lượng 29

2.3 Phân tích số liệu 36

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu và tỷ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7 37

3.1.1 Đặc điểm chung quần thể nghiên cứu 38

3.1.2 Các hoạt động và kinh nghiệm làm việc của người tham gia nghiên cứu 39

3.1.3 Các hoạt động tiếp xúc và bảo vệ cá nhân với gia cầm ốm, chết 42

3.1.2 Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa 45

3.1.3 Tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm gia cầm A/H5 và A/H7 48

3.2 Các yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm 52

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới (n=202) 38

Bảng 3.2 Công việc của đối tượng nghiên cứu (n=202) 39

Bảng 3.3 Kinh nghiệm làm việc của đối tượng tham gia nghiên cứu 40

Bảng 3.4 Thâm niên và thời gian tiếp xúc với gia cầm (n=202) 40

Bảng 3.5 Người tham gia nghiên cứu tiếp xúc với gia cầm ốm chết 42

Bảng 3.6 Các biện pháp bảo vệ cá nhân và tần suất sử dụng khi tiếp xúc với gia cầm sống (N=202), gia cầm ốm/chết (N=46) 44

Bảng 3.7 Tỉ lệ người có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa 45

Bảng 3.8 Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo từng phân typ 47

Bảng 3.9 Phân bố các trường hợp dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 và A/H7 theo huyện (N=202) 48

Bảng 3.10 Hiệu giá kháng thể đặt hiệu kháng vi rút cúm A/H5 clade 2.3.2.1 và A/H5 clade 2.3.4.4 bằng phương pháp HI và MN 48

Bảng 3.11 Số mẫu dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 51

Bảng 3.12 Sự phân bố tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 theo yếu tố địa điểm,tuổi, giới (N=202) 52

Bảng 3.13 Mối liên quan giữa đặc điểm tiếp xúc với gia cầm và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 (N=202) 54

Bảng 3.14 Mối liên quan giữa loại công việc và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 54

Bảng 3.15 Mối liên quan giữa việc tiếp xúc với gia cầm ốm, chết và tình trạng huyết thanh có kháng thể kháng vi rút cúm A/H5 55

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion vi rút cúm 4

Hình 1.2 Sự lưu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ 9

Hình 1.3 Phân típ cúm A ( HA& NA) 10

Hình 1.4 Vi rút cúm lưu hành theo phân typ tại miền Bắc Việt Nam, 2006-2018 17

Hình 2.1 Qui trình đánh giá tỉ lệ kháng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7) 21

Hình 2.2 Hình ảnh minh hoạ sự ngưng kết và không ngưng kết của hồng cầu ngựa 24

Hình 2.3 Sơ đồ các bước chuẩn độ ngược 27

Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng trung hòa vi lượng 32

Hình 3.1 Phân bố người tham gia nghiên cứu theo tuổi và giới 39

Hình 3.2 Số ngày tiếp xúc trung bình trên một tháng 41

Hình 3.3 Tỉ lệ người có kháng thể kháng vi rút cúm mùa theo địa điểm 46

HA Hemaglutination Assay( Phản ứng ngưng kết hồng cầu )

HI Hemaglutination Inhibition test ( Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu) TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới ( World Health Oganization )

TPCK L-1- tosyllamido-2- phenylethyl chloromethyl ketone

MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells ( tế bào thận chó thường trực )

MỞ ĐẦU

Vi rút cúm là tác nhân chính gây ra các vụ dịch cúm hàng năm tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với tỷ lệ mắc và tử vong cao Lịch sử đã ghi nhận các vụ đại dịch cúm xảy ra trong thế kỷ XX như đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 (A/H1N1), đại dịch cúm châu Á năm 1957 (A/H2N2), đại dịch cúm Hồng Kong năm 1968 (A/H3N2) và đặc biệt là đại dịch cúm A/H1N1pdm xuất hiện năm 2009 tại rất nhiều quốc gia và các vùng lãnh thổ Chim hoang dã và thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng) được chứng minh là các vật chủ lây nhiễm tự nhiên của vi rút cúm A Do

đó, vi rút cúm không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh ở mức nhẹ cho các loài này Tuy nhiên, một số biến thể của vi rút cúm gia cầm mang độc lực cao thuộc các phân typ A/H5 hoặc A/H7 (bộ gen có sự trao đổi và tích hợp) có khả năng thành dịch bệnh Trong quần thể gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút…), vi rút có khả năng nhiễm và gây chết hoàng loạt trên đàn gia cầm, gây thiệt hại lớn cho nông dân Qua quá trình tiếp xúc trực tiếp, vận chuyển, giết mổ gia cầm bệnh, con người có khả năng bị lây bệnh chéo thông qua hạt khí, chất thải của gia cầm, bề mặt của các dụng cụ (đồ dùng cho ăn, giết mổ) có chứa vi rút Do vậy, nguy cơ lây nhiễm vi rút cúm từ động vật sang người luôn thường trực, đặc biệt qua quá trình tiếp xúc trực tiếp với gia cầm và thuỷ cầm bị bệnh

Tại Việt Nam, vi rút cúm A/H5N6 đã được xác định lưu hành trên gia cầm từ 2013-2014, vi rút A/H7N9 hiện tại chưa xuất hiện và cho đến nay, chưa có trường hợp nhiễm cúm A/H5N6 và A/H7N9 trên người tại Việt Nam Tuy nhiên, việc giao thương, buôn bán gia cầm tại biên giới phía Bắc chưa được kiểm soát chặt chẽ làm nguy cơ vi rút cúm gia cầm xâm nhập vào Việt Nam từ Trung Quốc là rất cao Việc xác định sự xuất hiện của vi rút thông qua đáp ứng kháng thể đã được thực hiện trong các năm 2011 và 2014 với sự hỗ trợ của Tổ chức Y tế thế giới Đây là những nghiên cứu quan trọng và có ý nghĩa trong việc phát triển vacxin cúm mùa và vacxin cúm gia cầm trên người trong tương lai Xuất phát từ những lí do trên, chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7) và một số yếu tố liên quan ở người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017” nhằm phát hiện và đưa ra những thông số

nghiên cứu quan trọng trong công tác điều tra dịch bệnh cúm tại Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xác định một số đặc điểm của quần thể nghiên cứu, đánh giá tỉ lệ huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5 hoặc A/H7

2 Mô tả một số yếu tố liên quan đến khả năng phơi nhiễm với vi rút cúm gia cầm

ở người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ ở Hà Nội năm 2017

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm

1.1.1 Đặc điểm vi rút cúm

Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae Đây là nhóm vi rút có giải phổ vật chủ

rộng, được phân chia thành nhiều phân nhóm khác nhau dựa trên hai loại protein bề mặt của vi rút là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Hai

loại protein này có trên bề mặt capsid của hạt vi rút [41] Họ Orthomyxoviridae đã

được phát hiện và chia thành 4 nhóm vi rút chính gồm [53]:

 Nhóm vi rút cúm A (Influenza A)

 Nhóm vi rút cúm B (Influenza B)

 Nhóm vi rút cúm C (Influenza C)

 Nhóm Thogoto Nhóm vi rút cúm A có 18 phân típ (subtype) HA từ H1 đến H18 và 11 phân típ

NA từ N1 đến N11[54] Về mặt lý thuyết, sự tái tổ hợp giữa các phân típ HA và NA

sẽ tạo ra nhiều phân típ khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh Mặt khác, vi rút cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen

NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ Vi rút cúm A là nguyên nhân chính gây ra các đại dịch cúm trên toàn cầu Vi rút cúm B được phân loại thành hai dòng kháng nguyên phân biệt vào những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng B/Yamagata (B/Yamagata/16/88- lineage viruses) dựa trên đặc tính kháng nguyên của glycoprotein hemagglutinin bề mặt Tương tự vi rút cúm A, cúm B có thể được phân loại thành nhóm và phân nhóm phụ

Vi rút cúm B thường thay đổi chậm hơn về dặc tính di truyền và kháng nguyên so với cúm A Các nhóm vi rút khác nhau bởi các kháng nguyên bề mặt capsid, ở vi rút cúm

A và B là Hemagglutinin (HA), ở vi rút cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP) Vi rút cúm B gây bệnh chủ yếu trên người và hải cẩu, vi rút cúm C gây bệnh chủ yếu trên con người và một số loài lợn Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm A gồm những thông tin sau:A /viết tắt vật chủ( nếu là động vật)/ nơi phân lập /mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập( có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và NA của chủng vi rút)

ví dụ: A/swine/Taiwan/1/70 (H3N2)[52]

Danh pháp quốc tế qui định cho vi rút cúm B gồm những thông tin sau: B/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân lập/năm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001) Do sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm B hầu như không quan sát được nên danh pháp quốc tế của vi rút cúm B không có sự tham gia cảu kháng nguyên bề mặt HA và NA như đối với danh pháp quốc tế được qui định cho vi rút cúm A

Vi rút cúm là căn nguyên gây ra bệnh cúm, hội chứng cúm là bệnh cấp tính đường hô hấp với triệu chứng chủ yếu là sốt cao đột ngột, sổ mũi, nhức đầu, uể oải, mệt mỏi, đau toàn thân Bệnh lây lan nhanh và có thể gây thành dịch Nếu không được kiểm soát tốt, bệnh cúm có thể lan rộng ra nhiều nước gây đại dịch

Hình thái, cấu trúc và đặc điểm sinh học phân tử vi rút cúm:

Vi rút cúm có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính trung bình từ 80

-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi kéo dài tới 2000nm Khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dalton Một vi rút chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% \ carbonhydrate

Vi rút có cấu tạo gồm: vỏ (capsid), vỏ ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi

đơn, âm Mỗi sợi ARN liên kết với các protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức

hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mô hình a hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và

a

b

phiên mã Phức hệ này được bao bọc bởi màng protein nền và lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ

Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của vi rút Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6

nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: Haemaglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) [9]

1.1.2 Kháng nguyên và kháng thể

Các kháng nguyên quan trọng của vi rút cúm nằm ở phần lõi và phần vỏ ngoài Phần lõi của vi rút cúm chứa một phân tử ARN và protein tương ứng với kháng nguyên S (Soluble), kháng nguyên S không có ý nghĩa với cơ chế miễn dịch bảo vệ của cơ thể Phần vỏ ngoài chứa hai kháng nguyên quan trọng là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), đây là hai kháng nguyên quan trọng để phân loại vi rút cúm Hai kháng nguyên HA và NA mang tính đặc hiệu típ (HA), thứ típ (NA) Hiện nay đã phát hiện được 18 cấu trúc kháng nguyên H, ký hiệu từ H1 đến H18 và 11 cấu trúc kháng nguyên N ký hiệu từ N1 đến N11[54]

Kháng nguyên hemagglutinin HA còn gọi là yếu tố ngưng kết hồng cầu (NKHC) Kháng nguyên này giúp vi rút bám vào tế bào niêm mạc đường hô hấp, gây hiện tượng hòa màng, từ đó xâm nhập vào trong tế bào Nó có thể bám vào màng hồng cầu một số loài động vật (gà, chuột lang, ngựa ) làm những hồng cầu này bị dính lại với nhau gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu mà mắt thường có thể nhìn thấy rõ ràng, nhờ đó có thể phát hiện sự có mặt của vi rút Kháng thể tương ứng với HA có tác dụng bảo vệ cơ thể, đặc hiệu cho từng phân typ cúm Sự có mặt của kháng thể đặc hiệu HA làm cho vi rút mất khả năng bám vào tế bào niêm mạc đường hô hấp, do đó mất hoặc giảm khả năng gây bệnh Kháng thể tương ứng với kháng nguyên HA còn gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (NNKHC) vì nó làm cho vi rút mất khả năng bám vào hồng cầu (ức chế hiện tượng NKHC) Dựa vào đó có thể thực hiện phản ứng NNKHC nhằm xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng từng phân typ vi rút cúm hoặc xác định các phân typ vi rút cúm từ

chủng phân lập được trên tế bào Kháng nguyên neuraminidase NA (kháng nguyên trung hòa) có hoạt tính enzyme làm loãng chất nhầy ở đường hô hấp, làm vi rút tiếp xúc dễ dàng hơn với tế bào của niêm mạc, giúp cho vi rút xâm nhập tế bào dễ dàng Trong quá trình nhân lên của vi rút, enzyme này giúp cho sự lắp ráp các thành phần RNA và protein của vi rút thành virion và giúp cho virion thoát ra khỏi tế bào dễ dàng thông qua hoạt tính enzyme phân tách HA khỏi các thụ thể trên bề mặt tế bào niêm mạc Kháng thể tương ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể, nhưng tác dụng này không mạnh bằng tác dụng bảo vệ của kháng thể ngăn NKHC Nếu cơ thể chỉ có kháng thể kháng N thì vẫn có khả năng mắc bệnh khi nhiễm vi rút, tuy rằng bệnh có nhẹ đi

Các phản ứng của kháng thể đối với vi rút cúm đã được nghiên cứu từ lâu dựa vào việc phân tích kháng thể được tạo ra từ tế bào B đơn của con người [33] Khi dịch cúm xảy ra lần đầu tiên, hệ thống miễn dịch của con người chưa đáp ứng được

và thành các đợt dịch lớn Năm 2009, vi rút H1N1 theo mùa đã xuất hiện ở người nhưng vi rút này có các glycoprotein bề mặt H1 và N1 khác biệt về mặt kháng nguyên Do thiếu khả năng miễn dịch quần thể, vi rút mới nổi này lây lan nhanh chóng trong cộng đồng Tuy nhiên, trong vài năm, chúng đã trở thành vi rút cúm theo mùa, sau đó gây dịch bệnh với tỷ lệ tử vong thấp hơn so với đại dịch [17] Phản ứng kháng thể do lây nhiễm tự nhiên thường rộng hơn và tồn tại lâu hơn phản ứng kháng thể do tiêm chủng gây nên, tuy nhiên cơ chế này chưa rõ ràng Do đó, các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu cơ chế này, khám phá được cơ chế này sẽ giúp cải thiện các loại vaccine hiện tại Theo Florian K, ông đã theo dõi phản ứng của kháng thể đối với vaccine cúm hiện nay, phản ứng của kháng thể với kháng nguyên vi rút cúm gia cầm Từ đó đưa ra sự khác biệt giữa lây nhiễm tự nhiên và tiêm chủng, khác nhau về phản ứng kháng thể mà chúng tạo ra và cách những phản ứng này bảo vệ chống lại sự lây nhiễm trong tương lai, phát triển vaccine vi rút cúm thế hệ tiếp theo [22] Hiểu rõ hơn về cơ chế phản ứng kháng nguyên- kháng thể của vi rút cúm sẽ thúc đẩy phát triển các loại vaccine mới kháng vi rút hiệu quả hơn, nhất là trong tình trạng kháng thuốc nhiều như hiện nay

1.1.3 Tính đa dạng của vi rút cúm

Một đặc điểm rất quan trọng là các vi rút cúm thuộc típ A có tính đa dạng cao, khi hiện tượng trôi (drift) và trượt (shift) của kháng nguyên xảy ra, điều này giúp vi rút cúm A có khả năng thoát khỏi cơ chế bảo vệ của vật chủ [10] Những thay đổi dần dần của kháng nguyên gọi là đặc tính trôi dạt của kháng nguyên Nguyên nhân

do các đột biến tích tụ trong quá trình sao chép làm thay đổi khả năng bám dính của phức hợp polymerae trên kháng nguyên, từ đó dẫn đến vô số biến thể mới được tạo

ra, cho phép vi rút thích nghi với những thay đổi của môi trường [16] Ngoài ra, sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A (reassortant) xảy ra khi có 2 vi rút gây nhiễm trên cùng một tế bào, kết quả tạo ra vi rút mới- tiềm tàng vi rút đại dịch:

 Năm 1933: lần đầu tiên phân lập được vi rút cúm, sau này được gọi là vi rút cúm A0, có công thức kháng nguyên vỏ (H0N1)

 Năm 1947: xuất hiện A(H1N1)

 Năm 1957: xuất hiện A(H2N2)

 Năm 1968: xuất hiện A/ Hồng Kông (H3N2)

 Năm 2002: xuất hiện A/Asia (H5N1) và mỗi năm đều tiếp tục có sự thay đổi ít nhiều

 Năm 2009: xuất hiện A/pandemic H1N1/09

 Năm 2014: các ca nhiễm A/H5N6 tại Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Công, Myanmar và Việt Nam

Đại dịch cúm thường do vi rút cúm típ A khi có những thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của vi rút cúm A Vi rút cúm típ

B không có những thay đổi lớn kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng Vi rút cúm típ C gây bệnh không điển hình và chỉ giới hạn trong quần thể nhỏ, không gây dịch lan rộng

1.1.4 Độc lực của vi rút cúm

Đối với các vi rút cúm A gây bệnh trên gia cầm, độc lực của vi rút cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai

loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [21] HPAI là loại vi rút cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng Vi rút loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà

và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [7, 40] Nhóm nghiên cứu của Abente E J và cộng sự đã chứng minh vi rút cúm A H5N1 mang độc lực cao vẫn là mối quan tâm trong cộng đồng do tỉ lệ tử vong cao Nghiên cứu của nhóm đã xác định đặc tính lây nhiễm và khả năng lây truyền của H5N1 có nguồn gốc từ nhóm độc lực cao và H1N1 pdm09, từ đó nhấn mạnh tầm quan trọng việc giám sát bệnh cúm trong cộng đồng [6] LPAI là loại vi rút khi phát triển trong

cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ Đây là loại vi rút lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh

trong tự nhiên của vi rút cúm A [Error! Reference source not found., Error!

Reference source not found.] Vi rút cúm gia cầm độc lực thấp LPAI ở các loài

chim hoang dã rất quan trọng vì chúng có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của vi rút gia cầm độc lực cao HPAI hoặc hình thành các chủng vi rút có khả năng thích nghi với người với khả năng phát tác thành đại dịch [11] Vi rút cúm A có thể biến đổi từ cúm gia cầm độc lực thấp thành vi rút ở gia cầm có độc lực cao gây tử vong Các vi rút kháng thuốc gần đây bao gồm hầu hết cúm A H1N1 theo mùa Từ năm 2008-

2009, cúm A/H1N1 mang đột biên H254Y - đột biến trên gen mã hóa neuraminidase (NA) gây kháng thuốc oseltamivir (TamifluH) [27] Nghiên cứu này

đã chứng minh rằng vi rút mới có thể hình thành từ việc pha trộn một số chủng và thích nghi với các vật chủ mới, do đó ẩn chứa hiểm họa về đại dịch cúm mới

Để phân loại vi rút cúm, các thí nghiệm thực hiện gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch Sau dó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI) Điểm tối đa là 3 điểm và đó là vi rút có độc lực cao nhất Theo quy định của Tổ chức thú y thế giới (OIE), vi rút cúm nào có chỉ số (điểm) IVPI từ 1,2 trở lên là thuộc loại có độc lực cao - HPAI và thấp hơn 1,2 là thuộc loại độc lực thấp – LPAI [35] Các vụ dịch lớn đều do vi rút HPAI gây ra Các loạt vi rút cúm gia cầm gây ra các vụ dịch lớn ở gia cầm thường là vi rút có kháng nguyên H5, H7

và H9 Riêng với H5 và H7 thường bắt nguồn từ vi rút độc lực thấp, sau quá trình lây truyền trên gà và chim cút độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn Đối với các vi rút cúm thông thường gây bệnh trên người theo mùa, các vi rút có khả năng gây đột biến trên HA, làm thay đổi khả năng bám dính với thụ thể trên tế bào chủ, gây tình trạng tăng nặng trên lâm sàng của bệnh nhân

1.2 Nguồn lây nhiễm

Qua các trường hợp bệnh được ghi nhận, nguồn truyền nhiễm của bệnh cúm bao gồm: người bị bệnh, người mang mầm bệnh không triệu chứng đối với các vi rút cúm mùa; các loại gia cầm, thủy cầm, các loại chim di cư đối với các vi rút cúm gia cầm Chim hoang dã nhiễm cúm gia cầm nhưng không chết hàng loạt, chúng mang vi rút cúm gia cầm đi theo đường di cư Do đó, các nhà khoa học cho rằng các loài chim hoang dã là loài phân tán vi rút cúm gia cầm (Hình 1.2)

Hình 1.2 Sự lưu hành của phân típ cúm A trên mỗi vật chủ

Nguồn:

Host-range-of-influenza-A-virus-Notes-The-IAV-HA-subtypes-isolated-from-each-host_fig1_316283274[55]

Bệnh cúm gia cầm đã được xác định nguồn lây nhiễm ban đầu là từ các loài thủy cầm di trú, đây là ổ chứa tự nhiên của vi rút, thường không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho chim và thuỷ cầm Tuy nhiên chúng thường đề kháng với vi rút, chúng mang vi rút nhưng không bị bệnh, các gia cầm nuôi không đề kháng với vi

rút, do đó tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với chim di trú là nguyên nhân chính của dịch cúm Vi rút cúm gia cầm có thể lây nhiễm trực tiếp cho con người khi tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và các sản phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh [25] Một số biến thể cường độc (H5, H7) xuất hiện gần đây do khả năng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở chim và gia cầm [24]

Các phân typ cúm A đã được xác định các nguồn lây nhiễm cụ thể như: cúm AH1N1 xuất hiện ở người, gia cầm và lợn; cúm A H3N2 xuất hiện ở người, vịt, lợn, ngựa, cúm A H5 xuất hiện ở người, gia cầm, lợn (Hình 1.3)

Hình 1.3 Phân típ cúm A (HA& NA)

Nguồn:

Known-hosts-for-different-HA-and-NA-influenza-A-virus-subtypes_tbl1_43521028[56]

1.3 Đường lây và cơ chế lây truyền

Vi rút cúm lây truyền nhanh chóng từ cơ thể bệnh sang cơ thể khỏe mạnh bằng đường hô hấp thông qua các hạt aerosol có chứa vi rút trong không khí và/hoặc qua đường tiêu hóa do tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, đất,

nước, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi bị ô nhiễm (dịch bài xuất, xác vật bệnh, chất thải) của cơ thể bệnh [7, 32] Người chăm sóc, giết mổ, mua bán hoặc vận chuyển gia cầm là những đối tượng có nguy cơ nhiễm bệnh cao do thường xuyên tiếp xúc với các chất dịch bài tiết, chất thải của gia cầm, nhất là trong trường hợp đối tượng không có thiết bị phòng hộ, chưa có cảnh báo về dịch của các cơ quan có thẩm quyền

Vi rút cúm có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm Khả năng gây bệnh của vi rút cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng vi rút Các vi rút cúm gia cầm độc lực thấp không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng độc lực cao (H5, H7) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm trên gia cầm, có thể lây sang người [47] Với hàng rào vật chủ, vi rút cúm gia cầm chưa thể lây lan mạnh từ gia cầm sang người Tuy nhiên, khi vi rút cúm gia cầm lây bệnh và thích nghi trên vật chủ là lợn, nơi tế bào hô hấp có cả 2 loại thụ thể α2,3 và α2,6, thì khi ấy khả năng vi rút cúm gia cầm lây lan rộng là có thể xảy ra

1.4 Phương pháp phân tích chuẩn đoán vi rút cúm

1.4.1 Phương pháp sinh học phân tử

Phản ứng PCR/RT-PCR: Vi rút có vật liệu di truyền là ARN cần enzyme phiên

mã ngược để tổng hợp cADN và ADN polymerase tổng hợp ADN từ cADN Vi rút có vật liệu di truyền là ADN cần enzyme ADN polymerase để tổng hợp ADN Ưu điểm của phương pháp này là có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua khả năng phát hiện đoạn ADN/ARN đặc hiệu trong mẫu bệnh phẩm

Phản ứng Realtime PCR/RT-PCR: sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh

quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN/ARN của vi rút trong mẫu bệnh phẩm theo thời gian thực Ưu điểm của phương pháp là theo dõi tiến trình phản ứng và biết được lượng ADN tạo thành ở từng thời điểm, độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm

1.4.2 Phương pháp xác định trình tự gen

Hiện nay, giải trình tự gen được chia thành 4 thế hệ và liên tục được cập nhật Thế hệ 1: Theo phương pháp của Frederick Sanger, dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi ADN bằng dideoxynucleotide Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc –OH ở vị trí carbon 3’ và được thay bằng –H, đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau Những đoạn ADN được điện di qua mao quản từ nhỏ tới lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser Phân tích kết quả: sử dụng phần mềm ADNStar (nối các phân đoạn nucleotide với nhau tạo thành một đoạn gen hoàn chỉnh, so sánh các đoạn gen của vi sinh vật với các vi sinh vật lưu hành trong khu vực và trên thế giới) sử dụng phần mềm MEGA (xây dựng cây gia hệ)

Áp dụng giải trình tự gen thế hệ 1, mẫu bệnh phẩm nhiễm cúm cần được thực hiện khuếch đại qua quá trình phân lập

Thế hệ 2: Sử dụng các phương pháp như: Pyrosequencing, Ion Semiconductor, Illumina Trong đó, hệ thống giải trình tự Illumina là hệ thống xác định trình tự gen thành công và phổ biến nhất hiện nay Illumina sử dụng kỹ thuật gọi là cầu khuếch đại nhằm nhân bản các chuỗi ADN đơn được cố định trên bản flow cell Các trình tự này

sẽ tự đọc thông qua các nucleotide được đánh dấu bằng huỳnh quang, tương tự trong phương pháp Sanger Tại Trung tâm Cúm - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương hiện đã thực hiện phương pháp này, áp dụng đồng thời cho việc giải trình tự gen vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và vi rút cúm đã được nhân lên sau quá trình phân lập

Thế hệ 3: Giải trình tự dựa trên các kỹ thuật phân tích tín hiệu đơn phân tử, phân tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp 1 chuỗi DNA trong lỗ nano

Thế hệ 4: Giải trình tự tức thời dựa trên tín hiệu điện phân tử Phương pháp này

sử dụng dòng điện để vận chuyển một mẫu chưa biết qua một lỗ đường kính chỉ 1nm Một protein nanopore được gắn lên một màng polymer không dẫn điện Hệ thống này luôn chứa một dung dịch điện ly – khi đặt vào một điện trường không đổi, một dòng điện có thể xuất hiện trong hệ thống Độ lớn của cường độ dòng điện qua bề mặt lỗ nano phụ thuộc vào kích thước của lỗ nano cũng như thành phần của ADN/ARN trong

lỗ nano đó Khi đủ gần lỗ, các mẫu làm thay đổi đặc trưng về cường độ dòng điện qua

bề mặt lỗ Tổng điện tích qua lỗ bằng tích phân mặt của cường độ dòng điện chảy qua

bề mặt lỗ giữa khoảng thời gian T1 và T2

1.4.3 Phương pháp phân lập vi rút

Phương pháp phân lập vi rút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát vi rút nói chung Mẫu bệnh phẩm lâm sàng lý tưởng là mẫu được lấy trong khoảng 5 ngày đầu từ khi khởi phát bệnh Chủng vi rút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm vi rút học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính kháng nguyên để có thể dự báo sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho phép lựa chọn thành phần một số vacxin Việc phân lập vi rút trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, tuy nhiên thời gian phân lập kéo dài (thường là 3 tuần) Đối với vi rút cúm, phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vacxin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn vi rút với hiệu giá cao đối với sản xuất vacxin cúm

1.4.4 Phương pháp phát hiện kháng thể

Đây là phương pháp phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút trong huyết thanh bệnh nhân Có ba phương pháp cơ bản được sử dụng là: phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và phản ứng trung hòa vi lượng (MN) Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút hoặc sự biến động kháng thể giữa hai mẫu huyết thanh

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): kháng thể (KT) kháng vi rút khi kết

hợp với kháng nguyên chuẩn (vi rút chuẩn) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu

Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể đánh giá kháng thể IgG lưu hành trong quần thể hay đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vacxin với một số lượng mẫu lớn Đối với

vi rút cúm, phần lớn KT kháng HA đều được phát hiện bằng phản ứng HI, do đó đây là phản ứng đặc hiệu phân typ đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm Tuy nhiên, theo một số nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ đặc hiệu thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng (MN)

Phản ứng trung hòa vi lượng (MN): vi rút được ủ cùng với huyết thanh (pha

loãng bậc 2) ở 37°C trong 1 giờ tạo điều kiện cho kháng thể trung hòa (nếu có) trong huyết thanh sẽ trung hòa vi rút Sau thời gian ủ, hỗn dịch vi rút- huyết thanh được ủ với

tế bào cảm thụ phù hợp Lượng vi rút còn lại không bị trung hòa bởi kháng thể trong huyết thanh sẽ gây nhiễm tế bào và tạo ra các tế bào hoại tử Dựa vào sự xuất hiện của các đám hoại tử để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa của mẫu huyết thanh

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 phương pháp để phát hiện và định lượng vi rút cúm có trong mẫu bệnh phẩm Đây là những phương pháp nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể trung hòa kháng đặc hiệu và đem lại kết quả chính xác cho nghiên cứu

1.5 Phòng bệnh và điều trị

Để điều trị và phòng ngừa một số loại cúm thông thường như cúm AH1N1, cúm AH3N2, các phòng nghiên cứu đã nghiên cứu ra một số loại thuốc điều trị cúm như: amantadine, rimantadine, oselramivira, zanamivir [8] Hiện nay, amantadine

và rimantadine không còn được sử dụng để điều trị bệnh cúm do tỷ lệ kháng thuốc cao Oseltamivira và zanamivir là hợp chất ức chế neuraminidase bằng cách cạnh tranh với vị trí enzyme hoạt động của vi rút, các neuraminidase giúp giải phóng virus khỏi tế bào bị nhiễm sau khi nhân lên Các hợp chất này đã được chứng minh

là có hiệu quả đối với bệnh dịch theo mùa và đại dịch Thuốc oseltamavir đã được

sử dụng rộng rãi đề điều trị bệnh cúm năm 2009 [15] Ngoài ra, tiêm vaccine cúm là cách bảo vệ hiệu quả nhất giúp phòng ngừa bệnh cúm mùa Theo tổ chức Y tế thế giới WHO, tiêm phòng vaccine làm giảm tỷ lệ tử vong do cúm đến 70-80% và hiệu lực bảo vệ lên tới 80-90% Hiệu quả của vaccine cúm bắt đầu suy yếu sau khoảng 6

tháng kể từ thời điểm tiêm, để phòng bệnh cúm mùa nên tiêm nhắc lại định kỳ mỗi năm một lần vaccine cúm mùa với thành phần kháng nguyên thay đổi hàng năm

1.6 Các yếu tố liên quan tới nhiễm cúm gia cầm

Có nhiều yếu tố liên quan tới nhiễm cúm gia cầm đã được xác định như vị trí địa lý, thời gian, thời tiết, lứa tuổi, tình trạng bệnh lý nền hoặc yếu tố di truyền Theo một nghiên cứu của Guerisi C và cộng sự, từ năm 2012-2017, nhóm nghiên cứu đã thu thập số liệu trên 6992 cá nhân tham gia điều tra và cho thấy yếu tố liên quan gây nguy cơ mắc cúm bao gồm: giới tính, độ tuổi, béo phì, sử dụng phương tiện giao thông công cộng và tiếp xúc với vật nuôi [18] Nữ giới cho thấy tỉ lệ ca có triệu chứng cúm cao hơn so với nam giới Trẻ em dưới 5 tuổi và từ 5-14 tuổi có tỉ lệ mắc cao hơn so với các lứa tuổi còn lại Trong một nghiên cứu khác của Steven Riley, tỷ lệ nhiễm lây nhiễm giảm đáng kể theo độ tuổi, độ tuổi 3-19 có tỉ lệ lây nhiễm là 39%, 20-39 tuổi là 8.9%, 40-59 tuổi là 5.3% và trên 60 tuổi là 0.77% Các thông số báo cáo cho thấy trẻ em gặp nhiều triệu chứng hơn người lớn [31] Trong đại dịch cúm A H1N1 năm 2009, số ca tử vong do nhiễm trùng tăng theo độ tuổi, từ 3-19 tuổi là 0.66 đến độ tuổi 60 trở lên là 220 Đến cuối tháng 1/2010, ước tính rằng

đã có 56% trẻ 3-19 tuổi đã bị lây nhiễm bởi vi rút cúm A H1N1 pdm 2009 Nghiên cứu tại Indonesia chỉ ra các yếu tố nguy cơ bao gồm mật độ dân cư, mật độ gia cầm, tình hình dịch cúm trên gia cầm trong khu vực sinh sống, mật độ đường xá (số km đường giao thông trên một km2), nguồn nước sử dụng [49]

Các khu vực khác nhau có đặc điểm thời tiết khác nhau cũng có liên quan tới tình trạng nhiễm cúm Kể từ khi xuất hiện cúm A H5N1 vào cuối năm 2003 tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm đã được xác định có liên quan tới hai hệ thống sông lớn là sông Hồng và sông Mê Kong vì đây là nơi có mật độ chăn nuôi vịt cao hơn so với các vùng khác Dịch cúm gia cầm H5N1 thường xuất hiện cuối tháng đông- xuân, khi thời tiết lạnh ẩm mưa phùn, vi rút có khả năng tồn tại lâu trong không khí Đây cũng là thời điểm một số loài chim di cư hoạt động nên khả năng phát tán vi rút sang khu vực khác rất cao Từ năm 2003 – 2005, các trường hợp mắc cúm H5N1 và

tử vong tập trung chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam, sau năm 2010 các ca H5N1 có xu hướng xảy ra ở biên giới giáp Campuchia ở phía Nam và các ca tử vong tập trung ở

khu vực đồng bằng sông Cửu Long [25] Tỷ lệ mắc cúm H5N1 cao nhất từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau [30] Tại Trung Quốc, các nhà nghiên cứu đã phân tích 350 trường hợp nhiễm H7N9 và 47 trường hợp H5N1 Kết quả cho thấy các ca nhiễm H5N1 chủ yếu xảy ra ở miền Nam, Trung và Tây Bắc của Trung Quốc, sự lây nhiễm H5N1 tương quan với khoảng nhiệt độ 2-22°C và áp suất khí quyển 980-

1025 kPa Sự lây nhiễm H7N9 tương quan với khoảng nhiệt độ 4-14°C và độ ẩm tương đối 65-95% [23]

Hiện nay, có ít báo cáo về yếu tố liên quan tới người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ đầu mối, chợ dân sinh Trong khi đó, người buôn bán, người giết

mổ gia cầm là những đối tượng tiếp xúc trực tiếp và thời gian tiếp xúc nhiều nhất với nguồn lây bệnh chính là gia cầm Trên thực tế, người giết mổ hiếm khi sử dụng công cụ bảo hộ lao động, điều này dễ tiềm ẩn nguy cơ dịch cúm gia cầm, nhất là chủng cúm A H5N1có thể lây qua người bằng đường hô hấp, tiếp xúc hoặc ăn gia cầm chết Đã có nhiều ổ dịch cúm được xác định là bùng phát từ các chợ bán gia cầm, chim, vịt trời Các yếu tố liên quan nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam được chỉ

ra bao gồm tiếp xúc trực tiếp (giết thịt, vận chuyển ) với gia cầm ốm hoặc chết (nguy cơ gấp 31 lần), có xuất hiện gia cầm ốm, chết trong hộ gia đình (nguy cơ gấp 7.4 lần) [13] Nghiên cứu tại Trung Quốc cũng cho thấy việc tiếp xúc trực tiếp với gia cầm ốm, chết (giết thịt, sờ, vận chuyển ) là yếu tố nguy cơ chủ yếu của nhiễm

vi rút cúm A/H5N1 với OR = 506.6; tiếp xúc gián tiếp vong vòng 1 mét với gia cầm

ốm, chết hoặc sản phẩm của gia cầm ốm, chết hoặc phân của gia cầm ốm, chết với

OR = 56.9; và ghé thăm chợ bán gia cầm với OR = 15.4 Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc chỉ ra mối liên quan giữa thời gian tiếp xúc với gia cầm trong một ngày

và tình trạng vệ sinh của chợ gia cầm Theo đó, thời gian tiếp xúc với gia cầm qua hoạt động buôn bán càng dài và tình trạng vệ sinh của chợ càng kém thì nguy cơ nhiễm vi rút cúm A càng cao Cụ thể là buôn bán gia cầm trên 10 giờ/ngày, bán nhiều loại gia cầm, không vệ sinh/khử khuẩn sau khi tiếp xúc với gia cầm là yếu tố nguy cơ của nhiễm vi rút cúm A/H5 [50] Do đó, thu thập và đánh giá số liệu trên các đối tượng người tiếp xúc với gia cầm, người giết mổ gia cầm tại các chợ sẽ cung

cấp tình hình bệnh cúm và ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm ra cộng đồng, ngăn chặn nguy cơ bệnh cúm thành đại dịch

1.7 Tình hình nhiễm cúm tại Việt Nam và trên thế giới

Tại Việt Nam, chương trình giám sát cúm Quốc Gia thực hiện từ 2006 đến nay

đã xác định được sự lưu hành của các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H3N2 và vi rút cúm B Đến năm 2018, có hai thời điểm cúm lưu hành được xác định gồm: tháng 2-tháng 3 với sự lưu hành của vi rút cúm B, tháng 10 - tháng 12 với sự lưu hành của

vi rút cúm A Các phân typ của vi rút cúm A lưu hành luân phiên theo năm, cụ thể

2016, 2018 phân tip A/H1N1pdm09 chiếm ưu thế, trong khi năm 2017 là phân tip A/H3N2 [5] Tại Việt Nam, năm 2019, số ca mắc cúm và tử vong do cúm thấp hơn

so với năm 2018, cụ thể, tháng 11/2019 ghi nhận 408907 trường hợp mắc cúm, 10 trường hợp tử vong (giảm 10.4% số mắc và giảm 2 trường hợp tử vong so với cùng

kỳ tháng 11/2018)[2] Các vi rút cúm mùa lưu hành tại Việt Nam có sự tương đồng cao với các chủng trong khu vực châu Á, Úc và New Zealand, chưa ghi nhận chủng cúm mới mang đột biến gen làm tăng độc tính hay kháng thuốc kể từ năm 2011(Số liệu do Trung tâm cúm Quốc gia cung cấp)

Hình 1.4 Vi rút cúm lưu hành theo phân typ tại miền Bắc Việt Nam,

2006-2018

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới và báo cáo về tình hình bệnh tật và

tử vong hàng tuần (MMWR) của Trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh Hoa Kỳ

(CDC), trong mùa cúm 2016 – 2017, bệnh cúm lưu hành ở mức độ vừa phải Vi rút cúm A/H3N2 chiếm ưu thế, 84,9% tại Mỹ, 76% tại Châu Âu Ngoài ra, vi rút cúm A/H1N1 pdm09, vi rút cúm B thuộc 2 dòng B/Yamagata và B/Victoria được báo cáo thường xuyên hơn từ cuối tháng 3 đến tháng 5/2017[38] Ở Châu Á, hoạt động của vi rút cúm năm 2017 là cúm AH3N2 và cúm B, A/H1N1pdm09 hoạt động trở lại vào cuối năm 2017[43]

Trong năm 2017, tại Việt Nam vi rút cúm gia cầm lưu hành trên gia cầm với 2 loại A/H5N1 và A/H5N6, trong đó A/H5N1 chiếm 1,76%, cúm A/H5N6 chiếm 0,84%, không có mẫu nào dương tính với A/H7N9 Tuy nhiên, vẫn tồn tạị nguy cơ dịch bệnh do cúm gia cầm như A/H7N9, A/H5N2, A/H5N8 phát sinh và lây lan trong thời gian tới do vận chuyển, buôn bán, tiêu thụ gia cầm và sản phẩm gia cầm nhập lậu[3] Vi rút cúm A/H5N6 và A/H7N9 đã xuất hiện trên gia cầm từ 2013-2014, nhưng hai vi rút này chưa xuất hiện trên người tại Việt Nam Một nghiên cứu thực hiện trên 3045 mẫu gia cầm khỏe mạnh thu thập tại các chợ ở tỉnh Thừa Thiên Huế năm 2014 xác định được sự lưu hành của vi rút cúm trong đó có 8 mẫu dương tính với A/H5N6 Các mẫu này được thu thập từ vịt, ngan và mẫu môi trường tại các chợ này Phân nhóm vi rút được xác định là 2.3.4.4, kháng nguyên xác định được không tương đồng với các vi rút đã lưu hành tại Việt Nam[12] Điều

đó cho thấy sự du nhập của phân nhóm vi rút mới từ các khu vực khác, có thể từ các quốc gia láng giềng do hoạt động buôn bán gia cầm với các nước này Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc cũng chỉ ra nguy cơ lây nhiễm vi rút cúm A/H7N9 sang các nước láng giềng bao gồm cả Việt Nam, tuy nhiên nguy cơ lây nhiễm từ người sang người vẫn được coi là thấp[44]

Năm 2014, Tổ chức y tế thế giới WHO ghi nhận ca nhiễm vi rút cúm A/H5N6 đầu tiên trên người ở Trung Quốc Tổng số 16 trường hợp được ghi nhận, trong đó 6 trường hợp tử vong, trường hợp cuối cùng được ghi nhận vào 1/12/2016 Đến nay, trên thế giới đã ghi nhận 17 trường hợp nhiễm vi rút cúm A/H5N6 trên người có tiền sử phơi nhiễm với gia cầm và đã có 10 trường hợp

tử vong [45] Các trường hợp nhiễm chủ yếu là người lớn với tiền sử phơi nhiễm với gia cầm [30] Dịch cúm A/H5N6 lan truyền mạnh trong quần thể

chim tại Trung Quốc, Nhật Bản, Đông Nam Á và đặc biệt là năm 2017 ghi nhận dịch lớn tại Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Công, Myanmar và Việt Nam Vi rút này thể hiện độc lực cao đối với các cá thể chim và được phân lập

từ cả gia cầm và chim hoang dại Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng về khả năng duy trì và lây truyền trực tiếp trong quần thể người [46]

Vi rút cúm A/H7N9 được ghi nhận lần đầu vào tháng 3 năm 2013 với sự lưu hành trong quần thể gia cầm tại Trung Quốc Tính đến tháng 9 năm 2017, có 1564 trường hợp nhiễm chủng vi rút này với 610 ca tử vong được ghi nhận tại Trung

Quốc, tỷ lệ tử vong là 39% [Error! Reference source not found.] Vi rút cúm độc

lực cao và độc lực thấp A/H7N9 đều được phát hiện ở chim ở Trung Quốc Phân tích của TCYTTG cho thấy số trường hợp nhiễm vi rút cúm A/H7N9 giảm vào các tháng mùa hè nhưng tổng số ca nhiễm cộng dồn trong đợt dịch năm 2016 có chiều hướng tăng cao hơn đợt dịch trước đó Điều đó cho thấy sự gia tăng lan truyền của

vi rút và cần thiết phải thực hiện giám sát thường xuyên hơn đối với cả ngành y tế

và thú y [44] Trong 4 đợt dịch cúm từ 2013 đến 2015 tại Trung Quốc, 88% bệnh nhân có dấu hiệu mắc viêm phổi, 68% phải nhập viện và điều trị tại khoa hồi sức

tích cực và 41% tử vong [Error! Reference source not found.] Hầu hết các ca

nhiễm vi rút cúm A/H7N9 đều có phơi nhiễm với gia cầm hoặc môi trường bị nhiễm vi rút như tại các chợ gia cầm Do đó giám sát nhiễm vi rút trên những người buôn bán, giết mổ gia cầm là cần thiết để có thể đưa ra các biện pháp phòng chống dịch kịp thời, giúp giảm số ca mắc và tử vong do bệnh này Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Myanmar sử dụng mẫu thu thập từ gia cầm ở các chợ cho thấy tỷ lệ nhiễm vi rút cúm A là 6,5% Trong đó, không phát hiện được các mẫu dương tính với vi rút cúm A/H7N9 nhưng có 1,3% dương tính với A/H5N6 [36]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu: mẫu huyết thanh được tách từ mẫu máu thu thập của những người làm nghề buôn bán, giết mổ, vận chuyển gia cầm tại một số chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu là các chợ buôn bán, giết mổ gia cầm tại ba huyện Đông Anh, Thanh Trì và Thường Tín thuộc thành phố Hà Nội Đây là các huyện ở khu vực ngoại thành và có nhiều chợ buôn bán, giết mổ gia cầm, đặc biệt là chợ Hà Vỹ của huyện Thường Tín là chợ đầu mối gia cầm của khu vực miền Bắc với hàng trăm

hộ kinh doanh gia cầm

2.1.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

Phương pháp chọn mẫu:

Lập danh sách và lựa chọn chợ nghiên cứu

Danh sách các chợ của các huyện được lập với thông tin về số người làm nghề buôn bán, giết mổ gia cầm của từng chợ Việc lựa chọn chợ dựa vào số lượng người làm nghề này, chợ có nhiều người buôn bán, giết mổ gia cầm hơn sẽ được chọn trước cho tới khi đủ 200 mẫu Do đặc điểm của 3 huyện là khác nhau, nên nhóm

nghiên cứu phân bổ số lượng mẫu như sau: huyện Đông Anh: 50 người, huyện Thanh Trì: 50 người, huyện Thường Tín: 100 người

Lựa chọn người buôn bán, giết mổ gia cầm tại các chợ

Tại các chợ được chọn, tất cả những người làm nghề buôn bán, giết mổ gia cầm đảm bảo tiêu chuẩn lựa chọn (có thời gian làm nghề ít nhất 6 tháng tính từ thời điểm nghiên cứu trở về trước, trên 18 tuổi, tự nguyện tham gia nghiên cứu, có phiếu điều tra đầy đủ thông tin (Mẫu phiếu điều tra được trình bày ở Phụ lục 1)) sẽ được mời tham gia nghiên cứu cho tới khi đủ cỡ mẫu cho từng huyện như trên

Việc lựa chọn này đã được sự đồng ý và hỗ trợ của chính quyền và ban quản

lý các chợ Mỗi đối tượng tham gia nghiên cứu sẽ được cung cấp một mã số riêng

để có thể quản lý chính xác trong suốt nghiên cứu, cũng như đảm bảo tính khuyết danh cho những đối tượng này Mỗi đối tượng sẽ được tiến hành phỏng vấn và đề nghị cung cấp 3-5ml máu tĩnh mạch để xét nghiệm tìm kháng thể kháng vi rút cúm mùa, cúm gia cầm

2.2 Phương pháp

Qui trình đánh giá tỉ lệ kháng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7) được tóm tắt trong hình 2.1

Hình 2.1 Qui trình đánh giá tỉ lệ kháng huyết thanh có kháng thể đặc hiệu

kháng vi rút cúm mùa, cúm gia cầm (A/H5, A/H7)

2.2.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI)

2.2.1.1 Nguyên lí

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) là phương pháp truyền thống để đánh giá sự đáp ứng miễn dịch với protein hemagglutinin (HA) của vi rút cúm Protein HA trên bề mặt của vi rút cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Sự gắn kết đặc hiệu của kháng thể với các vị trí đặc hiệu kháng nguyên trên phân tử HA sẽ gây cản trở việc liên kết giữa HA và thụ thể trên tế bào hồng cầu, điều này làm ức chế quá trình ngưng kết hồng cầu

Phản ứng HAI có thể được chia thành 3 phần sau:

2.2.1.2 Nguyên vật liệu và trang thiết bị

a Kháng nguyên dùng trong phản ứng HAI:

- Vi rút cúm mùa: được cung cấp bởi Viện vacxin và sinh phẩm y tế (IVAC)

A/H1N1: NYMC X-179A (A/California/7/2009)

A/H3N2: NYMC X-223A (A/Texas/50/2012)

Cúm B: NYMC BX-51B (B/Massachusetts/02/2012)

- Vi rút cúm gia cầm:

A/H5N1: A/Muscovy duck Vietnam LBM 992/2017 - clade 2.3.2.1

(phân lập từ gia cầm thu thập tại các chợ ở Hà Nội trong giai đoạn 2014-2017)

A/H5N6: A/Muscovy duck Vietnam LBM 942/2017 - clade 2.3.4.4

(phân lập từ gia cầm thu thập tại các chợ ở Hà Nội trong giai đoạn 2014-2017)

A/H7N9: A/Anhui/1/2013 độc lực thấp, phân lập được từ người (được cung

cấp bởi Viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản (NIID)

b Huyết thanh chứng:

- HAI với vi rút cúm mùa: huyết thanh chứng dương là kháng huyết thanh chuẩn của cúm A/H1N1pdm09, A/H3N2 và cúm B do tổ chức Y tế thế giới cung cấp; huyết thanh chứng âm là huyết thanh của những người được xác định là không có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm

- HAI với vi rút cúm gia cầm: huyết thanh chứng dương của vi rút cúm A/H5N1 và A/H7N9 do Tổ chức Y tế thế giới cung cấp; huyết thanh chứng

âm là huyết thanh của những người được xác định là không có kháng thể đặc hiệu kháng vi rút cúm

c Hóa chất, sinh phẩm:

- Dung dịch nước muối nồng độ ~26%, Sigma, Cat 71392-1L

- Dung dịch chống đông máu: Dung dịch Alsever’s: Sigma, Cat

A3551-100ML

- Đệm muối phosphate dạng viên, Sigma, Cat P4417-100 TAB

- BSA, fraction V, bột (Sigma, Cat 05482)

- Enzyme phá huỷ thụ thể, RDE (II) (Denka Seiken Co., Ltd)

- Hồng cầu ngựa 1% / Hồng cầu gà tây 0,5%

- Phiến 96 giếng (đáy V)

- Pi-pet đơn kênh và đa kênh, đầu côn tương ứng

- Tuýp các loại

2.2.1.3 Chuẩn bị sinh phẩm / hoá chất

Các dung dịch dùng cho phản ứng HAI: ( chi tiết xem phụ lục 2)

Kháng nguyên vi rút cúm mùa Kháng nguyên vi rút cúm gia cầm

Dung dịch nước muối sinh lí 0,85% Dung dịch nước muối sinh lí 0,85%

Dung dịch PBS 1X Dung dịch PBS 1X+ 0,5% BSA

Hồng cầu gà tây 0,5% trong dung dịch

PBS (thời gian lắng là 30 phút)

Hồng cầu ngựa 1% trong dung dịch PBS + 0,5% BSA (thời gian lắng là 60 phút)

2.2.1.4 Các bước thực hiện:

Phần 1 Xử lí huyết thanh (mẫu huyết thanh nghiên cứu và mẫu chứng)

Xứ lý huyết thanh cho phản ứng HAI sử dụng kháng nguyên là vi rút cúm mùa:

Trộn 3 thể tích RDE với 1 thể tích huyết thanh; ủ ở 37oC từ 16 – 18 tiếng

Ủ huyết thanh đã xử lí RDE ở 56o

C trong 1 giờ, trộn đều hỗn hợp sau mỗi khoảng thời gian 15 phút

Ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ hồng cầu lắng

Kiểm tra huyết thanh sau khi xử lý bằng RDE và hấp phụ hồng cầu đặc bằng cách nhỏ 50 µl huyết thanh và 50 µl hồng cầu 0,5% vào phiến Ủ ở nhiệt độ phòng

30 phút rồi đọc kết quả

Hình 2.2 Hình ảnh minh hoạ sự ngƣng kết và không ngƣng kết của hồng

cầu ngựa

Xứ lý huyết thanh cho phản ứng HAI sử dụng kháng nguyên là vi rút cúm gia cầm:

- Bất hoạt mẫu huyết thanh ở bể ủ 56oC trong 30 phút, để huyết thanh trở lại nhiệt độ phòng

- Pha loãng huyết thanh với dung dịch PBS theo tỉ lệ 1 phần thể tích huyết thanh với 4 phần thể tích PBS (huyết thanh pha loãng 1/5)

- Thêm hồng cầu đậm đặc vào mỗi mẫu huyết thanh đã pha loãng 1/5 theo tỉ lệ

Phần 2 Chuẩn bị dung dịch kháng nguyên 8 HAU

Xác định hiệu giá HA của chủng cúm bằng cách thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

- Nhỏ 50μl PBS vào vào các giếng từ cột 2 – 12 của phiến 96 giếng

- Nhỏ 100μl dung dịch vi rút cần xác định HA vào giếng ở cột 1 Pha loãng vi rút bậc 2 từ cột 1 đến 11 Cột 12 làm chứng hồng cầu

- Nhỏ thêm 50μl dung dịch hồng cầu dùng cho HAI vào các giếng Dùng tay vỗ nhẹ phiến và để ở nhiệt độ phòng 30 phút (vi rút cúm mùa) hoặc 60 phút (vi rút cúm gia cầm)

- Đọc hiệu giá HA của vi rút Hiệu giá của vi rút là độ pha loãng cuối cùng của gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn

Chuẩn bị dung dịch kháng nguyên 8HAU

- Dựa vào hiệu giá HA của vi rút, pha loãng vi rút trong PBS lạnh để có kháng nguyên chuẩn – là dung dịch chứa 8 đơn vị HA/50μl (8HAU/50μl) Ví dụ, nếu hiệu giá của vi rút là 64 thì sẽ pha 1 phần vi rút với 7 phần PBS (vì 64 : 8 = 8) để có dung dịch kháng nguyên chuẩn 8HAU/50μl

- Thực hiện “chuẩn độ ngược” đê kiểm tra hiệu giá HA của dung dịch kháng nguyên vừa pha bằng cách thực hiện phản ứng HA Nếu kết quả là 8HAU/50μl thì dung dịch kháng nguyên vừa pha được gọi là kháng nguyên chuẩn cho phản ứng HAI Nếu phản ứng HA không cho kết quả là 8HAU/50μl thì phải điều chỉnh và kiểm tra lại cho đến khi đạt được 8HAU/50μl Bảo quản dung dịch kháng nguyên chuẩn ở 40

C và chỉ sử dụng trong ngày

Hình 2.3 Sơ đồ các bước chuẩn độ ngược

Phần 3 Thực hiện phản ứng HAI

Nhỏ 25 μl PBS vào các giếng từ B đến H (B1-11 đến H1-11) và B12 đến D12 Nhỏ 50 μl PBS vào các giếng từ A12 đến H12 để dung làm chứng hồng cầu (EC)

Nhỏ 50μl huyết thanh đã xử lý (huyết thanh 1:10) vào hàng đầu tiên (A1-12): + A1-A10: huyết thanh nghiên cứu

+ A11: huyết thanh chứng dương

+ A12: là huyết thanh chứng âm

Pha loãng huyết thanh bậc 2 bằng cách: ở các cột 1-11, chuyển 25 μl huyết thanh từ hàng A tới hàng H, loại bỏ 25 μl cuối cùng ở hàng H; ở cột 12: chuyển 25

μl huyết thanh từ hàng A tới hàng D, loại bỏ 25 μl cuối cùng ở hàng D

Nhỏ 25 μl kháng nguyên 8 HAU/50 μl vào từng giếng chứa huyết thanh đã pha loãng bậc 2 (trừ cột E12 đến H12 là chứng hồng cầu)

Vỗ nhẹ phiến, ủ ở nhiệt độ phòng (220C đến 250C) trong khoảng thời gian

60 phút

Thêm 50 μl dung dịch hồng cầu chuẩn vào tất cả các giếng Vỗ nhẹ phiến

Để phiến ở nhiệt độ phòng để hồng cầu lắng, thời gian tương ứng với từng loại hồng cầu

Đọc hiệu giá HAI

*Ghi chú: mẫu chứng dương, chứng âm: 10 phiến/ thực hiện 1 lần

2.2.1.5 Nhận định kết quả

Điều kiện để kết quả phản ứng HAI có giá trị

Chuẩn độ ngược phải cho kết quả 8HAU/50µl

Chứng hồng cầu không có ngưng kết

Huyết thanh chứng âm không gây ức chế ngưng kết hồng cầu

Huyết thanh chứng dương có hiệu giá HAI thấp/cao hơn so với giá trị đã biết 1 bậc pha loãng đối với từng loại kháng nguyên (ví dụ: HAI đã biết là 160, các kết quả HAI=80 hoặc 160 hoặc 320 được chấp nhận)