Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh lúa nhằm ứng dụng trong phòng trị bệnh thối rễ do dickeya zeae gây ra

Kiểm soát sinh học nhờ sử dụng các vi sinh vật đối kháng với mầm bệnh là hướng đi được nhiều quốc gia quan tâm trong phát triển nông nghiệp bền vững, giúp thay thế một phần thuốc bảo vệ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN DUY TỚI

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH LÚA NHẰM ỨNG DỤNG TRONG

PHÒNG TRỊ BỆNH THỐI RỄ DO Dickeya zeae GÂY RA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN DUY TỚI

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH LÚA NHẰM ỨNG DỤNG TRONG

PHÒNG TRỊ BỆNH THỐI RỄ DO Dickeya zeae GÂY RA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐINH THÚY HẰNG

PGS TS PHẠM THẾ HẢI

Tôi xin cảm ơn đề tài NĐT.34.ITA/17: “Nghiên cứu hệ vi sinh vật nội sinh phục

vụ sản xuất chế phẩm phòng chống bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae pv oryzae) và

bệnh thối rễ (Dickeya zeae) trên cây lúa” đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia thực

hiện các nội dung nghiên cứu

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cán bộ khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và trang bị những kiến thức hữu ích cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh chị đông nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021

Học viên

Nguyễn Duy Tới

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Dickeya zeae và bệnh thối thân rễ trên cây trồng 3

1.1.1 Lúa và vai trò của cây lúa trong đời sống 3

1.1.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Dickeya zeae 3

1.1.2 Phân bố trong tự nhiên và phương thức gây bệnh 5

1.1.3 Bệnh thối thân/gốc do Dz và các biện pháp phòng trị 7

1.2 Vi khuẩn nội sinh thực vật (EB) và lợi ích đối với cây chủ 10

1.2.1 Đa dạng EB và cây chủ 10

1.2.2 Cơ chế xâm nhập và phân tán 11

1.2.3 Vai trò của EB đối với cây chủ 13

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên vật liệu 20

2.1.1 Mẫu lúa và chủng vi khuẩn kiểm định 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh 21

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng Dickeya zeae (Dz) 22

2.2.3 Tách DNA genome từ các chủng vi khuẩn thuần khiết 22

2.2.4 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 23

2.2.5 Thí nghiệm in planta đánh giá khả năng đối kháng Dz của vi khuẩn nội sinh 24

2.2.6 Tách chiết và xác định hoạt chất sinh học kháng Dz 26

2.2.7 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn nội sinh 27

2.3 SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây lúa 29

3.2 Sàng lọc vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng Dickeya zeae (Dz) 30

3.3 Xác định vị trí phân loại của các chủng có hoạt tính kháng Dz cao 32

3.3.1 So sánh trình tự gen 16S rDNA 32

3.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 34

3.4 Xác định hoạt chất kháng Dz của các chủng EB có tiềm năng cao 35

3.4.1 Tinh sạch hoạt chất kháng Dz bằng HPLC 35

3.4.2 Nghiên cứu xác định cấu trúc hoạt chất kháng Dz từ chủng VY81 36

3.5 Đánh giá hiệu quả chủng VY03 đối kháng Dz trên cây lúa 39

3.5.1 Xác định điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng VY03 39

3.5.2 Thí nghiệm in planta đánh giá hiệu quả ức chế Dz của chủng VY03 40

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 57

TÓM TẮT 74

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái tế bào vi khuẩn D zeae dưới kính hiển vi điện tử quét [76] 5

Hình 1.2 Bệnh thối gốc do Dz trên cây lúa (A), ngô (B) và chuối (C) [25, 80, 103] 8

Hình 1.3 Các con đường xâm nhập của EB vào cây táo [42] 12

Hình 1.4 Điều hòa phytohormone ở thực vật nhờ EB [128] 16

Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh lúa (A) đĩa cấy gạt từ mẫu rễ sau khi khử trùng bề mặt; (B) Đĩa kiểm chứng đặt trực tiếp mẫu thân, rễ, lá sau khi khử trùng bề mặt; (C) Đĩa cấy gạt nước rửa mẫu rễ lần cuối sau khi khử trùng bề mặt 29

Hình 3.2 Tế bào của chủng DZ2Q qua kính hiển vi phản pha (A) và lúa Bắc Thơm bị lây bệnh nhân tạo từ chủng DZ2Q tại viện Bảo vệ Thực vật (B) 30

Hình 3.3 Hoạt tính kháng Dz của các chủng VY03, VY81, VY149, VY166, VY235, VY244 đánh giá bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch 32

Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại neibourgh joining dựa trên trình tự 16S rDNA gần đủ của các chủng nội sinh VY03 (A); VY81 (B); VY65, VY149, VY166, VY235, VY244 (C) so sánh với các loài có quan hệ gần gũi Trong từng cây, chủng L acidophilus, B gladioli, B cepacia tương ứng được chọn làm out group 33

Hình 3.5 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng VY03 (A, B), VY81 (C, D) 34

Hình 3.6 Phổ hấp phụ tại bước sóng 240 nm của hoạt chất thô tách từ các chủng VY03 (A); VY81 (B) 35

Hình 3.7 Tách chiết hoạt chất từ canh trường của chủng VY81 (A) Hiệu suất tách chiết của các dung môi khác nhau (B) Hoạt tính kháng Dz ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau 36

Hình 3.8 Phổ hấp thụ UV - vis của hoạt chất kháng Dz tinh sạch từ chủng VY81 (A) so sánh với phổ hấp thụ của chất 2-(2-heptenyl)-3-methyl-4-quinolinol (B) [58] 37

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của (A) heptenyl)-3-methyl-4-quinolinol [58] và (B) 2-(2-heptenyl)-3-methyl-4(1H)-quinolone [123] 38

Hình 3.10 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy tới sinh trưởng của chủng VY03 40

Hình 3.11 Thí nghiệm in planta đánh giá hiệu quả ức chế Dz gây bệnh thối gốc/thân lúa của chủng VY03 (A) Công thức 1; (B) Công thức 2; (C) Công thức 3; (D) Công thức 4 41

Hình 3 12 Vết thương tổn khi nhiễm Dz (A); khi được điều trị bằng chủng VY03 (B) và độ dài vết thương tại những cây bị bệnh (C) 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Dickeya và các cây chủ của chúng 4

Bảng 1.2 Một số kháng sinh sản xuất bởi EB ức chế mầm bệnh thực vật 17

Bảng 2.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 24

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch Hoagland (dung dịch mẹ 2 )[142] 25

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch vi lượng (1 lít) 25

Bảng 2.4 Thành phần môi trường Landy [159] 27

Bảng 3.1 Số lượng vi khuẩn nội sinh phân lập từ các mẫu lúa 30

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc tìm kiếm các chủng vi khuẩn nội sinh lúa kháng Dz 31

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

FISH Fluorescence in situ hybridization

PCR Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TKT Thực khuẩn thể

T-RFLP Terminal restriction fragment length polymorphism

TTSS Type three secretion system

VOC Volatile organic compound (Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi)

MỞ ĐẦU

Theo thống kê, sản lượng gạo trên toàn thế giới năm 2018 đạt 769.9 triệu tấn,

và là nguồn lương thực chính của thế giới [35] Thiệt hại hàng năm do dịch bệnh gây ra trên cây lúa ở các nước châu Á ước tính từ 24-41%, trong đó, bệnh bạc lá, đạo ôn, đốm nâu gây tổn thất nghiêm trọng nhất [129] Bệnh thối gốc/thân do vi

khuẩn Dickey zeae (tên trước kia là Erwinia chrysanthemi pv zeae) gây ra được báo

cáo đầu tiên bởi Prasad (1930) với các biểu hiện như xuất hiện vết thối màu nâu

sậm gần gốc, bẹ lá ngả vàng, cháy khô, cây đổ gục [76] Sau đó, Dickeya zeae

được ghi nhận là nguyên nhân gây thối rễ trên cây lúa ở Nhật Bản, Trung quốc, Đài

Loan [51, 82, 117] Ở Việt Nam, bệnh thối gốc lúa do Dickeya zeae gây ra được ghi

nhận đầu tiên ở Tiểu Cần, Trà Vinh và sau đó lan rộng ra nhiều tỉnh khác ở đồng bằng sông Cửu Long [1]

Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để kiểm soát bệnh do vi sinh vật (VSV)/côn trùng gây ra là biện pháp được áp dụng ở nhiều khu vực canh tác nông nghiệp trên thế giới Lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật dẫn đến ảnh hưởng xấu cho môi trường, chưa kể tới việc xuất hiện các VSV kháng thuốc làm giảm hiệu quả phòng chống bệnh [164] Kiểm soát sinh học nhờ sử dụng các vi sinh vật đối kháng với mầm bệnh là hướng đi được nhiều quốc gia quan tâm trong phát triển nông nghiệp bền vững, giúp thay thế một phần thuốc bảo vệ thực vật [49] Nhiều loài vi khuẩn như

Bacillus, Burkholderia, Lysobacter, Pantoea, Pseudomonas và Streptomyces đã

được nghiên cứu sử dụng để kiểm soát các tác nhân gây bệnh ở cây trồng [46] Nhiều loài thuộc các chi nêu trên là vi khuẩn nội sinh thực vật, ngoài việc đóng vai trò là các tác nhân kiểm soát sinh học, chúng còn đem lại nhiều lợi ích cho cây trồng như tăng cường thu nạp dinh dưỡng và thúc đẩy tăng trưởng [9]

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu vi

khuẩn nội sinh ở cây lúa nhằm ứng dụng trong phòng trị bệnh thối rễ do Dickeya zeae gây ra” để tìm ra các loài vi khuẩn nội sinh cũng như hoạt chất sinh học của chúng đối kháng vi khuẩn gây bệnh Dickeya zeae nhằm ứng dụng trong nông

Mục tiêu của đề tài

 Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn nội sinh lúa có hoạt tính đối

kháng vi khuẩn Dickeya zeae gây bệnh thối thân/rễ lúa

 Nghiên cứu, xác định hoạt chất kháng Dz của các chủng vi khuẩn nội sinh

 Bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu quả của vi khuẩn nội sinh kháng Dz trên

cây lúa ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Dickeya zeae và bệnh thối thân rễ trên cây trồng

1.1.1 Lúa và vai trò của cây lúa trong đời sống

Lúa (Ozyra spp.) là loài thực vật một lá mầm, được trồng hàng năm Gạo là

lương thực chính được tiêu thụ rộng rãi nhất đối với một bộ phận dân số thế giới (65% dân số), đặc biệt là châu Á và châu Phi Gạo là mặt hàng nông nghiệp có sản lượng cao thứ 3 thế giới (741,5 triệu tấn vào năm 2014), sau mía (1,9 tỉ tấn) và ngô (1 tỷ tấn) [41]

Hiện nay, việc sản xuất lúa gạo diễn ra ở hơn 100 nước trên thế giới Châu Á

là vùng sản xuất lúa gạo chính, chiếm đến 90% về sản lượng cũng như diện tích trồng trọt Việt Nam cũng là quốc gia có nghề lúa nước từ cổ xưa, với dân số 95 triệu dân và 100% dân số sử dụng lúa gạo làm lương thực chính, kim ngạch xuất khẩu hàng năm đạt 6 triệu tấn Điều đó cũng cho thấy nghề sản xuất lúa nước đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân Tổng lượng gạo xuất khẩu 11 tháng đầu năm 2020 đạt 5,74 triệu tấn, tương đương với giá trị 2,85 tỉ USD, giảm 2,2% về khối lượng nhưng lại tăng 10,4% về giá trị so với cùng kỳ năm 2019 (Theo báo Lao động ngày 17 tháng 12 năm 2020)

1.1.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Dickeya zeae

Chi Dickeya thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae bao gồm nhiều loài gây bệnh trên cây trồng và động vật, như Pantoea, Brenneria, Enterobacter và Pectobacterium [125] Chi Dickeya zeae trước đây có tên gọi khác là Erwinia chrysanthemi Chi Erwinia gồm nhiều loài gây bệnh trên thực vật, trong đó có các loài phân giải pectin như Erwinia carotovora, E chrysanthemi, và các loài không phân giải pectin như E amylovora [149] Loài E chrysanthemi được Burkholder và

cộng sự (1953) đặt tên và được biết đến là loài gây bệnh trên nhiều cây chủ thuộc

chi cúc (Chrysanthemum), cũng như nhiều loài thực vật khác thuộc nhóm một lá

mầm và hai lá mầm, đặc biệt là chuối, ngô, khoai tây và cà chua [20]

Theo công bố của Samson và cs (2005), chi Dickeya gồm 6 loài tương ứng

với các đối tượng cây chủ khác nhau (Bảng 1.1)[125]

Bảng 1.1 Các loài Dickeya và các cây chủ của chúng

D dianthicola Erwinia chrysanthemi biovar 1,7 và 9

E chrysanthemi pv dianthicola Pectobacterium chrysanthemi pv

dianthicola

Chi cẩm chướng, khoai tây, cà chua, rau diếp xoăn, bắp cải, cây thược dược, cây lá bỏng

D dadatii E chrysanthemi biovar 3 (một vài

D zeae E chrysanthemi biovar 8 và một số

Chuối, ngô, khoai tây

D dieffenbachiae E chrysanthemi biovar 2

E chrysanthemi pv dieffenbachiae

P chrysanthemi pv dieffenbachiae

Vạn niên thanh, cà chua, chuối

Sau này, một số loài mới được mô tả và bổ sung vào chi Dickeya như D solani, D aquatica, D fangzhongdai, D lacustris, D undicola, D poaceiphila và

D oryzae Hiện tại, chi Dickeya bao gồm 12 loài với tên gọi được công nhận hợp lệ

(https://www.bacterio.net/genus/dickeya)

Đặc điểm chung của các loài thuộc chi Dickeya là Gram âm, di chuyển bằng

tiên mao (tế bào có từ 8 đến 11 tiên mao) [31] Các loài này không sinh bào tử, tế bào trực khuẩn, tròn ở hai đầu, thường xuất hiện một mình hoặc theo đôi, kích thước dao dộng từ 0,8 – 3,2  0,5 – 0,8 μm (trung bình 1,8  0,6 μm) tuỳ thuộc vào nguồn carbon và điều kiện sinh trưởng [137] Về đặc tính sinh lý, các loài thuộc chi

Dickeya cũng có một số điểm chung như kỵ khí tùy tiện, catalase dương tính,

oxydase âm tính, sản sinh  -galactosidase, khử nitrate, sinh H2S, lên men sinh axit

từ L(+)-arabinose, D(-)-ribose, L(+)-rhamnose, D(-)-lycerol, mannitol, sorbitol, esculin và salicin; không sinh urease hoặc axit từ adonitol [31]

D-Hình 1.1 D-Hình thái tế bào vi khuẩn D zeae dưới kính hiển vi điện tử quét [76]

1.1.2 Phân bố trong tự nhiên và phương thức gây bệnh

1.1.2.1 Phân bố trong tự nhiên

Khả năng sống sót của Dickeya zeae trong tự nhiên là rất cao, chúng có thể

tồn tại đến 10 tuần trong phân của các loài gia súc, 140 ngày trong đất với độ ẩm

40%, 29 ngày trong đất không được khử trùng [11] Trong môi trường nước D zeae

có thể tồn tại với thời gian khác nhau, cụ thể là 7 ngày trong nước máy, 21 ngày trong nước ao, 49 ngày trong đệm phosphate, hơn 154 ngày trong nước mưa [76]

Trong các mô thực vật, D zeae có thể tồn tại đến 24, 15, 12 ngày ở nhiệt độ tương

ứng 10, 20, 30  C [12] Như vậy, thực vật chứa Dz là nguồn mầm bệnh dễ phát tán

trong tự nhiên [149]

Trước khi xâm nhập vào cây chủ, Dz có thể cư trú biểu sinh trên bề mặt lá

hoặc rễ Nhiệt độ và độ ẩm thích hợp (35  C và độ ẩm 70-90%) sẽ giúp Dz phát triển

và sản xuất đủ lượng enzyme pectinase để phá hủy thành tế bào thực vật [130] Ngoài ra, một số yếu tố canh tác như bón nhiều đạm, sử dụng các nguồn nước ô nhiễm, ứ đọng nước trong đất do mưa và tưới tiêu, vận chuyển nhanh chất dinh dưỡng trong các hệ thống mạch của cây cũng tạo điều kiện thuận cho sự gây bệnh

của các loài Dickeya [149] Trong điều kiện thuận lợi, Dz xâm nhập vào cây chủ

thông qua vết thương, hoặc lỗ hở tự nhiên, bắt đầu chu kì gây bệnh với 2 giai đoạn chính, (i) tăng sinh từ từ và cư trú tiềm ẩn trong khoảng gian bào thực vật mà không gây bất kỳ triệu chứng nào (nhờ khả năng trốn thoát hệ thống miễn dịch thực vật) và sau đó là (ii) biểu hiện các yếu tố độc lực, đặc biệt là sản xuất lượng lớn pectate

lyase để phân hủy thành tế bào thực vật Trong quá trình phân giải mô thực vật, Dz

tiếp tục thu nhận dinh dưỡng và tăng sinh, khiến cho quá trình lây nhiễm diễn ra một cách nhanh chóng làm cho thực vật ít có thời gian phát triển các hệ thống phòng vệ [60]

1.1.2.2 Hình thức gây bệnh trên thực vật

Tương tự như các loài Dickeya khác, Dz tạo ra một loạt các yếu tố độc lực

bao gồm các enzyme phân hủy thành tế bào, hệ thống bài tiết loại III (TTSS), siderophores và sắc tố chàm giúp vi khuẩn xâm chiếm và gây hại cho cây [59]

Thành tế bào thực vật là hàng rào phòng thủ quan trọng chống lại các mầm bệnh Cấu trúc cơ bản của thành tế bào thực vật gồm các vi sợi cellulose gắn bên trong mạng lưới pectin và hemicellulose Các polysaccharide pectin chiếm 30-50 % thành tế bào của thực vật hai lá mầm, đóng vai trò quan trọng trong tạo sự ổn định của mô thực vật Do đó, pectin là mục tiêu tấn công chính của nhiều mầm bệnh thực

vật [22] Dickeya spp tấn công thành tế bào thực vật bằng cách tiết ra các enzyme

phân hủy thành tế bào, đặc biệt là enzyme pectinase Triệu chứng thối mềm thân/gốc thực vật là do hoạt động tích lũy pectinase (đặc biệt là pectate lyases) phá

hủy pectin Ngoài ra, nhiều enzyme khác như cellulase, xylanase và protease cũng được vi khuẩn tiết ra để phá thành tế bào thực vật [38]

Trong tự nhiên, nhiều loài VSV sản sinh các siderophore để hòa tan sắt và kiểm soát nồng độ sắt trong tế bào [107] Các vi khuẩn gây bệnh thực vật sản sinh siderphore để hấp thu sắt từ nhiều loại chất nền hữu cơ của thực vật, góp phần quan

trọng vào tính độc lực của chúng [121] Ví dụ Dickeya sp sản sinh chrysobactin và

achomobactin là các siderphore cần thiết để gây nhiễm trùng toàn thân ở thực vật

[44] Tuy nhiên, yếu tố quyết định độc lực chính của Dickeya sp là các enzyme

phân hủy thành tế bào, giúp vi khuẩn xâm chiếm các khoảng gian bào và mô thực vật [101]

Dickeya zeae có thể lây nhiễm trên cả thực vật một lá mầm và hai lá mầm

[63] Vi khuẩn sinh tổng hợp phytotoxin zeamine, có khả năng ức chế sự nảy mầm của hạt thóc và tăng trưởng của cây Các protein độc tố được chuyển vào tế bào thực vật thông qua hệ thống bài tiết tuýp III (TTSS), gây ức chế/phá hủy hệ thống phòng thủ của vật chủ [21]

1.1.3 Bệnh thối thân/gốc do Dz và các biện pháp phòng trị

1.1.3.1 Phạm vi gây bệnh của Dz

Các loài thuộc chi Dickeya là nguyên nhân gây bệnh thối mềm gốc/thân trên

nhiều đối tượng cây chủ ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới, gồm các loài

cây lương thực, cây cảnh, cây hoang dã [113] Dickeya zeae được công bố gây bệnh

trên nhiều loài thực vật, bao gồm 4 loại cây ký chủ hai lá mầm tự nhiên (khoai tây, thuốc lá, cúc và trầu bà) và 6 loại cây ký chủ một lá mầm tự nhiên (lúa, ngô, chuối, dứa, lục bình, cỏ lông tay), trong đó ngô, lúa và chuối là ba loại cây trồng chịu thiệt hại nặng nề nhất [125] (Hình 1.2) Ngoài ra, còn có nhiều loại thực vật được báo

cáo là vật chủ nhân tạo của Dickeya zeae [59] Bệnh thối gốc ngô được báo cáo ở

nhiều quốc gia như Mỹ, Brazil, Pháp, Ý, Senegal, Cuba, Ai Cập, Mexico, Ấn Độ, Hàn Quốc, Iran, Nhật Bản, Trung Quốc và Thái Lan [59] Trên cây chuối, tỷ lệ mắc

và mức độ nghiêm trọng của bệnh đã được tăng lên rất nhiều kể từ lần bùng phát ở

mắc 20-70%, thậm chí là 90% ở một số vùng canh tác trong giai đoạn 2010-2012

[81, 168] Chuối bị thối mềm do Dz cũng được báo cáo ở Bờ Biển Ngà, Jamaica,

Panama và Martinique, gây ra thiệt hại nặng nề về kinh tế [125]

Hình 1.2 Bệnh thối gốc do Dz trên cây lúa (A), ngô (B) và chuối (C) [25, 80, 103]

Bệnh thối gốc lúa do Dz có thể dẫn đến thiệt hại 90% về năng xuất gạo Bệnh

này chủ yếu xảy ra ở miền nam Trung Quốc, làm giảm năng suất lúa đến 90% ở Giang Tô năm 1980, bùng phát ở các tỉnh Phúc Kiến, Hồ Nam, Quý Châu và Sơn Đông với tỷ lệ mắc bệnh từ 15-100% vào năm 2000 [59] Bệnh thối gốc lúa còn được phát hiện ở châu Âu và các nước Đông Nam Á [16, 51] Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận đầu tiên tại Tiểu Cần, Trà Vinh trong năm 2000, sau đó bệnh lan nhanh ở nhiều tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và gây thiệt hại về năng suất lúa [1]

Triệu chứng điển hình của bệnh thối gốc lúa do Dz là các vết đen xuất hiện ở

nhánh non giữa các bẹ, sau đó lan xuống các hạch, thân, và cuối cùng là gốc, rễ Tại các vị trí bị thối mềm có mùi hôi khó chịu Ở giai đoạn phát triển mạnh mẽ, nhiều cây đẻ nhánh đã thối rữa khắp vùng thân rễ, toàn bộ khóm lúa mắc bệnh dễ dàng bị nhổ ra khỏi đất [117]

Nhóm các loài Dickeya spp có thể được xác định dựa trên so sánh trình tự

16S-23S ITS dài 171 bp khuyếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc trưng cho loài là LF/LR (LF 5’- TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3’ và LR 5’- TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3’)[79] Nassar và cộng sự (1996) đã thiết kế cặp

mồi ADE-1, ADE-2 để nhân đoạn gen dài 420 bp của nhóm gen pelADE mã hóa cho enzyme pectate lyase đặc hiệu đối với Dickeya spp [105] Xác đinh vị trí phân

loại đến mức độ loài được thực hiện dựa trên so sánh trình tự đầy đủ 16S rDNA [40]

1.1.3.2 Các biện pháp phòng trị bệnh

Bệnh thối gốc do vi khuẩn Dickeya spp trước đây thường được kiểm soát

bằng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học như dithane M-22, captan, flytolan, ferbam, bitorithane, Blitox-50 W, chất tẩy trắng, tuy nhiên hiệu quả đạt được không cao, nhưng lại gây ảnh hưởng tới môi trường [147] Một số chất kháng sinh như

streptomycin, terramycin, streptocycline có hiệu quả ức chế đối với Dz, tuy nhiên

khó áp dụng trong thực tế [147]

Ứng dụng của các tác nhân sinh học như xạ khuẩn, vi khuẩn vùng rễ, vi

khuẩn nội sinh… để phòng trị bệnh thối gốc do Dz ngày càng được các nhà khoa

học quan tâm do tính an toàn và thân thiện với môi trường Một số loài vi khuẩn

như Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens và vi nấm Glomus fasciculatum đã được công bố là có hoạt tính kháng Dz và được thử nghiệm ứng dụng để kiểm soát

bệnh thối gốc lúa đạt hiệu quả đáng chú ý [104]

Nhiều nghiên cứu gần đây cũng cho thấy việc kiểm soát mầm bệnh Dz bằng

vi khuẩn nội sinh cũng đem lại tác dụng Trong nghiên cứu của mình, Jafra và cộng

sự đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây lục bình tạo ra hoạt chất đối

kháng Dz và cho hiệu quả trong điều kiện nhà lưới [66] Ba chủng vi khuẩn nội sinh Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas parafulva, Bacillus velezensis cũng cho thấy tiềm năng cao trong việc kiểm soát bệnh thối mềm do Dz gây ra [78]

Ở Việt Nam, một số loài vi sinh vật có hoạt tính kháng Dz đã được công bố

gần đây Trần Vũ Phến và cs (2015), Trần Hưng Minh và cs (2016), đã tìm được

các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng ức chế Dz với đường kính phòng

ức chế từ 7,5 – 8 mm Trong điều kiện nhà lưới, ứng dụng các chủng này để phòng

chống bệnh do Dz gây ra đã đạt hiệu quả > 60%, tương đương so với thuốc bảo vệ

thực vật hóa học Starner 20WP [1, 2]

Hướng nghiên cứu sử dụng các thực khuẩn thể (TKT) ký sinh và diệt tế bào

dòng TKT ký sinh trên 14 chủng vi khuẩn Dickeya spp., trong đó 8 dòng TKT phân

bố ở ba tỉnh Cần Thơ, Kiên Giang và Sóc Trăng có phổ ký sinh rộng Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng áp dụng dòng TKT ΦEchKG8b với đường kính vòng phân giải vi khuẩn cao nhất ở điều kiện nhà lưới cho hiệu quả cao trong phòng trị bệnh thối gốc lúa [1]

1.2 Vi khuẩn nội sinh thực vật (EB) và lợi ích đối với cây chủ

Vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào bên trong các mô của thực vật mà không gây hại cho cây cũng như không kích thích đến hệ thống đáp ứng miễn dịch của cây được gọi là vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic Bacteria, EB) EB có mặt ở tất cả các loài thực vật đã được phân tích (hơn 300.000 loài trên trái đất) [112] Trong thực tế, thực vật không chứa vi khuẩn có lợi sẽ kém chống chịu các mầm bệnh và các yếu tố gây căng thẳng từ môi trường, dẫn đến kém sinh trưởng hoặc khó tồn tại trong tự nhiên [148]

1.2.1 Đa dạng EB và cây chủ

Vi khuẩn nội sinh thực vật (EB) là một hệ quần xã với sự đa dạng phong phú

về loài, mức độ đa dạng phụ thuộc vào từng loài cây chủ, cũng như tuổi/các giai đoạn phát triển của cây, vị trí địa lý, kiểu gen, thậm chí là các mô khác nhau trên cùng một cây [52]

Nghiên cứu đa dạng của hệ EB có thể được thực hiện thông qua cách tiếp cận phân lập và nuôi cấy sử dụng các quy trình khử trùng bề mặt phù hợp [13, 32]

Theo cách tiếp cận này, EB thuộc các chi Bacillus, Burkholderia, Micrococcus, Pantoea, Pseudomonas, Stenotrophomas thường chiếm ưu thế trong bộ chủng phân

lập được [24, 53]

Tuy nhiên, vi khuẩn có thể nuôi cấy thường chỉ chiếm dưới 1% số lượng vi khuẩn nội sinh thực tế [7], nên các phương pháp đánh giá sự đa dạng thông qua DNA, đặc biệt là gen 16S rRNA như điện di gel gradient biến tính (DGGE), diện di gel gradient nhiệt độ (TGGE), đa hình độ dài đoạn giới hạn đầu cuối (T-RFLP), lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), metagenomics là những giải pháp hiệu quả hơn [8, 53,

88, 144]

Phương pháp metagenomics sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới hiện đang được sử dụng rộng rãi để phân tích đa dạng hệ EB, cho phép đưa ra bức tranh đa dạng một cách đầy đủ nhất [132] Nhiều công bố đã chỉ ra rằng

Proteobacteria là nhóm chiếm ưu thế nhất trong hệ EB, trong đó các phân lớp α-, β-

và đặc biệt là γ-Proteobacteria thường gặp hơn cả [97, 126] Một số nhóm vi khuẩn khác như Actinobacteria, Bacteroidetes và Fimicutes cũng chiếm số đông, sau Proteobacteria, trong hệ EB [122]

1.2.2 Cơ chế xâm nhập và phân tán

EB hoặc là có sẵn bên trong cây chủ hoặc là xâm nhập từ môi trường vào thông qua những phương thức khác nhau, như truyền dọc qua hạt giống, thụ tinh hoặc truyền ngang từ môi trường đất, nước, không khí hoặc qua các vật trung gian [18] Di chuyển qua hệ mạch xylem là con đường chính của EB tới các mô của cây chủ (Hình 1.3), quá trình này có thể mất vài tuần tùy từng loại cây [29] Sự có mặt của nhiều loài EB trong biểu mô của hầu hết các bộ phận của cây là một minh chứng cho việc EB xâm nhập vào hệ mạch xylem và đi đến toàn bộ cây [67]

Phương thức truyền dọc của EB thông qua hạt đã được chứng minh trên nhiều loài thực vật bằng cách phân lập vi khuẩn từ hạt đã được khử trùng bề mặt, như lúa, ngô, thuốc lá, cà phê, nho, bí ngô cùng một số loài thực vật hoang dã khác [28, 45, 55, 85, 95, 157] Hơn thế, EB được tìm thấy ở các bộ phận khác nhau của hạt như lớp áo, nội nhũ và các mô phôi [98] EB tìm thấy trong hạt thường thuộc về

các chi Bacillus và Pseudomonas, với tần suất thấp hơn có Paenibacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Pantoea và Acinetobacter [150] Tuy nhiên, sự có

mặt của EB bên trong hạt không hoàn toàn có nghĩa là chúng có nguồn gốc từ cây

bố mẹ và không phải tất cả các EB trong hạt đều tiếp tục có mặt trong cây con [42] Phân tích hệ EB trong hạt giống và cây (ở ngô, lúa) bằng công cụ metagenome cho thấy có nhiều điểm tương đồng trong thành phần loài [39, 84, 100]

Một con đường truyền dọc khác là thông qua mô phân sinh đỉnh chồi, bao gồm các cơ quan trên mặt đất như thân, lá, hoa và các cơ quan sinh sản, theo đó, các hạt đang phát triển có thể thu nhận được EB từ mô phân sinh, đảm bảo truyền EB từ

cây mẹ sang cây con [116] Ngoài truyền dọc qua hạt, EB còn được truyền qua hạt phấn bằng đường khí khổng hoặc nhờ các loài côn trùng hỗ trợ thụ phấn Mật độ

EB ở phấn hoa khá cao 106-1 09/gam và có mức đa dạng cao [90]

Hình 1.3 Các con đường xâm nhập của EB vào cây táo [42]

(A) Truyền dọc qua hạt; (B) Khí quyển vào hạt; (C) Cơ quan sinh sản; (D) qua rễ; (E) qua khí khổng vào lá; (F) Côn trùng vào cây qua hút nhựa; (G) Truyền sang hoa qua thụ phấn Xâm nhập từ môi trường bên ngoài vào cây là phương thức phổ biến nhất và

là nhân tố chính tạo nên sự đa dạng của hệ EB, các con đường chính là từ đất vào

rễ, hạt và từ không khí, nước thông qua khí khổng [5] Hệ sinh thái đất chứa quần

xã VSV vô cùng đa dạng, là nguồn gốc của nhiều loài EB trong các mô của thực vật [152] Mật độ tế bào vi khuẩn trong đất dao động từ 105 ̶ 107 CFU/g đất tươi, trong khi đó mật độ tế bào vi khuẩn vùng rễ có thể đạt đến 107 ̶ 109 CFU/g [15] Phương thức xâm nhập phổ biến của EB là thông qua tế bào lông hút, các vết thương, vết nứt trên rễ do quá trình phát triển của cây [139] Nhiều loài EB xâm nhập vào cây theo nhiều cách và ở các vị trí khác nhau [166] Hình thức xâm nhập thụ động là khi

EB đi qua các vết nứt tại khu vực rễ đang phát triển, đầu rễ hoặc những vết thương,

nơi rò rỉ các chất chuyển hóa của thực vật [53, 56] Sự xâm nhập chủ động của EB được thực hiện nhờ sản sinh các enzyme phân hủy thành tế bào (pectinase, cellulase), có hệ thống cảm ứng, có lông roi và tiên mao giúp chuyển động giật [143] Khác với các tác nhân gây bệnh, EB sản sinh các enzyme ở nồng độ thấp cũng như giữ mật độ tế bào thấp nhằm tránh kích hoạt hệ miễn dịch của cây chủ [33, 170]

Sau khi xâm nhập vào cây qua rễ/lá, EB theo hệ mạch xylem di chuyển đến các mô/cơ quan của cây nhờ lông roi [127] EB di chuyển dọc theo các khoang gian bào nhờ tiết ra các enzyme phân hủy thành tế bào như cellulase và pectinase [27] Mật độ tế bào của quần thể EB trong thân và lá có thể đạt đến 103 - 104 CFU/g sinh khối tươi thực vật trong điều kiện tự nhiên [27]

1.2.3 Vai trò của EB đối với cây chủ

Vi khuẩn nội sinh mang lại nhiều tác dụng có lợi đối với cây chủ, bao gồm (i) trực tiếp hỗ trợ cây trong thu nhận chất dinh dưỡng, điều chỉnh phytohormone, qua đó cải thiện sự tăng trưởng của cây trong điều kiện bình thường và khắc nghiệt; hoặc (ii) gián tiếp hỗ trợ cải thiện sức khỏe cây chủ bằng sản sinh chất kháng khuẩn, enzyme, cạnh tranh dinh dưỡng với mầm bệnh [88, 97]

1.2.3.1 Hỗ trợ trực tiếp

EB được chứng minh là có thể giúp cây gia tăng thu nạp chất dinh dưỡng cần thiết từ đất, bao gồm nitơ, sắt, phosphor và kích thích sinh trưởng nhờ sản sinh các phytohormone [47]

Cố định nitơ Thực vật chứa khoảng 3-4% N trong sinh khối, cao hơn nhiều so với

các chất dinh dưỡng khác Nitơ là thành phần chính của chất diệp lục, axit amin, ATP, axit nucleic [17] Nitơ cũng kích thích rễ phát triển, làm cho cây sinh trưởng nhanh, tăng chất lượng quả, lá về hàm lượng protein Nitơ còn có vai trò kích thích

sự hấp thụ và sử dụng các chất dinh dưỡng khác như K, P, đồng thời kiểm soát sự phát triển tổng thể của thực vật [17]

Trong môi trường đất nitơ tồn tại ở dạng là hợp chất hữu cơ (sinh khối) và khoáng (NH4+ và NO3 ) Thực vật chỉ sử dụng nitơ ở dạng NH4+ và NO3 , trong khi

đó phần lớn nitơ tồn tại ở dạng khí N2 trong khí quyển Nhiều loài EB mang enzyme nitrogenase xúc tác cho quá trình khử N2, tạo thành NH3 cung cấp cho cây theo phương trình phản ứng sau [118]:

EB có khả năng cố định nitơ giúp cây trồng phát triển mạnh trong môi trường thiếu N và tăng cường sức khỏe, thâm chí ở mức cao hơn là những vi sinh

vật cố định nitơ trong vùng rễ [61] Các chủng nội sinh như Gluconacetobacter diazotrophicus được tìm thấy bên trong cây mía và cây thông cho thấy khả năng cố định nitơ tốt [23] Vi khuẩn nội sinh Paenibacillus sp P22 cũng được tìm thấy bên

trong cây dương và được chứng minh là đóng góp vào tăng tổng lượng nitơ của cây chủ [131]

Hòa tan phosphor Phosphor (P) là một trong 6 chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu

(N, P, K, Ca, Mg và S) cần thiết cho thực vật Thiếu hụt P dẫn đến cây bị (i) giảm mạnh sự phát triển của rễ và chồi (chồi phát triển khẳng khiu, thẳng đứng, chồi bên chết), (ii) rụng lá sớm (lá chuyển màu nâu/tím), và (iii) kém trổ bông Thực vật hấp thu P dưới dạng phosphate (H2PO4 ) hòa tan trong đất thông qua rễ [155] Tuy nhiên, trong đất phosphor chủ yếu tồn tại ở dạng không hòa tan, do đó cây không sử dụng được [34] Phân phosphate (superphosphate) thường tạo phức với đất tới 75%

và hiệu quả đáp ứng phosphor cho cây không cao [34] Vi sinh vật, trong đó có EB

có thể làm tăng lượng phosphate hòa tan cho cây trồng nhờ các cơ chế như tạo phức, trao đổi ion và sản xuất axit hữu cơ [106] Các VSV hòa tan phosphate có tên gọi khác là vi khuẩn phân giải phosphate (Phosphate Solubilizing Bacteria, PSB) PSB tiết ra enzyme phosphatase có tác dụng khoáng hóa phospho hữu cơ, qua đó làm tăng nguồn P sử dụng được trong đất [154] PBS sản xuất một số axit hữu cơ như axit gluconic (GA), axit 2-ketogluconic, axit xitric và axit oxalic liên kết với các ion dương mạnh như Fe, Al, Ca trong muối phosphate, qua đó chuyển phosphor

về dạng hòa tan [71] Sản xuất axit hữu cơ đã được nghiên cứu ở nhiều loài EB như

sinh axit gluconic ở Burkholderia cepacia, Erwinia herbicola, Pseudomonas sp và Pseudomonas cepacia; tạo axit sulfuric và nitric ở các loài Thiobacillus và Nitrosomonas [50] Chủng nội sinh Bacillus subtilis CB8A sản xuất 6 loại axit hữu

cơ có khả năng hòa tan phosphor [96] Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng 59% EB có khả năng hòa tan phosphate khoáng [5]

Sinh siderophore Sắt là một nguyên tố quan trọng của sự sống, cần thiết cho hầu

hết các sinh vật Sắt có trong nhiều protein kiểm soát các quá trình sinh lý quan trọng ở thực vật, ví dụ như thoát hơi nước và hô hấp [88] Trong tự nhiên, sắt tồn tại chủ yếu ở dạng Fe3+ không hòa tan như oxit, hydroxit, hay các muối cacbonat, phosphate và không được sử dụng bởi thực vật Một số loài EB có khả năng sinh siderophore tạo phức với Fe3+ giúp thực vật tăng thu nhận sắt (thông qua sự phân hủy chelat ở rễ hoặc sự trao đổi phối tử) [88] Một số nghiên cứu cho thấy EB sản sinh siderophore có lợi ích đáng kể với cây trồng như tăng sinh khối chồi và rễ (ở ngô), kích thích sinh trưởng (ở cà chua trong nuôi cấy thủy canh), tăng hàm lượng diệp lục (ở cây đậu xanh) [92, 119, 134] Trong môi trường bị ô nhiễm kim loại nặng, siderophore từ EB có tác dụng giảm ảnh hưởng của hàm lượng kim loại nặng cao trong đất, qua đó tăng cường khả năng chống chịu của cây [19]

Sản sinh và điều hòa hàm lượng phytohormone Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

EB có khả năng sản sinh các phytohormone điều hòa sinh trưởng giúp tăng cường tích lũy và chuyển hóa chất dinh dưỡng, phản ứng với điều kiện môi trường, qua đó làm tăng mức sinh trưởng của cây [114, 136] Mặt khác, trong điều kiện môi trường bất lợi, EB có thể giúp thực vật điều chỉnh phytohormone để giảm tác động tiêu cực

từ các tác nhân gây căng thẳng trong môi trường [47] Các phytohormone được EB sản sinh gồm có ethylene, axit indole-3-acetic (IAA) [47]

IAA là một auxin chính ở thực vật, có vai trò kiểm soát nhiều quá trình sinh

lý quan trọng, bao gồm (i) sự phân chia, kéo dài và biệt hóa tế bào thực vật; (ii) kích thích sự nảy mầm của hạt và củ; (iii) kiểm soát các quá trình phát triển sinh dưỡng; (iv) tăng số lượng xylem và sự phát triển của rễ, hình thành rễ bên và rễ bất định…[140, 141] Ngoài ra, IAA có thể kiểm soát sự tổng hợp các phytohormone

khác như ethylene, axit gibberellic [160] Nghiên cứu trên nhiều đối tượng cây trồng như phong lan, đậu tương, dâu tây, cây dương, cây liễu… cho thấy hệ EB có khả năng sản sinh IAA tốt, làm tăng diện tích bề mặt rễ, sản lượng rễ bên, cải thiện sinh khối rễ [30, 75, 146, 151]

Ethylene là hormone thực vật quan trọng trong việc kiểm soát các phản ứng của cây khi gặp điều kiện căng thẳng sinh học và phi sinh học ngoài môi trường Ethylene ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của thực vật bằng cách thúc đẩy sự ra rễ, ức chế sự kéo dài của rễ, kích thích nảy mầm của hạt, đẩy nhanh quá trình quả chín, hoa héo, sự rụng lá và sinh tổng hợp các hormone khác [4] Tiền chất để sản xuất ethylene ở thực vật là 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC), được oxy hóa thành ethylene (Hình 1.4) [128] EB tham gia vào việc điều hòa hàm lượng ethylene nhờ có hoạt tính ACC deaminase, phân hủy ACC thành ammonia và α-ketobutyrate (Hình 1.4) [108, 120, 169] Quá trình phân hủy ACC diễn ra ở rễ cây, giúp làm giảm sự căng thẳng của thực vật, đồng thời cung cấp thêm dinh dưỡng cho cây [145]

Hình 1.4 Điều hòa phytohormone ở thực vật nhờ EB [128]

1.2.3.2 Hỗ trợ gián tiếp

EB có thể tăng cường sự sinh trưởng của cây chủ một cách gián tiếp nhờ ức chế các tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh về dinh dưỡng, sản sinh các hoạt chất đối kháng như kháng sinh, độc tố, hợp chất hữu cơ kháng khuẩn [135] EB

được chứng minh có tác động đến các mầm bệnh nấm, vi khuẩn, viru s , tuyến trùng

và côn trùng [86]

Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng là một phương thức của EB kiểm soát các tác nhân

gây bệnh là vi sinh vật Các loài EB có khả năng cao trong sử dụng nguồn dinh dưỡng sẵn có và chiếm khoảng không gian sinh trưởng sẽ giúp làm giảm mật độ và mức độ phân bố của các VSV gây bệnh Innerebner và cs đã cho thấy khả năng

cạnh tranh chất dinh dưỡng (nguồn carbon) của chủng EB Sphingomonas sp dẫn đến ức chế vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas syringae trên cây cà chua [65]

Sản sinh chất kháng sinh: VSV sản xuất kháng sinh như một chất độc, ở nồng độ

thấp có thể tiêu diệt một số loài VSV khác Trong một số trường hợp, kháng sinh do

vi khuẩn nội sinh tạo ra đặc biệt hiệu quả trong việc ngăn chặn mầm bệnh thực vật

[110] EB thuộc các chi Actinobacteria, Bacillus, Enterobacter, Paenibacillus, Pseudomonas và Serratia được công bố nhiều nhất về khả năng sản xuất kháng sinh

chống lại VSV gậy bệnh [6, 83, 86] Một số kháng sinh được sản xuất bởi vi khuẩn nội sinh tiêu diệt mầm bệnh thực vật được tổng hợp tại bảng dưới đây (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số kháng sinh sản xuất bởi EB ức chế mầm bệnh thực vật

Fusarium oxysporum Khô héo [74]

Ralstonia solani, Pyricularia oryzae

Chết rạp và đạo ôn

[165]

Sản sinh các hợp chất hữu cơ kháng khuẩn dễ bay hơi: là một chức năng khác

của EB, giúp chống lại mầm bệnh thực vật Các hợp chất này chất chuyển hóa thứ cấp của vi sinh vật có thể chứa acids, alcohols, aldehydes, aromatics, esters, heterocycles, ketones, terpenes…[162] Nghiên cứu của Massawe và cs đã cho

thấy 8 trong 16 VOCs được sản sinh từ 3 chủng Bacillus gây tác động tiêu cực đến Sclerotinia sclerotiorum, đặc biệt là axit oxalic [94] Axit 2-metylbutyric, 2- heptanone và isopentyl axetat được tạo ra bởi chủng Bacillus subtilis DZSY21 có tác dụng ức chế phát triển sợi nấm và hình thành bào tử của Curvularia lunata

[162]

Sản sinh các loại enzyme phá hủy tế bào của tác nhân gây bệnh: một số EB có

khả năng sản sinh enzyme như chitinase, cellulose, β-1,3 glucanases, proteases, có tác dụng làm đông cứng 1 phần thành tế bào của nhiều nấm gây bệnh, bao gồm

Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Rhizoctonia solani và Pythium ultimum [43, 72, 109, 138]

Sản sinh siderphore: EB sinh siderophore giúp cây chủ tăng cường thu nhận sắt,

dẫn đến hạn chế sắt cho tác nhân gây bệnh, qua đó kìm hãm sự phát triển của

chúng Nghiên cứu thực hiện trên chủng EB Pseudomonas putida đột biến tăng

cường sản sinh siderphore cho hiệu quả tốt bảo vệ thực vật khỏi nấm bệnh

Fusarium oxysporum [93, 156] Tương tự như vậy, siderphore dạng hydroxamat từ các chủng Methylobacterium spp cũng cho thấy hiệu quả trong việc giảm thiểu tác hại từ bệnh úa lá loang lổ trên cây có múi do Xylella fasrantyosa subsp pauca gây

ra [77]

Điều hòa phytohormone: Sự xuất hiện của mầm bệnh thường dẫn đến tăng cường

sinh tổng hợp ethylene ở thực vật, làm tăng mức độ trầm trọng của bệnh EB sản xuất ACC deaminase giúp ngăn cản quá trình tổng hợp ethylene có thể giúp làm giảm thiệt hại cho cây trồng do mầm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm [48,

54, 62, 87]

Một số EB có thể kích hoạt hệ thống cảm ứng đề kháng (Induced Systemic Resistance, ISR) ở thực vật, qua đó giảm mức độ ảnh hưởng của mầm bệnh do

nấm/vi khuẩn/virus gây ra, tăng cường khả năng chịu áp lực của cây trồng [10] ISR

là một cơ chế đề kháng ở thực vật, được kích hoạt khi cây bị VSV tấn công, truyền tín hiệu bằng axit jasmonic, axit salicylic và ethylene [26, 163] EB có thể tạo ra các phản ứng miễn dịch ngắn hạn nhờ kích hoạt điều chỉnh phytohormone ở rễ trong quá trình xâm nhập cây chủ [115] Trong nghiên cứu của Benhamou, quá trình kích

hoạt ISR do chủng EB Bacillus pumilus SE34 đã được xác định gồm các bước (i)

xây dựng hàng rào cấu trúc, sản xuất một số hợp chất độc hại (như phenolic và phytoalexinc), (ii) tích lũy các enzyme thủy phân (như chitinase, β-1, 3-glucanase), (iii) giải phóng oligosaccharid, dẫn đến kích thích các phản ứng phòng vệ khác, qua

đó giúp thực vật nâng cao hệ thống phòng thủ, hạn chế sự xâm nhập của các mầm bệnh tiềm ẩn [14] Trong nghiên cứu khác, cảm ứng ISR ở cây cà chua bởi các

chủng EB Bacillus subtilis IN937b, Bacillus pumilus SE34, và Bacillus amyloliquefaciens IN937a được chứng minh là có thể giúp cây chủ chống lại virut

khảm dưa chuột [57, 167]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Mẫu lúa và chủng vi khuẩn kiểm định

- Cây lúa khỏe mạnh và cây bị bệnh thối gốc/thân được thu tại 3 miền Bắc, Trung, Nam của Việt Nam (thuộc đề tài NĐT.34.ITA/17) theo hướng dẫn của các chuyên gia bệnh học thực vật tại viện Bảo vệ Thực vật (Bộ NN&PTNT) Các địa điểm thu mẫu lúa trong các năm 2017 – 2018 lần lượt

là Phú Yên, Khánh Hòa, Thái Bình, Long An.

- Chủng Dickeya zeae DZ2Q do GS Venturi tại ICEGB cung cấp được sử

dụng làm vi khuẩn kiểm định [16].

2.1.2 Hóa chất

- Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật đều có tiêu chuẩn chất lương cao từ các hãng cung cấp có uy tín như Meck (Đức), Sigma (Mỹ), Wako (Nhật), Himedia (Ấn Độ), Biobasic (Canada)

- Hóa chất và một số kit dùng cho sinh học phân tử từ các hãng Bioneer (Hàn Quốc), Fermentas (Đức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ)

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh thái Vi sinh vật Ứng dụng, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQGHN, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học, sinh học phân tử và hóa phân tích đạt tiêu chuẩn quốc tế

- Bể ổn nhiệt (Jeio Tech, Hàn Quốc);

- Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản);

- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức);

- Máy PCR (Eppendorf, Đức);

- Thiết bị điện di ngang (Nyx Technik, Mỹ);

- Máy GelDoc (BioRad, Mỹ);

- Máy đo quang phổ UV – Vis (Beckman Coulter, Mỹ);

- Kính hiển vi phản pha và huỳnh quang (Zeiss, Đức);

- Nồi khử trùng Hyrayama HV 110 (Nhật Bản);

- Tủ an toàn sinh học cấp II (Esco Labculture kiểu A2, Anh);

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Agilent HPLC 1260, Mỹ);

- Tủ ấm lắc MaxQ 4000 (Thermo Scientific, Mỹ);

- Máy cô quay (IKA RV 10 V – C, Đức);

- Tủ hood (ESCO, Anh)

Ngoài ra, một số thiết bị, dụng cụ cần thiết cho quá trình nuôi cấy và thí nghiệm như đĩa petri, bình tam giác, bình duran, pipet, que cấy…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh

Xử lý mẫu Thân, rễ, lá của cây lúa được rửa sạch bằng nước máy, sau đó cắt phần

thân thành các đoạn có kích thước từ 5 – 7 cm, tương ứng với trọng lượng từ 0,5 – 1

g Các đoạn thân lúa được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong các dung dịch cồn 75%, hypochlorire 50% (7% hoạt tính Cl) và rửa sạch 05 lần bằng nước cất vô trùng Nước rửa cuối (100  l) được cấy trải và một phần mẫu sau khi khử trùng bề mặt được đặt lên đĩa môi trường TSA 1/6 (Himedia, Ấn Độ) trong 60 phút trước khi tiến hành nghiền mẫu để làm đối chứng kiểm tra mức tinh sạch của bước khử trùng

bề mặt và xác định các vi khuẩn ngoại sinh (epiphytic) còn lại trên bề mặt mẫu Các đĩa được ủ tại nhiệt độ 30  C trong 3 – 5 ngày

Phân lập vi khuẩn nội sinh Mẫu thân lúa sau khử trùng bề mặt được nghiền mịn

trong 10 ml đệm PBS 1  vô trùng, sử dụng chày và cối sứ đã khử trùng Dịch nghiền được pha loãng theo dãy 101 - 106 và cấy gạt (100  l) trên môi trường

thạch đĩa TSA 1/6 ở các nồng độ pha loãng khác nhau, các đĩa sau đó được ủ tại

nhiệt độ 30oC trong 3 - 5 ngày Các khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái khác biệt so với

đĩa đối chứng được lựa chọn và tinh sạch lại trên đĩa TSA 1/6 cho đến khi thu được chủng thuần khiết

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng Dickeya zeae (Dz)

Chủng vi khuẩn Dickeya zeae DZ2Q được nuôi trong môi trường dịch thể

TSB (Himedia, Ấn Độ), lắc 160 vòng/phút ở 30°C trong 24 giờ và sử dụng làm chủng kiểm định Môi trường thạch TSA được khử trùng, để nguội xuống nhiệt độ dưới 50°C rồi bổ sung dịch nuôi vi khuẩn kiểm định theo tỷ lệ 1% (v/v), lắc nhẹ và

đổ vào các đĩa petri Vi khuẩn nội sinh được nuôi trên môi trường thạch đĩa TSA 1/6 hoặc môi trường dịch thể TSB 1/2 tại 30oC trong 24 giờ Tạo các thỏi thạch có khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh và đặt lên đĩa petri chứa vi khuẩn kiểm định, khoảng cách giữa các thỏi thạch khoảng 3 cm [69] Đối với các mẫu là dịch chiết thô hoặc phân đoạn thu được từ sắc ký lỏng cao áp (HPLC), 50  l mẫu được nhỏ vào các lỗ có đường kính 5 mm được tạo ra trên đĩa thạch chứa vi khuẩn kiểm định [89] Ủ các đĩa thử hoạt tính ở nhiệt độ 30°C và đọc kết quả sau 24 giờ Khả năng

kháng Dz của chủng vi khuẩn nội sinh được xác định dựa vào kích thước vòng kháng khuẩn (ΔD) quanh vị trí thỏi thạch hoặc lỗ đã nhỏ dịch

ΔD = D – d

Trong đó: D là đường kính vùng kháng khuẩn (mm)

d là đường kính thỏi thạch (mm)

2.2.3 Tách DNA genome từ các chủng vi khuẩn thuần khiết

DNA genome của chủng vi khuẩn thuần khiết được tinh sạch theo phương pháp của Marmur [91], gồm các bước như sau:

- 1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 – 10000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8)

- Thêm 50 µl lysozyme (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong

1 giờ

- Thêm 50 µl SDS (20%) và 50 µl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong

bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ

- Thêm 400 µl PCI, trộn đều trong 1 - 3 phútt, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút Lặp lại bước vừa rồi thêm 1 lần

- Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3 M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (để lạnh  20oC), trộn đều và giữ ở  20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, thu kết tủa DNA

- Rửa DNA trong ethanol 70% (để lạnh  20oC) trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút rồi đổ cồn và làm khô DNA ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan DNA trong 50 µl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại

 20  C cho các thí nghiệm tiếp theo

Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% bổ sung Redsafe (trong đệm TAE 1  ) tại 100 V trong thời gian 15 phút Sau khi điện di, gel agarose được chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad)

2.2.4 Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại

Gen 16S rDNA (  1500 bp) của các chủng nội sinh thuần khiết được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)

và 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT) với thành phần và chu trình phản ứng

mô tả ở bảng 2.1

Gen 16S rDNA của các chủng thuần khiết (  1500 bp) sau khi tinh sạch bằng kít PCR-purification (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems Trình tự gen sau đó được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining, trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều [37, 124]

Bảng 2.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA

Thành phần phản ứng Thể tích

(µl)

Nhiệt độ (oC) Thời gian

Chuẩn bị cây thí nghiệm: Hạt giống lúa Bắc Thơm được sử dụng trong các thí

nghiệm in planta Trước khi gieo, hạt giống được phơi nắng 30 phút, sau đó được

khử trùng bề mặt trong dung dịch NaClO 50% (7% hoạt tính clo) trong 30 phút rồi rửa sạch trong nước cất vô trùng 5 lần Để xác nhận bước khử trùng bề mặt, 100 µl dịch rửa lần cuối cùng được cấy trải trong môi trường thạch TSA1/2

Hạt giống sau đó được đặt trong thạch 1 % bổ sung dinh dưỡng Hoagland (Bảng 2.2), ủ trong điều kiện tối ẩm, nhiệt độ 30  C trong 7 ngày Hạt nảy mầm được chuyển vào trồng trong ống falcone 50 ml có chứa 35 ml môi trường bán rắn (0,3% agar) Hoagland 1/2, để phát triển trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, 8 giờ tối,

30  C, độ ẩm 70%, tưới bằng nước khử trùng 2 ngày/1 lần, tạo cây lúa 0 ngày tuổi [73, 142]

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch Hoagland (dung dịch mẹ 2  )[142]

Iron chelate (Fe-EDTA hoặc Fe-DTPA, hoặc

Manganese chloride 4-hydrate (MnCl2.4 H2O 1,81 g

Thí nghiệm in planta đánh giá khả năng kiểm soát Dz [78]

Cây lúa15 ngày tuổi (32 cây) được sử dụng trong thí nghiệm Vi khuẩn nội sinh được nuôi trong môi trường TSB ở 30oC, 160 vòng/phút trong 24 giờ; chủng vi

khuẩn kiểm định Dz được nuôi trong môi trường TSB ở 30  C trong 24 giờ, sau đó được pha loãng bằng TSB tới OD600 = 0,1

Nhiễm Dz vào cây được tiến hành như sau: 16 cây được nhiễm Dz bằng cách nhúng đầu kim tiêm vào dịch nuôi Dz (OD600 = 0,1) và chích 2 lần vào thân ở vị trí cách gốc 1 cm, phía trên mặt thạch Sau 1 ngày, theo cách tương tự chích vi khuẩn nội sinh (OD600 = 0.1) vào cùng một vị trí đã chích Dz đối với 8 trong số 16 cây

chích vi khuẩn nội sinh (OD600 = 0.1) đối với 8 cây Như vậy thí nghiệm gồm 4 công thức (mỗi công thức 8 cây) như sau:

- Công thức 1: Nhiễm Dz;

- Công thức 2: Nhiễm đồng thời vi khuẩn nội sinh và Dz;

- Công thức 3: Đỗi chứng chỉ nhiễm vi khuẩn nội sinh;

- Công thức 4: Đối chứng không có vi khuẩn

Các cây thí nghiệm được trồng lại trong 35 ml thạch bán lỏng chứa Hoagland 1/2 ở 30°C, độ ẩm 75%, chu kỳ sáng-tối 16 giờ-8 giờ, theo dõi trong 8 ngày Kết quả được đánh giá bằng hiệu quả phòng trừ và chiều dài tổn thương trên cây lúa [78]

Hiệu lực phòng trừ tính theo công thức của Abbott [3]:

Hiệu lực (%) = C ̶ B C × 100

Trong đó: C = TLB (%) ở công thức 1

B = TLB (%) ở công thức 2

TLB = Số cây bệnh/Số cây thí nghiệm

2.2.6 Tách chiết và xác định hoạt chất sinh học kháng Dz

Tách chiết hoạt chất sinh học: Dịch nuôi vi khuẩn nội sinh được ly tâm ở 4000

vòng/phút trong 15 phút để loại sinh khối Tách chiết hoạt chất được tiến thành với

4 loại dung môi bao gồm: ethyl acetate, butanol, ethanol và n-hexan theo tỷ lệ 1:1 với 3 lần lặp lại Sau quá trình khuấy đảo, lớp dung môi chứa hoạt chất được thu hồi

và cô bằng máy cô quay chân không với nhiệt độ bể gia nhiệt là 30oC Cao chiết được hòa tan lại bằng acetonitrile (ACN) và sử dụng cho bước tinh sạch tiếp theo

Tinh sạch và xác định cấu trúc hoạt chất sinh học: Dịch chiết thô được đưa về

nồng độ ACN 15% rồi đưa lên cột sắc ký lọc gel C18 (Agilent, Mỹ), sử dụng dung môi ly giải ACN có nồng độ lần lượt là 15%, 30%, 45%, 60%, 80% và 100% Mỗi nồng độ được bơm qua cột 2 lần nhằm đảm bảo ly giải hoàn toàn các chất có phân

tử lượng phù hợp với từng nồng độ Dịch ly giải được kiểm tra hoạt tính kháng Dz

để lựa chọn phân đoạn có hoạt tính kháng tốt nhất và tiếp tục phân tích bằng HPLC

sử dụng cột sắc ký phản pha Eclipse Plus C18 (150  4,6 mm; 3 µm) (Agilent, Mỹ), dung môi CH3CN/H2O với nồng độ CH3CN tăng dần từ 15 - 85% trong 35 phút với tốc độ 1,2 ml/phút

Thu các phân đoạn (1 phân đoạn/1 phút) và tiến hành thử hoạt tính kháng Dz

để xác định phân đoạn có hoạt tính kháng tốt nhất Thu các phân đoạn tương ứng

với các đỉnh riêng biệt để thử hoạt tính kháng Dz

Hoạt chất đơn kháng Dz được thu thập và được làm khô trên thiết bị đông

khô, sau đó tiến hành xác định phổ khối (Agilent 1100 LC-MSD Trap, Mỹ) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) (Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Mỹ) tại Trung tâm Đổi mới công nghệ, VAST

2.2.7 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và sinh lý của vi khuẩn nội sinh

Hình thái tế bào vi khuẩn nội sinh được quan sát dưới kính hiển vi phản pha

1000  và kính hiển vi điện tử quét (SEM) Tế bào được nhuộm Gram theo hướng dẫn của nhà sản xuất Khuẩn lạc được quan sát sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới sinh trưởng của chủng vi khuẩn nội sinh được đánh giá trong thí nghiệm nuôi cấy ở dải nhiệt độ 25, 30, 37, 42  C; dải

pH 5, 6, 7, 8, 9; dải độ mặn 0, 0.5, 1, 1.5, 2% (w/v) Ảnh hưởng của các điều kiện dinh dưỡng khác nhau được đánh giá, gồm nguồn carbon (glucose, sucrose, acetate, methanol, rỉ đường), nguồn nitơ (casein, cao thịt, cao nấm men, peptone) dựa theo môi trường cơ bản Landy (Bảng 2.4) [159] Sinh trưởng của vi khuẩn nội sinh được đánh giá thông qua giá trị OD600 sau 24 giờ nuôi cấy.

Bảng 2.4 Thành phần môi trường Landy [159]

STT Thành phần Khối lượng (g/L)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây lúa

Mẫu lúa được sử dụng để phân lập vi khuẩn nội sinh là các giống lúa chủ đạo

ở các địa phương đại diện cho các vùng canh tác thuộc ba miền Bắc, Trung, Nam, gồm có giống lúa Bắc Thơm tại Thái Bình, giống lúa IR17494 tại Phú Yên, giống lúa ML202 tại Khánh Hòa và lúa nếp IR4625 tại tỉnh Long An Cây lúa thu thập bao gồm cây khỏe và cây bị bệnh thối rễ dưới sự hướng dẫn của chuyên gia từ viện Bảo vệ Thực vật Các mẫu lúa được giữ trong túi kín, bảo quản mát và đưa về

phòng thí nghiệm Trong thời gian thu mẫu, bệnh thối thân do Dz không có biểu

hiện rõ rệt

Vi khuẩn nội sinh được phân lập từ các mẫu thân, rễ, lá của cây lúa sau khi khử trùng bề mặt Các chủng được lựa chọn phân lập dựa trên so sánh loại trừ với các đĩa đối chứng (i) mẫu đã khử trùng bề mặt đặt trực tiếp trên môi trường dinh dưỡng và (ii) nước rửa lần cuối của mẫu sau bước khử trùng bề mặt (Hình 3.1)

Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh lúa (A) đĩa cấy gạt từ mẫu rễ sau khi khử trùng bề mặt; (B)

Đĩa kiểm chứng đặt trực tiếp mẫu thân, rễ, lá sau khi khử trùng bề mặt; (C) Đĩa cấy gạt nước rửa mẫu rễ lần cuối sau khi khử trùng bề mặt

Kết quả cho thấy, số lượng vi khuẩn còn lại trong dịch rửa cuối rất ít (Hình 3.2C) Tuy nhiên, mẫu rễ/thân/lá sau khi đã khử được trùng bề mặt vẫn còn chứa nhiều vi khuẩn bám dính bề mặt, đặc biệt là ở các mẫu thân và rễ (Hình 3.2B) Các khuẩn lạc phát triển trên đĩa đối chứng (Hình 3.2B) sẽ được loại trừ trong quá trình thu nhận khuẩn lạc từ mẫu nghiền để phân lập EB (Hình 3.2A) Những khuẩn lạc

chắn thu được chủng thuần khiết Các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được bảo quản trong glycerol 15% tại  20  C

Tổng cộng, chúng tôi đã phân lập được 470 chủng vi khuẩn nội sinh từ các mẫu lúa thu thập từ các vùng canh tác khác nhau (Bảng 3.1) Có thể thấy, số lượng

vi khuẩn phân lập được từ rễ luôn là nhiều nhất, sau đó đến thân và lá Do số lượng mẫu lúa thu thập ở Phú Yên và Khánh Hòa ít hơn so với hai địa điểm còn lại nên số chủng vi khuẩn phân lập được cũng thấp hơn

Bảng 3.1 Số lượng vi khuẩn nội sinh phân lập từ các mẫu lúa

TT Địa điểm thu mẫu

*Hình thái khác với các khuẩn lạc xuất hiện trong các mẫu đối chứng

3.2 Sàng lọc vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng Dickeya zeae (Dz)

Chủng Dickeya zeae DZ2Q do GS Venturi tại ICGEB cung cấp được sử

dụng làm chủng kiểm định để sàng lọc Chủng DZ2Q thể hiện độc tính mạnh trên giống lúa Bắc Thơm trong thử nghiệm ở Việt Nam (Hình 3.2)

Hình 3.2 Tế bào của chủng DZ2Q qua kính hiển vi phản pha (A) và lúa Bắc Thơm bị lây bệnh

nhân tạo từ chủng DZ2Q tại viện Bảo vệ Thực vật (B)

Phương pháp khuếch tán đặt thỏi thạch được sử dụng để kiểm tra khả năng

ức chế Dz của các chủng vi khuẩn nội sinh lúa đã phân lập được Tổng số có 20 chủng nội sinh lúa thể hiện hoạt tính đối kháng Dz với đường kính vòng kháng

khuẩn trong khoảng từ 2-12 mm (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc tìm kiếm các chủng vi khuẩn nội sinh lúa kháng Dz

STT Tên chủng Đường kính vòng

kháng khuẩn (mm)

Phân lập từ bộ phận của cây

Trong số 20 chủng có hoạt tính kháng Dz sàng lọc được, chỉ có chủng VY03

được phân lập từ rễ lúa ở Thái Bình, 19 chủng còn lại đều được phân lập từ thân và