Nghiên cứu đa hình di truyền gen cathl4 mã hóa peptide kháng khuẩn nhóm cathelicidin ở bò vàng bản địa việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỖ THỊ TƯƠI NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM CATHELICIDIN Ở BÒ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ

ĐỖ THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ

HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM

CATHELICIDIN Ở BÒ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ THỊ TƯƠI

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CATHL4 MÃ

HÓA PEPTIDE KHÁNG KHUẨN NHÓM

CATHELICIDIN Ở BÒ VÀNG BẢN ĐỊA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội - 2021

Tôi xin chân thành cảm ơn các quý thầy cô, cùng các học viên cao học của

Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học và các Phòng chức năng trực thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi môi trường học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt chương trình học Cao học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên chăm sóc, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Ngày 29 tháng 01 năm 2021

Học viên cao học

Đỗ Thị Tươi

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan cathelicidin 3

1.1.1 Nguồn gốc phát sinh và tổ chức hệ gen cathelicidin ở động vật có vú 3

1.1.2 Cấu trúc và hoạt tính chức năng của cathelicidin 4

1.1.3 Cơ chế tác động và miễn dịch của cathelicidin ở động vật có vú 7

1.2 Họ gen CATHL và tình hình nghiên cứu đa hình di truyền CATHL4 ở gia súc 11

1.2.1 Tính đa dạng của họ gen CATHL ở trâu và bò 11

1.2.2 Tình hình nghiên cứu gen CATHL4 13

1.3 Bò vàng Việt Nam và tiềm năng phân hóa di truyền mở rộng của gen CATHL4 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Mẫu DNA tổng số 17

2.1.2 Mồi 17

2.3.3 Hóa chất 18

2.3.4 Thiết bị 18

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.5 Phương pháp nghiên cứu 19

2.5.1 Định hướng và thiết kế nghiên cứu 19

2.5.2 Phương pháp khuếch đại gen CATHL4 21

2.5.3 Phương pháp phân tích trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR 22

2.5.4 Phương pháp tách dòng gen CATHL4 22

2.5.5 Phương pháp phân tích đa hình exon 4 – CATHL4 dựa trên kỹ thuật phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (single strand conformation polymorphism – SSCP) 24

2.5.6 Phương pháp phân tích đa hình trình tự gen CATHL4 từ các dòng plasmid phân tích 26

2.5.7 Xác định số bản sao gen CATHL4 bằng phương pháp Real time PCR 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Khuếch đại và tinh sạch gen CATHL4 29

3.2 Kết quả phân tích trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR 29

3.3 Tách dòng gen CATHL4 và sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp 30

3.4 Phân tích đa hình sợi đơn SSCP vùng exon 4 của gen CATHL4 32

3.5 Kết quả phân tích đa hình trình tự gen CATHL4 tách dòng 33

3.6 Kết quả phân tích đa hình số bản sao của gen CATHL4 có trong hệ gen bò vàng Việt Nam 36

3.6.1 Xây dựng đường chuẩn trong định lượng số bản sao gen CATHL4 36

3.6.2 Kết quả xác định đa hình số bản sao gen CATHL4 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cơ chế phân tử được đề xuất về nguồn gốc của cathelicidin từ cystatin 4

Hình 2: Mô hình cấu trúc và sự hình thành cathelicidin có hoạt tính chức năng 5

Hình 3: So sánh trình tự peptide kháng khuẩn của các phân tử protein CATHL tiền thân ở bò với các loài động vật có vú khác 6

Hình 4: Vai trò, chức năng của cathelicidin ở động vật có vú 7

Hình 5: Cơ chế hoạt động của cathelicidin 8

Hình 6: Ức chế hoạt hóa TLR qua trung gian nội độc tố bởi cathelicidin 9

Hình 7: Cathelicidin (LL-37) tác động ảnh hưởng đến biệt hóa tế bào và kích thích hình thành các chemokine định hướng tế bào sao và thu hút, thúc đẩy tăng sinh tế bào B 10

Hình 8: So sánh vùng trình tự axitamin biến đổi từ 12 biến thể phát sinh gen CATHL4 ở trâu 14

Hình 9: Kết quả PCR khuếch đại gen CATHL4 29

Hình 10: Kết quả giải trình tự gen CATHL4 trực tiếp từ sản phẩm PCR của một đoạn trình tự gen CATHL4 30

Hình 11 Khuẩn lạc thu được sau khi biến nạp vector pJET1.2 mang gen CATHL4 vào tế bào E coli trên môi trường LB ampicilin 31

Hình 12 Kết quả PCR sàng lọc khuẩn lạc với mồi pJET1.2 31

Hình 13 Kết quả chạy điện di SSCP trên gel polyacrylamide 32

Hình 14: Kết quả PCR xác định tính chính xác và chiều gắn của đoạn gen CATHL4 chèn trên vector pJET1.2 33

Hình 15: Trình tự xác định và dự đoán cấu trúc của peptide cathelicidin-4 35

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩn qPCR và đường cong nóng chảy của gen CATHL4 và GAPDH 37

Hình 17: Đường cong khuếch đại và đường chuẩn của định lượng tuyệt đối bằng qRT- PCR 38

Hình 18: Số lượng bản sao trung bình của gen CATHL4 trong DNA hệ gen của bò vàng trên 4 vùng địa lý Việt Nam 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Phân loại cấu trúc, chức năng và vị trí biểu hiện của các gen CATHL đã xác

định trên bò (Bos taurus) 12

Bảng 2: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu xác định đa hình CATHL4 ở bò vàng 17

Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen CATHL4 21

Bảng 4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen CATHL4 21

Bảng 5 Thành phần phản ứng nối 22

Bảng 6 Thành phần phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc 23

Bảng 7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc 23

Bảng 8 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn exon 4 - CATHL4 25

Bảng 9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn exon 4 - CATHL4 25

Bảng 10: Thành phần hóa chất gel polyacrylamide 12%, 0.5X TBE 26

Bảng 11 Thành phần phản ứng Real-Time PCR định lƣợng số bản sao của gen CATHL4 27

Bảng 12 Chu trình nhiệt phản ứng Real-Time PCR định lƣợng số bản sao của gen CATHL4 27

Bảng 13: Thống kê các đa hình SNP, indel trên vùng exon của gen CATHL4 34

Bảng 14: Kết quả xác định số bản sao gen CATHL4 ở các quần thể bò vàng Việt Nam 39

Bảng 15: Số bản sao của gen CATHL4 xác định đƣợc trên các cá thể bò vàng Việt Nam 40

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AMP Antimicrobial peptide Peptide kháng khuẩn

AMD Antimicrobial domain Miền kháng khuẩn

APCs Antigen-presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên APS Ammonium persulphate Amoni persulfate

APOL3 Apolipoprotein L3 Apolipoprotein L3

ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat

BMAP Bovine myeloid antimicrobial

peptide

Peptide kháng khuẩn dòng tủy

bò

BTA22 Bos taurus chromosome 22 Nhiễm sắc thể số 22 của Bos

taurus

cDNA Complementary DNA DNA bổ sung

CNV Copy number variation Biến đổi số bản sao

CXCL13 C-X-C Motif Chemokine Ligand

13

Phối tử chemokine 13

DNA Deoxyribose Nucleic Acid Axit deoxyribose nucleic

ddH2O Deionized distilled H2O Nước cất khử ion

LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide

LTA Lipoteichoic acid Axit lipoteichoic

ng / µl Nanogram / Microlit Nanogam trên Microlit

nsSNP Nonsynonymous single

nucleotide polymorphism

Đa hình nucleotide đơn sai nghĩa

OD Optical density Mật độ quang học

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PG / NPG Prognostic gene /

non-prognostic gene

Gen tiên lƣợng / Gen không tiên lƣợng

qRT-PCR Quantitative real time

polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase định lƣợng thời gian thực

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

SDS Sodium dodecylsulphate Natri dodecyl sulfat

SEM Standard error of the mean Sai số chuẩn của trị số trung

bình

ssDNA Single-stranded DNA DNA sợi đơn

SSCP Single-strand Conformation

Polymorphism

Đa hình cấu trúc sợi đơn

Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus

TBE Tris-Borate-EDTA Tris-Borate-EDTA

TEDMED N, N, N’, N’-

Tetramethyl-Ethylenediamine

N, N, N’, N’- Ethylenediamine

Tetramethyl-TLR Toll-like receptor Thụ thể giống toll

TNFa Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

SYBR Asymmetrical cyanine dye Thuốc nhuộm asymmetrical

cyanine

U Enzyme unit (μmol/min) Đơn vị enzyme (μmol/min)

µg / l Microgram / Lit Microgam / lít

1

MỞ ĐẦU

Cathelicidin-4 là một loại peptide kháng khuẩn (AMP) có tính lưỡng ái, có khả năng diệt khuẩn phổ rộng với vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm, động vật nguyên sinh [5, 11, 45] và tham gia vào đáp ứng miễn dịch bẩm sinh bảo

vệ vật chủ [52] Ở nồng độ cao, cathelicidin-4 có hoạt động kháng khuẩn trong thời gian kéo dài, ức chế trực tiếp HIV trong ống nghiệm [40] Đặc biệt, cathelicidin-4

có độc tính thấp đối với tế bào chủ [9] nên nó thuộc nhóm peptide được nhắm đến như các đáp ứng điều trị trong phát triển kháng sinh mới và peptide kháng khuẩn

Cathelicidin-4 (indolicidin) là thành viên thuộc họ cathelicidin ở gia súc

được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới, được mã hóa bởi gen CATHL4 Cấu trúc gen

CATHL4 có 4 exon với trình tự đầu N mã hóa cho peptide tín hiệu và protein

cathelin tương đối bảo thủ [59], trình tự kháng khuẩn đầu C (AMD) mã hóa cho

peptide cathelicidin-4 có tính đa hình cao Gen CATHL4 có mức nhân lặp mạnh, đã

được xác định với 6 – 12 bản sao (CNV) ở trâu Ấn Độ [9] và 3 – 11 CNV ở giống

bò địa phương tại Pháp, Đức, Ý, Anh… [22] Nhiều nghiên cứu cho thấy mức độ đa

hình di truyền gen CATHL4 ở trâu, bò là cao Xu hướng tiến hóa tái sắp xếp gen và phân hóa theo hướng biến đổi gen CATHL4, mở rộng họ gen CATHL là phổ biến ở

nhiều nhóm trâu, bò trên thế giới Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu về các gen mã hóa cathelicidin cũng như chưa có các công bố liên quan

Bò vàng Việt Nam thuộc giống bò vàng phương Nam, hình thành qua nhiều đời lai tạo và tạp giao giữa các giống bò Lào, Campuchia, Mianma, Ấn Độ và Trung Quốc [3] Bò thuộc bộ động vât nhai lại, có khả năng chuyển đổi thức ăn thô xanh thành năng lượng tích lũy, cho sức cày kéo, thịt, sữa và các sản phẩm như da, sừng, móng Bò vàng có sức sống, khả năng kháng bệnh, chống chịu và thích nghi tốt dưới nhiều điều kiện bất lợi về khí hậu, dinh dưỡng, môi trường Đặc biệt,

CATHL ở người và bò có tới 70% tương đồng về trình tự, có chung chức năng bảo

thủ và có tính chất tương đồng về biểu hiện hoạt tính chống độc tố, phù hợp về mặt sinh lý [36] Dựa trên các đặc tính sinh học của bò vàng cho thấy tiềm năng mang

2

lợi thế và tiềm tàng khả năng phân hóa với nhiều dạng đa hình di truyền gen

CATHL4

Nghiên cứu tính đa hình gen CATHL4 trên bò vàng Việt Nam góp phần làm

sáng tỏ mối liên quan với tính chống chịu, khả năng kháng bệnh và mối liên quan giữa các quần thể bò vàng ở nước ta và các nhóm bò trên thế giới Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, hướng nghiên cứu về các gen mã hóa peptide kháng

khuẩn ở trâu bò nói chung và nghiên cứu đa hình gen CATHL4 ở bò vàng Việt Nam

là cần thiết Do đó, đề tài: “Nghiên cứu đa hình di truyền gen CATHL4 mã hóa

peptide kháng khuẩn nhóm cathelicidin ở bò vàng bản địa Việt Nam” đã được

thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xác định được tính đa hình di truyền gen

CATHL4 (về trình tự DNA và số bản sao gen) ở các quần thể bò vàng thu thập tại

một số khu vực phân bố tại Việt Nam

Các nội dung nghiên cứu:

- Khuếch đại gen CATHL4 từ DNA tổng số của bò bằng kỹ thuật PCR và

giải trình tự trực tiếp

- Tách dòng gen CATHL4, khuếch đại đoạn gen có tiềm năng bộc lộ tính

đa hình về trình tự gen (exon 4) của gen CATHL4 bằng PCR, phân tích đa hình gen bằng kỹ thuật SSCP và giải trình tự các biến thể gen CATHL4

- Phân tích tính đa hình số bản sao của gen CATHL4 có trong hệ gen của

bò vàng Việt Nam

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kinh phí từ đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số KLEPT.18-02

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cathelicidin

1.1.1 Nguồn gốc phát sinh và tổ chức hệ gen cathelicidin ở động vật có vú

Thuật ngữ cathelicidin được đặt ra vào năm 1995, bắt nguồn từ sự tương đồng trong trình tự với protein cathelin, một thành viên của họ cystatin - chất ức chế protein cysteine (cathelin là viết tắt của chất ức chế cathepsin L) [59] Cathelicidin

ban đầu được phát hiện trong bạch cầu trung tính ở cá mút đá Atlantic (Myxine

glutinosa), sau đó được tìm thấy ở người và nhiều loài động vật khác Tiền thân

cathelicidin được tìm thấy trong các tế bào tủy, tế bào biểu mô của da và đường tiêu hóa, trong khi các dạng cathelicidin trưởng thành được tìm thấy ở bề mặt niêm mạc

và trong dịch tiết của cơ thể như mồ hôi, sữa mẹ và nước bọt [29, 31] Các cathelicidin được phân lập đầu tiên là cecropin vào năm 1980 từ các mô của bướm

Hyalophora cecropia sau một nghiên cứu 10 năm về khả năng miễn dịch của côn

trùng [25] và từ bạch cầu trung tính của bò là bactenecin, được đặt tên là Bac5 và Bac7 [24] Một thành viên khác của họ cathelicidin, magainin, đã được phân lập

vào năm 1987 từ da của loài ếch Xenopus leavis [64]

Cathelicidin được hình thành bởi sự nhân lặp, phân hóa từ các cystatin với cơ

chế được Zhu (2008) mô tả: các miền kháng khuẩn (AMD) của CATHL được tạo ra

do một đột biến điểm xuất hiện trong quá trình tiến hóa làm mất bộ ba kết thúc của exon III và mở rộng khung đọc đến codon kết thúc ở khung đọc tiếp theo, đoạn trước đó là 3’UTR trở thành intron I03 của gen CATHL (Hình 1) Sau đó, bộ ba kết

thúc ở khung đọc tiếp theo bị đột biến trở thành vị trí cắt nối Exon IV (E4) sau đó

đã đạt được sự phân hóa trở thành domain kháng khuẩn (AMD) [59]

Tổ chức gen CATHL ở động vật có phân hóa đa dạng, được phân loại và đặt tên riêng trên các loài Ở động vật có vú đã xác định được hơn 60 gen CATHL

Trong đó, số lượng lớn gen được xác định ở các loài thú đơn huyệt và thú có túi, có

14 gen CATHL phân ly đã được xác định ở hệ gen của thú có túi tammar wallaby, 8 gen ở thú mỏ vịt (MaeuCath1 – 8) [57], 19 gen ở chồn Opossum (ModoCath1 – 19)

4

[16], và 3 thành viên ở chim Cút (Cc-CATH1, 2 và 3) [21] Ở gia súc, 7 thành viên

họ CATHL đã được xác định ở bò (CATHL1 – 7); 7 gen CATHL chính được xác định ở trâu (CATHL1 – 6 và CAMP) [9]; 8 thành viên được phát hiện ở hươu xạ rừng (CATHL1p, CATHL3L2, CATHL4 – 7, CATHL8p và CATHL9) [63]; 4 loại

CATHL chính xác định ở lợn (NPG/PG2, PMAP28, PMAP26 và PR39) trong tổng

số 8 gen CATHL với 2 bản sao PMAP36 và 4 bản sao gen PG / NPG; 3 gen CATHL

có trong hệ gen của ngựa (eCATH-1, -2 và -3) [43] Ở người, khỉ rhesus, chuột, thỏ

và lợn guinea sở hữu một gen CATHL, có tên lần lượt LL-37, RL-37, mCRAMP,

rCRAMP và CAP11 [26]

Hình 1: Cơ chế phân tử được đề xuất về nguồn gốc của cathelicidin từ cystatin E và I tương ứng là exon và intron Các ô vuông biểu diễn khung đọc mở Stop: mã kết thúc

Chữ “hoặc” cho biết hai khả năng chèn các vị trí của I 03 [59]

1.1.2 Cấu trúc và hoạt tính chức năng của cathelicidin

CATHL thuộc nhóm peptide cation lớn có đặc tính lưỡng tính và là đại diện

chính của hệ thống miễn dịch ở nhiều động vật có xương sống Tất cả các gen

CATHL đều có chung một cấu trúc bao gồm 4 exon, hình thành dưới dạng

pre-pro-peptide Vùng exon 1 - 3 mã hóa cho peptide tín hiệu (29 – 30 axit amin) và một

5

miền N-terminal cathelin (94 – 114 axit amin) Vùng này có chứa một đến hai liên kết disulfide giữa hai cysteine giúp hình thành cấu trúc cố định của protein cathelin Vùng exon 4 mã hóa cho một miền C-terminal, phân hóa hình thành các peptide trưởng thành có hoạt tính kháng khuẩn (AMD) (12 – 100 axit amin) [24, 59] (Hình 2)

Hình 2: Mô hình cấu trúc và sự hình thành cathelicidin có hoạt tính chức năng

Chữ C: các vị trí cysteine bảo thủ tham gia hình thành các liên kết disulfide [59]

Ở động vật có vú, đặc điểm trình tự miền cathelin bảo thủ có tới 40% sự tương đồng giữa các loài, còn các AMP tạo thành có tính biến đổi cao được cho là kết quả của quá trình sao chép gen có xuất hiện các đột biến điểm khác biệt trong quá trình tiến hóa [59] Tính chất này được thể hiện khi so sánh về trình tự peptide

dạng tiền thân của các thành viên thuộc họ CATHL ở bò so với người, ngựa, chuột,

cá và gà [53] (Hình 3) AMP thể hiện khác nhau giữa các cá thể và giữa các loài Trình tự gen thay đổi nên các AMP thường không đồng nhất về chiều dài (12-100 axit amin) Các họ cathelicidin bao gồm năm nhóm peptit riêng biệt, bao gồm: (1)

6

dodecapeptit mạch vòng chứa một liên kết disulfur, (2) peptide chứa hai liên kết disulfur (protegrin ở lợn), (3) peptit có cấu trúc xoắn ốc (LL-37 ở người, CAP18 ở thỏ, BMAP-27, -28 và -34 ở bò, PMAP-23, -36 và -37 ở lợn), (4) peptit chứa giàu tryptophan (indolicidin ở bò) và peptide giàu proline và arginine (Bac7 ở bò, PR-39

ở lợn), và (5) các phân tử peptide ngắn sắp xếp lặp lại ngẫu nhiên (Bac5 và 7 ở bò, OaBac5 và 7,5 ở cừu, PR-39 và propnin ở lợn nhà) [50, 51, 61]

Hình 3: So sánh trình tự peptide kháng khuẩn của các phân tử protein CATHL tiền

thân ở bò với các loài động vật có vú khác

Người (Homo sapiens, hCAP-18), chuột ( Mus musculus, CAMP), ngựa ( Equus caballus, ecath-2), chó (Canis lupus familiaris, CAMP) và gà ( Gallus gallus, cathl2)

[53]

Cathelicidin được lưu trữ trong các hạt bạch cầu trung tính dưới dạng tiền chất không hoạt động (pre-pro-peptide) và được giải phóng dưới dạng AMP trưởng thành khi có tín hiệu yêu cầu, sau khi bị phân cắt bởi proteinase hoặc elastase [47] AMP có khoảng 50% axit amin có tính kị nước, mang điện dương, có khả năng kháng khuẩn trực tiếp đối với nhiều mầm bệnh, bao gồm cả vi khuẩn Gram dương

và Gram âm, nấm, ký sinh trùng và vi-rút Cathelicidin có rất nhiều chức năng điều

7

hòa đáp ứng miễn dịch, vừa tăng cường và ức chế viêm, tác động trực tiếp và gián tiếp lên hóa trị liệu và biệt hóa tế bào Vì cathelicidin kích thích chữa lành vết thương và tạo mạch [42, 59], nên chúng có thể được sử dụng trong điều trị bổ sung cho các vết thương dễ nhiễm trùng như vết thương phẫu thuật Ngoài ra, cathelicidin mang nhiều tiềm năng, công dụng với vai trò làm thuốc trong điều hòa miễn dịch hoặc kháng khuẩn [52] Cathelicidin cũng được sử dụng như một chất bổ trợ vắc-xin hoặc phụ gia và thích hợp làm vắc-xin ức chế miễn dịch thế hệ tiếp theo trên vật liệu nano [65] (Hình 4)

Hình 4: Vai trò, chức năng của cathelicidin ở động vật có vú [18]

Hiện nay, có hơn 500 peptide kháng khuẩn được phát hiện ở các loài sinh vật [37], cho thấy một số lượng lớn các biến thể hình thành trong tự nhiên nhờ tiến hóa thích nghi để hình thành nên các dạng peptide trưởng thành có vai trò quan trọng trong sự sống và phát triển

1.1.3 Cơ chế tác động và miễn dịch của cathelicidin ở động vật có vú

Cathelicidin được biểu hiện dưới nhiều dạng khác nhau ở các loài động vật

và có chức năng điều hòa miễn dịch khác nhau Cathelicidin tỏ ra hữu hiệu bởi khả năng chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn nhờ tương tác của các AMP trưởng thành

8

mang điện tích dương với các thành phần bề mặt màng tế bào vi khuẩn mang điện

âm (LL-37 ở người, Cap-18 ở thỏ, Bac7, BMAP-28 ở bò có thể liên kết trực tiếp với lipopolysaccharide (LPS) tích điện âm từ vi khuẩn Gram âm) [15, 22] Tương tác màng của hầu hết các AMP - Cathelicidin của động vật có xương sống không thông qua thụ thể [26] và nó có xu hướng hình thành các chuỗi xoắn ốc lưỡng tính khi tiếp xúc với màng vi khuẩn (Hình 5A) Cơ chế hoạt động của AMP cho thấy sự khác biệt đáng kể trong cách thức hoạt động khi so sánh với kháng sinh Điều này là do chúng ảnh hưởng đến nhiều mục tiêu, không giống như kháng sinh thông thường, tấn công một mục tiêu cụ thể [32, 42] Một trong những cơ chế chính được kích hoạt bởi cathelicidin là liên kết của chúng với màng đích, sau đó là sự thẩm thấu và / hoặc phá vỡ, dẫn đến rò rỉ chất tế bào gây ra cái chết của vi khuẩn [34](Hình 5B)

Hình 5: Cơ chế hoạt động của cathelicidin.

(A) - Cathelicidin điều chỉnh cấu trúc bằng cách tương tác tĩnh điện với màng vi khuẩn (B) - Sự phá vỡ màng vi khuẩn gây ra bởi cathelicidin (C) - Ức chế tổng hợp / thủy phân ATP gây ra thông qua các cathelicidin liên kết với ATP synthase [7].

Ngoài các mục tiêu màng, cathelicidin cũng có thể hoạt động nội bào, liên kết hoặc làm suy giảm các phân tử, bao gồm DNA, RNA và protein Chúng có thể

9

can thiệp vào quá trình tổng hợp DNA, RNA và làm suy giảm chức năng của enzyme và các protein khác, vốn là các phân tử quan trọng cho sự sống của tế bào [52] Cụ thể, người ta đã quan sát thấy rằng cathelicidin có khả năng ức chế ATP synthase (Hình 5C), dẫn đến không tổng hợp được ATP, làm ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào, dẫn đến chết tế bào [4]

Cathelicidin tham gia ức chế phản ứng viêm để bảo vệ vật chủ khỏi các phản ứng quá kích hoạt miễn dịch đối với các nội độc tố vi khuẩn (LPS, axit lipoteichoic (LTA) và flagellin), bằng cách liên kết nội độc tố và ngăn chặn tín hiệu TLR Nhiều loại cathelicidin như LL-37, mCRAMP, K9, PMAP-36, BMAP-27, BMAP-28, indolicidin, SMAP-29, và chCATH-1, chCATH-2, chCATH-2, 3 có liên kết với các phối tử TLR4, có thể ức chế sản xuất TNFa do LPS trong các bạch cầu khác nhau, như đại thực bào, bạch cầu đơn nhân và các tế bào đuôi gai (DC) [52](Hình 6) Dẫn chứng là LTA của vi khuẩn kích hoạt TLR2 tạo ra biểu hiện LL-37 trong các đại thực bào ở người, từ đó có thể làm giảm các tác động viêm do LTA khác như sản xuất TNFa và IL-6 [41] Và BMAP kích hoạt phản ứng miễn dịch bằng cách kích thích sự biểu hiện của TNFa trong tế bào biểu mô tuyến vú của bò để chống lại các mầm bệnh trong sữa bò [48]

Hình 6: Ức chế hoạt hóa TLR qua trung gian nội độc tố bởi cathelicidin [52]

Bên cạnh việc kháng khuẩn, đáp ứng viêm, kiểm soát sự sống của tế bào, cathelicidin kích thích hệ thống miễn dịch bẩm sinh ở động vật bậc cao bằng các kích thích hình thành kháng thể và các tế bào chuyên hóa miễn dịch Đối với quá trình biệt hóa và tăng sinh tế bào, cathelicidin cũng có thể sửa đổi các phản ứng miễn dịch ở mức độ rộng hơn bằng cách ảnh hưởng đến sự biệt hóa của các tế bào miễn dịch và tăng cường sự biểu hiện của các thụ thể trong các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs) Cathelicidin kích thích các phản ứng định hướng Th1 trong các tế bào DC LL-37 kích thích sản xuất các phân tử đồng kích thích và bài tiết các cytokine tạo ra Th1 trong các DC có nguồn gốc monocyte ở người, như IL-6, IL-12

10

và TNFα [17] (Hình 7A) Đối với tế bào DC có nguồn gốc từ bạch cầu đơn nhân, LL-37 tác động đến các DC nang (fDC) (Hình 7B) LL-37 kích hoạt thụ thể FPRL1 trên fDC, dẫn đến điều chỉnh tăng CXCL13, thu hút các tế bào B thông qua thụ thể CXCR5 của chúng Việc sản xuất yếu tố kích hoạt tế bào B (BAFF) cũng được tăng cường bởi LL-37 Điều này dẫn đến tăng sinh tế bào B và tăng tiết globulin miễn dịch [27].

Hình 7: Cathelicidin (LL-37) tác động ảnh hưởng đến biệt hóa tế bào và kích thích hình thành các chemokine định hướng tế bào sao và thu hút, thúc đẩy tăng sinh tế bào B [52]

Với vai trò là chất điều hòa miễn dịch, cathelicidin có kích thước nhỏ, có thể

dễ dàng được kết hợp trong các sản xuất thuốc và vắc-xin Cathelicidin dẫn dụ các

tế bào miễn dịch đến vị trí tiêm và phân hóa DC và tế bào T đến các loại phản ứng miễn dịch cụ thể Cathelicidin có đặc tính chọn lọc cao hiện đang là mối quan tâm không ngừng trong việc phát triển các chất kháng khuẩn mới từ các AMP để sử dụng trong điều trị [33, 49]

Ngoài các vai trò điển hình đã được kể đến, cathelicidin còn tham gia hỗ trợ vào các chương trình tế bào, tái tạo, hình thành mạch với cơ chế tác động phong phú Một số chức năng khác chưa được hiểu rõ ràng

11

1.2 Họ gen CATHL và tình hình nghiên cứu đa hình di truyền CATHL4 ở gia súc

1.2.1 Tính đa dạng của họ gen CATHL ở trâu và bò

Gen mã hóa cho họ cathelicidin ở trâu và bò bao gồm 7 thành viên

(CATHL1, CATHL2, CATHL3, CATHL4, CATHL5, CATHL6 và CATHL7), nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 22 Các gen CATHL khác nhau thường đại diện

cho nhiều bản sao của gen với sự khác biệt hoặc không có sự khác biệt trong khu vực AMD [8], vùng trình tự mã hóa cho peptide kháng khuẩn có tính thay đổi cao

nhất trong gen Cho đến nay họ gen CATHL ở trâu, bò được mở rộng phong phú bởi

sự hình thành tính đa hình cao ở gen CATHL4 Ở trâu Ấn Độ, có tới 6 – 12 CNV của gen CATHL4 đã được xác định [9] và 3 – 11 CNV được xác định ở bò [22] Các

biến thể hình thành được cho là kết quả của quá trình lặp gen, kéo theo là sự phân ly chức năng diễn ra Cụ thể là các AMP mang nhiều khác biệt về trình tự, cấu trúc và

có phân hóa vị trí biểu hiện miễn dịch đa dạng Các gen CATHL có vị trí biểu hiện

khác nhau thường đại diện cho các mục tiêu chức năng nhất định Những khác biệt

về trình tự peptide, cấu trúc, vị trí biểu hiện và chức năng của các gen CATHL đã

được xác định ở bò cho thấy tính đa dạng cao của gen này được liệt kê trong bảng 1

12

Bảng 1: Phân loại cấu trúc, chức năng và vị trí biểu hiện của các gen CATHL đã xác

định trên bò (Bos taurus) [25, 44]

Tên

Dạng cấu trúc peptide

Trình tự AMP Vị trí biểu hiện Chức năng

Bạch cầu trung tính

RFRPPIRRPPIRPPFY PPFRPPIRPPIFPPIRP PFRPPLGPFP-NH2

Bạch cầu trung tính Kháng khuẩn

RRIRPRPPRLPRPRP RPLPFPRPGPRPIPRP LPFPRPGPRPIPRPLP FPRPGPRPIPRPL

Bạch cầu trung tính Kháng khuẩn

CATHL4 Cathelicidin-4

(Indolicidin)

Thẳng, giàu tryptophan

ILPWKWPWWPWRR

-NH2

Bạch cầu trung tính,

tế bào tủy xương

Kháng khuẩn, chống

lại S aureus, E coli Kháng nấm Candida

albicans, Cryptococcus neoformans

Giết chết các sinh vật

nguyên sinh Giardia

lamblia

Tham gia ức chế phản ứng viêm và các chương trình miễn dịch tế bào

Hoạt động kháng khuẩn mạnh mẽ chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương, bao gồm

Tiềm năng kháng khuẩn

Chú thích: R – Arginine, N – Asparagine, D – Aspartic acid, C – Cysteine, E – Glutamic acid, Q – Glutamine, G – Glycine, H – Histidine, I – Isoleucine, L – Leucine, K – Lysine,

M – Methionine, F – Phenylalanine, P – Proline, S – Serine, T – Threonine, W – Tryptophan, Y – Tyrosine, V – Valine

13

Tổ chức hệ gen CATHL ở trâu, bò không chỉ cho thấy sự phân hóa đa dạng

bởi nhiều biến thể hình thành qua quá trình tiến hóa, nhân lặp gen mà cấu trúc gen

còn xuất hiện nhiều điểm đa hình, đột biến phong phú Điển hình, gen CATHL2

được mô tả mang vùng AMP dài ngắn khác nhau (99 axit amin ở trâu, 43 axit amin

ở bò) và bao gồm một vùng PPIRPPII lặp lại 6 – 8 lần; CATHL3, CATHL5 và

CATHL6 có các vị trí thay thế / mất / thêm axit amin [9] Trong khi CATHL4 thể

hiện sự đa dạng chức năng đặc trưng bởi cấu trúc mang các đặc điểm biến đổi cao ở domain kháng khuẩn đầu C (AMD) Phân tích trình tự so sánh ban đầu các gen

CATHL2, CATHL5, CATHL6 và CATHL7 của 10 giống thuộc loài Bos taurus (loài

bò khu vực châu Âu, đông bắc Á và một phần châu Phi) và Bos indicus (Bò u – loài

sống ở vùng khí hậu nóng) trong nghiên cứu của Gillenwaters et al (2009) cho thấy

có rất nhiều vị trí đa hình, bao gồm cả các SNP và các vị trí indel (thêm/mất nucleotide) Cụ thể, phát hiện được 5 indel và 60 SNP trong đó có 7 đột biến sai

nghĩa Hơn nữa ở gen CATHL4 có đoạn chèn dài 24 bp; một trình tự vi vệ tinh sau

đó là vùng nhiều G lặp lại đa hình; và 2 vị trí đa hình SNP ở vùng mã hóa của gen

CATHL1 [23] Chính sự đa hình về trình tự kéo theo nhiều thay đổi về số bản sao

của gen cho thấy tính đa dang của họ gen CATHL cao, phổ chức năng rộng đóng vai

trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch ở trâu, bò

1.2.2 Tình hình nghiên cứu gen CATHL4

CATHL4, một thành viên của họ cathelicidin đã xác định ở gia súc được chú

trọng trong các nghiên cứu về đa hình, chức năng và biểu hiện Gen CATHL4 mang

tính đa hình bản sao gen cao với nhiều biến thể xuất hiện khác nhau ở các loài gia súc khác nhau Phân tích của Bickhart et al (2012) đã chỉ ra sự khác biệt về số lượng bản sao trong toàn bộ hệ gen của 5 cá thể bò châu Âu taurine (3 con Angus, một con Holstein và 1 Hereford) và một cá thể bò u (Nelore), gen liên quan đến tính kháng

vi khuẩn gây bệnh và kháng kí sinh trùng như gen CATHL4 có sự nhân lặp cao ở bò

u Nelore nhiều hơn so với bò châu Âu Whelehan et al (2014) đã xác định có 2 bản

sao của gen CATHL4 liền kề nhau trên BTA22 [53] So với các loài gia súc khác thì

CATHL4 ở trâu, bò có phân hóa mạnh hơn Bằng các nghiên cứu định lượng tương

14

đối số lượng gen CATHL4 ở 93 cá thể thuộc 31 giống bò khác nhau, Flores et al

(2011) đã xác định được có sự xuất hiện của 3 – 11 CNVs [22] Cũng đa dạng như

vậy, 6 CNVs - 12 CNVs của gen CATHL4 đã được phát hiện ở trâu (Hình 8) [9] Xem xét những khác biệt trong vùng AMP của 12 biến thể buCATHL4 ở trâu, sự

khác biệt được xác định hầu hết nằm trong vùng AMD dẫn đến sự đa dạng trình tự, kích thước và phân hóa cấu trúc của các loại peptide kháng khuẩn được tạo thành

Các buCATHL4 mang các khác biệt trong trình tự và có khả năng đại diện cho một

mục tiêu chức năng nhất định [9]

Hình 8: So sánh vùng trình tự axitamin biến đổi từ 12 biến thể phát sinh gen CATHL4

ở trâu [9]

Gen CATHL4 được xác định biểu hiện với mức độ khác nhau ở bạch cầu

trung tính, phổi, tuyến vú, tế bào lympho, tế bào máu đơn nhân và thực quản của bò

[22] Một nghiên cứu về gen CATHL4 cho thấy biến dị di truyền ở gen này có vai

trò đối với tính miễn dịch của ở trâu Ấn Độ Cathelicidin-4 có biểu hiện tăng cường gấp 10 lần trong sữa ở trâu [60] Nghiên cứu về chức năng các AMP của các gen

CATHL4 mới đã được xác định là có khả năng diệt khuẩn S aureus, S typhimurium, P aeruginosa, E coli [11, 44] Nghiên cứu mô phỏng cho thấy cấu

trúc peptide buCATHL4 có tính lưỡng ái (amphipathic – với cả phần ưa nước và kị

nước) làm tăng khả năng phá vỡ màng vi khuẩn Đáng chú ý là cathelicidin-4 ở gia súc được duy trì tính diệt khuẩn khi có mặt các protease vi khuẩn và protease nội sinh [9] Các peptide này cũng chống lại vi khuẩn ở giai đoạn sinh trưởng ổn định

và giảm sự hình thành biofilm Cathelicidin-4 cũng có tác dụng chống lại nhiều loại

15

nấm gây bệnh khác nhau như Candida albicans, Cryptococcus neoformans và có

tác dụng phá hủy các mục tiêu nội bào, chẳng hạn như DNA của vi khuẩn [45, 48]

và nó có khả năng gây chết tế bào theo cơ chế tự nhiên ở mầm bệnh đơn bào

Leishmania donovani [10] cũng như giết chết các sinh vật nguyên sinh Giardia lamblia [5] Đặc biệt, cathelicidin chống lại một số chủng kháng đa kháng thuốc và

có tính độc thấp đối với tế bào eukaryote [9] Do vậy, vai trò là kháng sinh có tiềm năng đối với vật nuôi, con người, như là các phân tử mô hình cho các liệu pháp điều trị dựa trên peptide trong tương lai [13, 22] Hiện nay, ở Việt Nam nghiên cứu về các gen mã hóa cathelicidin chưa được quan tâm, khai thác và chưa có các công bố liên quan đến các gen này

1.3 Bò vàng Việt Nam và tiềm năng phân hóa di truyền mở rộng của gen

CATHL4

Bò thuộc một nhánh động vật có vú có khoảng cách tiến hóa xa so với người

và động vật gặm nhấm, xuất hiện lần đầu tiên ∼60 triệu năm trước [35] Bò đại diện

cho bộ động vật nhai lại, lớp động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), bộ phụ nhai lại (Ruminantia), họ sừng rỗng (Bovidae), tộc bò (Bovini), loài bò (Bos primigenus, Bos javanicus, Bos gaurus, Bos frontalis, Bos

mutus, Bos sauvali, Bos taurus và Bos indicus) [20, 39] Hệ gen bò chứa tối thiểu

22.000 gen, đã được giải trình tự đến độ bao phủ ∼7 × Nhiều nghiên cứu cho thấy các thay đổi tiến hóa gen đặc trưng ở bò trong nhiễm sắc thể theo xu hướng có mật

độ nhân lặp cao hơn, làm phong phú hệ gen và phần lớn các biến thể đặc trưng của loài trong các gen liên quan đến tiết sữa và đáp ứng miễn dịch [14]

Bò vàng Việt Nam có phân bố rộng rãi ở khắp đất nước, hoặc được phân loại

theo tên địa phương như: bò Hà Giang, bò Phú Yên, bò Thanh Hóa, bò Nghệ An, Nghiên cứu xác định khoảng cách di truyền trên các nhóm bò Việt Nam cho thấy bò

Hà Giang có 56% hệ gen có nguồn gốc từ loại bò châu Âu không có u (Bos taurus)

và 46% từ dòng bò Ấn độ có u (Bos indicus), quần thể bò vàng thuộc các khu vực Lạng Sơn, Thanh Hóa, Phú Yên và bò U đầu rìu (Nghệ An) đều có nguồn từ bò Bos

16

indicus [2] Bò vàng sinh sống ở môi trường trên cạn, có thể sử dụng hiệu quả thức

ăn thô, chất lượng thấp để chuyển hóa thành các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và

thương mại Nhóm bò vàng rất đa dạng về ngoại hình, khối lượng và kích thước,

chúng mang những nét đặc trưng riêng và đáp ứng tốt với điều kiện sinh thái của

từng vùng [1] Bò vàng thích nghi tốt với môi trường nhiệt đới nóng ẩm thất

thường, nhu cầu dinh dưỡng thấp, kháng được ve và những bệnh do ve, ký sinh

trùng gây ra Những thay đổi về số lượng và tổ chức gen ở bò bao gồm sinh sản,

miễn dịch và tiêu hóa gây ra những ảnh hưởng sâu sắc đến hệ thống sinh học Đặc

biệt, sự tiến hóa liên quan đến những thay đổi mở rộng nhiễm sắc thể và khuynh

hướng hoạt động của chúng dẫn tới sắp xếp lại gen và hình thành gen mới Chính vì

vậy nghiên cứu những thay đổi trong loài bò có thể phản ánh sự thích nghi trao đổi

chất và miễn dịch Xem xét tác động từ vi sinh vật cao trong môi trường sống tự

nhiên của bò vàng Việt Nam, một loài chưa được khai thác lợi thế về đặc điểm, tính

đa hình gen CATHL4, nên tiềm tàng khả năng phân hóa với nhiều dạng đa hình di

truyền là lớn Với giả thuyết rằng, tính đa hình di truyền của gen CATHL4 có thể

định hướng đến việc xác định các AMP mới của họ cathelicidin và giải thích được

khả năng chống chịu với điều kiện môi trường sống của bò vàng bản địa Việt Nam

17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu DNA tổng số

Mẫu DNA tổng số đã tách chiết của 30 mẫu thuộc 4 nhóm bò tại các địa phương ở Việt Nam Trong đó, 7 mẫu tại Hà Giang (H), 10 mẫu tại Phú Yên (P), 7 mẫu tại Thanh Hóa (T) và 6 mẫu tại Nghệ An (U), nhận được từ Viện Chăn nuôi Quốc gia Các mẫu thu nhận được chọn ngẫu nhiên để tránh mối quan hệ di truyền hẹp giữa các cá thể Nồng độ DNA tổng số được xác định bằng máy NanoDrop™

1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher) để sử dụng trong nghiên cứu phân tích đa

hình di truyền gen CATHL4

2.1.2 Mồi

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu đã được thiết kế dựa trên các trình tự

gen CATHL4 và GADPH của Bos taurus đã được công bố trên ngân hàng gen (mã

số tương ứng: NC 037349.1 và AJ786261.1), trình tự gen đã công bố của Brahma (2015) và kết quả giải trình tự bò vàng Việt Nam trong nghiên cứu này Mồi được tổng hợp bởi công ty IDT (USA) và được thống kê ở bảng 2

Bảng 2: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu xác định đa hình CATHL4 ở bò vàng

Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp)

D4F AGACTGGGGACCATGCAGACCCAG 63,5 oC

1370 D4R TCACTGTCCAGAAGCCCGAATCTG 59,6 oC

C4SS – F GCTTGTGGCCTCCTTTTTCATAGCTCCA 62,6 oC

170 C4SS – R TCACTGTCCAGAAGCCCGAATCTG 60,7 oC

CAT – 4F CTGTCAGATCCTGAGCCTCGGGAA 62,0 oC

72 CAT – 4R TCACTGTCCAGAAGCCCGAATCTG 60,7 oC

pJET1.2F CGACTCACTATAGGGAGAGAGGC 56,7 oC

1489 pJET1.2R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 54,9 oC

GAPDH – F TCTTCACTACCATGGAGAAGGCTGG 60,0 oC

130 GAPDH – R TGCAGCAAGGAGCAAGTTAATTGCA 59,8 oC

18

2.3.3 Hóa chất

Các bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR, tinh sạch gel sản phẩm PCR và tách chiết plasmid được mua từ hãng Qiagen; thang chuẩn DNA được mua từ hãng Philekorea; hỗn hợp dNTP được mua từ hãng Thermo Fisher; enzyme RNase, H2O không chứa nuclease được mua từ hãng Invitrogen; Các hóa chất còn lại sử dụng trong nghiên cứu đều được mua từ Sigma, Merk đạt độ tinh khiết tiêu chuẩn

2.3.4 Thiết bị

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: Máy PCR PTC-200 (MJ Research); Máy NanoDrop™ 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher); Máy real-time PCR 7500 (Applied Biosystem); Máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf); Máy ly tâm Sigma 3K (Sigma-Aldrich); Máy vortex (Velp–Italy ZX3); Máy spindown (Cleaver Scientific); Bể ổn nhiệt (Eppendorf); Máy lắc (N-Biotek); Tủ an toàn sinh học (Labtech); Cân điện tử, cân phân tích (Sartorius); Thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad); Hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad)

2.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội;

Thời gian nghiên cứu: luận văn được tiến hành từ tháng 03/2019 đến tháng 10/ 2020

19

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Định hướng và thiết kế nghiên cứu

Định hướng phân tích đa hình di truyền của gen CATHL4 từ các mẫu bò

vàng bản địa Việt Nam

Nghiên cứu đa hình gen CATHL4 được thực hiện trên 30 cá thể bò vàng

thuộc 4 quần thể P, H, T và N DNA tổng số được tinh sạch từ các mẫu nghiên cứu

và gen CATHL4 được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu D4F và D4R (Bảng

2) Bước đầu, gen CATHL4 được khuếch đại từ 10 mẫu DNA hệ gen bằng PCR và

được giải trình tự trực tiếp Kết quả giải trình tự gen là thông tin sơ bộ nhằm xác định

gen có nhiều hơn một bản sao hay không Tiếp theo, nghiên cứu hướng đến xác định đa

hình trình tự và đa hình số bản sao của gen CATHL4 Trong nghiên cứu đa hình trình tự

gen, gen CATHL4 được khuếch đại bằng PCR và tách dòng sử dụng vector pJET1.2

Năm mươi (50) dòng khuẩn lạc từ mỗi mẫu cá thể được sàng lọc, tách chiết plasmid

được sử dụng cho phân tích SSCP nhằm xác định tính đa hình trình tự dựa trên mô

hình sai khác cấu hình sợi ssDNA (biến thể) gen CATHL4 Các dòng plasmid -

CATHL4 có mô hình SSCP khác nhau thể hiện dải cấu hình điện di sai khác và trùng

lặp trên mẫu của cùng một cá thể và trên các cá thể được chọn giải trình tự và phân tích

trình tự với các phần mềm tin sinh học để xác định các đa hình về trình tự DNA của

gen Trong nghiên cứu đa hình số bản sao gen CATHL4, 16 mẫu DNA tổng số bò vàng

đã được sử dụng cho phân tích Real-Time PCR, với gen GADPH được sử dụng làm

gen nội chuẩn

Cách kí hiệu mẫu trong nghiên cứu: Px.y, Hx.y, Tx.y, Ux.y Trong đó: P, H,

T, U lần lượt là kí hiệu của mẫu tại Hà Giang, Phú Yên, Thanh Hóa, Nghệ An; x là

số thứ tự kí hiệu mẫu; y là số thứ tự kí hiệu dòng khuẩn lạc (plasmid-CATHL4)

20

Sơ đồ thí nghiệm tóm tắt các bước nghiên cứu đa hình gen CATHL4: